Wirkungsspektrum eines Photosynthese-Ferments

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1 wobei die Energie schon nach wenigen Atomen Zwischenraum weitgehend abgeklungen sein dürfte und sich demzufolge die schwache S S-Bindung in unmittelbarer Nachbarschaft zu den hochabsorbierenden aromatischen Gruppen befinden müßte, sie könnte aber auch durch die von F ö r s t e r 3 6 oder W i r t z 3 geforderte Energieleitung in Proteinen verlustlos über längere Strecken geleitet werden 38. Nimmt man an, daß in erster Näherung von der in jeder chromophoren Gruppe absorbierten Energie jeweils x/e i n jede Raumrichtung abfließt wobei die Frage nach dem Leitungsmechanismus durchaus offenbleiben kann, so kommt man zu dem Ergebnis, daß zur Anhäufung der notwendigen Dissoziationsenergie in der S S-Bindung Energie-Teil3«Th. F ö r s t e r, Z. Naturforschg. 2 b, 14 [194]; 4 a, 321 [1949], P H OTO S YN T H E S E - F E R M E N T S <>3f) ströme aus etwa 4 6 Raumkoordinaten gleichzeitig ankommen müssen. Damit erscheint der experimentell ermittelte Wert von etwa 5 gleichzeitig wirksam gewordenen Quanten nicht unvernünftig. Es möge aber abschließend betont werden, daß in dieser qualitativen Betrachtungsweise alle Feinheiten, wie etwa das Verhalten von in Randzonen gelegenen S S-Bindungen oder von solchen, die zwar dissoziieren, aber aus sterischen Gründen nicht getrennt werden und deshalb sofort wieder rekombinieren können, vernachlässigt worden sind. Um solche Fragen zu klären, ist das bislang zur Verfügung stehende Untersuchungsmaterial noch nicht ausreichend genug. 3 K. W i r t z, Z. Naturforschg. 2b, 94, 324 [194]; 3 b, 131 [1948]. 38 H. D a n n e n b e r g, Angew. Chem. 63, 208 [1951]. Wirkungsspektrum eines Photosynthese-Ferments Von OTTO WARBURG, GÜNTER KRIPPAHL u n d W A L T E R SCHRÖDER Aus dem Max-Planck-Institut für Zellphysiologie, Berlin-Dahlem (Z. Naturforsdig. 10 b, [1955]; e i n g e g a n g e n a m 29. August 1955) Durch Zusatz verschiedener Wellenlängen zu rotem Meßlicht wird das Wirkungsspektrum eines Photosynthese-Ferments erhalten. B ringt man Chlorella die in weißem Licht gezüchtet wird in rotes Licht, so sinkt die Photosynthese bald ab; sie steigt wieder auf ihren Anfangswert an, wenn man dem roten Licht eine kleine, energetisch nicht in Betracht kommende Menge blaugrünen Lichts hinzufügt. So kann man ohne Energieaufwand, also katalytisch, Photosynthese entstehen lassen und wieder zum Verschwinden bringen. Dabei ist es wichtig, daß beim Absinken der Photosynthese im roten Licht zuerst die C0 2 -Aufnahme und erst dann die Oo-Entwiddung absinkt; und daß bei Zusatz des blaugrünen Lichts zuerst die C 0 2 Aufnahme wieder erscheint. Das Luminoferment der Photosynthese, das bei Zusatz des grünen Lichts entsteht, Proferment 4- blaugrün *" blaugrün Luminoferment, ist also an der Reduktion der Kohlensäure beteiligt. Variiert man die Wellenlänge des katalysierenden Lichts und bestimmt die Quantenintensitäten gleii O. W a r b u r g, G. K r i p p a h l u. W. d e r, Z. Naturforschg. 9 b, 66 [1954], Schrö- eher Wirkung /j und J2, so erhält man das Wirkungsspektrum des katalysierenden Lichts: Wx/Wa hlji, wo W j und W 2 die Wirkungsstärken der Wellenlängen 1 und 2 sind. Da aber gleiche Wirkung gleiche Quantenabsorption bedeutet, so ist das Wirkungsspektrum des katalysierenden Lichts gleich dem Absorptionsspektrum des Katalysators. Die Bestimmung dieses Spektrums (Abb. 1) wird im Folgenden beschrieben. Auf Grund dieses Spektrums werden am Schluß dieser Arbeit zwei Carotinoid-Proteide genannt, die als Modelle des Photosynthese-Ferments dienen können: der Sehpurpur, dessen prosthetische Gruppe nach R. A. M o r t o n Vitamin-A-Aldehyd ist, und Ooverdin, dessen prosthetische Gruppe nach R i c h a r d K u h n ein doppeltes Diketol des ^-Carotins ist. 1. O p t i s c h e V e r s u c h s a n o r d n u n g Die Wirkung des Lichts wurde manometrisch mit der 2-Gefäß-Methode bestimmt. In jedes Gefäß mußte gemessenes rotes Licht und gemessenes blau-

2 O. W A R B U R G, 632 G. K R I P P A H L grünes Licht eingestrahlt werden, so daß also 4 Lichtstrahlen erforderlich waren, die getrennt bolometrisch gemessen, aber zu 2 Paaren vereinigt in die Manometriegefäße eingestrahlt wurden. Wie dies mit Hilfe von 2 gewöhnlichen Spiegeln und einem teildurchlässigen Spiegel erreicht wurde, veranschaulicht Abb. 2. UND W. S C H R Ö D E R 2. G l e i c h u n g zur B e r e c h n u n g des Wirkungsspektrums Die Manometriegefäße enthielten bis 10 cmm Zellen in ccm auf einer Fläche von 8,3 cm 2. Bei dieser Flächendichte wurden von dem eingestrahlten roten Licht etwa 3 0 % und von dem eingestrahlten Einer Erläuterung bedarf lediglich die bolometrische Justierung der beiden roten Strahlen und der beiden blaugrünen Strahlen auf gleiche Intensität. Zuerst wurden mit Hilfe der eingezeichneten Blenden die beiden roten Strahlen auf gleiche Intensität justiert. Dann waren, da der teildurchlässige Spiegel Lampe X Lampe feildurchlässiger Spiegel Spiegel ~ Spiegel Trog -1- Blende - Blende zum Bolometer oder zu den Manometrie - Gefäßen hoo m hho hbo m soo 520 m/u Abb. 1. Wirkungsspektrum eines Photosynthese-Ferments. Rot anders teilt als Blaugrün, die beiden blaugrünen Strahlen ungleich, die nunmehr, ohne daß die Blenden geändert werden durften, justiert werden mußten. Dies geschah mit Hilfe des eingezeichneten Trogs, der bei der Justierung des Rot mit reinem Wasser gefüllt war und dem zur Justierung des Blaugrün Chromat zugesetzt wurde, das Rot nicht absorbiert. Als Lichtquelle für Rot diente eine 500 Watt-Metallfadenlampe (Schmalfilmlampe der Osram A.G.), aus der mit Rotscheibe und Interferenzfilter ein Bezirk um 645 mju isoliert wurde. Lichtquelle für Blaugrün war eine 300 Watt-Xenon-Hochdrucklampe der Osram A.G., aus der auf entsprechende Weise die verschiedenen blaugrünen Bezirke isoliert wurden. In beiden Fällen befand sich zwischen Lampe und Filtern 5 cm fließendes Wasser und im Fall des Blaugrüns außerdem 2 cm 1 0 % C u S HoO. Die Leistung beider Lampen wurde durch einen Spannungsgleichhalter konstant gehalten. Abb. 2. Optische Versudisanordnung zur Erzeugung von zwei roten und zwei blaugrünen Strahlen, die getrennt bolometrisch gemessen und zu Paaren vereinigt in die Manometriegefäße eingestrahlt werden. Meßlicht. katalvtisches Licht. blaugrünen Licht etwa 5 0 % von der Summe aller Chlorella-Pigmente absorbiert. Für die Aufnahme des Wirkungsspektrums wäre es am einfachsten gewesen, die Zelldichten so niedrig zu wählen, daß die Intensität des katalysierenden Lichts beim Durchgang durch die Manometriegefäße sich nicht merklich änderte 2. Da jedoch dann die manometrischen Ausschläge zu klein geworden wären, mußte mit erheblicher Absorption des katalysierenden Lichts gearbeitet werden, und es mußten aus den Intensitäten des ein- und austretenden Lichts die mittleren Intensitäten J des katalysierenden Lichts berechnet werden - Jo + J 2 2 Wie es z. B. der Fall war bei Aufnahme des Wirkungsspektrums der Eisenoxvgenase der Zellatmung. Vgl. Biochem. Z. 193, 339 [1928]'; 214, [1929],

3 Dann war in jeder Elementarschicht der Zellsuspensionen die von dem Photosynthese-Ferment absorbierte Quantenintensität des katalysierenden Lichts AJ -- J-ß.c-dx, (1) wo ß der Absorptionskoeffizient des Ferments, c die Konzentration des Ferments und dx der Lichtweg ist. Bestimmt man dann für verschiedene Wellenlängen 1 und 2 die /-Werte, die gleiche katalytische Wirkungen erzeugen, für die also 1, AJ,, so folgt aus (1) J\ ßi Ci dxi J>- ß-> c> dx_>, und wenn wir für ein und dieselbe Zellsuspension setzen ci c 2, dx, dx«, so folgt aus (2) A/A- f - Dies ist unsere Gleichung zur Bestimmung des Absorptionsspektrums des Photosynthese-Ferments. Man beachte, daß man es hier mit zwei verschiedenen Lichtabsorptionen zu tun hat: mit der Absorption durch die Summe der Chlorella-Pigmente, die man mit der Ulbrichtsdien Kugel direkt mißt; und mit der Lichtabsorption durch das PhotosyntheseFerment, die man nicht direkt messen, sondern nur durch das Wirkungsspektrum des blaugrünen Lichts bestimmen kann. Man beachte ferner, daß es bei Ableitung der Gl. (3) nicht korrekt war, die Lichtwege dx bei der Variation der Wellenlängen gleichzusetzen, da wegen der Zerstreuung der Lichtweg zunimmt, wenn man zu kürzeren Wellenlängen übergeht. Dieser Fehler verzerrt das Wirkungsspektrum ein wenig in der Richtung, daß die kurzwelligeren Absorptionskoeffizienten höher erscheinen, als sie wirklich sind. Ein Weg, wie man diesen Fehler experimentell eliminieren könnte, ist in Protokoll II angedeutet. PHOTOSYNTHESE-FERMENTS 633 grün-wirkung der Quotient y - Q ', der in reinem roten Licht 0 bis 0,5 war und bei Zusatz von blaugrünem Licht auf 1, 1 5 bis 1, 2 5 stieg. Bei der Aufnahme des Wirkungsspektrums wurden dann diejenigen Intensitäten verschiedener Wellenlängen bestimmt, die einen gleichen Anstieg von y hervorbrachten. Dabei war es nicht notwendig, daß Ay das maximal durch Blaugrün Erreichbare war, wenn nur Ay für die verschiedenen Wellenlängen gleich war. Als Bezugswellenlänge wählten war willkürlich die Wellenlänge 40 m^, deren Wirksamkeit bei Versuchen mit andern Wellenlängen jedesmal mitbestimmt wurde. (2) Die Zeitintervalle, in denen das blaugrüne Licht hinzugefügt und wieder fortgenommen wurde, betrugen 30 Minuten. Bei dieser Zeiteinteilung wurden keine Induktionszeiten beobachtet, so daß also Anstieg und Abfall von y in Zeiten vor sich gingen, die klein waren gegen 30 Minuten. Doch gilt dies nur für unsere heutigen Züchtungsbedingungen und hängt vielleicht mit dem Überschuß an 5-wertigem Vanadium zusammen. Früher hatten wir Zellen in Händen, für die die positiven und negativen Induktionszeiten länger waren. 4. V a n a d i u m Seit wir im Jahr 1953 das Brunnenwasser bei der Kultur der Chlorella durch doppelt dest. Wasser ersetzt haben 3, war es notwendig, bei der Kultur nach den Vorschriften von A r n o n 4 Mikroelemente zuzusetzen. A r n o n s Mikroelemente A enthalten Eisen, Borsäure, Mangan, Zink, Kupfer und Molybdän; seine Mikroelemente B enthalten Kobalt, Nickel, Chrom, Wolfram und Vanadium. Durch eine kürzlidie Mitteilung von A r n o n 5 ist es wahrscheinlich geworden, daß für die Kultur der Chlorella von der B-Gruppe nur das Vanadium notwendig ist; möglicherweise schaden sogar die anderen Elemente der BGruppe. Jedenfalls züchten wir zur Zeit mit den Mikroelementen A + Vanadium, doch muß die Möglichkeit offen gelassen werden, daß zeitweise auch Kobalt, Nickel oder Chrom notwendig sind. Da das Luminoferment die Reduktion der Kohlensäure bewirkt, so ist das sachgemäße Maß der Blau- Bei den Versuchen mit Vanadium machten wir die methodisch wichtige Feststellung 6, daß die Valenz des zugesetzten Vanadiums von Bedeutung ist. Das blaue Vanadylsulfat V 0 S HoO, in dem das Vanadium 4-wertig ist, wirkt nidit, während das gelbe 3 O. W a r b ü r g, Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 12, 356 [1953]. 4 D. A r n o n, Amer. J. Bot. 25, 322 [1938], 5 D. A r n o n, Nature [London] 12, 1039 [1953] W a r b u r g, G. K r i p p a h l u. W. B u c h h o l z, Z. Naturforschg. 10 b, 422 [1955]. 3. M a ß d e r W i r k s a m k e i t blaugrünen Lichts des

4 O. W A R B U R G, 634 G. K R I P P A H L Metavanadat N a V H 2 0, in dem das Vanadium 5-wertig ist, stark und schnell wirkt. Da an der Luft in neutralen verdünnten Lösungen von Vanadylsulfat langsam 5-wertiges Vanadium entsteht, ist der Unterschied zwischen den beiden Valenzstufen des Vanadiums nur deutlich, wenn die Lösungen frisch bereitet und die Versuche kurz sind. Bei der Feststellung dieser Unterschiede war es ein wesentlicher methodischer Vorteil, daß vanadiumarme Chlorella in manometrischen Versuchen sofort mit einer Zunahme der photochemischen Ausbeute reagiert, wobei wie bei Zusatz blaugrünen Lichts die COo-Aufnahme schneller zunimmt als die E n t wicklung, so daß bei Zusatz von 5-wertigem Vanadium der numerische Wert von y sehr erheblich ansteigt. 1 Z. B. wurden die folgenden y und ^ -Werte erhalten, wenn die Zellen ohne Vanadiumzusatz gezüchtet worden waren und wenn dann kurz vor der Messung des Quantenbedarfs der 30 bis 60 Min. dauerte das Vanadium in einer Menge von 100 y pro l zugesetzt wurde. Das Meßlicht war dabei 546 mju, J 54,3, das katalysierende Licht die blauen Cadmiumlinien der Jupiterlampe, J 0,6. 1 <f Versuch 1 Ohne V-Zusatz + 5-wertiges V 0,1 1, ,2 Versuch wertiges V + 5-wertiges V 0 1,0 15 4,0 Wir züchten zur Zeit mit 100 y 5-wertigem Vanadium pro l Kulturlösung und geben zu den Zellsuspensionen vor dem Einfüllen in die Manometriegefäße noch 100 y 5-wertiges Vanadium pro l Zellsuspension hinzu, beide Zusätze in Form von N a V H 2 0. Um sicher zu gehen, daß die Vanadium-Zusätze optimal sind, mag man sie bei Bestimmungen des Quantenbedarfs variieren. Die andern Salze unserer Kulturlösung sind: 5 g M g S 0 4 H.,0 + 2,5 g K H 2 P g NaCl + 2 g KNOg + 0,5 g Ca(N0 3 ) 2 4 H.,0, zu 1 l aus Quarz dest. Wasser, pn ist etwa 4,2 und steigt im Lauf der Kultur an. Die Stammlösung der A r n o n sehen Mikroelemente A hat die Zusammensetzung: 500 mg F e S 0 4 H mg F e ( N 0 3 ) 3 9 H mg H B 0 3 D e a n B u r k, Fed. Proe. 12, 611 [1953], UND W. S C H R Ö D E R mg M n S H mg Z n S 0 4 HoO + 8 mg C u S HoO + 2 mg (NH 4 ) B Mo HoO, zu 1000 ccm n/200 H 2 S0 4. Vor der Beimpfung der Zuchtkolben werden 2 ccm der Stammlösung zu 250 ccm Kultursalz-Lösung gegeben. Wir züchteten an einem Südfenster unter Zusatz einer 200 Watt-Metallfadenlampe, die in 20 cm Entfernung von den Kulturflaschen aufgestellt war. Zeitweise, in der dunklen Jahreszeit, züchteten wir unter Zusatz einer 100 Watt-Metallfadenlampe, die in 24 Stdn. 8 Stdn. nicht brannte. Noch immer gibt es wichtige Kultureinflüsse, die wir nicht kennen und die herauszufinden zur Zeit zu den Hauptaufgaben der Photosynthese-Forschung gehört. Z. B. können wir die guten Ausbeuten, die wir in den Jahren 1951 und 1952 regelmäßig in Bicarbonat-Carbonat bei PH 8,8 erhalten haben, heute nicht mehr erhalten. Wahrscheinlich enthielt das Brunnenwasser, das damals zur Kultur verwendet wurde, außer unsern heute verwendeten Mikroelementen noch ein anderes Mikroelement. 5. W a c h s t u m D e a n B u r k hat darauf aufmerksam gemacht, daß bei unseren Versuchen von 1950 die Energieausbeute bei der Photosynthese um so größer war, je größer der numerische Wert des Quotienten COo y - war; daß man die besten Ausbeuten bei y 1, 3 findet und daß die Ausbeuten bei y 0, 8 2 wesentlich schlechter sind. Diese Erfahrung ist in den letzten Jahren durchweg bestätigt worden. Zur Erklärung führt B u r k an, daß die Umwandlung von Kohlenhydrat in Protein oder Fett mit großen Energieverlusten verbunden ist, wie man aus den Arbeiten von P a s t e u r über Hefe und aus der Tierphysiologie weiß. Folgendes läßt sich über diese Zusammenhänge sagen: W^enn die Kohlensäure in zwei Stufen reduziert wird, zuerst in der reduktiven Carboxylierung zur Stufe der Ameisensäure CO,» + 2 H + R CHO RCHOHCOOH und dann in der Reduktion der Carboxylgruppe zur Stufe des Zuckers R CHOH COOH + 2 H R CHOH CHO + HoO. so ist 8 O. W a r b ü r g u. D e a n B u r k, Arch. Biochemistry 25, 410 [1950].

5 für die erste Reduktionsstufe y 2,0, für die zweite Reduktionsstufe 0, für beide Reduktionsstufen zusammen y 1, 0. Für alle weiteren Reduktionen, z. B. von Zucker zu Protein, ist y 0, so daß also y sinkt, wenn zur Photosynthese Proteinbildung hinzukommt. Aus diesen Überlegungen folgt jedoch nicht, daß der Quantenbedarf der Sauerstoffentwicklung in der Bilanz steigen muß, wenn wie bei der Proteinbildung die Kohlensäure durch einen anderen Wasserstoffacceptor ersetzt wird. Das Steigen des Quantenbedarfs mit sinkendem y ist also lediglich eine Erfahrungstatsache. Sucht man nach einer Erklärung, so ist daran zu denken, daß ein Teil der Energie der induzierten Atmung für die sekundären Stoffwechselvorgänge abgezweigt wird, so daß zur Wiederherstellung der Sauerstoffkapazität mehr Sauerstoff zurückreagieren muß, wenn Zucker der Wasserstoffacceptor ist, als wenn C 0 2 der Wasserstoffacceptor ist. Wie dies nun auch sein mag, jedenfalls ist ein Quantenbedarf, den man findet, nur dann der Quantenbedarf der Photosynthese, wenn y 2,0 bis 1, 0 ist; wenn also das Wachstum gegen die Photosynthese zu vernachlässigen ist. Die praktische Konsequenz dieser Überlegungen ist, daß man darauf bedacht sein wird, zur Messung der Photosynthese Zellen zu benutzen, die unter den Bedingungen der Messungen möglichst wenig Protein bilden, d. h. möglichst wenig wachsen. Man könnte sich denken, daß dies mit einer geeigneten Auswahl von Mikroelementen erreicht werden kann, indem man zum Beispiel vor der Messung alle Mikroelemente fortwäscht und dann nur solche Mikroelemente, die mit der COo-Reduktion zu tun haben, zusetzt. A n m. b. d. K o r r. : Nach einer kürzlich erschienenen Arbeit von T o 1 b e r t * bildet Chlorella bei der Photosynthese Glykolsäure, für deren Entstehung aus CO., und COo H 2 0 y 1,33 ist. Man könnte also unsere Erfahrungen dahin zusammenfassen, daß die Ausbeuten am besten bei der Glykolsäurebildung sind, d. h. bei dem Vorgang, bei dem die Kohlensäure der alleinige HAcceptor ist. 6. Q u a n t e n b e d a r f b e i d e r A u f n a h m e des W i r k u n g s s p e k t r u m s Da eine gute Energieausbeute eine Gewähr dafür ist, daß die Chlorella richtig gezüchtet worden ist; daß die Lichtwirkung linear zur Licht-Intensität ist; und daß Wachstum und andere sekundäre Stoff* N. E. T o l b e r t, Fed. Proc. 14, 292 [1955], P HOTO SY N T H E S E - F E R M E N T S Wellenlängen Quantenintensitäten gleicher Wirkung Auf 40 mm bezogenen Wirkungsstärken [cmm Quanten pro Minute] [m/t] <>3f) 20 3,2 1, 0,5 1,05 2,0 15,0 30,0 Wx W 0 0,05 0,33 0,62 1,85 1,00 0,39 0,02 0,035 Tab. 1. Meßlicht 645 m u, J 1 cmm Quanten pro Minute. Wechselvorgänge gegen die Photosynthese zu vernachlässigen sind, so sollte bei der Aufnahme des Wirkungsspektrums aus methodischen Gründen der Quantenbedarf gemessen werden, obwohl der Quantenbedarf in der Gleichung zur Berechnung des Wirkungsspektrums nicht vorkommt. Der Quantenbedarf pro Mol. Sauerstoff war bei unsern Versuchen ohne Berücksichtigung der Atmung 4,5 bis 5,5 und mit Berücksichtigung der Atmung 3,8 bis 4,, falls genügend Blaugrün zugesetzt wurde. Ohne Blaugrün war der Quantenbedarf ein Mehrfaches davon. Würde man mit dünneren Zellsuspensionen arbeiten, so würde die Atmung weniger ausmachen, doch würden dann die manometrischen Ausschläge für die Aufnahme des Wirkungsspektrums zu klein werden. Die Atmung würde ferner weniger ausmachen, wenn man Grün anstatt Rot als Meßlicht benutzen würde, da die Wirkung des Grün bis zu höheren Intensitäten linear bleibt (Protokoll III). Doch ist bei der Aufnahme des Wirkungsspektrums aus optischen Gründen rotes Meßlicht vorzuziehen, wie in Abschnitt 8 näher begründet wird.. Wirkungsspektrum In Protokoll I ist die Bestimmung der katalytischen Wirkungsstärken für die Wellenlängen 440 m^, 45 m// und 40 mju mit allen experimentellen Einzelheiten beschrieben. Im ganzen haben wir die katalytischen Wirkungsstärken von 8 blaugrünen Wellenlängen bestimmt, wobei immer 645 m/.i das Meßlicht war. Das Ergebnis findet man in Tab. 1 und graphisch in Abb. 1. Wie man aus der Abb. 1 sieht, hat das Wirkungsspektrum ein scharfes Maximum um 460 mji und fällt ziemlich gleidimäßig nach beiden Seiten ab.

6 696 O. W A R B U R G, G. K R I P P A H L Zum Vergleich wurde unter gleichen Bedingungen der Zelldichte mit gleichen Volumina Zellsuspension in den gleichen Manometriegefäßen das Absorptionsspektrum einer Chlorella-Suspension mit Hilfe der Ulbrichtschen Kugel aufgenommen und so das Absorptionsspektrum der Summe aller Chlorella-Pigmente für lebende Chlorella erhalten (Abb. 3). Wie man aus Abb. 3 sieht, hat das Absorptionsspektrum der Chlorella eine andere Form als das Wirkungsspektrum des Photosynthese-Ferments. In Protokoll II findet man experimentelle Einzelheiten über die Aufnahme dieses Spektrums sowie eine Bemerkung über den Einfluß der Zerstreuung auf die Form des Spektrums.! 8c mm Zellen ccm F-S3acm Oft V Q2 \ o WO WO WO WO WO m/u»- Abb. 3. Absorptionsspektrum lebender Chlorella, aufgenommen mit der Ulbriehtsdien Kugel. 8. G r ü n a l s Meßlicht Läßt man bei der Aufnahme des Wirkungsspektrums die Wellenlängen von 501 auf 520 m/u zunehmen, so sinkt nach Abb. 1 die Wirkungsstärke auf etwa die Hälfte. Nimmt man an, daß bei einer weiteren gleichen Zunahme der Wellenlänge die katalytische Wirkungsstärke wiederum auf die Hälfte sinkt, so wäre die Wirkungsstärke der grünen Quecksilberlinie 546 mp etwa 0,01, d. h. eine Quantenintensität J 100 der Wellenlänge 546 m/u müßte merklich katalytisch wirken. Da nun Grün von Chlorophyll nur schwach absorbiert wird und man deshalb, wenn Grün das Meßlicht sein soll, große Intensitäten einstrahlen muß, so ist mit grünem Meßlicht die katalytische Wirkung des blaugrünen Lichtes nicht so deutlich zu demonstrieren wie mit rotem Meßlicht. In Protokoll I I I ist ein Versuch mit Grün als Meßlicht beschrieben, bei dem 100 cmm Quanten der * S. B a 11, T. W. G o o d w i n u. R. A. M o r t o n. Nature [London] 153, 405 [1944]; Bioch. J [1948], UND W. S C H R Ö D E R Wellenlänge 546 m/u pro Minute eingestrahlt wurden. y sank dann in dem reinen grünen Licht nicht auf 0, sondern nur auf 0, 8 und stieg bei Zusatz von Blaugrün (/ 0,6) auf 1, 1 an. Ay war also nur 0,3, während es mit Rot als Meßlicht etwa 1,0 gewesen wäre. Der Quantenbedarf mit Grün + Blaugrün war 4,4 und stieg bei Fortnahme des Blaugrüns auf, während, wenn Rot das Meßlicht gewesen wäre, der Quantenbedarf bei Fortnahme des Blaugrüns auf etwa 14 gestiegen wäre. 9. M o d e 11 e Vergleichen wir das Wirkungsspektrum des Photosynthese-Ferments mit dem Spektrum der ChlorellaPigmente, so scheidet das Chlorophyll wegen seiner Bande im Rot aus. Die Carotinoide und Flavine der Chlorella absorbieren zwar wie das Ferment im wesentlichen im Blaugrün, aber die Spektren der aus Chlorella extrahierten Carotene, Xanthophylle und Flavine weichen nach der blauen Seite wesentlich von dem Wirkungsspektrum des Photosynthese-Ferments ab. Im übrigen würde uns bei der Suche nach einem Modell des Ferments die Übereinstimmung der Absorptionsspektren nicht genügen. Das Pigment, das wir suchen, muß außerdem eine Proteinverbindung sein, da es ein Ferment ist; es muß ferner im Licht schnell chemisch verändert werden und muß im Dunkeln schnell zu seiner Vorstufe zurückreagieren, da die Blaugrün-Wirkung schnell auftritt und bei Fortnahme des Blaugrüns schnell wieder verschwindet. Bestehen wir auf diesen 4 Forderungen, von denen die beiden letzten sehr speziell sind, so bleibt von allen bekannten Pigmenten nur der Sehpurpur übrig, der nach M o r t o n * eine Verbindung von Vitamin AAldehyd mit einem Protein, also ein CarotinoidoProteid, ist und der die Forderung der schnellen reversiblen Lichtreaktion erfüllt, die seine physiologische Funktion ist, und der durch den Wechsel Alkohol Aldehyd Wasserstoff übertragen kann. Von andern möglichen Modellen möchten wir die von R i c h a r d K u h n * * untersuchten Carotinoido-Proteide erwähnen, als deren prostetische Gruppe K u h n das Astaxanthin erkannte, ein doppeltes a-ketol, das Wasserstoff durch den Übergang Ketol Diketon übertragen kann und das in den Hummereiern (Maximum 40 mu), aber auch hier besonders wichtig - in der Grünalge Hämatococcus pluvialis gefunden ** R. K u h n, J. S t e n e u. N. A. S ö r e n s e n. Ber. dtsch. chem. Ges. 2, 1688 [1939].

7 1 worden ist. Allerdings ist von diesen Proteiden nodi nicht gezeigt worden, daß sie wie der Sehpurpur schnell und reversibel auf Licht reagieren. '645 " 1 '645 + M e ß l i c h t 645 m w D i e P u n k t e 4 4 0, 4 5 u n d 4 0 mu d e s Wirkungsspektrums Z e l l e n : 1-tägige Kultur, Südfenster WattMetallfadenlampe. In Kultursalzlösung + Mikroelemente A + wenig 5-wertiges Vanadium. In 5 CO. 10 O.,, 85 Argon. Saat 60 cmm pro 250 ccm, Ernte 304 cmm. PH 5,2. Vor der Messung 100 y 5-wertiges Vanadium als NaV0 3 4 H 2 0 zugegeben. M a n o m e t r i e : Gefäßpaar, Kästchen. Eingefüllt ccm Zellsuspension, die je 8,5 cmm Zellen enthielten. Temperatur 20. Gasraum 5 C0 2, 10 O,, 85 Argon. 90 Min. vorbelichtet, wo J die pro Minute eingestrahlten Quanten bedeuten. Kleines Gefäß: t/ 16,59, u' F,00, k'qi 0,931, k'cot 1,519. Großes Gefäß:,00, ka< 1,3, & c o > 1,965. x 0 j H',43 H- 9,61, *CO.. -H' 10,6 + H- 15,6 L i c h t a b s o r p t i o n, gemessen mit der Ulbrichtschen Kugel, in den Manometriegefäßen. a; ist der absorbierte Bruchteil des eingestrahlten Lichts, der Wellenlänge /. mm anfangs ,605 0,51 0,50 0,28 lo ^ 4 5 ' «45?) 2 wo für das Meßlicht die Zunahme von a 645 im Lauf des Versudis durch geradlinige Interpolation berücksichtigt wurde, während für das katalysierende Licht die Zunahme der Lichtabsorption zu vernachlässigen war. Protokoll I ( ) v 21,54, 63 P H O T O S Y N T H E S E - F E R M E N T S Ende 0,34 Nach 90' Vorbelichtung Großes Gefäß mm Brodie Kleines Gefäß mm Brodie J645 16,9 Ji40 2,1 J440 1,4 Jß45 ^440 / ,08 0,5 J645 16,9 ohne Blaugrün 3645 J440 J ,5 30' + 4, 5 +,0 16,9 0,4 30' + 5,0 0,502 9,0 J645 16,9 /45 0,58 0,43 ^ 45 9,0 J 15 16,9 LÖ 1,03 /45 0,3 10,0 J645 16,9 /40 1,28 ^40 1,1 c COf cco lco 8,8 + lo, 11,0 6,2 1,09 co ,0 ^.Tco., 34 " 0,8 ' 16,9 1,4 1,1 ^645 ^40 ^40 * >4 *co , ,89-9,0 38,3 42,9 1,1 4,5 *0, + 28,6 co 2 32,5 1,14 x a> + 35,9 l c o 43 1,20 Xq lco, + 10,0 ) x. + 35,9 43 6,0 4,9 5,1 1,20 woraus folgt, daß etwa gleich wirken: J^o 1,1; Jao 1,0; h5 0,5. Protokoll II ( ) M i t t l e r e I n t e n s i t ä t des katalysierenden LichtsJ - J + J (1 - rt) 2 wo J die eingestrahlte und J (1 a) die austretende Quantenintensität bedeutet. Q u a n t e n b e d a r f : Bei der Berechnung wurde nur der aus der Zelle austretende Sauerstoff berücksichtigt, also die Atmung vernachlässigt. Von dem katalysierenden Licht wurde nur der vom Chlorophyll absorbierte Bruchteil eingesetzt, also zum Beispiel, wenn in t Min. XQ2 cmm Sauerstoff aus der Zelle entwickelt waren: Absorptionsspektrum lebender Chlorella Ist bei der Messung mit der Ulbrichtschen Kugel J 0 die in die Zellsuspension eingestrahlte und J die austretende Licht-Intensität, so setzen wir Jt Ji0 e b d, wo b der Absorptionskoeffizient und d der Lichtweg ist. Variiert man die Wellenlänge und läßt das Volumen der Zellsuspension und die Dichte der Zellen konstant, so ist

8 638 In (JolA bx'dy In (JolJh b, do nometriekästchen eingefüllt, dessen Grundfläche 8,3 cm2 betrug. Wir fanden: Anders als im Fall von Lösungen ist hier wegen der Änderung der Zerstreuung mit der Wellenlänge d1 nicht d0, sondern d nimmt zu, wenn man zu kürzeren Wellenlängen übergeht. In J J ] als Funktion der Wellenlänge aufgetragen, ergibt also eine Kurve, die wegen der Zerstreuung über der wahren Absorptionskurve der Pigmente liegt, um so mehr, je kürzer die Wellenlängen sind. In derselben Weise ist das Wirkungsspektrum des Ferments das ja gleichfalls mit lebender Chlorella aufgenommen ist in Richtung Blau verzerrt. Um zu ermitteln, wieviel diese Verzerrung ausmacht, bestimmten wir mit der Ulbrichtschen Kugel lnjq// einmal für lebende Zellen und dann für einen Methanolextrakt der gleichen Zellen bei gleicher Pigmentkonzentration in den gleichen Gefäßen. Für ccm auf einer Fläche von 8,3 cm2 bei einer Zelldichte von 2,5 cmm Zellen pro cm3 fanden wir: 645 m/(, Lebende Zellen. J/J' 6,23, In y - 1, m,«, Methanol-Extrakt. J'JJ' 5,38, In j? 1, Zellen 1,03 Extrakt 546 m,«. Lebende Zellen. P H O T O S Y N T H E S E - F E R M E N T S <>3f) J'JJ' 1,3, In 546 m,«. Methanol-Extrakt J'JJ' 1,41, In Jo J Zellen Extrakt 0,548 0,349 1,5, d. h. die Zerstreuung machte bei 645 ma wenig aus, bei 546 m«jedoch so viel, daß der Lichtweg in der Zellsuspension 1,5-mal so groß war wie in der Lösung. Dabei machen wir die wahrscheinliche Annahme, daß die Absorption der Pigmente durch ihre Bindung in der Zelle nur wenig geändert wird, zumal die Differenzen bei den kürzeren Wellenlängen auftreten. Aus diesen Überlegungen folgt, daß das Absorptionsspektrum der lebenden Chlorella durdi zwei Einflüsse zustande kommt, durch die Änderung der Pigmentabsorption mit der Wellenlänge und durch die Änderung der Zerstreuung mit der Wellenlänge. Die Zellen stammten aus einer 1-tägigen SüdfensterKultur Watt-Metallfadenlampe. 8 cmm Zellen, suspendiert in ccm Kulturlösung, wurden in ein Ma- m,«jo/j In JJJ In (JoIJ)ä : In (JjJ)u ,11 2,08 2,34 2,43 1,95 1,91 1,9 1,505 1,19 1,085 1,18 1,24 1,31 1,38 1,46 1,0 0,4 0,32 0,85 0,888 0,60 0,64 0,582 0,409 0,14 0,082 0,165 0,215 0,20 0,322 0,38 0,531 0,842 0,825 0,983 1,000 0,62 0,28 0,655 0,460 0,196 0,092 0,186 0,242 0,304 0,362 0,438 0,59 Protokoll III ( ) Grün als Meßlicht Z e l l e n : 2-tägige Kultur, Südfenster WattMetallfadenlampe. In Kultursalzlösung + Mikroelemente A. In 5 CO.,, Argon. Saat 30 cmm Zellen in 250 ccm. Ernte 610 cmm. ph 5,6. Mit Kulturlösung auf cmm : ccm verdünnt. Vor der Messung 100 y 5-wertiges Vanadium als NaV0 3 4 H.,0 zugegeben. M a n o m e t r i e : Wie Protokoll I. M e ß 1 i c h t : Hg-Linie 546 m«, aus 500 Watt-HgHochdrucklampe, 2 cm 10% CuS0 4 5 H, mm Orangeglas I von Schott + 10 mm Didymscheibe. Die Filterscheiben befanden sich in fließendem Wasser, da sie ihre Durchlässigkeit bei Erwärmung erheblidi ändern. B l a u g r ü n : 60 Watt-Cadmiumrohr von Heraeus Hanau ( Jupiterlampe"), in 100 cm Entfernung von den Manometriegefäßen, + 2 mm Blauglas 23 von Schott. Eingestrahlte Intensität J aktinometrisch gemessen, indem das Versuchsgefäß im Thermostaten durch ein Aktinometergefäß gleicher Dimensionen ersetzt wurde. J 0,6 cmm Quanten pro Minute (ist m,u). L i c h t a b s o r p t i o n : Der absorbierte Bruchteil a des grünen Lichts wurde mit der Ulbriditschen Kugel am Anfang und am Ende des Versuchs gemessen. Anfang a 0,132, Ende a 0,148. Die Absorption für die dazwischenliegenden Zeiten wurde durdi geradlinige Interpolation berechnet. B e r e c h n u n g des Q u a n t e n b e d a r f s : Die absorbierte Intensität des blaugrünen Lichts konnte vernachlässigt werden. Wurden von dem Meßlicht J cmm Quanten pro Minute eingestrahlt und wurden in t Min. x0., cmm Sauerstoff aus der Zelle entwickelt, so war der Quantenbedarf (hiß «Mo) t XÖ -2 Die Atmung wurde also vernachlässigt.

9 SAUERSTOFFKAPAZITÄT Großes Gefäß 101 W + 20,5 blaugr. 0,6/ /540 J /546 ^blauer. h ' J 101 /blauer. /ö46 /blaugr. 30' + 14,5 0, ' + 16,5 0 / Kleines Gefäß O, / ,5 * C O, ,12 4,3 55 Oo 29,5 x co., 45 0,82 x 0 i + 56 X CO, y _ 4 6 0, / blaugr. 30' + 15,5 0,6 / /546,6 /, 101 /blaugr. 639 CHLORELLA + 34 Oo CCOO ,5 \xl c{ o 56 0,92 30' ,6 A co : ,26 1,13 30' + 1 /blaugr.,4 X^ y 32,0 CO 109-4,3 (p 1, ,0 DER 1,13 <P 4,4 Der pro Stunde aus den Zellen entwickelte Sauerstoff betrug hierbei das 26-fadie Zellvolumen, wenn das Blaugrün zugegeben wurde, und das 16-fache Zellvolumen, wenn das Blaugrün fortgenommen wurde. Versuche über die Sauerstoffkapazität der Chlorella Von OTTO WARBURG u n d WALTER SCHRÖDER Aus dem Max-Planck-Institut für Zellphysiologie, Berlin-Dahlem (Z. Naturforschg. 10 b, [1955]; eingegangen am 12. September 1955) Versuche über die Wirkung von 0.,-Mangel und von Phenanthrolin auf die O.,-Kapazität der Chlorella. Beziehungen der O.,-Kapazität der Chlorella zum Chlorophyll. D ie 0 2 -Kapazität der Chlorella 1 ist ihr Gehalt an photodissoziierbarem 0 2, der durch kurze starke Belichtung unter Bedingungen bestimmt wird, unter denen die Nachbildung der Kapazität langsam ist. Diese Oo-Kapazität der Chlorella hängt von ihrem Chlorophyllgehalt ab und ist bis zu den Chlorophyllgehalten, die 4 %, bezogen auf Trockengewicht, nicht übersteigen, etwa gleich dem Chlorophyllgehalt. Wenn zum Beispiel 100 cmm Chlorella 10 Mole Chlorophyll enthalten, so enthalten sie etwa 10// Mole an photodissoziierbarem Oo, woraus man schließen muß, daß der 0 2, der hei der Photosynthese aus den grünen Zellen entwickelt wird, aus dem Chlorophyll entwickelt ivird. Wir werden untersuchen, ob ein Zusammenhang besteht zwischen der 0 2 -Kapazität und dem isocyclischen Ring des Chlorophylls, und wir erinnern uns dabei der Entdeckung von C o n a n t 2, daß der isocyclische Ring des Chlorophylls unter gewissen Bedingungen 1 Mol. Oo absorbiert; und der Vermutung von H. F i s c h e r 2 *, daß das Kohlenstoffatom 10 des isocyclischen Rings fähig ist, ein Peroxyd zu bilden. Die 0 2 -Kapazität der Chlorella, die so groß ist wie die 0 2 -Kapazität des Blutes, ist dadurch entdeckt worden, daß es gelang, die Nachbildung der Kapazität so zu verlangsamen, daß die Austreibung der Kapazität und ihre Nachbildung zeitlich getrennt werden. Bei den im Folgenden beschriebenen Versuchen wird die Oo-Kapazität mit kontinuierlichem Licht in etwa 5 Min. ausgetrieben, während die Nachbildung der Kapazität 10 bis 20 Min. in Anspruch nimmt. Das Medium bei diesen Versuchen war die Salzlösung, in der die Chlorella kultiviert wird, die aber als Stickstoffquelle Ammoniumchlorid an Stelle von Nitrat enthielt, die kein Calcium enthielt, deren PH 3,8 an Stelle von 4,3 war und die mit 1 0 % anstatt mit 5 % C 0 2 gesättigt war. Wir überzeugten uns davon, daß diese Abweichungen von der normalen Zusammensetzung der Kulturlösung die Zellen nicht schädigten. Wurden die Zellen nach der Austreibung der Kapazität in das normale Kulturmedium zurückgebracht, so vermehrten sie sich unter den normalen Kulturbedingungen ohne Verzögerung gegenüber den Kontrollen. 1 O. W a r b u r g, G. K r i p p a h l, W. S c h r ö d e r u. W. B u c h h o l z, Z. Naturforschg. 9 b, 69 [1954], 2 J. B. C o n a n t, Science [New York] 3, 268 [1931]. 2a H. F i s c h e r, Chemie des Pyrrols, II, 2. S. 25. Akad. Verlags-Ges., Leipzig 1940.