Genetik der Resistenz

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1 Genetik der Resistenz tetr Repressor teta B 59be (Thr) A (Ala) G (Pro) C (Stop) A T C G (Trp) G (Leu) T (Ser) A (Ser) C (Ser) T Peter Heisig Universität Hamburg 1

2 Ursachen der Entwicklung von Resistenz - mikrobielle Faktoren Parameter Mikroorganismus Mensch Faktor Zellzahl gesamt 5 x x Masse [t] 5 x x Generationszeit 30 min. 30 Jahre 5 x 10 5 Zeit auf Erden [Jahre] 3,5 x x haploides Genom kurze Generationszeit hohe Zellzahl Spellberg et al.,

3 Resistenz ein altes Problem der Antibiotikatherapie, ein viel älteres Phänomen der Mikrobiologie Antibiotikum Jahr der geschätztes Alter Zulassung (USA) ersten Meldung der Resistenzgene 1939 * B. Wiedemann Penicillin Mio. Jahre Streptomycin Mio. Jahre Tetracyclin Methicillin Nalidixinsäure* Gentamicin Vancomycin Mio. Jahre Cefotaxim (ESBL) Linezolid* *: synthestisch hergestellt ESBL: extended spectrum β-lactamase 3

4 Ursachen der Entwicklung von Resistenzgenen - Antibiotika-bedingte Faktoren I Natürliche Antibiotika z.b. β-lactamantibiotika Produzent Pilz Selektionsdruck sehr lang Koevolution mit Erreger enzymatische Inaktivierung übertragbare Resistenzgene Synthetische Antibiotika z.b. Fluorchinolone Produzent Mensch Selektionsdruck sehr kurz keine Koevolution (keine enzym. Inaktivierung) (kein Resistenzgentransfer) 4

5 nzahl neuer Antibiotika Ursachen der Entwicklung von Resistenzgenen - Antibiotika-bedingte Faktoren II Abnehmende Zahl von Neuentwicklungen Zahlen der FDA für USA 5

6 Die drei Grundmechanismen der Resistenz beruhen auf nur zwei genetischen Veränderungen Veränderung der Zielstruktur Inaktivierung des Antibiotikums Verringerung der Antibiotikumkonzentration am Wirkort Mutation in vorhandener DNA oder Aufnahme neuer DNA 6

7 Ursachen für Resistenzentwicklung - Mutation und Selektion genetische Veränderung (Mutation) Selektion durch Antibiotikum Inoculum Mutationsfrequenz Fitness MHK-Anstieg 7

8 Intrazelluläre Mobilisation von Resistenzgenen R-Gen R-Gencassetten: aada, aadb, aaca, aacc, catb, cmla, dfra, dfrb sat qace Isoliertes R-Gen wird von Integron aufgenommen 59be IntI Integron-codierte Integrase schneidet R-Gen aus IntI pinti Integron atti pant Integron mit R-Gen Multiresistenz durch R-Gen-Kombinationen 8

9 Interzellulärer Transfer von Resistenzgenen Konjugation (Multiresistenzplasmide Enterobakterien) Transduktion (Pseudomonas) Transformation (Pneumokokken) 9

10 Co-Selektion von Resistenzgenen - tet-gene Beispiele Integron-assoziierte tet-gene: tet (A) / tet (E) / tet (G) in Klasse I-Integron-Strukturen. Co-Selektion mit Resistenzgenen bla, cat, aada, sul bei S. Typhimurium DT104 Transposon-assoziierte tet-gene: tet (M) auf Tn916 und Derivaten. Co-Selektion mit ermb bei Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus mit cat, apha in S. pneumoniae tet-gene assoziiert mit konjugativen Transposons: tet (Q) auf konjugativem Transposon CTnDOT. Co-Selektion mit ermf / ermg bei Bacteroides spp. Tetracyclin induziert Excision des Transposons aus dem Chromosom als initialen Schritt des Transpositionsvorgangs. Shoemaker et al.,

11 Genetische Veränderungen bedingen Resistenz Mutation in vorhandener genetischer Information reduzierte Affinität zum Target: gyra, rpob, rpsl, rrnb Inaktivierung des genetischen Repressors: marr, acrr, meci Inaktivierung des biochemischen Regulators: ampd veränderte Enzymaktivität: bla TEM, dfr, aac6 Ib-cr Aufnahme neuer genetischer Information Genfragmente: vollständiges Gen: vollständiger Stoffwechselweg: pbpx meca, bla, teta und tetm vana 11

12 Genetische Grundlagen der Resistenz am Beispiel der Fluorchinolone Erwerb von Punktmutationen geänderte Affinität der Zielstrukturen (gyra, gyrb, parc, pare) erhöhte Expression von mdr-effluxpumpen (marr, acrr) durch loss-of function mutation geändertes Substratspektrum von aac6 Ib-cr für 7-Piperazinyl-Chinolone Erwerb von Deletionsmutationen erhöhte Expression von mdr-effluxpumpen durch Funktionsverlust von Repressoren (marr, acrr) Erwerb von neuem genetischen Material vollständiges Gen codiert Schutz für Zielstrukturen (qnr/mfpa) Gen codiert für Acetyltransferase von 7-Piperazinyl-Chinolonen aac6 Ib-cr) 12

13 Bedeuting von Punktmutationen -gyramutationen bei E.coli Mutante MHKCip gyra parc erhöhter Efflux [µg/ml] WT WT-4* S80I ---- M I 0.25 D87G M I 0.5 S83L M I-4* 0.5 S83L S80I ---- WT S83L,D87G M I-3 1 S83L,D87G ----? M II 4 S83L ---- ΔmarR M II* 2 D87G ---- ΔmarR M II-3 8 S83L,D87G ---- ΔmarR M I-3-4a 16 S83L,D87G E84K ---- M I-3-4b 32 S83L,D87G S80I ---- M III 64 S83L,D87G S80I ΔmarR * in vitro erzeugt 13

14 Genetische Grundlage reduzierter Antibiotikumkonzentration am Wirkort antisense RNA acrr A B tolc micf ompf efflux pump porin maro marr Repressor mara Activator 14

15 Überexpression von MDR Effluxpumpen durch Mutationen Gram-negative Erreger Genlocus Outer membran Cytoplasmicmembran Expressionsstatus Δ MHK Cip [µg/ml] acrab acref acrr acra acrb tolc acrs acre acrf tolc schwach konstitutiv acrr - 0,015 0,06 nalb mexr mexa mexb oprm schwach konstitutiv mexr - 0,125 0,5 nfxb nfxc nfxb mexc mexd oprj + mvat mext mexe mexf oprn reprimiert nicht aktiv, reprimiert nfxb - mvat - 0, ,

16 MFP-A Protein ausmycobacterium tuberculosis ist ein Qnr-Homolog und schützt DNA Gyrase durch DNA Mimicking MfpA-Dimer Aufsicht MfpA nimmt eine α-helikale Struktur, ähnlich der B-Konformation von DNA 16

17 Inaktivierung von 7-Piperazinyl-Fluorchinolonen durch ein modifiziertes AAC(6 )-Ib-Enzym mit nur 2 Punktmutationen (W102R und D179Y) H N F N O N H O acetyl-coa HS-CoA O O C H 3 C AAC(6')-Ib-cr N F N O N H O O ciprofloxacin N-acetyl-ciprofloxacin MHK [µm] für E. coli WT in Ab- und Anwesenheit von AAC(6 )-Ib-cr ciprofloxacin (cipro) N-acetyl-ciprofloxain N-ethyl-cipro (enrofloxacin) norfloxacin kanamycin [µg/ml]

18 Genetische Grundlagen der Resistenz am Beispiel der β-lactamresistenz Erwerb von Punktmutationen geänderte Affinität der Zielstrukturen (pbp) erhöhte Expression von mdr-effluxpumpen (marr, acrr) durch loss-of function mutation von Repressoren geändertes Substratspektrum von bla-genprodukten (TEM-3 bis -1??) Erwerb von Deletionsmutationen erhöhte Expression von mdr-effluxpumpen durch Funktionsverlust von Repressoren (marr, acrr, meci) Erwerb von neuem genetischen Material vollständiges Gen codiert bla-genprodukte (TEM-1-2, SHV, CTX-M) vollständiges Gen codiert neues, β-lactam-unempfindliches PBP (meca) Genfragmente codieren β-lactam-unempfindliche PBP-Bereiche (pbpx) 18

19 Molekulare Struktur der TEM-1 β-lactamase Ω-Loop β-lactambindung Inhibitorbindung E104 R164 G238 E240 R244 N276 Q39 M69 T265 M182 Jelsch et al.,

20 Auswirkungen häufiger Mutationen in ESBL vom TEM-Typ auf die Enzym-Substratwechselwirkung Glu-104 ist über H-Brücken zu Asp-132 gebunden. Mutation zu Lys: Interaktion mit Asp-132 stört Positionierung von Ser-130; flexible NH 2 -Gruppe von Lys interagiert mit COOH-Gruppe der Oximinosubstituenten von Ceftazidim, Ceftibuten, Azthreonam. Arg-164 stabilisiert durch ionische Wechselwirkung zu Asp-179 den Ω-Loop mit Glu-166. Mutation zu Ser oder His: Weniger H-Brücken zu Glu-166 destabilisieren Ω-Loop, so daß größere Substituenten zur active site gelangen. Glu-240 interagiert mit größeren Acylamid-Substituenten Mutation zu Lys: Elektrostatische Wechselwirkung mit COOH-Gruppen von Oximinosubstituenten von Azthreonam, Ceftazidim. Ala-237 bildet einen Rand der β-lactam-bindungsstelle, so daß die CO und NH-backbone- Gruppen mit CO des β-lactamrings und NH des C6/C7-Acylamidosubstituenten interagieren. Mutation zu Thr: Verzweigte Oximino-Substituenten werden aus der Bindungsstelle herausgehalten, dafür interagiert NH mit Thr über eine Wasserstoffbrücke. 20

21 Aminosäuresubstitutionen bei TEM-1-Typ β-lactamasen zu einer Erweiterung des Substratspektrums führen Enzym TEM-1 L Q A M E H R W M G A G E R T S TEM-12 S TEM-20 T S TEM-25 F S M TEM-10 S K TEM-17 K TEM-26 K S TEM-6 K H TEM-5 S T K TEM-15 K S TEM-4 F K S M TEM-9 F K S M TEM-27 H K M TEM-28 H K TEM-29 H TEM-43 K H T TEM-47 S K M TEM-48 F S K M TEM-49 F S K M G TEM-52 K T S TEM-55 E TEM-58 S 21

22 Punktmutationen erweitern das Substratspektrum zur ESBL - am Beispiel von TEM-β-Lactamasen Enzym Aminosäure Relative Hydrolyserate CTX CAZ AZT TEM-1 Glu Arg Glu TEM-17 Lys Arg Glu TEM-12 Glu Ser Glu TEM-X Glu Arg Lys TEM-26 Lys Ser Glu TEM-10 Glu Ser Lys Glu=Glutamat; Arg=Arginin; Lys=Lysin; Ser=Serin; CTX=Cefotaxim; CAZ= Ceftazidim; AZT=Azthreonam Sowek et al.,

23 Faktoren mit Einfluss auf die β-laktamresistenz (ohne β-laktamase) Anzahl der Genkopien bzw. der Expressionsstatus ( Chromosomal bzw. Plasmid-codiert (z.b. SHV-1), Promotor- bzw. Attenuatormutationen z.b. K1-β-Laktamase Inaktivierung von negativen Regulatoren, z.b. AmpD) Expressionsstatus und Affinität von Effluxpumpen in der Äußeren Membran Menge und damit Aktivität an verfügbarer β-laktamase am Wirkort 23

24 Erwerb von β-lactamresistenz bei PRSP in Form von Resistenz-determinierenden Genfragmenten S. pneumoniae S. oralis PBP2 Mutation PBP2-analog Mutation Mutation Transformation resistentes Mosaikgen PBPX Penicillinresistenter S. pneumoniae Hakenbeck,

25 Erwerb von Methicillinresistenz durch Transfer von SCCmec-Elementen bei MRSA meca mecri Deurenberg, Stobberingh,

26 Induktion von Resistenz - genetische Grundlagen Bindung von Tetracyclin an TetR-Repressor der Tetracyclin-spezifischen Effluxpumpe TetA Loss-of-function Mutation in ampd: Chromosomal codierte AmpD-Amidase hydrolysiert Induktor für AmpR-Regulator der AmpC β-lactamase Erwerb eines Transposons mit Signaltransduktionsystem VanRS für Glycopeptide 26

27 Induktion der Expression Tetracyclin-spezifischer Effluxpumpen durch Tetracyclin tetr tetab tetr tetab Repressor Effluxpumpe Tetracyclin- Mg 2+ -Komplex 27

28 Induktion der Expression chromosomal codierter β-laktamasen vom Typ AmpC (Klasse A) Wiedemann et al.,

29 Induktion der Glycopeptidresistenz durch Sensorkinasesystem VanRS IR L Transposition Regulation Van-Resistenz Modulation IR R ORF1 ORF2 vanr vans vanh vana vanx vany vanz Courvalin,

30 Mechanismen enzymatischer Inaktivierung von Antibiotika durch Hydrolyse bla: β-lactamase β-lactame ere: Erythromycin- Esterase Erythromycin vgb: Streptogramin B-Esterase Streptogramin B durch Acetyltransfer aac: Aminoglycosid-Acetyltransferase Aminoglykoside cat: Chloramphenicol-Acetyltransferase Chloramphenicol vat,sat: Streptogramin A-Acetyltransferase Streptogramin A durch Phosphotransfer aph: Aminoglycosid-Phosphotransferase Kanamycin fosc: Fosfomycin-Phosphotransferase Fosfomycin durch Adenyltransfer aad: Aminoglycosid-Adenyltransferase Gentamicin rad: Rifampin-Adenyltransferase Rifampicin 30

31 Mechanismen der Veränderung der Zielstruktur durch Erwerb einer Mutation rpsl: Protein S10 des 30S-Ribosoms Streptomycin rpob: RNA-Polymerase β-untereinheit Rifampicin gyra: Gyrase A-Untereinheit Nalidixinsäure durch Erwerb genetischen Materials meca: Penicillin-Bindeprotein 2a Oxacillin pbpx: Penicillin-Bindeprotein 2 Penicillin dfr,sul: DHPS, DHFR Sulfonamid, TMP tetm/o: EF-G-, EF-Tu-Analoga Tetracyclin durch enzymatische Modifikation ermc: 23S-rRNA-Methylase Erythromycin vana: D-Ala-D-Lac-Ligase Vancomycin rmta: 16S-rRNA-Methylase Aminoglycoside 31

32 Reduzierter Zugang zum Wirkstoff durch reduzierten Einstrom ompf: Porin Chinolone oprd2: Porin Imipenem uhpt: Uptake von Hexose-P Fosfomycin durch erhöhten Ausstrom tet: H + / Tetracyclin-Antiporter Tetracyclin vga: Streptogramin A-Efflux Streptogramin A mef: Macrolid-Efflux Makrolide mex, acr: Multiple Resistenz Chinolone, Tetracyclin, mtr,mdfa Multiple Resistenz Chloramphenicol, Oxazolidinone, β-lactame durch Kombination beider Mechanismen mar: multiple Antibiotikaresistenz Chinolone, Tetracycline, durch Schutzproteine qnr: DNA mimicking Chinolone 32

33 Veränderung vorhandener genetischer Information 33

34 Erwerb neuer genetischer Information 34

35 35

36 Faktoren, die bei β-laktamasemutationen Einfluss auf die Ausbildung von Resistenz haben Geschwindigkeit der Hydrolyse-Reaktion (hoher k cat -Wert) Affinität für das Substrat (niedriger Km-Wert) Kombination von β-laktamasen (AmpC + ESBL) Livermore,

37 D-Alanyl-D-Alanin ist die Zielstruktur der Glycopeptidantibiotika Cycloserin 2 L-ala 2 D-ala D-Ala-D-alaligase D-ala D-ala UDP-NAc-Mur L-ala D-glu L-lys V a n 37

38 Glycopeptidresistenz bei Enterokokken durch Erwerb neuer genetischer Information IR L Transposition Regulation Van-Resistenz Modulation IR R ORF1 ORF2 vanr vans 2 L-ala 2 D-ala D-ala vanx D-ala vanh vana UDP-NAc-Mur L-ala D-glu L-lys vanx vany vanz vanh D-ala+ D-lac 2H Pyruvat vana D-Ala-D-lac-Ligase D-ala D-lac vany V a n V a n Van-resistant 38

39 Wirkungsspektren verschiedener β-laktamasen β-laktamase Vorkommen Substrate Penicillinase BlaZ S. aureus Penicillin β-laktamase TEM-1, SHV-1 Enterobacteriaceae + Aminopenicillin Überexprimierte TEM-1, SHV-1 Enterobacteriaceae + Inhibitor ESBL TEM-3, SHV-2, CTX-M Enterobacteriaceae + Cephalosporine AmpC-Überproduktion ( Gen.) AZT (- Inhibitor) Carbapenemasen + Gram-negative + Carbapeneme Efflux/Permeabilität 39