Transfusionsmedizin. Universitätsmedizin. Georg-August-Universität Göttingen. Vorlesungsbegleitendes Skript

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1 Universitätsmedizin Georg-August-Universität Göttingen Zentrum Hygiene und Humangenetik Abteilung Transfusionsmedizin Transfusionsmedizin Vorlesungsbegleitendes Skript Version vom , Drucklegung 02/2011

2 2 Mit freundlicher Unterstützung des "Vereins zur Förderung der Forschung und Entwicklung in der Transfusionsmedizin e.v."

3 3 Inhaltsverzeichnis 1. BLUTGRUPPENSEROLOGIE Allgemeines ABO-System Biochemie und Genetik des ABO-Blutgruppensystems Erworbenes B-Antigen und Verlust der A B H-Antigene Rh-System Allgemeines Genetik, Biochemie und Aufbau der Rh-Antigene D-Varianten und D weak Nomenklaturen im Rh-System Transfusionsmedizinische Regeln für den Rh-Faktor D Transfusionsmedizinische Bedeutung von C, c, E, e und C w Rh-Antikörper bei Patienten weitere Blutgruppenmerkmale Kell-System Duffy-System Kidd-System MNSs-System Immunhämatologische Diagnostik Blutgruppenbestimmung Richtlinien Durchführung der ABO-Blutgruppenbestimmung Bestimmung des Rh-Faktors D bei Patienten Bestimmung des Rh-Faktors D bei Blutspendern Bestimmung weiterer Blutgruppenmerkmale Antikörpersuchtest Direkter und indirekter Anti-Humanglobulin-Test (AHG-Test) Direkter AHG-Test Indirekter AHG-Test Transfusionsvorbereitung Bed side-test Morbus haemolyticus neonatorum (MHN) Neonatale Alloimmunthrombozytopenie (NAIT) Automimmunhämolytische Anämie BLUT UND BLUTDERIVATE Blut und seine Bestandteile Allgemeine Prinzipien zur Herstellung Präparateherstellung aus der Vollblutspende Prinzip der Apherese Lagerung und Stabilität der einzelnen Blutkomponenten Therapie mit Blutkomponenten Erythrozytenkonzentrate Thrombozytenkonzentrate 34

4 Gefrorenes Frischplasma Stammzellen UNERWÜNSCHTE WIRKUNGEN Akute unerwünschte Wirkungen Hämolytische Transfusionsreaktionen Intravasale Hämolyse Extravasale Hämolyse Klinik und Therapie der hämolytischen Transfusionsreaktion Febrile nichthämolytische Transfusionsreaktionen Allergische Transfusionsreaktionen Urtikarielle Transfusionsreaktionen Embolie Hypervolämie Transfusionsassoziierte akute Lungeninsuffizienz (TRALI) Verzögerte Transfusionsreaktionen Verzögerte hämolytische Transfusionsreaktion Erstimmunisierung Boosterung eines Antikörpers Transfusionshämosiderose Graft-versus-host-Reaktion (GvHD) Posttransfusionelle Purpura (PTP) INFEKTIONEN Virale Infektionen Hepatitisviren Hepatitis B Hepatitis C Retroviren Cytomegalievirus (CMV) Bakterien Treponemen - Syphilis Parasitosen Malaria Prionen Maßnahmen zur Reduktion von Nebenwirkungen durch Transfusionen RECHTLICHE GRUNDLAGEN Dokumentation Rückverfolgungsverfahren und Meldepflichten Qualitätsmanagement Gesetze und Richtlinien 54

5 5 1. BLUTGRUPPENSEROLOGIE 1.1 Allgemeines Blutgruppen sind genetisch determinierte ( antigene ) Merkmale von Erythrozyten, aber auch von Leukozyten und Thrombozyten. Mittlerweile sind für die Erythrozyten über 600 verschiedene Blutgruppenmerkmale in über 20 Blutgruppensystemen bekannt. Biochemisch handelt es sich um Kohlenhydrate (Oligosaccharide) oder um Polypeptide, die an Membranlipide gebunden oder über hydrophobe Anteile in die Lipidschicht der Membran integriert sind (Abb. 1). Abb. 1 Die Erythrozytenoberfläche trägt darüber hinaus viele negativ geladene Gruppen, überwiegend Neuraminsäure, die an Membranpeptide gebunden ist. Die dadurch bewirkte negative Nettoladung der Erythrozytenoberfläche heißt Zetapotential. Sie ist die Ursache für die hohe Suspensionsstabilität von Erythrozyten und verhindert eine stärkere Annäherung der Zellen aneinander. Diese negative Ladung behindert auch die Agglutination durch inkomplette IgG-Antikörper (s.u.), da diese den durch die negative Ladung bedingten physiologischen Abstand zwischen Erythrozyten nicht ohne Hilfe überwinden können. Im Routinebetrieb erfolgen Blutgruppenbestimmungen schnell und sicher mit Hilfe der Hämagglutination, die durch Zugabe von Antiseren bestimmter Blutgruppenspezifität erreicht wird. Die entsprechenden Antikörper sind entweder in der Lage, direkt eine Agglutination (Verklumpung der Erythrozyten) durch Brückenschlag von einer Zelle zur anderen herbeizuführen, oder sie binden nur an die Erythrozytenoberfläche, ohne zu einer Agglutination zu führen. Im letzteren Fall können die an die Erythrozytenoberfläche gebundenen Antikörper mit Hilfe eines agglutinierenden Antihumanglobulin-(AHG)-Serums (Coombsserum) nachgewiesen werden. Dieses bewirkt eine Brückenbildung zwischen den an der Erythrozytenoberfläche gebundenen Antikörpern (Abb. 2). Mit proteolytischen Enzymen (Bromelin, Papain, Trypsin, Pronase etc.) können Peptide, die u.a. Träger der Neuraminsäure sind, von der Membran abgespalten werden. Dieses führt zu einer verbesserten Annäherung der Zellen durch den Verlust der negativen Ladung an der Erythrozytenoberfläche. Allerdings gehen dabei auch bestimmte Blutgruppenantigene verloren, wie z.b. die Antigene des MNSs- und Duffy-Blutgruppensystems. Andererseits wird

6 6 durch diesen Enzymansatz der Nachweis von Antigenen und Antikörpern des ABO- und des Rh-Blutgruppensystems verbessert. Kompletter Antikörper (IgM) Abb. 2 Inkompletter Antikörper (IgG) Unter den Antikörpern mit Blutgruppenspezifität unterscheidet man Allo-Antikörper von Auto- Antikörpern. Allo-Antikörper bildet ein Mensch gegen Blutgruppenmerkmale, die er selbst nicht besitzt. Diese können nach Transfusionen oder im Rahmen einer Schwangerschaft auftreten. Allo-Antikörper sind irreguläre oder Immun-Antikörper. Dagegen sind Isoagglutinine des ABO-Systems (Anti-A und Anti-B) natürliche, reguläre Antikörper, d.h. sie werden ohne Kontakt mit fremden Erythrozyten gebildet. Auto-Antikörper sind Antikörper gegen ein meist hochfrequentes erythrozytäres Antigen, das eine Person selber trägt. Die Blutgruppenantikörper sind in der Regel vom IgM- oder IgG-Typ, bzw. ein Gemisch von beiden. Nach einer erfolgten Immunisierung werden zunächst IgM-Antikörper gebildet, später dann IgG-Antikörper. Die Isoagglutinine (Anti-A und Anti-B) liegen in der Regel als IgM- Antikörper vor. Dagegen sind die Antikörper des Rhesus-Systems fast ausschließlich irreguläre Immun-Antikörper der IgG-Klasse. IgG-Antikörper sind, im Gegensatz zu den IgM- Antikörpern, plazentagängig und können von der Mutter auf den Foeten übertragen werden. Ein Morbus haemolyticus neonatorum (MHN) tritt auf, wenn die Mutter IgG-Antikörper gegen ein Blutgruppenmerkmal des Foeten bildet. Je nach Reaktionsoptimum unterscheidet man Kälte- und Wärmeantikörper. Kälteantikörper, wie die natürlichen IgM-Antikörper im ABO-Blutgruppensystem reagieren am besten bei 4 C. Wärmeantikörper, die zumeist IgG-Antikörper sind, reagieren am besten bei 37 C. Kälteantikörper vom IgM-Typ nennt man auch komplette Antikörper, weil sie ohne Zugabe von reaktionsverstärkendem Hilfsstoff, dem sogenannten Supplement, direkt agglutinieren können. Dagegen lösen die Wärmeantikörper vom IgG-Typ meist erst nach Zugabe von Supplement Agglutinationen aus, weshalb sie als inkomplett bezeichnet werden. Wenn ein Kälteantikörper noch bei 37 C wirksam ist, spricht man von einer breiten Wärmeamplitude. Am bedeutendsten sind Antikörper, wenn sie unter physiologischen Bedingungen, d.h. bei 37 reagieren (Abb. 3).

7 7 IgM-Antikörper IgG-Antikörper Molekulargewicht D D Antigen-Bindungsstellen 10 2 Überbrückungsstrecke > 300 Ångström ca. 140 Ångström Komplementaktivierung Gut mäßig (IgG1 und IgG3) Serum-Konzentration mg/dl mg/dl Placenta-Passage Nein ja Biologische Halbwertszeit 5 Tage Tage Reaktionsoptimum Kälte (Testung in NaCl-Milieu) Wärme (Testung durch Zugabe von Supplement oder mittels Coombstest) Beispiele Anti-A, Anti-B Anti-D, Anti-K, Anti-E Abb. 3: Vergleich zwischen IgM- und IgG-Antikörpern Die Reaktion eines spezifischen Antikörpers mit dem korrespondierenden Antigen führt zunächst zu einem Antigen-Antikörper-Komplex. Dieser Komplex kann nach Komplementaktivierung zur direkten Zerstörung der Erythrozytenmembran führen (intravasale Hämolyse). Andererseits induzieren Antigen-Antikörper-Komplexe eine Phagozytose durch das Milz- Makrophagen-System. Die Anlagerung von Antikörpern an Erythrozyten führt in vivo nicht zur Bildung von Agglutinaten. Dagegen können im Labor blutgruppenserologische Antigen-Antikörper- Reaktionen optisch in Form einer Erythrozyten-Agglutination oder einer Hämolyse sichtbar gemacht werden. Da Antikörper der IgG-Klasse den Abstand zwischen zwei Erythrozyten nur schlecht überbrücken können und somit in der Regel keine Agglutination auftreten kann, bedient man sich verschiedener Hilfsmittel, um die stattgefundene IgG-Bindung an den Erythrozyten durch Agglutinatbildung nachzuweisen: 1. Enzymbehandlung der Erythrozyten (z.b. mit Bromelase, Papain), die zur Abspaltung von Peptiden und daran gebundener Neuraminsäure auf der Erythrozytenoberfläche führt. Dadurch verringert sich die negative Ladung auf der Erythrozytenoberfläche und die Erythrozyten können sich einander besser annähern. 2. Änderung der Dielektrizitätskonstanten des Suspensionsmediums, z.b. durch Albuminzusatz, wodurch eine bessere Annäherung der Erythrozyten gewährleistet wird oder durch Änderung der Ionenstärke des Mediums durch Zusatz von LISS (Low ionic strength solution), wodurch eine schnellere und umfassendere Bindung der IgG-Antikörper erreicht wird. 3. Coombs-Technik (Antiglobulin-Technik): Den Erythrozyten mit gebundenen Antikörpern werden Anti-Humanglobulin-Antikörper (Coombs-Serum) zugegeben. Diese verbinden zwei erythrozytär gebundene Antikörper miteinander. Dadurch wird die Distanz zwischen zwei Erythrozyten überbrückt. Grundsätzlich gibt es verschiedene Arten von Coombs-Seren. Polyspezifische enthalten Antikörper gegen humane Immunglobuline und Komplement, monospezifische nur solche gegen eine einzelne Immunglobulinklasse (z.b. anti-igg, anti-iga) bzw. gegen Komplement (z.b. Anti-C3). Unterschieden werden direkter und indirekter Coombs-Test. Beim direkten Coombstest wird zu den Patienten-Erythrozyten Coombs-Serum (Anti-Humanglobulin) gegeben. Liegen bereits in vivo mit Antikörpern beladene Patienten-Erythrozyten vor, wird durch Anti- Humanglobulin eine Agglutinationsreaktion ausgelöst. Beim indirekten Coombs-Test wird Serum oder Plasma des Patienten mit Test-Erythrozyten inkubiert und anschließend

8 8 Coombs-Serum hinzugegeben. Man prüft also beim indirekten Coombs-Test, ob das Serum des Patienten erythrozytäre Antikörper enthält. 1.2 ABO-System Das ABO-Blutgruppensystem umfasst die wichtigsten Blutgruppen. Die Antigene A und B definieren die 4 unterschiedlichen Phänotypen O, A, B und AB. Ihre molekulare Struktur beruht auf bestimmten endständigen Verzweigungen von Kohlenhydratketten, die an Lipide oder Proteine der Erythrozytenmembran angeheftet sind. ABO-ähnliche Kohlenhydratstrukturen finden sich dabei nicht nur auf nahezu allen Zellen des menschlichen Körpers, sondern sie sind auch auf Bakterien und im Tier- und Pflanzenreich weit verbreitet. Im ABO-Blutgruppensystem liegen obligat natürliche Antikörper vor, die sogenannten Isoagglutinine (Anti-A und Anti-B). Diese Antikörper sind entsprechend der sogenannten Landsteiner sche Regel gegen die Antigene (Antigen-A und Antigen-B) gerichtet, die dem Individuum selbst fehlen. Die Isoagglutinine liegen phyiologisch im Überschuß vor, was bedingt, dass die ABO-Blutgruppe bei Transfusionen immer berücksichtigt werden muss, da es ansonsten bei einer inkompatiblen Transfusion zur Komplementaktivierung mit anschließender sofortiger intravasaler Hämolyse der Erythrozyten kommen kann. Eine hämolytische Transfusionsreaktion vom Soforttyp verläuft in nicht wenigen Fällen tödlich. Erythrozytenkonzentrate werden daher majorkompatibel transfundiert, d.h. im Serum des Blutempfängers dürfen sich keine Isoagglutinine gegen die ABO-Antigene auf den transfundierten Erythrozyten befinden. Zum Beispiel darf ein Patient mit der Blutgruppe A und vorliegendem Anti-B, nur Spendererythrozyten der Blutgruppen A oder O erhalten (Abb. 4). Patientenblutgruppe A B AB O Abb. 4 Kompatible Erythrozytenkonzentrate A oder O B oder O AB, A, B oder O O Im Allgemeinen ist dagegen die Übertragung von Isoagglutininen gegen die A- oder B- Antigene, die der Empfänger aufweist (Minor-Inkompatibilität), von geringerer klinischer Bedeutung, da die transfundierte Antikörpermenge zumeist begrenzt ist und die Isoagglutinine außerdem bei der Transfusion im Empfänger stark verdünnt werden. Für die Transfusion von Erythrozytenkonzentraten und Plasmapräparaten gelten die in der folgenden Graphik abgebildeten Transfusionsmöglichkeiten (Abb. 5). Dabei können Erythrozytenkonzentrate mit der Blutgruppe O (ohne A- und B-Antigene) kompatibel zur Versorgung von Patienten mit den Blutgruppen A, B und AB eingesetzt werden, während Plasma von Spendern mit der Blutgruppe AB aufgrund der fehlenden Isoagglutinine Patienten mit den Blutgruppen A, B und O transfundiert werden können.

9 9 ABO-kompatible Transfusionen: Erythrozyten Plasma Spender Empfänger Abb. 5 Empfänger Spender Zur Bestimmung der ABO-Blutgruppe werden immer die Antigene der Erythrozyten und das dazugehörige Serum hinsichtlich der Isoagglutinine untersucht. Durch die Bestimmung der Isoagglutinine im Serum wird der Befund an den Erythrozyten kontrolliert (umgekehrte Typisierung, Abb. 6). Reaktionsmuster bei der ABO-Blutgruppenbestimmung: Agglutination der Erythrozyten durch Reaktion des Serums mit Testerythrozyten der Blutgruppe ABO-Blutgruppe (Phänotyp) Anti-A Anti-B A 1 A 2 B O O A B AB Abb. 6 Für die Feststellung der Erythrozyteneigenschaften im ABO-System sind verschiedene Reagenzien verfügbar. Zum einen sind das menschliche Isoagglutinine, die ein heterogenes Gemisch von Antikörpern unterschiedlicher Art und Bindungsstärke bilden (polyklonale Antikörper), zum anderen humane, monoklonale Antikörper, die der IgM-Klasse angehören und die nicht nur schneller, sondern auch stärker als polyklonale Testreagenzien reagieren. Des Weiteren, kommen sogenannte Lektine zum Einsatz. Dabei handelt es sich um Proteine oder Glykoproteine pflanzlichen oder tierischen Ursprungs, die spezifisch Kohlenhydratstrukturen binden. Bei der ABO-Bestimmung wird beispielsweise das Lektin aus dem Samen der indischen Prunkbohne (Dolichos biflorus) eingesetzt, welches Anti-A 1 - Spezifität besitzt. Das natürliche Vorkommen der Isoagglutinine im menschlichen Serum scheint sich auf eine inapparente Immunisierung durch A- und B-ähnliche Antigene auf Bakterien, die im Magen- Darm-Trakt verbreitet vorkommen, zurückführen zu lassen. Anti-A und Anti-B werden daher erst primär innerhalb des ersten Lebensjahres gebildet. Der Titer der Antikörper steigt bis zum 10. Lebensjahr an und fällt dann, insbesondere im höheren Alter, wieder ab. Anti-A und Anti-B sind zumeist Antikörper vom IgM-Typ, die insgesamt stärker bei 4 C als bei 37 C reagieren. Daneben können aber auch Antikörper vom IgG-Typ ohne nachweisbare Immunisierung vorkommen, die besser bei 37 C reagieren. Die IgG-Antikörper lassen sich in der Regel nicht lebenslang sondern eher episodenhaft nachweisen, eventuell auch unabhängig von Schwangerschaften oder Transfusionen. Bei entsprechender Blutgruppenkonstellation (meistens Mutter O, Kind A 1 ) kommen IgG-Antikörper auch als Auslöser eines Morbus haemolyticus neonatorum (Mhn) in Frage. Die noch schwache Ausprägung der AB-

10 10 Merkmale an den fetalen Erythrozyten ist allerdings der Grund für den zumeist milden Verlauf eines ABO-bedingten Mhn Biochemie und Genetik des ABO-Blutgruppensystems Chemisch handelt es sich bei den Blutgruppenantigenen A und B um endständige Kohlenhydratabschnitte, die von spezifischen Glycosyltransferasen an die sogenannte H- Substanz (die Vorstufe der Antigene A und B) angeknüpft werden. Die A- und B-Transferase synthetisieren beide a1,3-glykosidische Bindungen, unterscheiden sich aber in ihrer Substratspezifität. Während die A-Transferase ( entspricht: a1,3-n-acetylgalactosaminyltransferase) N-Acetylgalactosamin (GalNAc) auf H überträgt, ist dieses bei der B- Transferase (entspricht: a1,3-galactosyltransferase) D-Galactose (D-Gal). Sind die A- und B-Transferase nicht aktiv, so bleibt die Anknüpfung an die H-Substanz von N- Acetylgalactosamin und Galactose aus. Dieser Fall liegt bei Individuen mit der Blutgruppe O vor, die daher nur das H auf der Erythrozytenmembran besitzen (Abb. 7). H-Substanz A-Antigen Glc Gal D-Gal NAc NAc N-Acetylgalactosaminyltransferase Glc NAc D-Gal L-Fuc L-Fuc Glc NAc D-Gal D-Gal Galactose L-Fuc B-Antigen Abb. 7: Die A-Transferase bindet N-Acetylgalactosamin, die B-Transferase Galactose an das H- Antigen. (GalNAc = N-Acetylgalactosamin, D-Gal = D-Galactose, GlcNAc = N-Acetylglucosamin, L- Fuc = L-Fucose) Die H-Substanz stellt selbst auch eine antigene Struktur dar. Sie entsteht durch die Bindung von Fucose an die endständige Galactose des Vorläufermoleküls auf der Erythrozytenmembran (Abb. 8). Das H-Antigen kann nicht gebildet werden, wenn die entsprechende Fucosyltransferase inaktiv ist. Die Folge ist, dass auch die A- und B- Transferasen den für das A- und B-Antigen spezifischen Kohlenhydratbaustein nicht an das unvollständige H-Antigen binden können. In diesem Fall resultiert der extrem seltene sogenannte Bombay-Phänotyp, bei dem die Erythrozyten weder ein A- oder ein B-Antigen, noch ein H-Antigen tragen. Individuen mit einem Bombay-Phänotyp weisen daher Anti-A, Anti-B und obligat auch ein hochtitriges Anti-H im Serum auf.

11 11 H-Substanz R Glc NAc D-Ga l R Glc NAc D-Ga l L-Fu c L-Fu c Abb. 8: Die aktive Fucosyltransferase 1 verbindet L-Fucose (L-Fuc) mit dem Vorläufermolekül aus N- Acetylglucosamin (GlcNAc) und D-Galactose (D-Gal). Eine inaktive Fucosyltransferase führt zum Bombay-Typ. Etwas 78% der Individuen mit der Blutgruppe A (oder AB) haben die Blutgruppe A 1. 20% die Blutgruppe A 2. Weitere Untergruppen von A wie Aint, A 3, A x, A m und A el sind wesentlich seltener. Die verschiedenen A Untergruppen unterscheiden sich deutlich in ihrer Antigendichte. Während A 1 Erythrozyten 1 bis 1,5 Millionen Antigene aufweisen, sind es bei A m und A el weniger als Die Blutgruppe A 1 ist durch eine hochaktive A-Transferase gekennzeichnet, welche die vorhandene H-Substanz komplett nach A hin umbaut. Bei den A-Untergruppen liegen Glykosyltransferasen vor, die sich in ihrer Wirksamkeit von der A 1 - Transferase unterscheiden, jedoch den gleichen immundeterminanten Zucker, nämlich N- Acetylgalactosamin an die Grundsubstanz binden. Je schwächer die Transferase umso weniger H-Substanz wird mit N-Acetylgalactosamin versehen. Untergruppen der Gruppe B spielen in Europa keine Rolle, sie sind jedoch in Ostasien verbreitet. Die Unterschiede in der Aktivität der Transferase zeigen sich in der Regel durch Nukleotidpolymorphismen in der Allelsequenz. Merkmalsträger einer schwachen A-Untergruppe produzieren gelegentlich irreguläre Antikörper, welche nur A 1 -Erythrozyten agglutinieren (sogenanntes irreguläres Anti-A 1 ). Diese IgM-Antikörper können als Auto-Antikörper interpretiert werden, sind jedoch wegen ihrer niedrigen Wärmeamplitude als klinisch irrelevante Kälteagglutinine anzusehen. Eine entsprechende Konstellation kann zu Fehlbestimmungen führen, wenn Blut mit einer schwachen A-Gruppe fälschlich als Blutgruppe O bestimmt wird (oder A 2 B als B). Der ABO-Locus befindet sich auf dem menschlichen Chromosom 9. Während bei Individuen mit den Blutgruppen A und B die entsprechenden Allele für aktive Enzyme (A- und B- Transferase) kodieren, besitzen Individuen mit der Blutgruppe O nur ein Allel, das keine genetische Information für eine aktive Glycosyltransferase besitzt. Dieses bedeutet, dass das inaktive Enzym des O Allels an die H-Substanz keinen Kohlenhydratbaustein binden kann. Die aktiven Transferasen der Allele A und B sind dominant über O, da sie die H-Antigene durch Anbinden der immundeterminanten Zucker N-Acetylgalactosamin bzw. D-Galactose maskieren. Liegen die Allele für die beiden Transferasen A und B vor, so befinden sich zugleich A- und B-Antigene auf den Erythrozyten und es kann von einer Kodominanz gesprochen werden. Die Beziehung zwischen dem ABO-Genotyp und dem erythrozytären Phänotyp ist aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlich (Abb. 9).

12 12 Genotyp Phänotyp Häufigkeit (%) A 1 A 1 A 1 A 1 A 2 A 1 36,72 A 1 O A 1 Abb. 9 A 2 A 2 A 2 A 2 O A 2 7,72 BB B 10,65 BO B A 1 B A 2 B A 1 B A 2 B 4,50 OO O 40,41 Die ABO-Gene kodieren für die Glycosyltransferasen. Die kodierende Region der ABO-Gene besteht dabei aus 7 Exons. Die Größe der Exons variiert zwischen 28 und 688 bp, wobei sich fast 80% aller Basen auf den Exons 6 und 7 befinden. Die gesamte kodierende Sequenz beträgt für die aktiven Glycosyltransferasen 1062 bp. Das resultierende Protein weist 354 Aminosäuren auf. Im Vergleich zum A 1 Allel unterscheidet sich das B Allel in nur 7 Nukleotiden, durch die 4 Aminosäureaustausche verursacht werden (Positionen 526, 703, 796, 803). Die drei anderen differierenden Nukleotide stellen sogenannte stille Mutationen dar (Positionen 297, 657, 930). Das A 2 Allel unterscheidet sich vom A 1 Allel nur durch einen Nukleotidaustausch (Position 467) sowie durch eine verlängerte Kodierungsregion, die einen Anbau von 21 Aminosäurereste am C-terminalen Ende der Transferase verursacht. Das O Allel kommt in zwei Hauptformen vor. Das häufige O 1 Allel (ca. 96% aller Individuen mit der Blutgruppe O) weist im Vergleich zum A 1 Allel eine Deletion (Position 261) auf, die in einem Stop Codon resultiert. Das seltenere O 2 Allel (ca. 4%) unterscheidet sich von der A 1 - Sequenz durch die zwei Nukleotide an den Positonen 526 und 802, die auch jeweils in einem Aminosäureaustausch resultieren (Abb ). Aufgrund der beschriebenen Nukleotidpolymorphismen in den ABO-Allelen ist eine molekulargenetische Typisierung per Polymerase-Kettenreaktion (RCR) möglich. Maßgeblich für die Routine bleibt aber weiterhin die blutgruppenserologische Untersuchung. Die molekulargenetische Diagnostik bleibt speziellen Untersuchungen vorbehalten, wie dieses z.b. bei Patienten mit Mischagglutinationen bei Zustand nach einer nicht ABO-identischen, jedoch majorkompatiblen Erythrozytentransfusion der Fall sein kann. A A 2 B O 1 O Abb. 10: Markierung von Nukleotiden der ABO-Allelen, die eine Abweichung zur Sequenz des A1 Allel aufweisen und zu einem Aminosäureaustausch führen - z.b. unterscheiden sich das A 1 Allel und das B Allel in 4 Nukleotiden (Pos. 526, 703, 796, 803).

13 A 1 A 2 B O 1 O Golgilumen Zytoplasma Transmembranäre Domäne Abb. 11: Schematische Darstellung der von den A-, B- und O-Allelen kodierten Glykosyltransferasen. Sie besitzen einen kurzen zytoplasmatischen Schwanz, eine hydrophobe, transmembranäre Domäne, eine Stammregion und eine große globuläre katalytische Domäne. Die Unterschiede in der Aminosäuresequenz zu A 1 sind markiert Erworbenes B-Antigen und Verlust der ABH-Antigene In seltenen Fällen kann es bei Patienten der Blutgruppe A 1 zu einer Änderung der ABO- Blutgruppeneigenschaften kommen, zu einem erworbenen B-Antigen. Als Ursache ist eine Veränderung des A-Merkmals durch bakterielle Enzyme (Deacetylasen) bei Infektionen des Magen-Darm-Traktes anzunehmen. Diese Infektionen mit gramnegativen Bakterien sind wiederum häufig bei kolorektalen Tumoren zu finden. Die Änderung der Antigenstruktur führt zur Bindung von Anti-B. Das Anti-B im Serum dieser Patienten reagiert mit normalen B- Zellen anderer Individuen, jedoch nicht mit den eigenen Erythrozyten. Das Vorkommen eines erworbenen B-Antigens ist manchmal mit einem Polyagglutinationsphänomen verbunden, d.h. dass die Erythrozyten dieser Patienten mit allen verfügbaren Seren unspezifische Agglutinationsreaktionen, eine sogenannte Panreaktivität, zeigen. Das Phänomen eines erworbenen B-Antigens ist allerdings nur in wenigen Fällen bei A 2 Individuen beschrieben worden. Bei Patienten mit Erkrankungen der blutbildenden Stammzellen im Knochenmark, wie bei Leukämien, können im Verlauf der Erkrankungen die Antigene A, B und H verloren gehen. Wahrscheinlich werden bei diesen Patienten die entsprechenden Transferasen zur Produktion der immundeterminanten Kohlenhydratbausteine nicht ausreichend produziert. 1.3 Rh-System Allgemeines Die Antigene des Rh-(früher Rhesus)-Systems sind am Aufbau des Membranskeletts von Erythrozyten beteiligt. Im Gegensatz zu ABO-Antigenen, welche am Ende längerer Ketten weit aus der Erythrozytenmembran herausragen können, liegen die Antigene des Rh- Systems in bzw. dicht auf der Erythrozytenmembran. Im Rh-System gibt es nur sehr selten natürliche (d.h. vorgebildete) Antikörper im Sinne von Isoagglutininen, eine Serumgegenprobe ist also nicht möglich. Es gibt auch keine lösliche Blutgruppensubstanz. Die Antigene des Rh-Systems kommen nur auf Erythrozyten vor. Die

14 14 Zahl der Antigene pro Erythrozyt liegt für den Rh-Faktor D erblich bedingt zwischen etwa und , also erheblich niedriger als im ABO-System. Im Rh-Blutgruppensystem sind heute über 50 verschiedene erbliche Antigen-Varianten bekannt. Viele davon sind abgeschwächte Antigenformen oder Defektvarianten, bei welchen eine oder mehrere Komponenten im normalerweise zu erwartenden Rh-Antigenprofil fehlen. Eine solche Vielfalt weist kein anderes erythrozytäres Blutgruppensystem auf. Die meisten seltenen Varianten wurden nicht in Europa sondern bei Menschen afrikanischer Herkunft beobachtet. Im Folgenden werden die in Mitteleuropa wichtigen Rh-Faktoren D, D weak, C, C w, c, E und e besprochen. Der wichtigste ist der Rh-Faktor D. Auf eine Beschreibung der selteneren Varianten muss hier verzichtet werden. Ist der Rh-Faktor D vorhanden, so lautet die Blutgruppe Rh positiv, ist er nicht vorhanden, so liegt die Blutgruppe Rh negativ vor. Die Blutgruppe Rh positiv (D+) kommt in unserer Bevölkerung bei 83% aller Menschen vor, incl. 0,6% mit abgeschwächtem Rh-Faktor (heutige Bezeichnung D weak). Die übrigen 17% sind Rh negativ (D-). Das Fehlen des Rh-Faktors D beschreibt man auch mit dem Buchstaben d. Da d gegenüber D rezessiv ist, muss bei Rhnegativen Individuen d erblich zweimal vorliegen (dd). Am RHD Genort D-negativer Individuen ist eine nicht kodierende genetische Struktur nachweisbar, die als Hybrid Rhesus Box bezeichnet wird. Internationalen Vereinbarungen entsprechend ist es nicht zulässig, die Rh-Blutgruppe in Blutgruppenbefunden und auf Blutprodukten mit D und/oder d zu beschreiben, es müssen die Begriffe Rh positiv bzw. Rh negativ verwendet werden. Es ist jedoch erlaubt, Zusätze anzubringen, z.b. Rh positiv (D+) bzw. Rh negativ (D-) Genetik, Biochemie und Aufbau der Rh-Antigene Die Rh-Faktoren werden durch die auf Chromosom 1 unmittelbar benachbarten Gene RHD und RHCE codiert. Jedes dieser Gene besteht aus 10 Exons und 9 Introns. Das RHD Gen codiert für den Rh-Faktor D. Liegt mindestens 1 normales RHD Gen vor, so ist diese Person Rh positiv (D-positiv). Fehlt an diesem Genort auf beiden Chromosomen das RHD Gen, so ist das Individuum Rh negativ (D-negativ). Das RHCE Gen codiert mit Nukleinsäurepolymorphismen auf Exon 2 für die Faktoren C oder c ( groß C" und "klein c") und mit einem Polymorphismus auf Exon 5 für die Faktoren E oder e ( groß E" und "klein e"). Während mit den Bezeichnungen "D, C, c, E, e" Antigene beschrieben werden, die serologisch mit entsprechenden Antikörpern nachweisbar sind, so wird mit der Bezeichnung "d" nur das Fehlen von D angegeben. d ist kein Protein bzw. Antigen und ist daher mit serologischen Methoden nicht nachweisbar. Als Genkomplexe oder auch Rh-Haplotypen werden die Kombinationen DCe, dce usw. bezeichnet. Einem Rh Phänotyp z.b. mit der Rh-Formel CcD.ee liegt als Genotyp eine Kombination aus 2 Rh Haplotypen zugrunde, entweder DCe/Dce oder DCe/dce. Die Unterscheidung zwischen diesen beiden Genotypen kann durch Familienutersuchungen oder molekulargenetisch durch Nachweis der Hybrid Rhesus Box getroffen werden. Aus der serologischen Unklarheit über den Genotyp heraus resultiert die Bezeichnung "D." d.h. "entweder DD oder Dd".

15 15 Genotyp Phänotyp Genotyp Phänotyp D ist über d dominant. Nur wenn beide Eltern jeweils ein Chromosom 1 mit fehlendem Gen für D vererben, resultiert der Phänotyp Rh negativ (Rh negativ ist rezessiv). Die Merkmale C und c werden kodominant vererbt. Dasselbe gilt für die Merkmale E und e. Bei Mischerbigkeit sind beide Merkmale serologisch nachweisbar. Die Polypeptide - RhD für den Faktor D, und RhCcEe für die Faktoren C, c, E, und e - bestehen aus jeweils 417 Aminosäuren. Diese Polypeptide enthalten keine Saccharid- Anteile, sind also keine Glycoproteine. Das vom RHD Gen codierte Polypeptid besteht wie das CE-Polypeptid aus 417 Aminosäuren, jedoch sind die Aminosäuren des D-Polypeptids an 35 Positionen von denjenigen des CE-Polypeptids verschieden. Bei Rh negativen Menschen gibt es nur ein ce-polypeptid, das D-Polypeptid fehlt. Als Epitop bezeichnet man Teilstrukturen eines Antigens. Mit Hilfe monoklonaler Anti-D-Reagenzien wurden bisher ca. 30 Epitope des Rh-Faktors D unterschieden. Aus diesen Epitopen setzt sich der Rh-Faktor D mosaikartig zusammen D-Varianten und D weak Polymorphismen des RHD Gens bewirken eine abgeschwächte und/oder qualitativ veränderte Expression des D-Polypeptids bei ca. 0,5 % der Bevölkerung. Die überwiegende Mehrzahl der Personen mit diesen so genannten D-Varianten kann kein Anti-D bilden und wird als D weak bezeichnet. D-Varianten bei Personen, die nach Schwangerschaft oder Erythrozytentransfusionen Anti-D gebildet haben bzw. bilden könnten werden Partial-D Phänotypen genannt (ca. 0,02 % der Bevölkerung). Die in Europa häufigste und am besten untersuchte Partial-D Variante ist die Kategorie D VI. D VI -Probanden werden wie alle anderen Partial-D Empfänger Rh negativ, als Blutspender Rh positiv definiert. Dahingegen gelten D weak Phänotypen sowohl als Empfänger als auch als Blutspender Rh positiv Nomenklaturen im Rh-System Lange waren verschiedene Schulen über die Vererbung im Rh-System zerstritten. Schwierigkeiten machte die Vorstellung, dass e i n Gen die Vererbung von d r e i Merkmalen bewirken sollte. Die Gegner dieser Vorstellung forderten für jeden Rh-Faktor ein eigenes

16 16 Gen. Wie oben dargestellt ist heute bekannt, dass z w e i Gene auf dem Chromosom 1 die Rh-Faktoren (D,C/c,E/e) kodieren. Die Auseinandersetzungen über die Vererbung im Rh-System hatten zwei verschiedene Nomenklaturen zur Folge. Zwar hat sich heute in Europa die CDE-Faktorennomenklatur nach Fisher und Race durchgesetzt, die zweite Nomenklatur nach Wiener ist jedoch auch heute noch in den USA gebräuchlich, und beide sollte man kennen. Die folgende Tabelle stellt beide Nomenklaturen gegenüber: Rh positive Haplotypen Rh negative Haplotypen nach nach nach nach Wiener Fisher/Race Wiener Fisher/Race Rh 1 CDe rh cde Rh 2 cde rh' Cde Rh o cde rh'' cde Rh z CDE rh y CdE Die sehr ungleichmäßige Verteilung der Rh-Haplotypen wurde durch Untersuchungen über mehrere Generationen in vielen tausend Familien ermittelt. In der folgenden Tabelle sind die 10 häufigsten Genotypen (homozygote reinerbige und heterozygote mischerbige) entsprechend ihrer Häufigkeit aufgeführt: Mit RHD zusammen ist am häufigsten das Allel RHCe gekoppelt, seltener liegt RHD zusammen mit RHcE vor. Die Kombinationen (=Haplotypen) Dce und DCE kommen bei Weißen eher selten vor. Rh positive Menschen tragen mindestens auf einem Chromosom 1 beide Gene, nämlich eines für D und das zweite für Ce oder ce (sehr selten andere Kombinationen). Die serologisch bestimmte Rh-Formel wird heute noch in der alphabetischen Reihenfolge dargestellt z.b. CcD.ee. Nach Kenntnis der genetischen Grundlagen für die RH Gene wird jedoch der Genotyp in einer geänderten Reihenfolge angegeben (siehe nächste Tabelle). In dieser Tabelle ergibt sich eine Differenz zu 100%, in welcher die noch viel selteneren Haplotypen vertreten sind, z.b die Haplotypen mit D weak, desweiteren die Haplotypen mit großen Faktoren ohne D (dce, dce, dce), und der Haplotyp mit nur großen Faktoren, DCE (Rh z ). Die Häufigkeit dieser seltenen Haplotypen liegt selbst mischerbig in Kombination mit den häufigsten Haplotypen unter 1%.

17 17 Genotyp Häufigkeit Genotyp Häufigkeit 1. DCe/dce 32 % 6. DcE/DcE* 2 % 2. DCe/DCe* 17 % 7. DCe/Dce 2 % 3. dce/dce* 15 % 8. dce/dce 2 % 4. DCe/DcE 12 % 9. DCe/DC w e 1 % 5. dce/dce 11 % 10. dce/dc w e 1 % * = homozygot Transfusionsmedizinische Regeln für den Rh-Faktor D Während man den Rh-Faktor D bei Rh positiven Menschen mit entsprechenden Testseren nachweist, muss die Blutgruppe Rh negativ über das Fehlen des Rh-Faktors D erkannt werden. Der Rh-Faktor D muss im Doppel-Ansatz mit zwei unterschiedlichen Testseren bestimmt werden. Der Rh-Faktor D ist ein sehr starkes Immunogen. Für eine Immunisierung Rh negativer Personen reicht die Menge von 0,2 ml Rh positiven Blutes in ca. 80% der Fälle aus. Wegen der so häufigen Immunisierung von Rh negativen Empfängern durch den Rh-Faktor D gilt die Transfusion von Rh positivem Blut an Rh negative Empfänger mit Ausnahme von Notfällen als ärztlicher Kunstfehler. Ist aufgrund eines massiven Blutverlustes nicht ausreichend Rh negatives Blut verfügbar, wird das Risiko einer Antikörperbildung, möglicherweise verbunden mit einer hämolytischen Transfusionsreaktion, in Kauf genommen. Rh negatives Blut gilt als universal verträglich ist also auch für Rh positive Empfänger geeignet. Daher wird 0 Rh negatives Blut in der Rettungsmedizin bei unbekannter Blutgruppe eingesetzt. Eine Anti-D-Prophylaxe (i.m. verabreichtes Anti-D) dient der Verhinderung einer Immunisierung Rh negativer Mütter während der Schwangerschaft und nach der Entbindung von Rh positiven Kindern. Es kommt auch vor, dass Rh negative Empfänger durch die versehentliche Verabreichung Rh positiver Blutkonserven gefährdet werden. Falls dies rechtzeitig bemerkt wird, kann durch eine nachträgliche intravenöse IgG-Anti-D- Applikation (hochdosiert) eine Immunisierung verhindert werden Transfusionsmedizinische Bedeutung von C, c, E, e und C w Die Rh Untergruppen C, c, E und e können durch eine Agglutination mit entsprechenden Testseren erkannt werden. Das gilt auch für das Merkmal C w, eine Variante des Merkmals C (Häufigkeit 1,3%). Grundsätzlich kann zwar jeder Mensch nach entsprechender Bluttransfusion Antikörper gegen C, c, E oder e bilden, vorausgesetzt dass er selbst diese Antigene nicht hat. Dies geschieht jedoch viel seltener als bei dem Rh-Faktor D. Die Immunogenität des Rh-Faktors D ist weit größer als diejenige der übrigen Rh-Faktoren, deshalb ist bisher in der Regel bei Bluttransfusionen nur die Berücksichtigung von D vorgeschrieben. Darüber hinaus sollen Mädchen sowie gebärfähige Frauen keine Erythrozytenkonzentrate erhalten, die zu einer Immunisierung gegen die übrigen Antigene des Rh-Systems oder den Kell- Faktor führen können. Unter den Rh Untergruppen hat E die größte Immunogenität, gefolgt von c.

18 Rh-Antikörper bei Patienten Bei Patienten sind Antikörper gegen Faktoren des Rh-Systems fast immer Folge eines immunisierenden Kontakts mit menschlichem Fremdblut durch Schwangerschaft und Entbindung oder durch Bluttransfusionen. Rh-Antikörper sind daher irreguläre Antikörper. Bei ihrem ersten Nachweis im Plasma oder Serum eines Menschen gehören sie in aller Regel schon der IgG-Klasse an. IgG-Antikörper sind aus mehreren Gründen nicht so gut wie IgM- Antikörper in der Lage, eine direkte Agglutination herbeizuführen. Ungünstig für den Nachweis dieser Antikörper ist auch, dass die Rh-Antigene nicht in großer Zahl vorkommen, und dass sie dicht auf der Erythrozytenoberfläche liegen. Irreguläre IgG-Rh-Antikörper im Serum eines Patienten erlauben eine Bluttransfusion dann nicht mehr, wenn auf dem Spenderblut die entsprechenden Antigene vorhanden sind. Zum Nachweis dieser Antikörper beim Antikörpersuchtest und bei der Verträglichkeitsprobe (Kreuzprobe) müssen Methoden eingesetzt werden, die ausreichend empfindlich sind. Dazu gehört die Anwendung von Supplement (z.b. LISS-Reagenz) und unbedingt der indirekte Coombstest. Nur in Zweifelsfällen kann der Zusatz von Enzymen, die die Erythrozytenoberfläche verändern, empfohlen werden. 1.4 weitere Blutgruppenmerkmale Im Folgenden sind diejenigen Blutgruppenmerkmale aufgeführt, die seltener (als ABO- und Rh-System) klinische Probleme hervorrufen. Die klinische Bedeutung eines Blutgruppenmerkmals wird dabei von 3 prinzipiellen Aspekten geprägt: 1. wie immunogen ist das Merkmal, d.h. wie häufig bildet ein Mensch nach Transfusion mit einem solchen Merkmal - Allo-Antikörper gegen dieses Merkmal? 2. wie häufig kommen unverträgliche Transfusionen bezüglich des entsprechenden Merkmals vor? 3. wie ist die klinische Wirkung des Antikörpers, z.b. in Bezug auf eine hämolytische Erkrankung des Neugeborenen (morbus haemolyticus neonatorum, MHN)? Tabelle: Häufigkeit von irregulären IgG-Antikörpern (Ak) bei Transfusionsempfängern Spezifität Häufigkeit unter den IgG-Antikörpern (%) Antigenfrequenz (%) Anti - D Anti - K Anti - E Anti - Fy a Anti - c Anti - Jk a Anti - C Anti - S Anti - e 33,0 24,0 23,0 7,5 4,4 4,0 1,8 1,8 0,5 85,0 9,7 30,0 69,0 80,0 75,0 70,0 52,0 98,0 Bei Antigenen mit sehr geringer Häufigkeit (private antigens) ist die Wahrscheinlichlichkeit, dass ein Mensch immunisiert wird, sehr gering, selbst wenn die Immunogenität hoch ist. Wie auch aus der Tabelle klar wird, haben vor allem Rh- und Kell-System die größte klinische Bedeutung, da sie auch einen MHN hervorrufen können. Deshalb schreiben die Richtlinien zur Hämotherapie vor, dass gebärfähige Frauen bei Transfusionen auch Rh-verträgliche

19 19 (d.h. nicht nur D, sondern auch C und E kompatible) und Kell-verträgliche Erythrozytenkonzentrate erhalten sollten Kell-System Das Kell-System ist ein polymorphes System mit über 20 bekannten Antigenen. Die beiden antithetischen Hauptantigene sind K (Kell, K1) und k (Cellano, K2). Beim extrem seltenen McLeod-Phänotyp fehlen die Kell-Antigene bzw. sind abgeschwächt. Die bei dieser Erkrankung auftretenden Symptome ( Akanthozytose, Anisozytose, hämolytische Krisen), oft vergesellschaftet mit progressiv septischer Granulomatose und neurologischen Symptomen, sprechen für eine funktionelle Bedeutung des Kell-Systems. Das Kell- Antigen K ist stark immunogen. Die Immunantikörper vom Typ Anti-K sind meist vom IgG1-Typ mit Komplementaktivierungskapazität und können auch einen MHN hervorrufen Duffy-System Die Antigene des Duffy-Systems sind ebenfalls Polypeptide, die sich in mehreren Schlingen durch die Erythrozytenmembran winden. Sie werden durch proteolytische Enzyme (z.b. Bromelin, Papain) zerstört, was den Nachweis entsprechender Antikörper mit enzymbehandelten Testerythrozyten unmöglich macht. Die beiden antithetischen Hauptantigene sind Fy a und Fy b. Fy a wird zu den mittelstarken Immunogenen gerechnet. Die Antikörper sind fast immer vom IgG-Typ, binden häufig Komplement, können dramatische, hämolytische Transfusionsreaktionen auslösen und einen MHN hervorrufen Kidd-System Die Merkmale des Kidd-Systems heißen Jk a und Jk b. Antikörper gegen diese Merkmale sind immer transfusionsrelevant und sie können einen MHN auslösen. Anti-Jk b ist allerdings sehr selten MNSs-System Im polymorphen MNSs-System gibt es die vier Hauptantigene M, N, S, s und zahlreiche, meist seltene Varianten (ca 40 bekannte Antigene). Antikörper gegen diese Merkmale sind klinisch nur relevant bei aktueller Nachweisbarkeit, Reaktivität bei 37ºC bzw. Positivität im indirekten Antiglobulintest. Dann können sie z.t. schwere hämolytische Transfusionsreaktionen oder einen MHN auslösen. 1.5 Immunhämatologische Diagnostik Die immunhämatologische Diagnostik gliedert sich in die allgemeine Blutgruppenserologie und in die spezielle immunhämatologische Diagnostik. Für die Blutgruppenbestimmung werden Antiseren mit definierter Blutgruppenspezifität eingesetzt, um bei Patienten (Empfängern) bzw. Blutspendern das Vorhandensein oder Fehlen entsprechender Blutgruppenmerkmale (Antigene) zu ermitteln. Die Antiseren sind in der Regel monoklonal. Sie sind monospezifisch, stammen aus Zellkulturen von verschiedenen Klonen und gehören nur einer Immunglobulinklasse an, idealerweise IgM. Die Antiseren lösen beim Vorliegen des entsprechenden Antigens eine Agglutination der Erythrozyten aus. Für die Blutgruppenbezeichnung ist das Vorhandensein und/oder das Fehlen von Antigenen ausschlaggebend. Eine besondere Stellung nimmt das ABO-Blutgruppensystem insofern ein, weil hier nicht nur die jeweiligen Antigene mittels spezifischer Antiseren nachgewiesen werden sondern auch

20 20 die bei diesem Blutgruppensystem natürlicherweise auftretenden Antikörper (Anti-A und/oder Anti-B). Für den Isoagglutininnachweis benutzt man Testerythrozyten mit bekannter ABO- Blutgruppe. Für die Untersuchung von irregulären Antikörpern werden ausschließlich Erythrozyten der Blutgruppe O verwendet. Die spezielle immunhämatologische Diagnostik dient der Charakterisierung (Reaktionsverhalten) und der Identifizierung (Spezifität) von irregulären Antikörpern. Die Spezifität von Alloantikörpern wird mit Hilfe von Testzell-Panels, die vollständig austypisierte Erythrozyten von mindestens 8, meist 11 verschiedenen Spendern enthalten. Die Charakterisierung des Reaktionsverhaltens von Antikörpern dient der Beurteilung ihrer klinischen Bedeutung. Zur Charakterisierung gehört die Ermittlung der optimalen Reaktionstemperatur. Kälteantikörper gehören fast immer der IgM-Klasse an, agglutinieren vorzugsweise bei 4 C, gelegentlich noch bei 20 C und nur selten bei Körpertemperatur (37 C). Umgekehrt reagieren Wärmeantikörper der IgG-Klasse vorzugsweise bei 37 C. Eine weitergehende Charakterisierung ist möglich durch Verwendung von enzymbehandelten Testerythrozyten. Der Nachweis von IgM-Kälteantikörpern gelingt idealerweise durch eine direkte Agglutination. Dagegen können IgG-Wärmeantikörper nur schlecht agglutinieren. Der Nachweis ihrer Bindung an Erythrozyten gelingt am sichersten nach einer Wärmeinkubation mit Hilfe eines Anti-Humanglobulin-Serums (AHG-Serum) im indirekten Coombstest. Dieses AHG-Serum (sive Coombs-Serum) ist entweder monospezifisch für IgG, oder es ist polyspezifisch und enthält Antikörper gegen IgG, IgA, IgM und gegen das C3d-Fragment der dritten Komplementkomponente Blutgruppenbestimmung Richtlinien Nach den Richtlinien der Bundesärztekammer zur Gewinnung von Blut und Blutbestandteilen umfasst der Mindestumfang einer Blutgruppenbestimmung die Bestimmung der ABO- Blutgruppe (Blutgruppenmerkmale, Serumeigenschaften) und des Rh-Faktors D sowie die Durchführung eines Antikörpersuchtests. Für Patienten, bei denen eine längerfristige Transfusionstherapie absehbar ist, ist die Bestimmung der kompletten Rh-Formel und der Kell-Formel dringend zu empfehlen, damit hierzu angepasst - besser noch übereinstimmend - transfundiert werden kann. Dies ist bei Mädchenn und bei Frauen im gebärfähigen Alter sogar vorgeschrieben. Die Blutgruppenbestimmung muss an einer nur für diesen Zweck entnommenen Blutprobe durchgeführt werden. Bei Blutspendern ist neben der ABO-Blutgruppenbestimmung die Bestimmung der kompletten Rh- und Kell-Formel erforderlich. Bei Erythrozytenkonzentraten muss neben der ABO-Blutgruppe die vollständige Rh- und Kell-Formel angegeben werden. Weiterführende Untersuchungen zur Ermittlung auch stark abgeschwächter Varianten des Rh-Faktors D sind nur bei Blutspendern erforderlich. Pflichtbestandteil jeder Blutgruppenbestimmung ist ein Antikörpersuchtest (s.u.) zum Ausschluss oder zum Aufspüren von irregulären erythrozytären Antikörpern. Bei positivem Antikörpersuchtest muss die Spezifität der Antikörper ermittelt und ihre klinische Relevanz bewertet werden. Bei gegebener klinischer Relevanz können weitergehende Blutgruppenbestimmungen bei Empfängern und Erythrozytenkonzentraten erforderlich werden, um verträgliche Transfusionen zu gewährleisten. Für den Fall, dass eine serologische Verträglichkeitsprobe im Rahmen einer Erythrozytentransfusion erforderlich wird, muss eine Blutgruppenkontrolle beim Patienten durchgeführt werden. Der Antikörpersuchtest muss mit einer frischen Blutprobe wiederholt werden, wenn die vorherige Blutentnahme länger als drei Tage zurückliegt.

21 Durchführung der ABO-Blutgruppenbestimmung Die Testreagenzien für die Durchführung der ABO-Blutgruppenbestimmung bedürfen einer Zulassung. Zur Bestimmung der Erythrozytenmerkmale sollten monoklonale Testreagenzien verwendet werden mit den Spezifitäten Anti-A und Anti-B. Monoklonale Testseren enthalten Antikörper, die sich nur gegen ein einziges Epitop richten. Diese Antikörper gehören dann auch nur einer Immunglobulinklasse an, nämlich IgM oder IgG. Für die Gewinnung monoklonaler Antikörper werden meist Mäuse immunisiert, deren Milzzellen mit einer immortalisierten Krebszelllinie (ebenfalls von der Maus) fusioniert und nach mehreren Testund Klonierungsschritten die gewünschten Antikörper-produzierenden Lymphozyten isoliert. In Zellkultur produzieren diese Zellen dann auf unbegrenzte Zeit den gewünschten Antikörper. Für die Serumgegenprobe zum Nachweis entsprechender Antikörper im Serum oder Plasma des Probanden sind Testerythrozyten der Blutgruppen A1, A2, B und O zu verwenden. Die Ergebnisse von Antigenbestimmung und Serumgegenprobe müssen sich entsprechen, anderenfalls sind sie nicht zu verwerten. Bei Neugeborenen und Säuglingen ist die Serumgegenprobe noch negativ. Insofern sind diese noch nicht endgültigen Ergebnisse entsprechend mitzuteilen Bestimmung des Rh-Faktors D bei Patienten Bei den Testseren für die Bestimmung der Rh-Faktoren handelt es sich heutzutage fast ausschließlich um monoklonale Antikörper. Auch Reagenzien zur Bestimmung des Rh-Faktors D bedürfen einer Zulassung. Bei Transfusionsempfängern, Schwangeren und Neugeborenen soll die Bestimmung des Rh- Faktors D mit zwei monoklonalen Antikörpern erfolgen, die aus verschiedenen Zellklonen stammen müssen und die das abgeschwächte Merkmal der Kategorie D VI nicht erfassen. Ein Kontrollansatz zum Ausschluss einer Autoagglutination ist mitzuführen. Bei negativem Ergebnis in allen drei Ansätzen ist der Patient (bzw. Schwangere und Neugeborene) als Empfänger von Transfusionen Rh negativ. Bei übereinstimmend positiven oder auch schwach positiven Ergebnissen ist der Patient Rh positiv. Bei abweichenden oder fraglich positiven Ergebnissen wird der Patient "als Empfänger Rh negativ" behandelt. Die Ursachen für solche Diskrepanzen sollten jedoch ermittelt werden Bestimmung des Rh-Faktors D bei Blutspendern Bei Blutspendern muss zusätzlich mit entsprechenden monospezifischen Reagenzien (Anti- C, -c, -E und -e) die komplette Rh-Formel bestimmt werden. Weiterhin ist bei der Untersuchung von Spendern besonders wichtig, dass auch D weak und partial-d Phänotypen als D-positiv erkannt werden. Der Nachweis (oder Ausschluss) von D-Varianten erfolgt mit polyklonalen oder oligoklonalen Reagenzien im indirekten Coombstest. Blutspender mit einer abgeschwächten D-Variante (D weak) oder einem partiell ausgeprägten Rh-Antigen D gelten als Rh positiv. In seltenen Fällen tragen Rh negative Menschen neben dem Gen für ce ein weiteres Gen für Ce oder für ce (extrem selten für CE). Es ist Konsens, dass für Rh negative Transfusionsempfänger mit der Rh-Formel ccddee auch Erythrozytenkonzentrate z.b. mit diesen Rh-Formeln Ccddee oder ccddee verwendet werden können Bestimmung weiterer Blutgruppenmerkmale Eine Bestimmung weiterer Blutgruppenmerkmale bei Empfängern und Spendern wird erforderlich, wenn nach einem positiven Antikörpersuchtest irreguläre Antikörper mit Blutgruppenspezifität erkannt werden. Dann muss durch entsprechende Bestimmungen nachgewiesen werden, dass Patienten die Merkmale, gegen welche der oder die Antikörper

22 22 gerichtet sind, nicht aufweisen, und dass diese Merkmale auch auf den zur Transfusion vorgesehenen Erythrozyten fehlen. Auch bei diesen Bestimmungen sind immer zwei verschiedene Testreaganzien entsprechend den Anweisungen der Hersteller einzusetzen, und es müssen heterozygote, für das jeweilige Merkmal positive sowie (entgegengesetzt homozygote) negative Kontrollerythrozyten mituntersucht werden Antikörpersuchtest Beim Antikörpersuchtest wird das Serum oder EDTA-Plasma eines Patienten mit Hilfe eines Testzell-Panels aus mindestens zwei, besser drei Testerythrozyten verschiedener Spender der Blutgruppe O auf das Vorliegen transfusionsrelevanter irregulärer Antikörper hin überprüft. Die Testzellen sollen folgende Merkmale aufweisen: Rh-System: Kell-System: Duffy-System: Kidd-System: MNSs-System: P - System: Lewis-System: C, C w, c, D, E, e K, k Fy(a), Fy(b) Jk(a), Jk(b) M, N, S, s P1 Le(a), Le(b). DAbei sollen die fett gedruckten Antigensysteme beim Antikörpersuchtest möglichst homozygot vorliegen. Die Methoden für den Antikörpersuchtest sollen nach dem jeweils modernsten Kenntnisstand ausgewählt werden. Pflichtbestandteil des Antikörpersuchtests soll jedoch immer ein indirekter AHG-Test sein (s.u.). Für die Identifizierung der Spezifität von irregulären Antikörpern wird ein erweitertes Testzell- Panel mit mindestens 8, meist 11 Zellen verwendet Direkter und indirekter Anti-Humanglobulin-Test (AHG-Test) Die entsprechenden Untersuchungsverfahren wurden 1945 von dem Engländer Coombs entwickelt, und die von seinem Namen hergeleitete Bezeichnung Coombs-Test hat sich hartnäckig bis in die heutige Zeit gehalten. Erst ganz allmählich bürgert sich die Bezeichnung Anti-Humanglobulin-Test (AHG-Test) ein. Anti-Humanglobulin-Serum (AHG-Serum [auch Coombs-Serum genannt]) wird benutzt, um an Erythrozyten gebundene Immunglobuline (IgG, IgA und IgM) und/oder gebundene Fragmente (C3b und C3d) der dritten Komplementkomponente nachzuweisen. Polyspezifisches AHG-Serum ist das Reagenz der ersten Wahl für Screening- Untersuchungen und enthält Antikörper gegen die drei genannten Immunglobuline und gegen die C3-Fragmente. Für weiterführende Untersuchungen stehen monospezifische AHG-Seren (Anti-IgG, Anti-IgA, Anti-C3d usw.) zur Verfügung. Es muss zwischen dem direkten AHG-Test und dem indirekten AHG-Test unterschieden werden Direkter AHG-Test Beim direkten AHG-Test werden die Erythrozyten eines Patienten untersucht. Dabei ist die Fragestellung, ob bereits in vivo eine Immunreaktion stattgefunden hat, die zur Bindung von Immunglobulinen und/oder Komplement an seine Erythrozyten geführt hat mit der Folge einer bereits in vivo ablaufenden Hämolyse. Bei den Immunglobulinen kann es sich entweder um Alloantikörper handeln, z.b. um ein Anti-D oder andere blutgruppenspezifische IgG- Antikörper, die in der Lage sind, bei Foeten und Neugeborenen einen MHN (morbus