Nachweis und Differenzierung potentiell humanpathogener Clostridium spp. in unterschiedlichen Matrizes

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1 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Nachweis und Differenzierung potentiell humanpathogener Clostridium spp. in unterschiedlichen Matrizes U. Messelhäußer, R. Zucker, P. Kämpf, H. Schreiner, U. Pudich, H. Diepolder, C. Höller, U. Busch

2 Humanpathogene Clostridium spp. Lebensmittel C. perfringens (Typ A und selten Typ C u. D) Botulinum-Toxin produzierende Clostridium spp. (Typ A, B, E und F) (C. difficile) Wundinfektionen C. botulinum (Typ A, B, E und F) C. perfringens (Typ A) u. a. C. tetani, Clostridium septicum u. C. chauvei Krankenhausassoziierte Erkrankungen C. difficile C. perfringens (Typ A) Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 2

3 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Clostridium perfringens

4 Clostridium perfringens gram-positive, sporenbildende anaerobe bzw. aerotolerant wachsende Stäbchenbakterien Einteilung in fünf Toxintypen (Typ A bis E) ubiquitäre Verbreitung in der Umwelt lebensmittelassoziierte Toxi-Infektionen in der Mehrzahl durch C. perfringens Typ A-Stämme mit der Fähigkeit zur Enterotoxinbildung (CpE) Freisetzung des Enterotoxins im Darmlumen durch die Sporulation der aufgenommenen vegetativen Zellen Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 4

5 Toxintypen Haupttoxine Genotyp Humanmedizinisch bedeutsame Erkrankungen Veterinärmedizinisch bedeutsame Erkrankungen α β ε ι A x cpa Gangrän bei Wundinfektionen Durchfall (Fohlen, Ferkel usw.) cpa, cpe cpa, cpb2, (cpe) Gastroenteritis (lebensmittelbedingt, antibiotoikaassoziiert) Nekrotisierende Enteritis (Geflügel) B x x x cpa, cpb1, etx, (cpe) Dysenterie bei Lämmern, Hämorrhagische Enteritis bei Kälbern und Fohlen, Enterotoxämie bei Schafen C x x cpa, cpb1, (cpe) cpa, cbp2, (cpe) cpa, cpb1, cpb2, (cpe) Nekrotische Enteritis (Darmbrand) Nekrotisierende Enteritis bei Ferkeln, Lämmern, Kälbern, Fohlen Enterotoxämie bei Schafen D x x cpa, etx, (cpe) Gastroenteritis Enterotoxämie bei Lämmern, Schafen, Kälbern und Ziegen E x x cpa, iap, ipb, (cpe) cpa, iap Enterotoxämie bei Kälbern Petit et al., 1999 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 5

6 Angewandtes Nachweisverfahren Probenmaterial 9 x TPGY-Bouillon Keimzahlbestimmung (Spiralplattenverfahren auf Eigelb-Lactose-Agar) Bebrütung unter anaeroben Bedingungen bei 37 C für 24 h real-time-pcr von verdächtigen Kolonien real-time-pcr nach DNA-Extraktion aus der Anreicherungsbouillon Ausstrich aus der Anreicherungsbouillon auf Eigelb- Lactose-Agar und Blutagar Bebrütung unter anaeroben Bedingungen bei 37 C für 24 h real-time-pcr von verdächtigen Kolonien Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 6

7 C. perfringens in Lebensmitteln pflanzlichen Ursprungs Blattsalate (u. a. Rucola, Feldsalat), n = 49 Nachweis von C. perfringens in 31 von 49 Proben (63 %): 5 1 ausschließlich cpa cpa/cpe cpa/cpb2 25 Trockenpilze u. Gewürze, n = 108 Nachweis von C. perfringens in 35 von 108 Proben (32 %): ausschließlich cpa cpa/cpe cpa/cpb2 cpa/iap Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 7 27

8 C. perfringens in Lebensmitteln pflanzlichen Ursprungs Tee und Teeerzeugnisse, n = 57 Nachweis von C. perfringens in 30 von 57 Proben (53 %): 3 1 ausschließlich cpa cpa/cpe cpa/cpb2 cpa/iap cpa/etx Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 8

9 C. perfringens in Lebensmitteln tierischen Ursprungs Hackfleisch, n = 24 Nachweis von C. perfringens in 20 von 24 Proben (83 %): ausschließlich cpa cpa/cpe cpa/cpb2 Kesselkonserven (Direktvermarktung), n = 13 Nachweis von C. perfringens in 1 von 13 Proben (8 %) Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 9

10 C. perfringens in Proben mit Erkrankungshintergrund (01/ /2009) In insgesamt 12 von 960 auf C. pefringens untersuchten Proben wurde der Erreger nachgewiesen 1 1 ausschließlich cpa cpa/cpe cpa/cpb1 cpa/etx In keiner Probe lag die detektierte Keimzahl über 10 3 KbE/g. Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 10

11 Beispiel für einen lebensmittelbedingten Ausbruch (C. perfringens) Erkrankung mehrerer Kinder in einem Kinderhort ca. 8 h nach dem Verzehr von Hühnerfrikassee (Reste vom Vortag) an Durchfall ausschließlich qualitativer Nachweis von C. perfringens mit der Fähigkeit zur Enterotoxinbildung in Resten des Mittagessen qualitativer Nachweis von C. perfringens mit der Fähigkeit zur Enterotoxinbildung in den Stuhlproben der mehrerer Kinder vier Wochen später bestätigen die Untersuchungen des humanmedizinischen Referenzlabors für Anaerobier den Verdacht: Die humanmedizinischen Isolate und die Isolate aus den Lebensmitteln sind identisch Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 11

12 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Clostridium botulinum

13 Clostridium botulinum gram-positive, sporenbildende strikt anaerob wachsende Stäbchenbakterien ubiquitäre Verbreitung der Sporen in der Umwelt derzeitig Einteilung in die Toxintypen A bis G: Toxintypen A, B, E und F rufen lebensmittelassoziierte Intoxikationen / Toxi- Infektionen hervor übrige Toxintypen führen zu Erkrankungen bei unterschiedlichen Tierarten zwei Erkrankungsmöglichkeiten (im Zusammenhang mit der Aufnahme von Lebensmitteln): Aufnahme des Toxins ( lebensmittelassoziierter Botulismus ) Aufnahme der C. botulinum-sporen und Toxinbildung im Darm ( infektiöser Botulismus, vor allem bei Säuglingen von Bedeutung) Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 13

14 Nachweismethode in Zusammenhang mit einem humanen Erkrankungsfall Direktextraktion aus dem Lebensmittel Probenmaterial 9 x TPGY-Bouillon Bebrütung unter anaeroben Bedingungen bei 30 C bzw. 37 C für 48 h real-time-pcr nach DNA-Extraktion aus der Anreicherungsbouillon Ausstrich aus der Anreicherungsbouillon auf Eigelb-Lactose-Agar und Blutagar Bebrütung unter anaeroben Bedingungen bei 30 C bzw. 37 C für bis zu 48 h real-time-pcr von verdächtigen Kolonien Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 14

15 Nachweis von C. botulinum-stämmen Beispiel Proben im Rahmen von lebensmittelbedingten Erkrankungsfällen ( ) gesamt 1 C. botulinum 2007 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 15

16 Probenmaterial, aus dem die Stämme isoliert wurden Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 16

17 Beispiel für einen lebensmittelbedingten Ausbruch (C. botulinum) Erkrankung eines Familienvaters nach Verzehr von Leberwurst (Kesselkonserve) mit neurologischen Ausfallserscheinungen (Intensivstation mit Beatmungspflicht) Nachweis von C. botulinum Typ B Sporen und vegetative Zellen in zwei geöffneten Dosen Beurteilung der Probe unter Berücksichtigung des Erkrankungsfalles (epidemiologischer Zusammenhang) als gesundheitsschädlich und damit nicht sicher gem. Art. 14 Abs. 1 i. V. m. Abs. 2a der VO (EG) Nr. 178/2002 Maus-Bioassay aus dem Patientenmaterial positiv, auf den Toxinnachweis aus dem Lebensmittel wurde verzichtet Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 17

18 Untersuchung von Proben im Rahmen des amtlichen Probenplans Honig Kesselkonserven Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 18

19 Schlussbemerkungen bei den beiden wichtigsten humanpathogenen Clostridium spp., im Lebensmittelbereich, C. perfringens und C. botulinum, ist eine ausschließlich kulturell-mikrobiologische Untersuchung nicht aussagekräftig häufig können die in der Literatur angegebenen Infektionsdosen auch im Rahmen von lebensmittelbedingten Erkrankungsfällen in den Verdachtsproben nicht nachgewiesen werden eine zuverlässige Risikobewertung für einzelne Produkte bzw. Produktgruppen ist nur beim Vorliegen belastbarer Daten über Vorkommen, Kontaminationsquellen und wege möglich Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 19

20 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Herzlichen Dank an. Frau Zucker für eine stets konstruktive Mitarbeit und die vielen investierten Arbeitsstunden die Labore für Lebensmittelmikrobiologie LM 3.1 u. LM 3.3 und

21 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit an Sie für Ihre Aufmerksamkeit!

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