Forschungsbericht 2006 des DRK-Blutspendedienstes Baden-Württemberg Hessen ggmbh Entwicklung der Forschung

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1 Blutspendedienst Forschungsbericht 2006 des DRK-Blutspendedienstes Baden-Württemberg Hessen ggmbh Entwicklung der Forschung Deutsches Rotes Kreuz

2 Inhalt Entwicklung der Forschung im fusionierten Blutspendedienst von 2001 bis Forschungstätigkeiten im Jahr Forschungsstruktur der Standorte QQuu aal lli iit ttäät ssssi iicchh eer ruunngg iinn i ddeer r BBl lluut tt vveer rssoo rgguunngg...26 r Bakterielle Kontamination von Blutprodukten Prävalenz von Bakterien in Pool- und Apherese-Thrombozytenkonzentraten und Strategien zur Reduktion des Transfusionsassoziierten Sepsisrisikos Blood and organ transmitted infectious agents (BOTIA Studie) Prävalenz von Parvovirus B19 bei Blutspendern Prävalenz von Anti-HBc bei Blutspendern Entwicklung und Evaluation eines automatisierten Wägemoduls für die NAT-Pooltestung Dokumentation der photochemischen Pathogeninaktivierung von Thrombozytenkonzentraten unter Verwendung von Amotosalen und UVA Licht mittels PCR und Bioanalyzer Einfluss der Pathogeninaktivierung von gefrorenem Frischplasma (GFP) mittels Amotosalen und UVA-Bestrahlung auf die Gerinnungsaktivität Qualitätssicherung der D-negativen Erythrozyten-Präparate durch Ausschluss von DEL-Blutpräparaten Nationale Qualitätssicherung der derzeit empfohlenen Rhesus-Typisierungsstrategie Leistungsbewertungsstudie eines neuen Verfahrens zur Blutgruppenbestimmung mittels Lateral-Flow-Technik: MDmulticard ABO-D-Rhsubgroups-K for patients Screening der Blutspender auf seltene Blutgruppen und Entwicklung von Antikörper-Identifizierungs-Panels Qualitätsmanagement Europäisches Twinningprojekt Malta-Deutschland: Verbesserung der Qualität und Sicherheit in der Gewinnung und Herstellung von Blutkomponenten Europäisches Projekt EU-Q-Blood-SOP: Entwicklung von Standards zur Etablierung von Qualitätsmanagementsystemen in der Transfusionsmedizin Europäisches Projekt EU-Blood-Inspection (EUBIS): Entwicklung von Standards und Kriterien entsprechend Direktive 2002/98/EC und 2005/62/EC für die Inspektion von Blutspendeeinrichtungen Entwicklung neuer Filter für die Leukozytendepletion bei Blutprodukten SSt ttaammmmzzeel lll lleenn uunndd ZZeel lll llt tthh eer raapp iiee i...62 Markierung von Stammzellen für die Detektion von Migration und Homing Interaktion von Nanopartikeln mit Stammzellpopulationen Charakterisierung von immunogenen Leukämie-assoziierten Antigenen zur Peptid-Vakzinierung von Patienten mit Leukämie Genetische Markierung und Modifikation von hämatopoetischen und mesenchymalen Stammzellen zum direkten in vivo-nachweis und Verbesserung des Therapieeffektes Erythrozyten aus Stamm- und Vorläuferzellen Stammzellen der Leukämie Charakterisierung und Optimierung der Migration Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) als kritischer Schritt in der Toleranzinduktion gegenüber Allotransplantaten Rolle von Rho-GTPasen in der Tumorangiogenese Zentralprojekt: Mausmodelle der Leukämie (Teil der Forschergruppe: Pathologische Genprodukte und ihre Wirkungsmechanismen ) Isolation und Charakterisierung endothelialer Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut, Subprojekt des Teilprojektes C3 Analysis of the multistep nature of homing and incorporation of circulating progenitor cells during tumor angiogenesis im Rahmen des TR-SFB Vergleichende Analyse mesenchymaler Stammzellen aus Knochenmark, Nabelschnurblut oder Fettgewebe OsteoCord Bone from Blood: Optimised isolation, characterisation and osteogenic induction of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood Standardisierung für die Regenerative Medizin (START-MSC) Stammzellbank mesenchymaler Stammzellen aus Nabelschnurblut und Entwicklung GMP-konformer Prozessierungstechniken Deutsches Register für Stammzelltransplantationen Adoptive Immuntherapie maligner Erkrankungen mittels der immortalisierten natürlichen Killerzelllinie NK Adoptive Immuntherapie der chronischen CMV-Infektion nach allogener Knochenmark- oder peripherer Blutstammzelltransplantation: eine Phase I/II-Studie Stammzellen für die regenerative Medizin Genomische Stabilität von hämatopoetischen Stammzellen nach Bestrahlung mit hochenergetischen schweren Ionen

3 Inhalt Langzeit-Sicherheitsbeobachtung im Rahmen der Gewinnung allogener Blutstammzellen (allopbsc) von gesunden Fremdspendern nach Vorbehandlung mit rhug-csf (Filgrastim oder Lenograstim) CD34-positive Stammzellen im peripheren Blut als "Repair-Mechanismus" nach cerebralem ischämischem Insult Knochenmarkstammzellen zur intrakoronaren Therapie bei akutem Myokardinfarkt im Rahmen einer placebokontrollierten, randomisierten, doppelt-blind Studie Untersuchungen zu mesenchymalen Stammzellen: Isolierung, Charakterisierung, Differenzierung, Seneszenz, GMPkonforme ex vivo Expansion und Migrations-Monitoring TTr raannssppl llaann ttaat t tti iioonnssmmeeddi iizzi iinn uunndd IImmmmuunnggeenneet I tti iikk Immunregulation von natürlichen Killer Zellen und Krankheitsprädisposition bei Autoimmunität Forschergruppe - Universitätsklinikum Frankfurt: Induktion immunologischer Toleranz durch Übertragung hämatopoetischer Stammzellen Individuell angepasste Immunsuppression nach allogener Transplantation durch molekulardiagnostisches Immunmonitoring Entwicklung von Reagenzien zur automatisierten Sequenz-basierten HLA-Typisierung Einfluss von Zytokin- und Gerinnungsfaktor-Genpolymorphismen auf das Überleben von Nierentransplantaten Einfluss von immunologisch relevanten Nicht-HLA-Genpolymorphismen in der Stammzelltransplantation Immunrekonstitution nach Blutstammzelltransplantation: Entwicklung von Methoden und Untersuchungsstrategien für HLA- und KIR-Differenzen im Rahmen der Gewebeverträglichkeit bei Blutstammzelltransplantation MMool lleekkuu llaar l ree PPaat tthhoopphhyyssi iiool llooggi iiee,,, DDi iiaaggnnoosst tti iikk uunndd TThheer raapp iiee i Analyse und Genreparatur angeborener Immun- und Hämatopoesedefekte I Analyse und Genreparatur angeborener Immun- und Hämatopoesedefekte II Diagnostik und Therapie der PNH Stammzelltransplantation bei aplastischer Anämie und paroxysmaler nächtlicher Hämoglobinurie BloodGen: Blutgruppen-Bestimmung und Genotypisierung Aufklärung des Polymorphismus im Rhesus-Blutgruppensystem Identifizierung und Aufklärung der klinischen Relevanz von RhCcEe-Varianten Molekulare Grundlagen abgeschwächter Antigeneigenschaften im ABO und RhCE System Charakterisierung der molekularen Grundlagen des Aspirin-like Defekts bei pädiatrischen Patienten und deren Familien. 139 Identifizierung und Charakterisierung neuer Rezeptoren bei Thrombozyten Genetische Variabilität von Genen der Blutgerinnung in der Normalbevölkerung Pharmakogenetik der oralen Antikoagulation Molekulare Diagnostik von erblich bedingten hämorrhagischen und thromboembolischen Krankheitsbildern der Blutgerinnung Molekulargenetische Analysen bei Hämophilie A-Patienten zur Analyse des Hemmkörperrisikos bei Anwendung von ADVATE - FVIII-Konzentrat Gentherapie der Hämophilie mittels intravaskulärer Administration von nicht-viralen Vektoren Optimierung einer rekombinanten FVIII Produktion in heterologen Zellsystemen und Analyse des FVIII- Sekretionsweges Entwicklung eines gentherapeutischen Ansatzes zur Behandlung der Hämophilie A Pharmakokinetik und thrombotische Aktivität von FVIII Etablierung und Analyse eines Mausmodels mit fluoreszensgekoppelten FVIII (FVIII-GFP) Prospektive Untersuchung zur Bedeutung von Einflussfaktoren auf die Blutungsinzidenz hämophiler Patienten Untersuchung der Interaktion von Blutgerinnung und zellulärem Immunsystem bei Reif- und Frühgeborenen und deren Korrelation mit postnatalen Erkrankungen Finanzierung der Forschung Publikationen Wissenschaftlichen Vorträge, publizierte Abstracts Wissenschaftspreise / Posterpreise Ausgerichtete wissenschaftliche Kongresse, Symposien Lehrveranstaltungen Fortbildungsveranstaltungen Akademische Ausbildung Mitgliedschaften/Funktionen Organe der Gesellschaft Impressum

4 Entwicklung der Forschung Entwicklung der Forschung im fusionierten Blutspendedienst von 2001 bis 2006 Sehr geehrte Leserin, Sehr geehrter Leser, die Landesverbände Baden, Baden-Württemberg und Hessen des Deutschen Roten Kreuzes sowie die Städte Frankfurt am Main und Kassel realisierten den Zusammenschluss ihrer Blutspendedienste im Jahr Hintergrund waren vor allem Überlegungen, der großen Herausforderung durch die sich ändernde Demographie im Blutspendewesen adäquat zu begegnen. Die Zahl der BlutspenderInnen zeigt eine rückläufige Tendenz, währenddessen der Bedarf an Blut und Blutpräparaten in Deutschland permanent steigt. Darüber hinaus bestehen wachsende Anforderungen an die Sicherheit und Qualität der Blutpräparate. Die Entwicklung der modernen Hochleistungsmedizin verlangt auch von Seiten der Blutspendedienste und der Transfusionsmedizin eine zunehmende Vielseitigkeit und eine wachsende Kompetenz auf allen Feldern unseres Fachgebietes. Aus herkömmlichen Blutspendeeinrichtungen und Blutbanken entstehen hoch differenzierte und hochleistungs-fähige Institute für eine moderne und kompetente Transfusionsmedizin mit dem Anspruch, auch den höchsten Erwartungen der Krankenhäuser der Maximalversorgung und der Universitäts-klinika in unserem Versorgungsbereich gerecht zu werden und diesen in jedweder Weise ein kooperativer und konstruktiver Partner zu sein. Dies gilt auch und insbesondere im Hinblick auf eine gemeinsame und partnerschaftliche Weiterentwicklung zukunftsweisender Zelltherapie-formen bis hin zu gentherapeutischen Anwendungen. Mit dem Zusammenschluss war klar, dass der fusionierte Blutspendedienst sich vorgenommen hat, eine forschende Einrichtung an der Spitze der Entwicklung des Fachgebietes in engem Schulterschluss mit forschenden Ein-richtungen an den Universitäten zu sein. Im Folgenden sei der Versuch einer kurzen Übersicht über das bisherig Geleistete gewagt: Da wir trotz des Zusammenschlusses eine im internationalen Vergleich kleine Einrichtung sind, haben wir uns entschlossen, bei der Profilgebung unserer Forschungsaktivitäten vier Schwerpunkte auszuwählen: Qualitätssicherung in der Blutversorgung Stammzellen und Zelltherapie Transplantationsmedizin und Immungenetik Molekulare Pathophysiologie, Diagnostik und Therapie Im Hinblick auf die Qualitätssicherung in der Hämotherapie war unsere Einrichtung weltweit die erste, der es gelungen ist, die so genannte Polymerase-Ketten-Reaktion (polymerase chain reaction = PCR) methodisch so zu entwickeln und in einer Weise in das Blutspendewesen zu integrieren, dass es möglich war, Erythrozyten- und Thrombozytenkonzentrate sowie gefrorenes Frischplasma (GFP) auf der Basis eines virusfreien Ergebnisbefundes für die in unserem Versorgungsgebiet zu transfundierenden Patienten freizugeben. Das Ergebnis dieser Arbeiten schlug sich in einer Erstpublikation in der Fachzeitschrift The Lancet nieder. Dies hat dazu geführt, dass wir in der zurückliegenden Phase für die DRK-Blutspendedienste Rheinland-Pfalz, Thüringen, Nordrhein-Westfalen, für die Bundeswehr, für die österreichischen Blutspendedienste in Kärnten, Vorarlberg, Wien und Graz sowie für das Luxemburgische Rote Kreuz und auch für andere Einrichtungen getestet haben. Die Methode wurde darüber hinaus auch an andere Blutspendedienste wie z. B. das Bayerische Rote Kreuz transferiert, das bis zum heutigen Tage nicht nur die eigenen, sondern auch die Blutspenden für die Blutspendedienste in Innsbruck und Salzburg mit der in Frankfurt entwickelten Methode testet. Zahlreiche weitere Blutspendedienste haben angefragt, konnten jedoch wegen stringenter Lizenzverträge mit Patentinhabern nicht bedient werden. Im Oktober 2006 ist es gelungen, für unsere Inhouse- Methode die CE-Zertifizierung zu erhalten. Damit ist die in unserem Blutspendedienst entwickelte PCR-Methode zum direkten Virusnachweis beim Blutspendescreening weltweit die erste und einzige Inhouse-Methode, der eine CE-Zertifizierung erteilt wurde. Nicht wenige wissenschaftliche Publikationen aus diesem Bereich unseres Blutspendedienstes sind bis heute wegweisend. 3

5 Entwicklung der Forschung Der Blutspendedienst hat, beginnend mit 2001, nacheinander sämtliche Institute und Tochtergesellschaften nach DIN EN ISO 9001:2001 zertifiziert und die Laboratorien nach DIN EN ISO akkreditiert. Damit war unser Blutspendedienst der Erste des Deutschen Roten Kreuzes, dem es gelungen ist, ein zertifiziertes Qualitätsmanagementsystem in allen seinen Bereichen zu etablieren. Aus dieser Arbeit heraus ist ein Profil des Blutspendedienstes erwachsen, das zu mehreren Projekten im Europäischen Bereich geführt hat: Außer der Restrukturierung des Blutspendedienstes in Malta wurden uns von der Europäischen Kommission zwei große EU- Projekte übertragen, in denen wir unter Teilnahme von jeweils 16 bis 18 EU-Ländern konsensuell Bestandteile eines Qualitätsmanagementsystems auf der Basis des von uns bereits Etablierten erarbeiten (Europäisches Projekt EU-Q-Blood-SOP: Entwicklung von Standards zur Etablierung von Qualitätsmanagementsystemen in der Transfusionsmedizin). In einem zweiten, bis 2010/2011 dauernden Projekt sollen unter unserer Federführung Kriterien für das Inspektionswesen und die Auditierung von Blutspendeeinrichtungen festgelegt werden (Europäisches Projekt EU-Blood-Inspection (EUBIS): Entwicklung von Standards und Kriterien entsprechend Direktive 2002/98/EC und 2005/62/EC für die Inspektion von Blutspendeeinrichtungen). Es ist vorgesehen, die Ergebnisse in zwei Manuals zusammenzufassen und diese dann mehrsprachig unter der EU-Kommission als Herausgeberin zu publizieren. Darüber hinaus beteiligen wir uns an einem neuen Projekt der EU zur korrekten Anwendung von Blutpräparaten (EU Optimal Blood Use Project) und dem BOTIA (Blood and Organ Transmitted Infectious Agents)-Projekt. Ein besonderer und innovativer Schwerpunkt unserer Arbeit ist die Weiterentwicklung der Stammzell- und Zelltherapien. Von Anbeginn der Knochenmarktransplantation war unser Institut in Ulm unverzichtbarer Partner der Abteilung Hämatologie am Universitätsklinikum Ulm. Beginnend in 1992 wurden wissenschaftlich und für die Versorgung der Patienten auch in den Instituten Frankfurt, Mannheim und Kassel entsprechende Strukturen aufgebaut. Mittlerweile sind zahlreiche Arbeitsgruppen an den verschiedenen Standorten sowohl mit den Universitätsklinika als auch untereinander derartig vernetzt, dass es gelungen ist, eine Reihe Fördermittel z. B. von der Deutschen Forschungsgemeinschaft, der José-Carreras-Stiftung, der Deutschen Krebshilfe usw. zu erhalten. Die wissenschaftliche Kompetenz und letztlich die dadurch bedingte fachliche Akzeptanz führte dazu, dass wir zu einem stabilen und großen Partner renommierter Einrichtungen bei der Versorgung mit Stammzellpräparaten geworden sind (siehe Abbildungen 6 u. 7). Herausragender Höhepunkt dieser Arbeit war die Septemberausgabe des international renommierten wissenschaftlichen Journals New England Journal of Medicine 2006, in der in drei von vier dort publizierten Originalarbeiten unsere Einrichtung in der Autorenschaft vertreten war (N Engl J Med 2006;355: ; N Engl J Med 2006;355: ; N Engl J Med 2006;355: ). Insbesondere die Stammzelltherapie bei der Behandlung von Patienten mit akutem Herzinfarkt stellt eine faszinierende Perspektive dar. Der Bereich der Transplantationsmedizin und Immungenetik wäre ohne hochqualifizierte und bestausgestattete HLA-Laboratorien nicht vorstellbar. Durch die Implementierung der jeweils modernsten Methoden einschließlich der Entwicklung von Inhouse-Methoden und deren CE-Zertifizierung ist es nicht nur gelungen, wissenschaftlicher Partner der klinischen Kollegen zu sein, sondern über diesen Weg und über die enge Verflechtung der Arbeit vor Ort mit den klinischen Kollegen, verantwortungsvolle Aufgaben zu übernehmen: So sind wir an unseren wichtigsten Standorten eines der großen so genannten Suchzentren ; dies bedeutet, dass wir im Auftrag der Hämatologen geeignete Stammzell- bzw. Knochenmarkspender zur Therapie vital bedrohter Patienten suchen (siehe Abbildung 7). Basis für diese Zusammenarbeit ist die Jahrzehnte lange Aufbauarbeit von wissenschaftlicher und klinischer Expertise auf dem Gebiet der HLA-Diagnostik, die Etablierung und Entwicklung eigener Knochenmark- und Stammzellspenderdateien sowie die Etablierung des Zentralen Knochenmarkregister Deutschlands (ZKRD) in Ulm. Sowohl über unsere eigenen Dateien als auch über das ZKRD gelingt es in sehr vielen Fällen, Spender zu finden und damit Leben zu retten. Die auf diesem Weg aufgebaute wissenschaftliche Kompetenz und Logistik führte im Weiteren dazu, dass die Deutsche Stiftung Organtransplantation (DSO) unsere Einrichtung in Frankfurt als Referenzzentrum für die Organtransplantation Deutschland Mitte ausgewählt hat. Jedes Jahr werden auf der Basis der Tag und Nacht an sieben Tagen in der Woche durchgeführten Untersuchungen Organe transplantiert. Diese Entwicklung zeigt in anschaulicher Weise die Verknüpfung wissenschaftlicher Arbeit mit klinischem Nutzen. 4

6 Entwicklung der Forschung Im Bereich der Molekularen Pathophysiologie, Diagnostik und Therapie wurden in den letzten Jahren vier Gebiete wissenschaftlich bearbeitet: An unserem Institut Ulm untersucht unsere Arbeitsgruppe Analyse und Genreparatur angeborener Immun- und Hämatopoesedefekte die Hintergründe und Therapiemöglichkeiten bei Erkrankungen der Abwehrzellen und der Blutbildung. Eine weitere renommierte Forschungsgruppe beschäftigt sich eingehend mit der molekularen Diagnostik von Antigenen auf roten Blutzellen. Auch hier wird im Rahmen eines EU-Projektes europaweit im Bereich Immunhämatologie kooperiert (BloodGen: Blutgruppen-Bestimmung und Genotypisierung). Auch mit den an der Blutgerinnung beteiligten Blutplättchen, den Thrombozyten, und deren Interaktionen beschäftigen sich Forschungsgruppen unserer Institute im Verbund mit klinischen Kollegen. Und schließlich versuchen Arbeitsgruppen, über Gentransfer die Hämophilie = Bluterkrankheit zu heilen. Hierbei ist es bisher gelungen, eine Methode zu etablieren, die bei Hämophiliemäusen zu einer Heilung der Blutungsneigung führte. Es dürfte außergewöhnlich schwierig sein, diese Verfahren bis zum Einsatz am Menschen weiterzuentwickeln. Daneben wurden wissenschaftliche Arbeiten auf dem Gebiet der Genetik der Gerinnungskrankheiten durchgeführt, worauf über lange Zeit hinweg unsere Einrichtung international führend war. Hierzu zählt auch die Erstentdeckung des so genannten Vitamin K-Gens, das regulativ in die Synthese von Gerinnungsfaktoren eingreift. Diese Erstentdeckung einer Arbeitsgruppe unseres Blutspendedienstes in enger Zusammenarbeit mit Forschungsgruppen in Würzburg und München führte zu einer Publikation in Nature einem der renommiertesten internationalen Publikationsorgane der Naturwissenschaften und ist derzeitig Gegenstand zahlreicher internationaler wissenschaftlicher Arbeiten im Hinblick auf die biologische Bedeutung des Vitamin K-Gens in unterschiedlichsten physiologischen und pathophysiologischen Zusammenhängen. Die nur exemplarische Darstellung einiger wissenschaftlicher Arbeiten zeigt, dass es gelungen ist, für unseren Blutspendedienst ein klares wissenschaftliches Profil zu erarbeiten. Einige wissenschaftliche Arbeiten fanden direkt Eingang in die klinische Anwendung, andere waren wegweisend für die Weiterentwicklung und die weitere wissenschaftliche Arbeit auf diesen Gebieten. Die wissenschaftliche Profilbildung führte dazu, dass eine immer weitergehende Vernetzung mit Universitätsklinika erfolgt ist: Neben Lehrstühlen für Transfusionsmedizin an den medizinischen Fakultäten in Frankfurt, Mannheim und Ulm und der Ernennung der Institutsdirektoren zu Universitätsprofessoren (C4) ist eine enge formale Kooperation mit den Fakultäten in Heidelberg und Tübingen entstanden. Darüber hinaus sind zwei ehemalige Oberärzte aus unseren Instituten zum wissenschaftlichen Vortrag vor Berufungskommissionen zweier medizinischer Fakultäten eingeladen worden, was in beiden Fällen zu erfolgreichen Berufungen auf Lehrstühle verbunden mit der Leitung universitärer transfusionsmedizinischer Institute geführt hat. Die wissenschaftliche Arbeit führte zu mehreren Habilitationen und Ernennungen von außerplanmäßigen Professuren in den verschiedenen Instituten. Der tägliche Umgang mit Studenten und die Übernahme von Lehrverpflichtungen trugen auch dazu bei, dass immer mehr Studenten das Fachgebiet der Transfusionsmedizin für interessant genug befanden, ihre Doktorarbeit auf diesem Gebiet zu fertigen: Derzeit sind 33 Doktoranden an unseren Instituten beschäftigt; seit 2001 haben mehr als 20 ihren Doktortitel bei uns erworben. Unser Engagement auf dem Gebiet der Lehre und Studentenausbildung spiegelt sich nicht nur wider in der Zahl der Vorlesungen und Unterrichtsveranstaltungen, sondern auch in der Tatsache, dass einer unserer ärztlichen Direktoren zum Studiendekan einer medizinischen Fakultät berufen wurde. Einige Kennzahlen der Forschungsleistungen sind nachfolgend grafisch dargestellt. Die Wahlen leitender Wissenschaftler zu Vorstandsmitgliedern bzw. zu Vorsitzenden der wissenschaftlichen Fachgesellschaften Deutsche Gesellschaft für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie (DGTI), der Deutschen Gesellschaft für Immungenetik (DGI) und der International Society of Blood Transfusion (ISBT) belegen die Akzeptanz unserer Arbeit in der nationalen und internationalen Fachwelt. Erfolge waren die Durchführung der nationalen Kongresse der DGTI in Mannheim 2004 (Prof. Klüter) und in Frankfurt a. M (Prof. Seifried) sowie der DGI in 2001 in Frankfurt a. M. und 2004 in Dresden (Prof. Seidl). In 2009 wird der Kongress der European Federation of Immunogenetics (EFI) in Kombination mit der Deutschen Gesellschaft für Immungenetik (DGI) in Ulm (PD Mytilineos) stattfinden. Ein Höhepunkt wird der Weltkongress der International Society of Blood Transfusion (ISBT) sein, der als Joint Congress mit der DGTI 2010 in Berlin (Prof. Seifried) stattfinden wird. 5

7 Entwicklung der Forschung Anzahl (gesamt) Abbildung 1: Anzahl der laufenden Forschungsprojekte Anzahl (gesamt) Abbildung 2: Anzahl der Publikationen : Insgesamt wurden 472 Artikel publiziert. 6

8 Entwicklung der Forschung Abbildung 3 zeigt, dass im Blutspendedienst Baden-Württemberg Hessen seit der Fusion eine kontinuierliche Zunahme des jährlichen kumulativen Impakt-Faktors erreicht wurde, mit einem Anstieg für 2006 auf beinahe das Dreifache des Wertes im Jahre Impaktfaktor (kumulativ) 600,0 500,0 400,0 300,0 200,0 100,0 0,0 552,3 409,6 261,1 218,1 175,9 194, Abbildung 3: Entwicklung der Qualität der Publikationen , ausgedrückt durch den sog. Impaktfaktor des Science Citation Index. Dieser Faktor bewertet, kategorisiert nach Zeitschriften, von wem und wie oft in einer be-stimmten Zeit die publizierten Artikel von anderen Autoren zitiert werden. Der Impaktfaktor ist nicht nach (Co-) Autorenschaft berichtigt. Der kumulative Impaktfaktor liegt bei 1811,8. Eingeworbene Drittmittel zur Finanzierung von Forschung und Entwicklung Für die Finanzierung von Forschung und Entwicklung im Blutspendedienst werden außer Eigenmitteln von extern eingeworbene Geldmittel genutzt. In einigen Instituten stehen außerdem in begrenztem Umfang auch strukturelle Mittel aus dem Haushalt der Universitäten zur Verfügung. Im Berichtszeitraum ist es den Instituten des DRK Blutspendedienstes Baden- Württemberg Hessen gemeinsam mit Forschungsgruppen aus dem In- und Ausland gelungen, insgesamt etwas mehr als elf Millionen Euro an Mitteln einzuwerben. Der größte Anteil entspricht dabei sogenannten Peer-Review -unterworfenen Mitteln: Hierbei werden kompetitive Forschungsanträge durch unabhängige externe Fachgutachter zur Förderung ausgewählt. Abbildung 4 stellt diese Entwicklung der Drittmitteleinwerbung im Blutspendedienst für den Berichtszeitraum dar. 7

9 Entwicklung der Forschung Gesamtsumme eingeworbener Drittmittel [Mio. Euro] 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 sonstige Drittmittel begutachtete Drittmittel Abbildung 4: Entwicklung der eingeworbenen Drittmittel zur Projektförderung unter Beteiligung von Wissenschaftlern des Blutspendedienst Baden-Württemberg Hessen ggmbh Die bewilligten Gesamtbeträge für ein Projekt wurden jeweils dem Jahr der Bewilligung zugeordnet. Der kumulative Betrag (Gesamteinwerbung) von 2001 bis 2006 liegt bei etwas über 11 Millionen. Wissenschaftliche Fort- und Weiterbildung, Förderung des wissenschaftlichen Nachwuchses, Promotionen, Habilitationen und Berufungen Insgesamt schlossen an unseren Instituten zwischen 2001 und 2006 mehr als 20 Doktoranden ihre Dissertation erfolgreich ab. Vier Oberärzte habilitierten sich an ihren jeweiligen medizinischen Fakultäten. Drei Oberärzte erlangten die Bezeichnung außerplanmäßiger Professor, und zwei ehemalige Oberärzte erhielten einen Ruf auf eine C3- bzw. C4-Professur. Zwischen 2001 und 2006 wurden 33 wissenschaftlichen Veranstaltungen und Kongresse ausgerichtet. Für die zahlreichen Lehrveranstaltungen an den Universitäten sei auf die Aufstellung am Ende dieses Berichtes verwiesen. Unter Federführung des ersten Vorsitzenden der Forschungsgemeinschaft geben die DRK- Blutspendedienste seit 2003 bundesweit gemeinsam das Fachmagazin hämotherapie Beiträge zur Transfusionsmedizin heraus. Ziel ist die kontinuierliche Fort- und Weiterbildung der klinisch tätigen Ärzte und medizinisch-technischen AssistentInnen (MTA) auf unserem Fachgebiet. Die Auflage liegt derzeit bei Stück pro Ausgabe zusätzliche Downloads ( bestätigen die Qualität und Relevanz der publizierten Beiträge. In den bisher acht Ausgaben haben Autorengruppen unserer Institute für mehr als 40% der Beiträge die wissenschaftliche und inhaltliche Verantwortung übernommen (Abbildung 5). 8

10 Entwicklung der Forschung Ausgaben 1/2003 bis 8/2006 (n = 51): Autorenschaften 14% 8% 6% 4% BSD Ba-Wü-He B C D E F 27% 41% Abbildung 5: Autorenanteil des DRK Blutspendedienstes Baden-Württemberg Hessen in der Zeitschrift hämotherapie Beiträge zur Transfusionsmedizin (Ausgaben 1/2003 bis 8/2006; Gesamt: 51 Beiträge im Mantelteil). Entwicklung der Knochenmarkfremdspender-Dateien der Institute Frankfurt, Mannheim und Ulm sowie der Sucheinheiten in Frankfurt und Ulm Neben dem Zentralen Knochenmarkspender-Register Deutschland (ZKRD), einem 100%igen Tochterunternehmen unseres Blutspendedienstes in Ulm, in welchem bundesweit die Spendersuchen für alle deutschen Patienten zusammengeführt werden, betreibt der DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg Hessen ggmbh an seinen Instituten in Frankfurt, Mannheim und Ulm eigenständige Knochenmarkspender-Register, in welchen sich gesunde Freiwillige als potentielle Knochenmarkstammzell-Fremdspender für Patienten mit Leukämien und anderen Bluterkrankungen registrieren und HLA-typisieren lassen können. Im Zeitraum 2001 bis 2006 konnte die Zahl der typisierten Spender von unter auf über gesteigert werden (Abbildung 6). Anzahl Spender (n) Freiwillige Knochenmark-Spender in den Dateien Frankfurt, Mannheim und Ulm von 2001 bis 2006 gesamt: Mannheim Ulm Frankfurt gesamt: Jahr Abbildung 6: Entwickung der Zahl der in den Dateien in Frankfurt, Mannheim und Ulm registrierten freiwilligen Knochenmarkstammzell-Spender.

11 Entwicklung der Forschung Im gleichen Zeitraum stiegen die peripheren Stammzellentnahmen von freiwilligen Spendern aus unseren drei Dateien von 23 im Jahr 2001 auf 122 im Jahr 2006, während im gleichen Zeitraum die Knochenmarkentnahmen in etwa konstant blieben und zwischen 10 und 20 pro Jahr schwankten (Abbildung 7). Jährlich führen wir für 500 bis 700 leukämiekranke Kinder und erwachsene Patienten der Universitätskliniken Frankfurt und Ulm sowie weiteren ca. 20 Transplantationskliniken in Deutschland Knochenmark-Fremdspender-Suchen aus den weltweiten Dateien durch. Entnahmeformen/Jahr bei Spendern aus den Dateien Frankfurt, Mannheim und Ulm kumulativ : PBSC-E: 426 KM-E: Anzahl (n) PBSC-E KM-E Jahr Abbildung 7: Entwicklung der Entnahmen pro Jahr bei Spendern aus unseren freiwiligen Knochenmarkspender- Dateien. Dargetellt ist die Zahl der jährlichen Entnahmen nach Entnahmeform. PBSC-E: Entnahme von ins periphere Blut mobilisierten Stammzellen; KM-E: Entnahme von Stammzellen aus dem Knochenmark. Wenngleich die Entwicklung der letzten fünf Jahre Grund zu Optimismus ist, sind wir uns bewusst, dass die ersten Erfolge der Vergangenheit keine Garantie für die Zukunft sind. Wir sind daher alle gewillt, unsere Anstrengungen auf dem Gebiet der Wissenschaft in der Transfusionsmedizin zu intensivieren. Unser Dank und gleichzeitig auch unsere Hoffnung in diesem Zusammenhang gilt nicht nur allen unseren engagierten MitarbeiterInnen, sondern auch unseren Förderern und Drittmittelgebern, nicht zuletzt den Kollegen und MitarbeiterInnen aus den kaufmännischen, Verwaltungs- und technischen Bereichen sowie der konstruktiv-wohlwollenden Begleitung durch die Aufsichtsratmitglieder und Gesellschafter unseres Blutspendedienstes. Prof. Dr. med. Erhard Seifried 10

12 Forschung 2006 Forschungstätigkeiten im Jahr 2006 Schwerpunkt I: Qualitätssicherung in der Blutversorgung Dieser Bereich vereinigt die Aktivitäten in Forschung und Entwicklung zur Sicherstellung der bestmöglichen Qualität auf dem Gebiet der Blutversorgung. Der Handlungsbedarf für intensivierte Forschungs- und Entwicklungstätigkeiten auf diesem Gebiet begründet sich vor allem durch die derzeit bekannten Ursachen für unerwünschte Wirkungen von Blutpräparaten und den hieraus abzuleitenden Notwendigkeiten zur weiteren Verbesserung der transfusionsmedizinischen Versorgung. Er betrifft Herstellung, Testung, Freigabe, Abgabe sowie Dienstleistungen für Krankenhäuser. In dem Schwerpunkt werden gegenwärtig folgende Hauptziele verfolgt: Entwicklung diagnostischer Methoden zur bestmöglichen Sicherheit hinsichtlich viraler und bakterieller Kontaminationen der Blutpräparate Pathogeninaktivierungsverfahren zur Reduktion von Viren, Bakterien und weiteren infektiösen Agenzien immunhämatologische Fragestellungen Risikominimierung durch ein zertifiziertes Qualitätsmanagementsystem Auf dem Gebiet der bestmöglichen Diagnostik zur Verbesserung der Virus- und bakteriellen Sicherheit von Blutpräparaten konzentrieren sich die Aktivitäten auf die Institute in Frankfurt und Ulm. Die Studie der Forschungsgemeinschaft der DRK-Blutspendedienste zur Erfassung der bakteriellen Kontamination in Apherese- und Pool-Thrombozytenkonzentraten (Transfusion 47:644, 2007) zeigte eine vergleichbare, jedoch signifikante bakterielle Kontaminationsrate der beiden Produkte. Zudem zeigte sich, dass trotz Testung jedes Produktes wegen der nicht vermeidbaren zeitlichen Verzögerung leider nicht jedes kontaminierte Produkt von der Anwendung ausgeschlossen werden konnte. Weitere Projekte im Institut Frankfurt nahmen die im Jahre 2006 eingeführte generelle Testung aller Blutspender auf die Anwesenheit des Infektionsmarkers anti-hbc für die Hepatitis B Infektion zum Anlass, die Charakteristika der derzeit zur Verfügung stehenden Tests zu vergleichen und erbrachten neue Daten zur Validität insbesondere von Messergebnissen im Bereich des sog. Cutoff Werts. Außerdem beschäftigte sich der Bereich mit der Verbesserung der Aussagen bei Vorliegen positiver Befunde für das mit der PCR untersuchte Parvovirus B19 der generellen Erfassung auch neuartiger Erreger wie z.b. des SARS-Virus im Rahmen des europäischen Konsortiums BOTIA der Entwicklung eines CE-zertifizierten PCR-Testkits zum direkten Virusnachweis in Blutpräparaten der Entwicklung eines automatisierten Verfahrens der PCR-Testung. Eine weitere Strategie zur Steigerung der Infektionssicherheit von Blutpräparaten stellen die sogenannten Pathogeninaktivierungsverfahren dar, deren Funktionsweise auf der Zugabe von in die DNA interkalierenden Substanzen und UV-Bestrahlung der Blutprodukte beruht. Nach den Vorarbeiten der Gruppe um Prof. Klüter und Frau Dr. Janetzko im Institut in Mannheim zur Verträglichkeit von mittels Apherese hergestellten Thrombozytenkonzentraten, die mit dem Psoralenderivat Amotosalen und UV-A Bestrahlung behandelt wurden, wurde in Mannheim ein PCR-Verfahren zur Messung der Vollständigkeit der Inaktivierung in jedem Produkt entwickelt. Für das Psoralen-Verfahren wurde im Institut Frankfurt die Inaktivierung von Plasmapräparaten und mögliche Auswirkungen auf wichtige Gerinnungsparameter untersucht. Gegenwärtig gibt es Planungen für einen limitierten klinischen Einsatz pathogeninaktivierter Thrombozytenkonzentrate im Rahmen einer Anwendungsbeobachtung. 11

13 Forschung 2006 Im Bereich Immunhämatologie steht die Bereitstellung einer national und international führenden Qualität in der Sicherheit und Aktualität der Blutgruppendiagnostik im Vordergrund der Aktivitäten. Hierzu werden aus Ulm die im Rahmen der nationalen DGTI-Studie zur Qualitätssicherung erhobenen Ergebnisse von schwachen D Typen in Transfusionsempfängern vorgestellt. Ergänzend hierzu beschäftigt sich eine Arbeitsgruppe in den Instituten in Mannheim und Baden-Baden mit der Optimierung des Blutspenderscreenings bei der Blutgruppenbestimmung und Antikörperidentifizierung. Der besonders schnellen, notfallangepassten Detektion des Rhesus-Untergruppenstatus und der ABO- Blutgruppenmerkmale dienen die im Institut Frankfurt in einer Anwendungsstudie untersuchten Kartensysteme auf serologischer Basis. Ein wesentliches weiteres Element innerhalb des Schwerpunkts Qualitätssicherung in der Blutversorgung bildet der Aufbau der Risikoanalyse und bewertung sowie der Vermeidung von Risiken durch ein professionelles Qualitätsmanagementsystem. Hierbei ist zu beachten, dass für Blutspendedienste die zur Verfügung stehende Methodik im Bereich Qualitätsmanagementsysteme, insbesondere der transfusionsmedizinischen Risikobewertung, zunächst oft praktisch nicht existent war und in Eigenarbeit zunächst erst entwickelt werden musste. Die Arbeitsgruppe um MUDr. W. Sireis in Frankfurt berichtet als wesentlichen Meilenstein die erfolgreiche Rezertifizierung der bereits seit 2001 zertifizierten Institute und die 2006 abgeschlossene Zertifizierung sämtlicher Institute der Tochtergesellschaften. Weiterhin wurden neue Systeme und Dokumente zur Erfassung und Bewertung von Risiken erarbeitet. Zusätzlich gelang es seit 2005 mit dem ersten EU-weiten Projekt im Rahmen des Förderprogramms Öffentliche Gesundheit, unter der Projektleitung von Prof. Dr. E. Seifried im Institut Frankfurt eine zentrale Stelle für Forschungs- und Entwicklungstätigkeiten im Rahmen der Harmonisierung von Qualitätsstandards im Bereich der Transfusionsmedizin zu etablieren. Die 2006 bearbeiteten Projekte befassen sich mit der Erstellung eines Handbuches zur Abfassung von Standardarbeitsanweisungen (EU-Q-BLOOD-SOP Projekt), der Erarbeitung von Richtlinien für die Inspektion von Blutspendeeinrichtungen (EUBIS-Projekt), sowie in einer bilateralen Zusammenarbeit mit Strategien zur Qualitätssicherung gemeinsam mit dem Blutspendedienst in Malta. 12

14 Forschung 2006 Schwerpunkt II: Stammzellen und Zelltherapie Seit jeher ist die Bereitstellung von Blutzellen zur intravenösen Anwendung eine Kernaufgabe der Transfusionsmedizin. Gegenwärtig werden in diesem Schwerpunkt die Klinische Anwendung von Stammzellen und Zelltherapeutika sowie die Entwicklung präklinischer Modelle für Stammzelltherapien bearbeitet. Im Bereich der klinischen Anwendung von Stammzellen und Zelltherapeutika gelang es zunehmend, Kooperationspartner für Anwendungen neuer innovativer Zelltherapieformen zu gewinnen und mit ihnen gemeinsam klinische Studien mit im Blutspendedienst hergestellten Zellpopulationen zu initiieren. Im Institut Frankfurt sind dies seitens des Universitätsklinikums Frankfurt die Klinik für Kinderheilkunde III (Pädiatrische Hämatologie und Onkologie) und die Medizinische Klinik II (Hämatologie / Onkologie, Rheumatologie, Infektiologie): Natürliche Killerzellen (Zellinie NK-92) bei Patienten mit Tumoren und Leukämien die Medizinische Klinik III (Kardiolologie, Angiologie/ Hämostaseologie): Stammzellen bei Patienten mit akutem Herzinfarkt sowie seitens des Universitätsklinikums Würzburg die Medizinische Klinik II: CMV-spezifische T-Lymphozyten bei immunsupprimierten Patienten im Institut Mannheim die Universitätsklinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie in Mannheim mit dem Deutschen Krebsforschungszentrum Heidelberg: dendritische Zellen bei Patienten mit Tumoren im Institut Ulm die Klinik für Innere Medizin III (Hämatologie, Onkologie, Rheumatologie und Infektionskrankheiten): dendritische Zellen bei Patienten mit Leukämien die Klinik für Innere Medizin II (Kardiologie, Angiologie, Pneumologie, Sport- und Rehabilitationsmedizin): Stammzellen bei Patienten mit Myokardinfarkt die Klinik für Hals-Nasen- und Ohrenheilkunde: opsonisierte Lymphozyten bei Patienten mit Tumoren. die Klinik für Kinder- und Jugendmedizin Transplantation hochaufgereinigter Stammzellen bei Immundefekten Als wichtige Voraussetzung für klinische Studien mit zellulären Therapien wird als strategisches Ziel die Etablierung präklinischer Modelle verfolgt: Im Bereich der Stammzell-Therapie wurde zwischen den Arbeitsgruppen an vier Standorten eine umfassende Initiative zur präklinischen Untersuchung und GMP-Produktion Mesenchymaler Stammzellen (MSC) aufgebaut. Hierbei übernehmen die einzelnen Arbeitsgruppen anteilig unterschiedliche Aufgaben, die in Tabelle 1 zusammengefasst sind: Tabelle 1: Aufgabenverteilung der Bearbeitung präklinischer Entwicklung Mesenchymaler Stammzellen (MSC) im DRK Blutspendedienst Baden-Württemberg Hessen. Aufgabe Isolierung Sortierung Markierung Tiermodell GMP-Reagenzien Institut MA TÜ, UL TÜ, UL F MA, UL Diese Initiative wird seit 2006 im Rahmen einer Kooperation mit dem nationalen französischen Blutspendedienst EFS, ebenfalls mit dem gemeinsamen Ziel der bald möglichen klinischen Anwendung dieser Zellen z.b. innerhalb eines europäischen Konsortiums weiter ausgebaut. Zu weiteren Zelltherapieformen wurden Mausmodelle entwickelt. Ziel ist die Charakterisierung und Herstellung von Vorläuferzellen, welche die Gefäßneubildung von Tumoren regulieren in Frankfurt und Mannheim Stammzellen der Leukämie als therapeutisches Target in Frankfurt Stammzellen zur Immunmodulation bei der Transplantatabstoßung in Frankfurt Mesenchymalen Stammzellen zur Wundheilung in Kooperation mit der Klinik für Dermatologie in Ulm. 13

15 Forschung 2006 Schwerpunkt III: Transplantationsmedizin und Immungenetik Die Hauptziele der Forschungs- und Entwicklungsaktivitäten bestanden 2006 in der Erforschung der Bedeutung von Zelloberflächenrezeptoren sowie von Polymorphismen von Zytokingenen für den Transplantationserfolg in der Translation laboranalytischer Marker aus der Forschung in die Routinediagnostik. Im Fokus der Forschungsaktivitäten steht die Definition weiterer Laborparameter und Faktoren für den Transplantationserfolg. Hierzu zählen die Untersuchungen zur Bedeutung von Rezeptoren auf Natürlichen Killerzellen (Frankfurt) und von Gen-Polymorphismen von Zytokinen (Ulm). Das Institut Heidelberg beteiligte sich mit einer Studie zur individuell angepassten Immunsuppression nach Fremdspender-Stammzelltransplantation. In Frankfurt wurde darüber hinaus eine interdisziplinäre Forschergruppe zur Ermittlung von Mechanismen der Toleranzinduktion bei Diabetes mellitus infolge der Transplantation hämatopoetischer Stammzellen unter der Beteiligung des Blutspendedienstes konstituiert. Die Aktivitäten im Entwicklungsbereich waren 2006 wesentlich geprägt von den Fortschritten bei den Techniken zur DNA-Sequenzanalyse transplantationsrelevanter Gene. Im Institut Ulm wurde hierbei die CE-Zertifizierung eines solchen Verfahrens erreicht. Im Institut Frankfurt konnte die automatisierte Extraktion von DNA und die Einbindung der Abläufe in eine Labor- Informationssystem (LIMS) erfolgreich etabliert werden. Darüber hinaus wurde ein elektronischer Spenderfragebogen für die Aufnahme in Knochenmark-Spenderdateien und ein elektronischer Datentransfer zur Zentraldatei ENDIS (ZKRD) entwickelt. Schwerpunkt IV: Molekulare Pathophysiologie, Diagnostik und Therapie Die Forschung in diesem Bereich vereinigt Aktivitäten zur Aufklärung der genetischen Ursachen von Krankheiten und weiterer, diagnostisch und therapeutisch nutzbarer genetischer Anomalien und Varianten. Sie umfasst folgende Bereiche: Genetische Stammzelldefekte und Genreparatur Der in Ulm bereits langjährig bestehende Forschungsbereich, der sich mit Gendefekten in hämatopoetischen Stammzellen und undifferenzierten Vorläuferzellen des Immunsystems beschäftigt, berichtet 2006 über mehrere neu entdeckte Gendefekte, die sich im Bereich der Lymphopoese oder der Erythropoese krankheitsrelevant auswirken. Parallel dazu wurden neue Ansätze zur gezielten Genkorrektur mit Hilfe kurzer, in vitro synthetisierter DNA-Stränge etabliert, was in Modellzellinien bereits gelingt. Außerdem stehen hier die Untersuchungen zur Pathophysiologie und Therapie der aplastischen Anämie und der paroxysmalen nächtlichen Hämogobinurie im Mittelpunkt des Interesses. Diese sind durch mehrere Kooperationen mit den neuesten Therapieansätzen und klinischen Behandlungsprotokollen z.b. im Rahmen der European Bone Marrow Transpantation (EBMT) auch international und europaweit vernetzt. Immunhämatologie Die bereits langjährig bekannten Aktivitäten im Institut Ulm beschrieben und charakterisierten im Jahre 2006 neue Varianten am Rhesus-Genort und untersuchten ihre klinische Relevanz. In dem EU-geförderten BloodGen Projekt wurde darüber hinaus eine neue marktreife Anwendungstechnologie zur Diagnostik von Blutgruppen entwickelt. Im Institut Mannheim werden neue molekularbiologische Verfahren verfolgt, die Varianten im ABO-System erfassen können und damit die Blutgruppendiagnostik ergänzen können. Thrombozytenimmunologie Das Institut Mannheim bearbeitet Fragestellungen zur Bedeutung thrombozytärer Rezeptoren bei der Entstehung thromboembolischer Erkrankungen, z.b. bei Herzinfarkt oder Schlaganfall. Außerdem sind hier die zur Verfügung gestellten Methoden zur molekularbiologischen 14

16 Forschung 2006 Bestimmung von Allelen der Human Platelet Antigen (HPA) Thrombozytenantigene sowie neuartige Ansätze zur Erfassung weiterer thrombozytärer Antigene von Bedeutung. Ein weiteres Drittmittel-gefördertes Forschungsprojekt befasst sich mit den genetischen Grundlagen einer thrombozytär bedingten Gerinnungsanomalie. Hämostaseologie Der Schwerpunkt Hämostaseologie im Institut Frankfurt zielt auf die Analyse genetischer Risikofaktoren und ursächlicher Faktoren für Gerinnungsdefekte und Thromboembolien, sowie die Entwicklung einer Gentherapie für Patienten mit Hämophilie. Eine Arbeitsgruppe beschreitet neue Wege auf dem Gebiet der Hämophilie (Bluterkrankheit) durch die Etablierung einer Gentherapie. Nach der Kartierung des Sektretionswegs und des intrazellulären Trafficking von F.VIII wurden diese Ansätze in neue. effizientere Zielzellen überführt und nutzen die Beeinflussung intrazellulärer Signalwege zur Optimierung der F.VIII Produktion und Sekretion. Parallel arbeitet die Arbeitsgruppe an vektorgebundenen, jedoch zellfreien Therapieformen zur Therapie der Hämophilie-Typen A und B. Darüber hinaus werden der Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp bei Patienten mit Hämophilie A und die genetische Variabilität weiterer Gene der Blutgerinnung verfolgt. Nach der 2004 erfolgten Entdeckung des Vitamin K-Gens Vitamin-K-Epoxid-Reduktase Komplex (VKORC)-1 stehen hier Untersuchungen zu VKORC-1 abhängigen Gerinnungsdefekten und ihre Assoziation mit Störungen der Blutgerinnungsfunktion im Mittelpunkt. Am Hämophiliezentrum Frankfurt werden prospektive Untersuchungen verschiedener Einflussfaktoren bei Patienten mit Hämophilie A und B durchgeführt. Prof. Dr. med. E. Seifried PD Dr. med. R. Henschler 15

17 Forschungsstruktur der Standorte Forschungsstruktur der Standorte Das Institut Baden-Baden Institut Baden-Baden (Institutsleitung: Dr. med. Ekkehard Richter) DRK Blutspendedienst Baden-Württemberg Hessen ggmbh Gunzenbachstr Baden-Baden Telefon: +49-(0) Telefax: +49-(0) Das Institut für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie Baden-Baden des DRK- Blutspendedienstes Baden-Württemberg Hessen ist ein Versorgungsstandort mit zentralen Aufgaben. Die ausschließlich anwendungsorientierten Forschungsprojekte betreffen die Qualitätssicherung in der Blutversorgung und dienen der Optimierung der Abläufe bei der Herstellung von Blutkomponenten, der Verbesserung der Qualität und Haltbarkeit der Blutpräparate und der Untersuchung immunhämatologischer Fragestellungen, wie z.b. die Frequenz seltener erythrozytärer Antigene in der Bevölkerung bzw. unter Blutspendern. In den Abteilungen laufen routinebegleitende Analysen sowie Applikations-, Entwicklungs- und Industrieauftragsforschung. Die personellen und materiell-technischen Voraussetzungen sind darauf beschränkt. Es bestehen Kooperationen mit entsprechenden DGTI Arbeitsgruppen, Arbeitgruppen der BEST Collaborative (Conventional Component Team), des Internationalen Referenzlabors für Blutgruppen in Bristol, SCARF (Philadelphia) und dem New York Blood Center. Das am Institut ansässige Reisemedizinische Beratungszentrum organisiert jährlich in Zusammenarbeit mit Reisen und Gesundheit den Baden-Badener Tag der Impf- und Reisemedizin, der am zum 8. Mal stattgefunden hat. Die Wissenschaftliche Leitung obliegt hierbei dem Institut Baden-Baden des DRK-Blutspendedienstes Baden-Württemberg Hessen. Am Institut Baden-Baden konnten in den Jahren 2001 bis 2006 insgesamt sechs Ärztinnen bzw. Ärzte die Weiterbildung zum Facharzt für Transfusionsmedizin abschließen. Dr. med. E. Richter 16

18 Forschungsstruktur der Standorte Das Institut Frankfurt Institut für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie Frankfurt Klinikum der Johann Wolfgang Goethe-Universität DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg Hessen ggmbh (Institutsleitung: Univ. Prof. Dr. med. Erhard Seifried) Sandhofstrasse Frankfurt Telefon: Telefax: Das Institut Frankfurt nimmt die Versorgung und hämotherapeutische Beratung sowie die immunhämatologischen Laborleistungen für das gesamte Universitätsklinikum Frankfurt wahr und betreut damit das Universitätsklinikum in allen transfusionsmedizinischen Belangen. Weiterhin stellt das Institut in Mittel- und Südhessen die Versorgung von insgesamt mehr als 100 Krankenhäusern mit Blutprodukten sicher und ist Referenzlabor für andernorts nicht lösbare immunhämatologische Fragestellungen. Neben mehr als Vollblutspenden pro Jahr, die von mehr als Blutspendern entgegen genommen werden, werden mehrere hundert Stammzellapheresen in der Abteilung Zellseparation durchgeführt. Der Lehrstuhl (C4) für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie am Universitätsklinikum Frankfurt stellt Lehre und Forschung im Fachgebiet sicher. In vier Forschungsschwerpunkten wurden die Forschungsaktivitäten auch im Jahr 2006 von den Ärzten und Wissenschaftlern des Frankfurter Institutes in enger Kooperation mit dem Universitätsklinikum und weiteren assoziierten Instituten kontinuierlich ausgebaut. Im Schwerpunkt Qualitätssicherung in der Blutversorgung ist das Frankfurter Institut mit seiner Vorreiterrolle bei der Einführung molekularbiologischer Untersuchungsmethoden in das Blutspenderscreening weltweit führend. Das von medizinischen Geschäftsführung initiierte und gemeinsam mit der Arbeitsgruppe molekulare Virusdiagnostik entwickelte, auf der PCR- Technologie basierende Pool-Testverfahren stellt seit 1997 den hohen Sicherheitsstandard der Blutprodukte sicher. Die durch Einführung dieser Technik belegte, ausgeprägte Reduktion des Risikos transfusionsassoziierter Virusinfektionen trug dazu bei, dass das molekularbiologische Blutspenderscreening auf Hepatitis C bzw. den AIDS-Erreger HIV von der Bundesoberbehörde, dem Paul-Ehrlich-Institut, seit 1999 bzw bundesweit gesetzlich vorgeschrieben ist sowie in vielen Ländern weltweit zum Standard wurde. Aktuelle Forschungsaktivitäten der Arbeitsgruppe Molekulare Pathogendiagnostik (PD Dr. med. M. Schmidt) sind konsequent darauf ausgerichtet, die Sicherheit der Blutprodukte weiter zu steigern. Neben der Entwicklung optimierter PCR Kits und deren CE-Zertifizierung sowie innovativer Automationskonzepte für die Virusdiagnostik umfassen diese Aktivitäten auch epidemiologische Untersuchungen zu viralen Infektionsmarkern mit möglichem Einfluss auf die Sicherheit der Blutprodukte. Einen neuen Schwerpunkt stellt die Entwicklung von Verfahren zur Reduktion bakterieller Kontaminationen von Blutprodukten dar. Vor dem Hintergrund des bereits sehr geringen Restrisikos transfusionassoziierter Virusinfektionen gewinnen diese Forschungsaktivitäten zur Reduktion des bakteriellen Risikos zunehmend an Stellenwert. Die Arbeitsgruppe führte die bundesweit etablierte Anti-HBc-Studie der DRK-Blutspendedienste als Prüfzentrum mit durch und prüfte die Prävalenz von West-Nil-Virus in der Spenderpopulation. Im Bereich des Qualitätsmanagements unter MUDr. W. Sireis und Prof. Dr. med E. Seifried wird für das seit dem Jahre 2002 akkreditierte und zertifizierte Institut Frankfurt mit der Strukturierung eines effektiven Risikomanagementsystems die Qualität unserer Blutpräparate weiter gestärkt. Ein modernes Qualitätsmanagementsystem wie in unserem Unternehmen bedarf der ständigen Weiterentwicklung und anwendungsorientierten Forschung, um den steigenden Anforderungen der Zukunft gerecht zu werden. Die Europäische Kommission hat die Vorreiterrolle des Instituts Frankfurt in Deutschland und Europa auf diesem Gebiet erkannt und entsprechend gefördert: Mit der Leitung europaweiter Projekte im Bereich des Qualitätsmanagements ( EU-Q-Blood-SOP Project, EU-Blood-Inspection Project ) werden die im Institut Frankfurt entwickelten Standards zur Erstellung von Arbeitsanweisungen zwischen 16 europäischen Ländern gemeinsam diskutiert, angepasst, verabschiedet und eingeführt. 17

19 Forschungsstruktur der Standorte Im Bereich des Schwerpunktes Stammzellen und Zelltherapie besteht je eine Arbeitsgruppe im klinischen (PD Dr. med. T. Tonn) und im präklinischen Bereich (PD Dr. med. R. Henschler). Im Rahmen einer Langzeitsicherheitsbeobachtung nach der Gewinnung allogener Blutstammzellen von gesunden Fremdspendern werden die Auswirkungen der Vorbehandlung mit Wachstumsfaktoren (G-CSF) untersucht (Dr. med. M. M. Müller, PD Dr. med. T. Tonn). Bei der Entwicklung innovativer Zelltherapien des akuten Herzinfarktes ist die Arbeitsgruppe im Rahmen einer multizentrischen Phase III Studie (REPAIR-AMI) für die GMP-gerechte Herstellung von Knochenmarkstammzellen zur intrakoronaren Applikation verantwortlich gewesen und begleitet diesen neuen Therapieansatz nun bis zur klinischen Einführung. Die adoptive Immuntherapie maligner Erkrankungen mittels einer Natürlichen Killerzelllinie (NK- 92), die gerichtete Antitumorimmuntherapie zur Behandlung des Neuroblastoms mit natürlichen Killerzellen, eine adoptive Immuntherapie chronischer CMV-Infektionen nach Knochenmarkoder Stammzelltransplantationen durch Transfusion von hocheffizienten Immunzellen sind Beispiele der Forschungsschwerpunkte dieser Gruppe. Die genannten Studien sind in mehreren Bereichen bereits in die klinische Anwendung übergegangen und zeigen deutlich, dass hier ebenfalls Forschung und Anwendung in der Klinik eng zusammen liegen. Die Arbeitsgruppe Stammzellbiologie (PD Dr. med. R. Henschler) ergänzt diese Untersuchungen. Sie arbeitet im präklinischen Bereich mit Hilfe von Tiermodellen. Dabei untersucht die Gruppe Bedingungen, unter denen Blutstammzellen auch in der Tumortherapie eingesetzt werden können, indem sie dort die Bildung von Tumor-Blutgefäßen verhindern und die Blutversorgung im Tumor selektiv unterbinden. Weiterhin fand die Gruppe heraus, dass sogenannte mesenchymale Stammzellen nach intravenöser Verabreichung einem geregelten gewebespezifischen Homing unterliegen. Die Kenntnis dieser Mechanismen wird für die Verbesserung neuer zelltherapeutischer Therapieansätze nutzbar gemacht. Auch maligne Erkrankungen wie Leukämien werden durch stammzellartige, bösartig veränderte Zellen ausgelöst. Die Biologie der leukämischen Stammzellen wird in Kooperation mit der Medizinischen Universitätsklinik Frankfurt näher untersucht, um neue therapeutische Ansätze zur Behandlung von Leukämien zu finden. Im Schwerpunkt Transplantationsmedizin und Immungenetik fokussiert die Forschungsgruppe unter der Leitung von Prof. Dr. med. C. Seidl auf die immunologischen Mechanismen bei Autoimmunerkrankungen und nach Transplantation solider Organe, wie z. B. nach Nierentransplantationen, aber auch Knochenmark- und peripheren Stammzelltransplantationen. In enger Zusammenarbeit mit den klinischen Kollegen der Universität Frankfurt aus den Kliniken für Kinderheilkunde, Hämatologie und Onkologie, Nephrologie und Transplantationschirurgie sowie weiteren klinischen Abteilungen werden die Auswirkungen von Fehlregulationen des Immunsystems bei Autoimmunerkrankungen untersucht, das Repertoire inhibitorischer Rezeptoren von Killerzellen (KIR) bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen und Patienten nach allogener Stammzelltransplantation beschrieben und die Bedeutung retroveraler Insertionen im Bereich des HLA-Systems für Autoimmunerkrankungen untersucht. Ein weiterer Forschungsschwerpunkt dieser Abteilung ist die Wechselwirkung zwischen kindlichem und mütterlichem Immunsystem in der Schwangerschaft und die Regulation der immunologischen Toleranz. Das gleichzeitige Vorhandensein von Spender- und Empfängerstammzellen nach Stammzell- und Knochenmarktransplantation, der sogenannte Chimärismus und die damit zusammenhängenden immunologischen Auswirkungen für Patienten nach Transplantationen sind ein weiterer Forschungsschwerpunkt dieser Arbeitsgruppe. Der Schwerpunkt Molekulare Pathophysiologie, Diagnostik und Therapie umfasst in Frankfurt die Arbeiten im Bereich der genetischen Grundlagen angeborener Gerinnungsstörungen sowie der Gentherapie angeborener monogener Erkrankungen des Blutes und der Blutgerinnung. Im letztere Bereich sind Arbeitsgruppen (PD Dr. med. T. Tonn; Dr. med. J. Schüttrumpf) mit der Entwicklung sicherer und effektiver Verfahren zur gentherapeutischen Behandlung der Bluterkrankheit (Hämophilie) beschäftigt. Eine wichtige Grundlage hierzu ist die Untersuchung der Expression von rekombinanten Gerinnungsfaktoren VIII und IX. Unter der Leitung von Dr. med. C. Geisen beschäftigt sich eine weitere Arbeitsgruppe mit der Aufdeckung der molekularen Mechanismen des Vitamin K-Stoffwechsels. Dadurch lässt sich die Behandlung mit blutverdünnenden Vitamin K-Antagonisten wie Marcumar in der Klinik 18

20 Forschungsstruktur der Standorte besser vorhersagen und steuern. Ein weiterer Arbeitsbereich ist die Variabilität von Genen der Blutgerinnung in der Normalbevölkerung und ihr Einfluss auf die Ausprägung verschiedener Krankheitsbilder wie Blutungsneigung oder Thromboseneigung und auf die Wirksamkeit der für die Behandlung von Gerinnungsstörungen verwendeten therapeutischen Substanzen. Die Arbeitsgruppe Hämophilie unter der Leitung von PD Dr. med. R. Großmann beschäftigt sich mit klinischen Aspekten von Gerinnungsstörungen, insbesondere bei der schweren Bluterkrankheit. Weiterhin steht die Verträglichkeit von Gerinnungstherapeutika (speziell von DDAVP) im Mittelpunkt des wissenschaftlichen und klinischen Interesses. In Kooperation mit der Kinderklinik der Universitätsklinik Würzburg wird die Rolle von Thrombozyten, Leukozyten und deren Interaktionen untersucht. Im Mittelpunkt stehen hier die Zell-Zell-Interaktionen und deren Ausprägung im Normalkollektiv sowie bei Patienten mit entzündlichen Erkrankungen und bei Patienten nach Stammzelltransplantation. Prof. Dr. med. E. Seifried 19

21 Forschungsstruktur der Standorte Das Institut Heidelberg Institut für Immunologie (Ärztlicher Direktor: Univ. Prof. Dr. med. Stefan Meuer) Institut für Klinische Transfusionsmedizin und Zelltherapie Heidelberg (Geschäftsführer: Prof. Dr. S. Meuer und Dipl.-Volkswirt M. Stähle) Im Neuenheimer Feld Heidelberg Telefon: Telefax: Im Jahr 2006 wurde im Forschungsschwerpunkt Transplantationsmedizin und Immungenetik das Projekt Individuell angepasste Immunsuppression nach allogener Transplantation durch molekulardiagnostisches Immunmonitoring bearbeitet. Ziel dieser Untersuchungen ist die Etablierung einer verbesserten Diagnostik nach Organtransplantation, welche pathophysiologische Risikofaktoren des einzelnen Patienten identifiziert, die Abstoßungsreaktionen frühzeitig und sicher erkennt und die durch funktionelle Analyse des Immunsystems eine individuell adaptierte Immunsuppression ermöglicht. Wir konnten zeigen, dass das individuelle Risiko von frühen Komplikationen nach Lebertransplantation schon aus dem Genexpressionsmuster der Reperfusionsbiopsie feststellbar ist. Durch die quantitative Expressionsanalyse von zentralen Genen der Immunantwort ist es uns gelungen, den funktionellen Grad der Immunsuppression individuell zu erfassen. Besonders in der Langzeitbetreuung transplantierter Patienten ist dieses Wissen von klinischer Relevanz, da Patienten deren Immunsystem durch die Therapie zu stark supprimiert wird, ein erhöhtes Risiko für gehäufte Infektionen und Tumore haben. Erstmalig ist durch diese Methode eine Orientierung gegeben, welche eine individuell auf den Grad der Immunsuppression angepasste Dosierung von Cyclosporin A erlaubt. Prof. Dr. med. S. Meuer 20

22 Forschungsstruktur der Standorte Das Institut Mannheim Institut für Transfusionsmedizin und Immunologie Mannheim DRK Blutspendedienst Baden-Württemberg Hessen ggmbh Institut Mannheim (Institutsleitung: Univ. Prof. Dr. med. Harald Klüter) Friedrich-Ebert-Str Mannheim Telefon: Telefax: Im Jahr 2006 sind am Institut Mannheim drei Forschungsschwerpunkte innerhalb des Forschungsprofils des DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg - Hessen mit den folgenden Themen bearbeitet worden: Schwerpunkt: Qualitätssicherung in der Blutversorgung Arbeitsgruppe Pathogeninaktivierung (Dr. Janetzko) Eines der vorrangigen Themen in diesem Schwerpunkt ist die photochemische Pathogeninaktivierung von Thrombozytenkonzentraten mittels Amotosalen in Kombination mit UVA-Bestrahlung. In den vergangenen Jahren wurden Studien für die Beurteilung der Thrombozytenqualität in-vitro und in-vivo durchgeführt. Die Herstellungserlaubnis für diese Präparate ist uns vom Regierungspräsidium erteilt worden. Der Antrag auf Zulassung beim Paul-Ehrlich-Institut findet sich z. Zt. in Arbeit. Daneben wurden neue Prüfverfahren entwickelt, die es ermöglichen, auf der Basis von PCR- Untersuchungen die erfolgreiche Amotosalen-UVA Behandlung zu dokumentieren. Aktuell sind Untersuchungen für die Etablierung einer quantitativen Auswertung dieser PCR Ergebnisse mittels Bioanalyser in Arbeit. Arbeitsgruppe Molekulare Immunhämatologie (PD Dr. Bugert) Die Projekte dieser Arbeitsgruppe zielen auf die molekulargenetische Charakterisierung abgeschwächter Blutgruppeneigenschaften im ABO-System und bei den Rh-Untergruppen. Schwerpunkt: Stammzellen und Zelltherapie Arbeitsgruppe (Dr. rer. nat. K. Bieback, Dr. med. X. D. Nguyen) Zell- und Immuntherapie Die Arbeitgruppe fokussiert sich auf die Untersuchung verschiedener Stammzellpopulationen. Dabei stehen Verfahren zur GMP-konformen Herstellung und Qualitätskontrollen im Vordergrund. Stammzellen, insbesondere die Interaktion von hämatopoetischen und mesenchymalen Stammzellen aus Nabelschnurblut, sind ein weiteres Thema. Darüber hinaus wird ein möglicher therapeutischer Einsatz von mesenchymalen Stammzellen und weiteren Vorläuferzellen in der Geweberegeneration evaluiert. Die Herstellung und klinische Anwendung dendritischer Zellen z.b. bei der Behandlung von Tumoren bilden einen weiteren Schwerpunkt unter der Leitung von Herrn Dr. Nguyen. Schwerpunkt: Molekulare Pathophysiologie, Diagnostik und Therapie Arbeitsgruppe Thrombozytenimmunologie (PD Dr. Bugert) Die Arbeitsgruppe befasst sich in verschiedenen Projekten mit der Identifizierung und funktionellen Charakterisierung neuer Rezeptoren bei Thrombozyten. Ein wichtiger Arbeitsschwerpunkt bildet dabei die Microarrayanalyse des thrombozytären Transkriptoms. Kandidatengene werden durch Exon-Resequenzierung auf DNA-Ebene hinsichtlich Genvarianten untersucht. Die Häufigkeitsverteilung der Varianten wird dann bei bestimmten Patientengruppen (mit thromboembolischen Komplikationen) und gesunden Kontrollen untersucht. Die Untersuchung der molekularen Grundlagen des Aspirin-like Defekt bildet einen weiteren Schwerpunkt der Arbeitgruppe. Hierbei handelt es sich um ein Kooperationsprojekt, das durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert wird. Prof. Dr. med. H. Klüter 21

23 Forschungsstruktur der Standorte Das Institut Tübingen Institut für Klinische und Experimentelle Transfusionsmedizin Universitätsklinikum Tübingen (Institutsleitung: Univ. Prof. Dr. med. H. Northoff) Zentrum für Klinische Transfusionsmedizin (Geschäftsführer: Prof. Dr. med. H. Northoff und Dipl.-Volkswirt M. Stähle) Otfried-Müller-Strasse 4/ Tübingen Telefon: Telefax: Die Aufgabenstellung des Zentrums für Klinische Transfusionsmedizin (ZKT) in Tübingen umfasst die Abnahme und Herstellung von Blutprodukten und die transfusionsmedizinische Krankenversorgung. In Personalunion geführt wird das für Forschung und Lehre zuständige Institut für klinische und experimentelle Transfusionsmedizin (IKET). Das Budget des IKET wird vom ZKT zu ca. 25 % unterstützt. Die Forschung am ZKT umfasst im Schwerpunkt Stammzellen und Zelltherapie die Darstellung von Pankreasinselzellen, die zusammen mit der Abteilung Chirurgie entwickelt und durch die Erteilung einer Herstellungserlaubnis, erstmalig in Deutschland, gekrönt wurde. Im Rahmen der Anpassung des Herstellungsprozesses an die GMP-Anforderungen wurde u.a. ein geschlossenes System zur Durchflusskühlung großer Flüssigkeitsmengen entwickelt, das Blutkultursystem BacT/Alert zur Sterilitätsprüfung von Zelltherapeutika validiert und der Endotoxinnachweis nach Ph. Eur. etabliert. Weitere Entwicklungsarbeiten werden geleistet bei der Herstellung eines GMP-geregelten AB-Serums zur Verwendung für Zellkulturen mit Anwendung beim Patienten. Das Serum wird ebenfalls im Rahmen einer Herstellungserlaubnis produziert und ist verfügbar. Am IKET läuft eine breite Palette an weiterer Forschungstätigkeit. Dazu gehört zum einen die Entwicklung einer diagnostischen Plattform auf Basis von Schwingquarzsensorik. Dieses BMBF-geförderte Projekt wird in einer breiten Kooperation mit Industrie und anderen universitären Instituten vorangetrieben. Entwicklungsziele sind derzeit der Einsatz von Schwingquarzen bei hämostaseologischem Monitoring und in der Malariaforschung. Die Kernarbeitsgruppe umfasst insgesamt 8 Drittmittelgeförderte Physiker, Chemiker, Pharmazeuten und Informatiker. Der Höhepunkt in 2006 war die Ausstellung einer Forschungsplattform auf dem Stand des BMBF auf der Medica. Als weiteres Forschungsgebiet im IKET läuft und lief in 2006 die Herstellung und der Einsatz von Genexpressionschips für die Stressforschung. Dieser wurde u.a. auch bei der umfassenden Untersuchung der Antwort des Organismus auf erschöpfende Ausdauerbelastungen unter verschiedenen Umgebungsbedingungen eingesetzt, einem weiteren drittmittelgeförderten Forschungsgebiet des IKET. Im Rahmen eines weiteren wesentlichen Forschungsgebiets des IKET wird die Präparation, Purifikation und Funktion von mesenchymalen Stammzellen untersucht, unter anderem in Interaktion mit Kontrastmitteln. Diesbezüglich wurde im September 2006 in Tübingen von uns in Zusammenarbeit mit der Pädiatrie ein Kongress veranstaltet, der sehr gut besucht und angenommen wurde und vermutlich den Beginn einer Serie markiert. Im Schwerpunkt Transplantationsimmunologie und Immungenetik wurden neue und bereits bewährte Methoden (LCT, MAIPA, ELISA) bei der Antikörpersuche (HLA-Klasse I, II, HPA) in verschiedenen Phasen der Nierentransplantationen verglichen. Um die vorgeschaltete zelluläre Immunaktivierung untersuchen zu können, wird der ELISPOT-Test etabliert, der auch bei Verdacht auf thrombozytäre Antikörper hilfreich ist. Prof. Dr. med. H. Northoff 22

24 Forschungsstruktur der Standorte Das Institut Ulm Institut Ulm (Institutsleitung: Univ. Prof. Dr. med. H. Schrezenmeier) DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg Hessen ggmbh Helmholtzstraße Ulm Telefon: Telefax: Aufgaben Das Institut für Klinische Transfusionsmedizin und Immungenetik Ulm (IKT Ulm) versorgt neben dem Universitätsklinikum Ulm über 130 Einrichtungen mit Blutprodukten, Stammzell- und Zelltherapiepräparaten und transfusions-medizinischer, immunhämatologischer sowie transplantationsimmunologischer Diagnostik. Das vom DRK-Blutspendedienst Baden- Württemberg Hessen ggmbh und der Universität Ulm gemeinsam getragene Institut für Transfusionsmedizin der Universität Ulm nimmt die Aufgaben in Forschung und Lehre war. Entwicklung 2006 Aufbauend auf schon bestehenden Schwerpunkten und Kompetenzen wurden im Institut im Jahr 2006 die Entwicklungen vor allem in zwei Feldern weiter intensiviert: 1) Molekulare Diagnostik in den Bereichen Blutgruppenbestimmung, Immungenetik und Immun- /Hämatopoese-Defekte und 2) Entwicklung von Stammzellpräparaten und Zelltherapeutika zur klinischen Anwendung. Im Schwerpunkt Molekulare Pathophysiologie, Diagnostik und Therapie sind die Arbeitsgruppe Molekulare Diagnostik erythrozytärer Antigene, die Arbeitsgruppe Transplantationsimmunologie und die Arbeitsgruppe Molekulare Pathophysiologie und Diagnostik von Immun- und Hämatopoese-Defekten und deren Gentherapie aktiv. Zwischen diesen bestehen methodische Überschneidungen, aber ein komplementäres Untersuchungsprofil. Die Fragestellungen der jeweiligen Untersuchungen knüpfen an diagnostische Fragestellungen an, welche schon jetzt zum Leistungsprofil des Instituts zählen und entwickeln entweder neue Methoden und/oder Ausweitungen der Methoden auf weitere Parameter. Ein Beispiel ist die Blutgruppendiagnostik, welche als serologische Diagnostik zum Standard-Repertoire gehört. Die in der Arbeitsgruppe Molekulare Diagnostik erythrozytäre Antigene gewonnenen Erkenntnisse zur molekularen Grundlage der Blutgruppenantigene, insbesondere zur genomischen Organisation des Rhesus-Lokus, stellten eine essentielle Basis für die Entwicklung eines Blutgruppen-Biochips in einem EU-geförderten Kooperationsprojektes dar. Ein weiteres Beispiel ist die Aufklärung der molekularen Ursache von Defekten der Blutbildung, wodurch eine gezielte Diagnostik überhaupt erst möglich wird. Gleichzeitig wird damit auch die Möglichkeit eines Brückenschlags zur Therapie eröffnet. Die in dem Projekt gewonnen Erkenntnisse definieren die Zielstrukturen für Genkorrekturansätze. Im Schwerpunkt Stammzellen und Zelltherapie beschäftigen sich die Arbeitsgruppen Zelluläre Immuntherapie und Stammzelltransplantation, Pathophysiologie und Therapie von hämatopoetischer Insuffizenz und Deutsches Register für Stammzelltransplantationen mit der Entwicklung, Etablierung und Auswertung von Therapien mit Stammzellen und neuen Zelltherapeutika. Dabei geht es zum einen um die GMP-gerechte Herstellung von Stammzellund Zelltherapiepräparaten, aber auch deren funktioneller Charakterisierung. Zu den Forschungsaktivitäten gehören die Untersuchungen von Zelltypen wie mesenchymalen Stammzellen (MSC), welche ein breites therapeutisches Potential besitzen, und der Einsatz von Knochenmarkzellen, welche schon lange in der Stammzelltransplantation eingesetzt werden, in neuen Indikationen, z. B. dem akuten Myokardinfarkt. Mit der Anwendung von Stammzellen in neuen Indikationen bzw. dem Einsatz neuer Zelltherapeutika sind immer auch Fragen zum Verhalten der Zellen im Organismus verbunden. Um verfolgen zu können, in welchen Geweben sich die Zelltherapie-Präparate ansiedeln und wie sich die Zellen dort verhalten, wird an Methoden zur Markierung dieser Zellen durch Transfektion oder Nanopartikel gearbeitet. 23

25 Forschungsstruktur der Standorte Weitere Detailinformationen finden sich in der nachfolgenden Kurzzusammenfassung wesentlicher F&E-Aktivitäten der Arbeitsgruppen im Jahr 2006 und in den ausführlicheren Einzelprojekt-Beschreibungen. Die Arbeitsgruppe "Molekulare Diagnostik erythrozytärer Antigene (Prof. Dr. W.A. Flegel, Frau Dr. I. von Zabern) erforscht Zusammenhänge zwischen Genotyp, Phänotyp, Struktur und Funktion der blutgruppentragenden Proteine, um Transfusionen sicherer und wirtschaftlicher zu machen. Die in Ulm entwickelten genetischen Methoden werden einer breiten Anwendung zugeführt. Die Prototyp-Entwicklung des Blutgruppen-Biochips in einem EU-geförderten Projekt (BloodGen) ist abgeschlossen. In verschiedenen internationalen Kooperationen wurde die klinische Relevanz von 11 neuen Rhesus-D-Varianten veröffentlicht. Wir haben die molekulare Basis des Crawford- Antigens gefunden. Ein Testkit wurde vorgestellt für ein in Ulm nachgewiesenes, klinisch wichtiges DEL -Antigen, welches jeder dritte D-negative Blutspender in Ostasien trägt. Die Arbeitsgruppe Transplantationsimmunologie (PD Dr. J. Mytilineos, Dr. K. Hirv, A. Vigh) beschäftigt sich im Schwerpunkt Transplantationsimmunologie und Immungenetik mit der HLA-Genetik, der Bedeutung der Zytokingenpolymorphismen sowie weiteren Histokompatibilitäts-fragestellungen bei Transplantationskandidaten. Ein Verfahren zum Nachweis von Polymorphismen verschiedener Gene (Zytokine, Chemokine, NOD2/CARD15) mit Luminex-Technologie (Liquid Chip) wurde entwickelt. In Kooperation mit der transplantationsimmunologischen Abteilung der Universität Heidelberg (Prof. Dr.G. Opelz) wurde eine Studie über den Einfluss von Polymorphismen im Blutgerinnungssystem (Faktor II, F.V und MTHFR) in der Nierentransplantation durchgeführt. Zur Verbesserung von Dauer und Erfolg einer nichtverwandten Stammzellspendersuche wurde basierend auf den Erfahrungen der Ulmer Sucheinheit ein Suchalgorithmus entwickelt. Zur Optimierung der Stammzellspendersuche wurde im Institut eine Methode zur hochauflösenden HLA-Diagnostik durch Sequenzierung entwickelt und im Jahr 2006 zur CE-Zertifizierung geführt. Eine Reihe neuer HLA-Allele wurde entdeckt, charakterisiert und in der internationalen Sequenzdatenbank angemeldet. Weitere Projekte beschäftigen sich mit Entwicklung von Verfahren zur Detektion von HLA-Null- Allelen, Durchführung eines ELISA-Crossmatch für die Organtransplantation und Evaluation des Einflusses von Minor-Histokompatibilitäts-Polymorphismen auf die Stammzelltransplantation In der Arbeitsgruppe "Molekulare Charakterisierung angeborener Immun- und Hämatopoese- Defekte und deren Gentherapie (Dr. K. Schwarz, Dr. D. Niewolik, Dr. U. Pannicke, Dr. F. Radecke) wurde die molekulare Diagnostik angeborener Immundefekte, angeborener Autoimmunitätserkrankungen und primärer Erythrozytendefekte (mit Dr. H. Cario, Klinik für Kinder- und Jugendmedizin, und Prof. emerit. Dr. H. Heimpel) um neu charakterisierte Defekte ergänzt. Die Patientenanalysen erhellten das Verständnis molekularer Abläufe der Entwicklung und Funktion von Lymphozyten und Erythrozyten. Die biochemische Analyse von Faktoren eines bestimmten DNA-Reparatursystems ( non- homologous end joining, NHEJ) wurde intensiviert. In Publikationen zur Fortentwicklung der nukleotidgenauen Genkorrektur angeborener Erkrankungen mit modifizierten Einzelstrang-Oligonukleotiden konnten wir zeigen, dass die Ausnutzung von DNA-Doppelstrangbrüchen zur Korrektur von Einzelkopie-Genen führt, und dass mit hoher Wahrscheinlichkeit auch Zellen manipulierbar sein sollten, die keine hohe Replikationsrate haben (z. B. hämatopoetische Stammzellen). In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. T. Cathomen (Charité, Berlin) werden DNA-sequenzspezifische Nukleasen zur DNA- Doppelstrangbruchgenerierung und Oligonukleotidmanipulation von Genomen im Rahmen eines EU-Kooperationsprojekts erprobt. In der molekularen Virusdiagnostik (Dr. U. Mayr-Wohlfart, Dr. K. Koerner) wurden Untersuchungen im Rahmen der CE-Zertifizierung der im Institut Frankfurt entwickelten Methode zum Screening der Blutprodukte auf die transfusionsrelevanten Viren HCV, HIV und HBV durchgeführt. Die Arbeitsgruppe "Zelluläre Immuntherapie und Stammzelltransplantation" (Dr. V. Mailänder, Dr. M. Marx, Dr. P. Reinhardt, Dr. M. Rojewski, Dr. P. Schauwecker, Dr. M. Wiesneth) beschäftigt sich mit der Weiterentwicklung klinisch anwendbarer Zelltherapeutika. 24

26 Forschungsstruktur der Standorte In Kooperation mit den Kliniken für Innere Medizin II und Innere Medizin III werden Patienten mit akutem Myokardinfarkt im Rahmen einer placebo-kontrollierten, doppelt-blinden Studie autologe Knochenmarkzellen intrakoronar appliziert. Weiterhin werden Methoden zur nicht-viralen Transfektion erarbeitet, um Stammzellen zu markieren und in ihrer Funktion zu modulieren. Verfahren zur GMP-gerechten Ex-vivo-Expansion von mesenchymalen Stammzellen (MSC) für die klinische Anwendung werden optimiert und die funktionellen Eigenschaften der MSC untersucht. Parallel wurde eine Linien-spezifische Chimärismusanalyse nach allogener Stammzelltransplantation weiterentwickelt. Zur Markierung von Stammzellen/Zelltherapeutika werden zusammen mit dem Institut für Organische Chemie III (Prof. Dr. K. Landfester) superparamagnetische Nanopartikel zum nichtinvasiven Nachweis mit bildgebenden Verfahren getestet. In der Arbeitsgruppe Diagnostik und Therapie hämatpoietischer Insuffizienz werden im Rahmen internationaler Studien in Kooperation mit der Klinik für Innere Medizin III Patienten mit paroxysmaler nächtlicher Hämoglobinurie (Dr. B. Höchsmann) mit innovativen Biologika therapiert. Die Datenzentrale des Deutschen Registers für Stammzelltransplantationen (DRST) (Dr. Dr. C. Müller) konnte in einem von der Deutschen José Carreras Leukämie-Stiftung unterstützten Projekt die Auswertungen zu den in Deutschland seit 1998 durchgeführten Stammzelltransplantationen fortsetzen. Ausblick 2007 Wichtige Projekte für das Jahr 2007 liegen in den beiden Schwerpunkten Entwicklung von Zelltherapeutika und molekulare Diagnostik: Optimierung GMP-gerechter Produktion von mesenchymalen Stammzellen (MSC) für Studien zur regenerativen Therapie, zur Immunmodulation und zur Durchführung von Zellmarkierungsstudien in Kooperation mit verschiedenen Kliniken im Universitätsklinikum Ulm. Entwicklung und Erprobung weiterer Nanopartikel zur Markierung und Modulation von Stammzellen in enger Kooperation mit der Abt.Organische Chemie III der Universität Ulm. CE-Zertifizierung des BloodGen-Biochips und Beginn des Routine-Einsatzes zur Genotypisierung von Blutgruppenmerkmalen. Erprobung der Genreparatur mit Oligonukleotiden und Analyse der Genotoxizität dieser DNA-Korrekturmethode mit und ohne DNA-Bruch. Molekularpathophysiologische Analyse von neu aufgeklärten Immundefekten und Anämien. Entwicklung weiterer In-vitro-Diagnostika zur Optimierung der Spenderauswahl für die Stammzelltransplantation, insbesondere Diagnostik von Zytokin-, Chemokin- und KIR-Gen- Polymorphismen und Untersuchung ihrer Bedeutung für die Verbesserung von Transplantationergebnissen durch Optimierung von Spenderauswahl Prof. Dr. med. H. Schrezenmeier 25

27 1 Qualliitätssiicherung iin der Bllutversorgung EUBIS European blood inspection and quality management system 18 Participants from EU member states: BE, CZ, DE, EE, FR, IE, IT, CY, HU, MT, NL, PL, UK (acceding) new member states: BG, RO EFTA states: IS 26

28 Qualtiätssicherung in der Blutversorgung Bakterielle Kontamination von Blutprodukten Hintergrund und Projektbeschreibung Die Einführung hochsensitiver Screeningmethoden (Realtime-PCR) reduzierten das Restinfektionsrisiko für HIV-1 und HCV auf ca. 1:30 Millionen. Dagegen steht ein Risiko für bakteriell Infektionen von 1:2000. Gerade die Thrombozytenkonzentrate, die bei Raumtemperatur unter ständiger Agitation gelagert werden, stellen für viele Bakterien nahezu ideale Kulturbedingungen dar. Anders als bei den viralen Infektionsübertragungen besteht bei den Bakterien die besondere Herausforderung, dass zunächst nur eine sehr geringe Konzentration an Bakterien im Thrombozytenkonzentrat vorliegt. Der ideale Test verfügt daher über eine extrem hohe Sensitivität und auch Spezifität. Ferner stellt sich die Frage, ob sich die unterschiedlichen Thrombozytenkonzentrate (Pool-Thrombozytenkonzentrate und Apheresekonzentrate) bezüglich des bakteriellen Restrisikos unterscheiden. Neben bereits kommerziell erhältlichen Nachweismethoden bestand eine weitere Aufgabe darin, eigene Schnellmethoden zu entwickeln. Alternativ besteht jedoch auch die Möglichkeit zur Durchführung einer Pathogeninaktivierung. Data are reported as number (%). p Values (chi-square test; p values for the four main comparisons with correction for testing of multiple hypotheses according to Holm32) for potentially positive cultures: ap = 0.001, plasma-ppcs vs. APCs; bp = 0.02, T-Sol PPCs vs. APCs; cp < (not adjusted), pooled PCs (plasma-ppcs and T-Sol-PPCs) vs. APCs. p Values for confirmed-positive cultures: dp = NS, plasma-ppcs vs. APCs; ep = NS, T-Sol PPCs vs. APCs; fp = 0.42 (not adjusted), pooled PCs (plasma-ppcs and T-Sol PPCs) vs. APCs. Number of apheresis procedures; in 3,376 apheresis procedures a single product and in 11,822 apheresis 2 units were produced; that is, the overall number of PCs from apheresis is 27,020. Two centers tested both APCs and pooled PCs. Wichtigste Ergebnisse Es konnte gezeigt werden, dass sich die unterschiedlichen Thrombozytenkonzentrate (Apheresen und Pool-TKs) nicht bezüglich ihrer bakteriellen Kontaminationsrate unterscheiden. Ferner gab es keine signifikanten Unterschiede bezüglich des Restinfektionsrisikos zwischen Pool-TKs in Plasma und Pool- TKs in Additivlösung. Im direkten Vergleich zwischen kommerziell verfügbaren Screeningmethoden zeichnete sich BacT/Alert aufgrund einer hohen Sensitivität aus. Die hohe Sensitivität ging jedoch einher mit einer höheren Rate an unspezifischen Befunden. Internationale Untersuchungsergebnisse bezüglich einer geringen klinischen Effizienz bei der Anwendung von Kulturmethoden konnten bestätigt werden. Es zeigte sich beim BacT/Alert, dass ca. 50% der reaktiven TKs zum Zeitpunkt des Bakteriennachweises bereits transfundiert waren. Ferner besteht bei den Kulturmethoden die Gefahr des Probenfehlers. Alternativ entwickelte Schnellmethoden bieten zwar potentiell die Möglichkeit einer späten Probenziehung, sind aber zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch nicht routinetauglich. Im direkten Vergleich zeichnete sich die 16s Realtime-PCR Methode gegenüber der FACS-Methode und der Scansystem-Methode durch eine hohe Sensitivität aus. Dem gegenüber stellt die Pathogeninaktivierung eine gute Alternative dar, mit der die Sicherheit der Thrombozytenkonzentrate erhöht werden kann, ohne dass es dadurch zu einer zeitlichen Verzögerung kommt. Summary The Research Group initiated a prospective multicenter study to assess prevalence and nature of bacterial contamination of pooled buffy-coat platelet concentrates (PPCs) and apheresis platelet concentrates (APCs) by routine screening with a bacterial culture system. In nine centers overall, 52,243 platelet (PLT) concentrates (15,198 APCs, 37,045 PPCs) were analyzed by aerobic and anaerobic cultures (BacT/ALERT, biomérieux). In 135 PLT concentrates (PCs; 0.26%), bacteria could be identified in the first culture (0.4% for APCs vs. 0.2% for PPCs; p < 0.001). In 37 (0.07%) of these PC units, the same bacteria strain could be identified in a second culture from the sample bag and/or the PC unit. The rate of confirmed positive units did not differ significantly between APC (0.09%; 1/1169) and PPC units (0.06%; 1/1544). Bacteria from skin flora (Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis) were the most prevalent contaminants. Median times to first positive culture from start of incubation were 0.7 and 3.7 days in aerobic and anaerobic cultures for confirmed-positive units. With a negative-to-date issue strategy, most PC units (55%) had already been issued by time of the first positive culture. The rate of confirmed bacterial contamination of PC units was low. Nevertheless, clinicians must be aware of this risk. The risk of bacterial contamination does not warrant universal preference of APCs. It must be questioned whether routine bacterial screening by a culture method can sufficiently prevent contaminated products from being transfused due to the delay until a positive signal in the culture system and due to false-negative results. In a second study a solid-phase scanning cytometer (optimized Scansystem, Hemosystem), fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis, and 16S RNA in-house nucleic acid testing (NAT) was evaluated by spiking PCs with four transfusion relevant bacteria (Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, and Escherichia coli ). Two different inocula (10 colony-forming units [CFUs]/mL and 10 CFUs/bag) were used to simulate real-life conditions. Samples were taken at 12, 16, 20, and 24 hours after spiking. With the high inoculum, NAT had a 100 percent rate of positive testing for all four types of bacteria (10/10 replicates) at each time point. With the exception of E. coli, the 27

29 Qualitätssicherung in der Blutversorgung sensitivity of FACS and optimized Scansystem was comparable for the high inoculum. With the low inoculum, 60 percent of E. coli, 80 percent of B. cereus, 90 percent of K. pneumoniae, and 100 percent of S. aureus were NATpositive 12 hours after spiking. In contrast, only 20 percent of E. coli, 10 percent of B. cereus, and 70 percent of K. pneumoniae were FACSpositive with the low inoculum 12 hours after spiking. In summary, the preliminary data revealed a higher sensitivity for NAT in comparison to FACS and optimized Scansystem under the defined study conditions. To imitate real-life conditions, further spiking studies with a low inoculum (10 CFUs/bag) and slower growing organisms should be conducted to examine the sensitivity of available detection systems. Fig. 1. Platelet concentrates (PCs) spiked with four types of bacteria with 10 CFUs per ml. PCs were spiked with a high inoculum (10 CFUs/mL). Test samples were taken after 12, 16, 20, and 24 hours and analyzed with the optimized Scansystem, FACS, and NAT. Before scanning samples with FACS, a 120-min incubation step in a special bacteria growth medium was completed. The number of bacteria was controlled immediately after spiking and again at each time point. To determine the bacterial number in each PC, 1 ml was diluted in eight serialized steps, pipetted to Columbia blood agar plates, and incubated at 37 C for at least 24 hours. Up to 500 colonies per plate could be counted. If more than 500 colonies were identified, the plate was considered uncountable and the next dilution step was analyzed. Bars indicate CFUs per ml ± 1 SD. Standort Frankfurt, Multicenter Studie der DRK Blutspendedienste Arbeitsgruppe Bakterielle Kontamination von Blutprodukten Projektleiter Prof. Dr. E. Seifried Mitarbeiter PD Dr. M. Schmidt, Kai Hourfar Kooperationen DRK Forschungsgemeinschaft unter Beteiligung der Blutspendedienste des Bayerischen Roten Kreuzes DRK Nord-Rhein-Westfalen DRK Niedersachsen (NSTOB) Förderung DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg - Hessen ggmbh Laufzeit des Projektes Weitere Informationen Schmidt M, Hourfar MK, Wahl A, et al. Fluorescence quencher improves SCANSYSTEM for rapid bacterial detection. Vox Sang 2006;90(4): Schmidt M, Hourfar MK, Nicol S-B, et al. A comparison of three rapid bacterial detection methods under simulated real-life conditions. Transfusion 2006;46(8): Schmidt M, Hourfar MK, Nicol SB, et al. FACS technology used in a new rapid bacterial detection method. Transfusion Medicine 2006; 16(5):

30 Qualtiätssicherung in der Blutversorgung Prävalenz von Bakterien in Pool- und Apherese- Thrombozytenkonzentraten und Strategien zur Reduktion des Transfusionsassoziierten Sepsisrisikos Hintergrund und Projektbeschreibung Dies ist eine Studie der Forschungsgemeinschaft der Blutspendedienste. In einer prospektiven Untersuchung werden mehr als Thrombozytenkonzentrate auf bakterielle Kontamination untersucht. Der Standort Ulm beteiligte sich an dieser Studie durch Sterilitätstestung von Pool-Thrombozytenkonzentraten mit additiver Lösung. Art des Thrombo- Zyten- Präparates Gesamtzahl untersuchter Präparate Anzahl der Zentren Ergebnisse der Sterilitätstestung Falsch positiv n (%) Potentiell positiv n (%) Bestätigt positiv n (%) APC (29.1%)* 6 54 (0.36%) 48 (0.32%) 13 (0.09%) Plasma PPC (42.2%) 3 54 (0.24%) 26 (0.12%) 16 (0.07%) T-Sol PPC Gesamt (28.7%) (100 %) (0.26%) 147 (0.28%) 24 (0.16%) 98 (0.19%) 8 (0.05%)** 37 (0.07%) P-Werte: (Chi-square test) Potentiell positive Kulturen: p = Plasma PPC vs. APC p = 0.02 T-Sol PPC vs. APC p < (not adjusted) Pooled PC (Plasma PPC and T-Sol PPC) vs. APC Bestätigt positive Kulturen : p = n.s. Plasma PPC vs. APC ** p = n.s. T-Sol PPC vs. APC p = 0.42 (not adjusted) Pooled PC (Plasma PPC and T-Sol PPC) versus APC Anzahl untersuchter Thrombozytenkonzentrate und Anteil positiver Ergebnisse Wichtigste Ergebnisse In untersuchten Thrombozytenkonzentraten betrug der Anteil bestätigt positiver Einheiten 0,07 %. Dabei zeigte sich kein signifikanter Unterschied in der Kontaminationsrate zwischen Apherese-Thrombozytenkonzentraten (0,09 %) und Pool-Thrombozytenkonzentraten aus Buffycoat (0,06 %). Bakterien der Hautflora (Propionibacterium acnes; Staphylococcus epidermidis) waren die am häufigsten nachgewiesenen Kontaminanten. Die mediane Zeit bis zur ersten positiven Kultur vom Beginn der Inkubation betrug 3,7 Tage. 29

31 Qualitätssicherung in der Blutversorgung Summary In this prospective study of the Forschungsgemeinschaft der Blutspendedienste overall platelet concentrates PC were analysed by aerobic and anaerobic cultures. The rate of confirmed positive PC-units was 0.07 %. The rate of confirmed positive units did not differ significantly between apheresis PCs (0.09 %) and pooled PC-unit (0.06 %). Bacterial from skin flora (Propionibacterium acnes; Staphylococcus epidermidis) were the most prevalent contaminants. Median time to first positive culture from start of incubation was 3.7 days. With a negative-to-date issues strategy the majority of PC units (55 %) had already been issued by time of the first positive culture. Standort Ulm und Frankfurt Arbeitsgruppe Bakterielle Kontamination von Thrombozytenkonzentraten Projektleiter Prof. Dr. H. Schrezenmeier Mitarbeiter Frau Dr. B. Höchsmann, Dr. K. Koerner, Dr. M. Wiesneth Kooperationen Dr. Schmidt, Dr. Sireis, Prof. Seifried, Institut für Transfusionsmedizin Frankfurt Weitere Institute im Rahmen der Forschungsgemeinschaft der DRK-Blutspendedienste Förderung Forschungsgemeinschaft der DRK-Blutspendedienste Laufzeit des Projektes Weitere Informationen Schrezenmeier H., Walther-Wenke G., Müller T.H., Weinauer F., Younis A., Holland-Letz T., Geis G., Asmus J., Bauerfeind U., Burkhart J., Deitenbeck R., Förstemann E., Gebauer W., Höchsmann B., Karakassopoulos A., Liebscher U.-M., Sänger W., Schmidt M., Schunter F., Sireis W., Seifried E.: Bacterial contamination of platelet concentrates: Results of a prospective multicenter study comparing pooled whole blood-derived platelets and apheresis platelets. Transfusion 47: (2007) 30

32 Qualtiätssicherung in der Blutversorgung Blood and organ transmitted infectious agents (BOTIA Studie) Hintergrund und Projektbeschreibung Vermehrte Anstrengungen in den vergangenen Jahren in Bezug auf Spenderselektion und auch der Implementierung von modernen Screeningmethoden führten zu einer wesentlichen Zunahme an Sicherheit. Dennoch bleibt ein potentielles Restrisiko, welches auch durch neue Pathogene bedingt ist, die derzeit nicht in die Routinediagnostik eingeschlossen sind. So breitete sich das West-Nil-Virus in den USA epidemisch Anfang dieses Jahrtausends von der Ost- zur Westküste aus und führte dazu, dass eine West-Nil-PCR in den USA eingeführt wurde. Andere neue Pathogene, wie zum Beispiel SARS oder H5N1, spielen in der Transfusionsmedizin nur eine geringe Rolle, da der Hauptinfektionsweg oral erfolgt. In Vorbereitung auf neue bisher unbekannte Pathogene wurde eine europäische Studie initiiert, in der Proben-Paare zwischen Spender und Empfänger gebildet werden. Unter Beteiligung von sieben europäischen Ländern sollen insgesamt Spender-Empfänger-Paare gewonnen werden. Dabei werden beim Empfänger eine Blutentnahme vor der Transfusion sowie zwei weitere Entnahmen nach der Transfusion entnommen. Im Anschluss werden alle Proben mit RAPD-Primern auf DNA untersucht. Im Falle einer neuen Epidemie werden die Proben erneut herangezogen, um zeitnah untersuchen zu können, ob dieses Pathogen zum einen damals schon in der Population vorhanden war und zum anderen eine transfusionsmedizinische Relevanz besteht. Bei der Identifizierung von neuen Pathogenen sollen die Proben auch für die Entwicklung von neuen diagnostischen Tests genutzt werden. Ausbreitung von neuen Pathogenen weltweit. Während einige Viren, wie zum Beispiel das West Nil Virus, sich lokal auf ein Gebiet fokussieren, breiten sich andere Viren, wie zum Beispiel das SARS Virus, innerhalb weniger Tage weltweit aus. Wichtigste Ergebnisse Die Studie wurde im Jahr 2006 gestartet und befindet sich zurzeit noch in der Phase1, die darin besteht, die Spender-Empfänger-Paare zu sammeln. 31

33 Qualitätssicherung in der Blutversorgung Die BOTIA Studie verläuft in insgesamt 5 Phasen. Nach dem Probensammeln (Phase 1), dem Aufbau einer Datenbank (Phase 2) und dem unspezifischen Screening mit RAPD Primern (Phase 3) werden in den Phasen 4 und 5 die Entwicklung von neuen diagnostischen Untersuchungstests angestrebt, sofern neue Pathogene innerhalb der Studie detektiert werden. Standort Frankfurt, Multicenter Studie der Europäischen Union Arbeitsgruppe BOTIA Studie Projektleiter Prof. Dr. E. Seifried Mitarbeiter PD Dr. M. Schmidt, Kai Hourfar Kooperationen Förderung Europäische Union (SP23-CT ) Laufzeit des Projektes

34 Qualtiätssicherung in der Blutversorgung Prävalenz von Parvovirus B19 bei Blutspendern Hintergrund und Projektbeschreibung Parvovirus B19 wurde zum ersten Mal 1975 in einem Blutprodukt von einem klinisch gesunden Spender entdeckt. Obwohl der Hauptinfektionsweg über Tröpfcheninfektionen verläuft, sind in der Literatur Übertragungen durch Blutprodukte beschrieben worden. Beim Parvovirus B19 handelt es sich um ein kleines nicht umhülltes Virus mit einem Durchmesser zwischen 18 und 26 mm. Aufgrund der fehlenden Lipidhüllen lässt es sich nur schwer inaktivieren. Infektionen sind 20% asymptomatisch oder gehen mit milden Symptomen wie eine vorübergehende Rötung einher. In seltenen Fällen kann sich auch eine Vaskulitis, Myokarditis, Glomerlusonephritis und eine Erythroblastopenie bilden. Das Virus befällt die erythrozytären Vorläuferzellen und induziert in diesen den programmierten Zelltod (Apoptose). Gerade während einer Schwangerschaft, für Neugeborene oder immunsupprimierte Menschen besteht somit eine größere Gefahr. Inzidenz von B19 positiven Konserven mit einer Konzentration >105IU/ml. Es zeigt sich eine undulierende Zunahme von Februar bis Juni sowie im Jahr Wichtigste Ergebnisse Seit April 2000 wurden alle Blutspenden mit Hilfe einer In-House Realtime-PCR Methode auf Parvoviren B19 untersucht. Positive Blutspenden mit einer Viruskonzentration größer 105 IU/ml werden gesperrt. Spender mit einer Viruskonzentration kleiner 105 IU/ml in der Pool-PCR wurden nicht aufgelöst. In einer prospektiven Studie wurden 50 B19 positive Spender über 1 Jahr gemonitort und auch auf B19 Antikörper untersucht. Dabei zeigte sich, dass Spender mit einer hohen Viruslast (in der Anfangsphase einer Infektion) nur sehr selten neutralisierende Antikörper (VP-2 Antikörper) aufwiesen, wohingegen Spender mit einer geringen Viruskonzentration ausschließlich auch neutralisierende Antikörper besaßen. Es zeigte sich somit, dass man auf die Auflösung von schwach positiven Spenderpools aufgrund der Anwesenheit von neutralisierenden Antikörpern verzichten kann, ohne dadurch eine Sicherheitslücke bei den Blutprodukten zu bekommen. Diese Aussage soll in einer retrospektiven Studie in Zusammenarbeit mit dem IKT Ulm durch Untersuchungen bei Empfängern von B19 virämischen Blutprodukten verifiziert werden. 33

35 Qualitätssicherung in der Blutversorgung Summary Although the main transmission pathway of B19 is normally via the respiratory route, several transfusion-transmitted infections have been reported. In order to increase blood safety, all blood donations to our blood donor service have been screened by a B19 mini-pool real-time NAT since April 2000 and from additional customers since summer Study design: In total, 2.8 million donations from Europe were screened for B19 by real-time mini-pool NAT. A subgroup of 50 B19 positive donors was screened for B19 IgG and IgM antibodies and B19 DNA over a six month period. The results were compared to those of 100 B19 DNA negative donors. Results: Data accumulated over the last six years indicates massive epidemics, in spring and summer 2004 and In total, the incidence was and per 100,000 donations with virus loads over 10 5 and below 10 5 IU/mL, respectively. Median virus concentration in the case group was 4.85X10 7 IU/mL at time point T0 and reduced to 4X10 2 IU/mL at the next donation (three months later). Neutralizing antibodies (VP2) were detected in all donations if virus load was reduced to less than 10 5 IU/mL. Conclusion: The release of B19 positive blood products with a concentration <10 5 IU/mL appears safe because of the high level of neutralizing VP2 antibodies. In contrast, blood products with a high B19 DNA concentration (>10 5 IU/mL), some of which did not contain neutralizing antibodies, were discarded in order to protect at risk persons. Abfall der Viruskonzentration über den Beobachtungszeitraum von 6 Monaten. Im gleichen Zeitraum wurde ein Anstieg an neutralisierenden Antikörpern (VP-2) beobachtet. Standort Frankfurt Arbeitsgruppe Molekulare Virussicherheit Projektleiter PD Dr. M. Schmidt Mitarbeiter Kai Hourfar Kooperationen IKT Ulm Prof. Dr. H. Schrezenmeier, Frau Dr. Mayr-Wohlfart Förderung DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg - Hessen ggmbh Laufzeit des Projektes

36 Qualtiätssicherung in der Blutversorgung Prävalenz von Anti-HBc bei Blutspendern Hintergrund und Projektbeschreibung Obgleich das transfusionsbedingte beobachtete Restinfektionsrisiko bezüglich HIV-1 und HCV Infektionen aktuell mit 1 zu 31 Millionen angegeben wird, liegt das Restinfektionsrisiko bezüglich Hepatitis B Infektionen um ca. 1 log Stufe höher bei 1: Die Ursache liegt zum einen an der Biologie des Virus. Während die genomische Verdoppelungszeit von HCV nur 10 h und für HIV nur 17 h beträgt, verdoppelt sich das HB-Virus nur alle 2,56 Tage. Ferner ist die Infektiösität von HBV gegenüber HCV und HIV-1 deutlich erhöht. Dies führt dazu, dass man für die HBV Diagnostik einen sehr sensitiven Screeningtest benötigt. Die Einführung der Mini-pool-PCR in das Blutspenderscreening 1997 detektierte bei einer Untersuchung von mehr als 31 Millionen Spenden 43 HBV DNA positive Proben, die HBsAg negativ waren. Allerdings waren ca. 50% dieser Spenden auch Anti-HBc reaktiv. Seit Oktober 2006 ist das Screening mit Anti-HBc gesetzlich vorgeschrieben. Spenden die Anti-HBc reaktiv sind werden zusätzlich mit einer Einzel-PCR mit erhöhter Sensitivität (Votum 31 <12 IU/ml) sowie auf Anti-HBs untersucht. In einer retrospektiven Fall-Kontroll-Studie soll untersucht werden, ob von Anti-HBc reaktiven Blutprodukten (Einzel-PCR HBV negativ) eine Infektionsgefahr ausgeht. A One second marker positive. B Both second markers positive. All 188 samples reactive by PRISM HBc and/or by PRISM HBcore were re-analysed by seven additional assays for anti-hbc. Samples were categorized into three groups [1 = anti-hbc-only reactives; 2 = one second marker positive for antibody to hepatitis B surface antigen or antibody to hepatitis B envelope antigen (anti-hbs or anti-hbe); 3 = samples reactive for anti-hbc and anti-hbe + anti-hbs). The samples were further classified into three classes (class A = reactive in all nine anti-hbc assays; class B = reactive in five to eight anti-hbc tests; class C = reactive in four or fewer anti-hbc-tests). Wichtigste Ergebnisse Seit Einführung der Anti-HBc Testung in den Blutspendedienst Baden-Württemberg Hessen im Februar 2006 wurden mehr als 1 Million Spenden auf Anti-HBc untersucht. Bei der Validierung der Anti-HBc-Tests wurden erhebliche Unterschiede in der Spezifikation beobachtet. Während Spenden, die neben Anti-HBc auch Anti-HBe reaktiv waren, von allen 9 Anti-HBc-Tests ohne Ausnahme reaktiv getestet wurden, unterschieden sich die Tests besonders bei Proben, die nur für den Parameter Anti-HBc reaktiv waren. Ferner zeigte sich in der Routineanwendung, dass der Begriff der Serokonversion nicht allein am Cut off fest gemacht werden kann, da einige Proben von Spende zu Spende um diesen Cut off Wert undulieren. Insgesamt wurden 12 HBV Einzel-PCR positive Spender detektiert. Look-Back Untersuchungen erbrachten bisher jedoch keine HBV Übertragungen. Retrospektiv wurde untersucht, ob das dreifache Screening mit HBV Mini-Pool-PCR, HBsAg und Anti-HBc notwendig ist. Bei der Datenanalyse von 1998 bis 2005 wären alle HBV-reaktiven Proben auch mit einem Screeningprocedere mit HBV-NAT und Anti- HBc entdeckt worden. 35

37 Qualitätssicherung in der Blutversorgung Analysis of 188 antibody to hepatitis B core antigen (anti-hbc)-reactive samples: comparison between nine anti-hbc assays. Anti-HBc assays were divided into competitive (Murex, AxSYM, PRISM HBcore, PRISM HBc, COBAS Immulite and Behring) and non-competitive (ADVIA and Ortho) assays. Sample cut-off values (S/Co) differed significantly between anti-hbc-only reactive samples and anti-hbc + antibody to hepatitis B envelope antigen (anti- HBe)-reactive samples. Summary Background and Objectives: Since voluntary introduction of hepatitis B virus (HBV) minipool nucleic acid amplification technology (NAT) at the German Red Cross, the expected residual risk of a transfusion-associated HBV infection has been estimated to be 1: about 10 times higher than for human immunodeficiency virus (HIV) or hepatitis C virus (HCV) infection. Donors demonstrating chronic positivity for antibody to hepatitis B core antigen (anti-hbc), negativity for hepatitis B surface antigen (HBsAg) and polymerase chain reaction (PCR)-negative with a low virus load are a major cause of this increased risk. Materials and Methods: Ten-thousand blood donors from our blood-donation centre were screened for anti-hbc using the current PRISM HBc and the new PRISM HBcore assay to evaluate the diagnostic sensitivity and specificity of these tests. PRISM HBcor PRISM HBcore-reactive samples were further analysed using seven additional tests for anti-hbc, two tests for antibody to hepatitis B surface antigen (anti-hbs), one test for antibody to hepatitis B envelope antigen (anti-hbe) and three HBV NAT assays. Results: From a total of donors, nine and 14 samples were reactive only in the PRISM HBc and the PRISM HBcore, respectively, whereas 165 samples were reactive in both anti-hbc assays. Further analysis of these 188 anti- HBc-reactive specimens in a total of nine different anti-hbc assays revealed concordant results for 162 (86 2%) secimens. Sample cut-off values for anti-hbc were significantly (P < 0 01) lower for anti-hbc-only reactive samples compared with specimens that were also reactive for anti-hbs or anti-hbe. Conclusions: Both PRISM anti-hbc assays revealed that 1 8% of non-prescreened blood donors from Germany were reactive for anti-hbc. Although sensitivity was comparable between both assays, specificity was increased significantly with the PRISM HBcore. High anti-hbc sample cut-off values were indicative for reactivity in other HBV parameters and for concordant results in the nine different anti-hbc assays. Look-back investigations are necessary to estimate the infection risk both of anti-hbc-only positive and of anti-hbc/anti-hbs-positive blood transfusions.. Standort Frankfurt, Arbeitsgruppe Molekulare Virussicherheit Projektleiter PD Dr. M. Schmidt Mitarbeiter Kai Hourfar Förderung DRK-Forschungsgemeinschaft Laufzeit des Projektes Weitere Informationen Schmidt M, Nubling CM, Scheiblauer H, Chudy M, Walch LA, Seifried E, Roth WK, Hourfar MK. Anti-HBc screening of blood donors: a comparison of nine anti-hbc tests. Vox Sang Oct;91(3):

38 Qualtiätssicherung in der Blutversorgung Entwicklung und Evaluation eines automatisierten Wägemoduls für die NAT-Pooltestung Hintergrund und Projektbeschreibung Seit dem Beginn der NAT-Testung in den DRK-Blutspendediensten Ende der 1990er Jahre bis zum heutigen Tage wurden die NAT-Testverfahren stetig verfeinert, um die virale Sicherheit der Blutprodukte zu steigern. Durch die Einführung der Real-time-PCR sowie durch die Mitführung von internen Kontrollen sowie Positivkontrollen ist der Prozess der NAT-Testung heute ein hochgradig überwachter Prozess. Invalide Testresultate können anhand der Ergebnisse der Reaktionskontrollen zuverlässig erkannt werden. Lediglich bei dem Teilprozess der Poolings worunter das Zusammenfassen von mehreren Einzelspenden zu einem sogenannten Minipool mit Hilfe von Pipettierrobotern verstanden wird konnten seit den Anfangstagen der NAT-Testung keine substanziellen Fortschritte hinsichtlich einer umfassenden Dokumentation und Überwachung erzielt werden. Bei Anwendung der Minipool-Testung ist es unerlässlich, dass ein ausreichendes Plasmavolumen jeder Blutspende zuverlässig in einen Minipool dispensiert wurde. Andernfalls besteht die Gefahr, dass eine virämische Blutspende aufgrund eines negativen Ergebnisses eines Minipools freigegeben wird, der eine für einen Nachweis nicht ausreichende Menge Plasma eines infizierten Spenders enthielt. Ziel des Projektes war es, in enger Kooperation mit der Firma Tecan das Konzept einer automatisierten Feinwaage zu evaluieren, Schwachstellen des Konzeptes zu identifizieren und ein routinetaugliches gravimetrisches Testverfahren bis zu seiner Markteinführung zu begleiten.. Automatisiertes Wägemodul Te-PoolSafeTM ermöglicht die gravimetrische Überprüfung jedes einzelnen Pipettierschrittes zu den Pool-Gefäßen Wichtigste Ergebnisse Auf Basis der im Rahmen dieser Studie gewonnenen Erkenntnisse konnte seitens der Firma Tecan ein routinetaugliches Wägemodul für die Überwachung des Poolings entwickelt werden. Die Feinwaage, die auf der Arbeitsfläche des Pipettierroboters platziert wird, hat eine Genauigkeit von ca. ± 2mg und dokumentiert jeden einzelnen Pipettierschritt zu einem Minipool. Abweichungen der dispensierten Menge vom vorgegebenen Wert können aufgrund der Genauigkeit des Moduls sicher identifiziert werden. Fehlerhaft pipettierte Proben können durch Anbindung des Moduls an das LIMS direkt von einer weiteren Verarbeitung ausgeschlossen werden. In der Studie konnte belegt werden, dass das System in der Lage ist, fehlerhafte Pipettierschritte zu detektieren, welche nicht durch die bisherigen Sicherheitsfunktionen der Pipettierroboter erkannt wurden. So wurden unter pipettierten Plasmaproben 37

39 Qualitätssicherung in der Blutversorgung fortgeschrittenen Alters (3-7 Tage) 18 fehlpipettierte Proben ausschließlich das neu entwickelte Wägemodul identifiziert. Jedoch wurde ebenfalls offenkundig, dass bei dem bisher angewandten Pooling-Procedere die Frequenz solcher sicherheitsrelevanter Pipettierfehler extrem selten ist. Zudem wird in der Routinetestung zusätzlich eine visuelle Kontrolle von Archivplatten durchgeführt, welche ebenfalls geeignet ist, Pipettierfehler bei dem Poolingprozess zu identifizieren. Nichtsdestotrotz stellt das Verfahren einen erheblichen Fortschritt, vor allem auf die Dokumentation des Poolingprozesses bezogen, dar. Summary When performing minipool-testing of blood donations for transfusion transmissible viruses, it is crucial to correctly dispense plasma from each donation into the pools. However, concerns regarding the monitoring and documentation of the pooling process exist. A balance module with a tube holder has been developed, which can be easily integrated into liquid handling platforms. The existing software monitors and evaluates every single dispensing from primary samples to the minipool to confirm liquid arrival. The weighing accuracy of the balance module is approx. 2 mg per dispensing episode. 10,156 blood donations were tested on a Tecan Genesis RSP pipetting system. 31 donations were not pipetted because the pipetting workstation identified a clot or sample shortage in the primary tube. The balance module exclusively detected another 18 mispipettings, which were outside of the acceptance criteria of 100 +/- 10%. The mean pipetted volume for these samples was 34.2 µl (range 0 87 µl). Visual inspection of the corresponding primary tubes showed blood clots, short sample or no apparent cause. The average deceleration of the pooling process, using the balance, was determined to be about 22%. With the novel liquid arrival check system, complete and consistent process documentation of pooling for NAT-testing is feasible. It enables blood banks to monitor and compare every single dispense made with predefined, required volumes. Results can be transferred to the laboratory information management system (LIMS) for automated selective exclusion of inaccurately dispensed samples... Standort Frankfurt, Arbeitsgruppe Sicherheit von Blutprodukten Projektleiter Apotheker Kai Hourfar / PD Dr. med. M. Schmidt Mitarbeiter Apotheker Kai Hourfar; Lucy Reichelt (MTA) Kooperation Tecan Schweiz AG Förderung Tecan Schweiz AG Laufzeit des Projektes Weitere Informationen Hourfar MK, Koller M, Roth WK, Kehrli R, Seifried E, Schmidt M. Balance module allows consistent monitoring and documentation of the pooling process for nucleic acid amplification technology testing. Vox Sanguinis in press. 38

40 Qualtiätssicherung in der Blutversorgung Dokumentation der photochemischen Pathogeninaktivierung von Thrombozytenkonzentraten unter Verwendung von Amotosalen und UVA Licht mittels PCR und Bioanalyzer Hintergrund Mit der Einführung photochemisch behandelter, pathogeninaktivierter Thrombozytenkonzentrate in die Routine stellt sich die Frage nach einer möglichen Qualitätskontrolle, die die Effizienz dieses Verfahrens dokumentiert. Die bisherigen Möglichkeiten beschränken sich auf die Messung der Bestrahlungsdauer und intensität des UVA Lichts, sowie der Bestimmung des Amotosalengehalts und der Photoprodukte mittels HPLC-Methode. Da diese Messmethode sehr komplex und aufwendig ist, kann sie z. Zt. nur in einem Speziallabor durchgeführt werden. Vorergebnisse Wir konnten in Vorarbeiten zeigen, das mittels PCR-Verfahren die Effizienz der Pathogeninaktivierung dokumentiert werden kann. Hierfür haben wir ein PCR System unter Verwendung von mitochondraler DNA etabliert: Das PCR-System besteht zum einen aus einem Fragment, das klein genug ist, damit statistisch gesehen Kreuzvernetzungen zwischen Genom und Amotosalen ausbleiben und somit unabhängig von der photochemischen Behandlung diese Sequenz in der PCR amplifiziert werden kann. Dieses Fragment dient als interne Kontrolle zum Nachweis einer korrekten PCR. Zum anderen haben wir ein Fragment ausgewählt, dass groß genug ist, damit Kreuzvernetzungen zwischen Genom und Amotosalen stattfinden. Diese Kreuzvernetzungen bedingen eine Inhibition der PCR, so dass die korrekt stattgefundene photochemische Behandlung nachgewiesen wird. Bisher erfolgte die qualitative Auswertung der PCR Ergebnisse anhand der Agarosegelelektrophorese. Ziel der Untersuchungen Mit den aktuellen Untersuchungen soll eine quantitative Auswertung der PCR-Ergebnisse mittels Bioanalyser etabliert und standardisiert werden, mit dem Ziel einen Cut off Wert zu definieren, ab dem die photochemische Behandlung als effizient angesehen werden kann. A Vor PCT Kleines Fragment Großes Fragment B Nach PCT Großes Fragment Kleines Fragment Abbildung A: Auswertung der PCR Ergebnisse aus einer Probe vor photochemischer Pathogeninaktivierung. Darstellung des kleinen Fragmentes, d.h. der internen PCR Kontrolle zum Nachweis der korrekten PCR sowie des großen Fragmentes, d.h. dem Amplicon, dass den Nachweis für die korrekte Behandlung erbringen soll. In dieser Probe lassen sich beide Fragment nachweisen. Abbildung B: Auswertung der PCR Ergebnisse aus einer Probe nach photochemischer Pathogeninaktivierung. Darstellung des kleinen Fragmentes, d.h. der internen PCR Kontrolle zum Nachweis der korrekten PCR sowie des großen Fragmentes, d.h. dem Amplicon, das den Nachweis für die korrekte Behandlung erbringen soll. In dieser Probe lässt sich das große Fragment als Zeichen der stattgefundenen Amotosalen- Genom-Kreuzvernetzung deutlich abgeschwächt nachweisen 39

41 Qualitätssicherung in der Blutversorgung Wichtigste Ergebnisse Wir konnten bisher zeigen, dass die Auswertung der PCR Ergebnisse mittels Bioanalyser möglich ist. Der Cut off Wert (Inaktivierungsfaktor) berechnet als Quotient aus der area under the curve der beiden Fragmente vor und nach der photochemischen Behandlung weist allerdings noch eine große Streubreite auf. P1 Inaktivierungsfaktor: P2 P2 : P1 P2 : P1 P1 P2 Nach PCT Vor PCT Kleines Fragment Großes Fragment Die beiden Kurvendarstellungen einer Probe vor photochemischer Behandlung (rot) und nach photochemischer Behandlung (blau) überereinander gelegt: Aus der area under the curve der beiden Fragmente vor und nach der photochemischen Behandlung kann ein Quotient berechnet werden (Inaktivierungsfaktor). Summary We could demonstrate that the bioanalyser is compatible for documentation of the PCR results. Until now the investigations show a wide range for a cut off value estimated from values gained from samples taken after versus before photochemical treatment. Standort Arbeitsgruppe Projektleiter Mitarbeiter Mannheim Sicherheit in der Hämotherapie Dr. med. Karin Janetzko PD. Dr. rer. nat. Peter Bugert Weitere Informationen Bruchmüller I, Janetzko K, Bugert P, Mayaudon V, Corash L, Lin L, Klüter H.:PCR inihibition assay documenting the amotosalen-based photochemical pathogen inactivation process of platelet concentrates. Transfusion 2005;45:

42 Qualtiätssicherung in der Blutversorgung Einfluss der Pathogeninaktivierung von gefrorenem Frischplasma (GFP) mittels Amotosalen und UVA-Bestrahlung auf die Gerinnungsaktivität Hintergrund und Projektbeschreibung Das stetige globale Auftreten neuer Pathogene, die die Sicherheit von Blutprodukten bedrohen, stellt die Blutspendedienste vor die Notwendigkeit, ständig neue Testverfahren zu etablieren. Eine mögliche Alternative zur immer komplexer werdenden Testung stellt die Inaktivierung von Pathogenen im Blut dar, wobei Qualität, Sicherheit und Funktion der Blutprodukte nicht beeinträchtigt werden darf. Weiterhin muss sich die Methode in die Produktions- und Freigabeabläufe eines modernen Blutspendedienstes integrieren lassen. Mit dem von der Firma Cerus entwickelten Intercept TM -System steht ein CE-zertifiziertes Pathogeninaktivierungsverfahren für Thrombozytenkonzentrate und Frischplasma zur Verfügung. Ziel dieser Studie ist es, den Einfluss dieses Pathogeninaktivierungsverfahrens, das auf dem Zusatz von Amotosalen, einem synthetischen Psoralen, mit anschließender UVA- Bestrahlung und nachfolgender Absorption des residualen Amotosalens und seiner Fotoprodukte beruht, auf die Gerinnungsparameter von gefrorenem Frischplasma zu untersuchen. Die dreiarmige Studie wird in der Abteilung Produktion des Institutes Frankfurt unter Routinebedingungen durchgeführt, um die Vereinbarkeit der neuen Abläufe mit den bisherigen Routinearbeits-schritten zu untersuchen. Jeweils 650 ml Frischplasma wird entweder (Arm A) von acht gesunden freiwilligen Plasmapheresespendern gewonnen und innerhalb 8h verarbeitet oder (Arm B) durch Zusammenführen von achtmal je drei AB0- und Rh-gleichen, aus Vollblut gewonnenen Plasmen bereitgestellt. Während in Arm B die Weiterverarbeitung nach 8h erfolgt, werden in Arm C die acht Poolplasmen erst nach einer 22-stündigen Lagerung bei Raumtemperatur weiterverarbeitet. Nach der photochemischen Pathogeninaktivierung werden die Plasmen in 200ml-Fraktionen geteilt und für sechs Wochen bei 40 C tiefgefrore n gelagert. Proben für die Gerinnungsanalysen werden vor Beginn der gesamten Prozedur, nach der Pathogeninaktivierung (= vor dem Einfrieren) und nach sechs Wochen Tiefkühllagerung untersucht. Wichtigste Ergebnisse Die beschriebene Methode der Pathogeninaktivierung mittels Amotosalen und UVA-Bestrahlung von aus Vollblutspenden bzw. mittels Plasmapherese gewonnenem gefrorenem Frischplasma (GFP) lässt sich problemlos in die Routinearbeitsabläufe eines Großblutspendedienstes integrieren. Die Qualität und Funktionalität des GFP bleibt unter dieser Pathogeninaktivierungsmethode weitestgehend erhalten. Somit besteht mit diesem Verfahren die Möglichkeit, dieses Verfahren im Blutspendedienst im größeren Maßstab zu etablieren. Summary Pathogen inactivation of frozen plasma using amotosalen + UVA does not significantly influence coagulation parameters with the exception of FVIII. The decrease in FVIII activity might be explained in part by an additional freeze-thawing cycle included in the protocol due to technical reasons. Increased TAT levels, especially in arm C, were not reflected in decreased AT activity or an increase in other markers of coagulation activation, but indicate continuous, although moderate activation of the coagulation cascade during storage time. The described inactivation procedure for whole blood derived and apheresis FP can be performed in a large blood bank setting without significant decreases in coagulation factor activities and thus without major impairment of the functional capacity of therapeutic plasma. 41

43 Qualitätssicherung in der Blutversorgung Parameter PT aptt TT FBG AT F II F V F VII F VIII F IX F X F XI F XII F XIII INR (% BL) (% BL) (% BL) (% BL) (% BL) (% BL) (% BL) (% BL) (% BL) (% BL) (% BL) (% BL) (% BL) (% BL) STUDIENARM A (Einzelspender-Aphereseplasma verarbeitet innerhalb von 8h) Ausgangswerte Nach PCT Wo. Lagerung bei -40 C STUDIENARM B (Plasma aus drei gepoolten Vollblutspenden verarbeitet innerhalb von 8h) Ausgangswerte Nach PCT Wo. Lagerung bei -40 C STUDIENARM C (Plasma aus drei gepoolten Vollblutspenden verarbeitet innerhalb von 22h) Ausgangswerte Nach PCT Wo. Lagerung bei -40 C Parameter D-Dimere vwf Ag vwf Act CBA PC PS Act PAP TAT PLG FBG imm APL (% BL) (% BL) (% BL) (% BL) (% BL) (% BL) (% BL) (ng/ml) (% BL) (% BL) (% BL) STUDIENARM A (Einzelspender-Aphereseplasma verarbeitet innerhalb von 8h) Ausgangswerte Nach PCT Wo. Lagerung bei -40 C STUDIENARM B (Plasma aus drei gepoolten Vollblutspenden verarbeitet innerhalb von 8h) Ausgangswerte Nach PCT Wo. Lagerung bei -40 C STUDIENARM C (Plasma aus drei gepoolten Vollblutspenden verarbeitet innerhalb von 22h) Ausgangswerte Nach PCT Wo. Lagerung bei -40 C Alle dargestellten Ergebnisse sind Medianwerte aus n = 8 gepoolten gefrorenen Frischplasmen (GFP) standardisiert auf die Ausgangswerte (= 100%). PCT: photochemical treatment; BL: baseline (= Ausgangswert = 100%); PT: prothrombin time; INR: international normalized ratio; aptt: activated partial thromboplastin time; TT: thrombin time; FBG: fibrinogen; AT: antithrombin; F: coagulation factor; vwf: von Willebrand factor; Ag: antigen; Act: activity; CBA: (vwf) collagen binding assay; PC: protein C; PS: protein S; PAP: plasmin-antiplasmin-complex; TAT: thrombin-antithrombin-complex; PLG: plasminogen; imm: immunological assay (= antigen); APL: antiplasmin. Standort Frankfurt Arbeitsgruppe Produktion und Stammzellbiologie Projektleiter PD Dr. med. Reinhard Henschler Mitarbeiter Dr. med. Markus M. Müller und Dipl. Biol. Hans-Ulrich Pfeiffer Kooperationen Institut für Experimentelle Hämatologie und Transfusionsmedizin der Universitätsklinik Bonn (Prof. Dr. med. Johannes Oldenburg und Prof. Dr. med. Bernd Pötzsch) Förderung Firma Cerus Corp., Concord, U.S.A. Laufzeit des Projektes 12/ /2006 Weitere Informationen Markus M. Mueller, Hans-Ulrich Pfeiffer, Margaret Rheinschmidt, Bernd Poetzsch, Johannes Oldenburg, Laurence Corash, Erhard Seifried and Reinhard Henschler: Effects of Pathogen Inactivation Using Amotosalen-UVA on Coagulation Parameters in Apheresis and Whole Blood Derived Frozen Plasma in a Large Blood Bank Setting. Blood 2006;108:281a- 282a 42

44 Qualtiätssicherung in der Blutversorgung Qualitätssicherung der D-negativen Erythrozyten-Präparate durch Ausschluss von DEL-Blutpräparaten Hintergrund und Projektbeschreibung Mit genetischer Diagnostik für das RHD-Gen werden unter vermeintlich D-negativen Spendern etliche Blutspender mit weak D- oder DEL-Bluten aufgedeckt, um diese Blute nur noch D- positiven Patienten zu transfundieren. Ohne genetische Diagnostik werden immer wieder D- negative Transfusionsempfänger durch das Antigen D solcher Blutspenden immunisiert. Bisher als D-negativ verkannte Spender, deren Erythrozyten einen D-/D+-Chimärismus aufweisen, können ebenso sicher entdeckt werden. Ein lebenslanger Chimärismus kann bei Zwillingsschwangerschaften mit gemeinsamem Blutkreislauf auftreten. Jede Transfusion solcher Blutspenden kann eine Anti-D-Immunisierung bewirken, weil sie jeweils mehrere Milliliter Erythrozyten mit völlig normalem D-positiven Phänotyp enthalten. Diese Beimengung von D-positivem Blut kann man mit keiner serologischen Routinemethode sondern ausschließlich mit genetischer Diagnostik nachweisen. Jede Anti-D-Immunisierung hat zumindest bei Frauen im gebärfähigen Alter und Mädchen eine erhebliche klinische Bedeutung. Ein Morbus hämolyticus neonatorum durch Anti-D wäre im Fall D-positiver Schwangerschaften wahrscheinlich. Durchfluss-zytometrische Analyse einer D +/- Chimäre. Die Fluoreszenz-Histogramme wurden mit indirekter Immunfluoreszenz und polyklonalem Anti-D in einer Blutspende einer D +/- Chimäre gewonnen (A), einer weiteren Blutspende drei Monate später (B) und einer Kontrolle mit 5% D-positiven Erythrozyten (C). Der D-positive Erythrozyten-Anteil beim Blutspender war ungefähr 6% Wagner et al., Licensee BioMed Central Ltd. Abdruck mit Genehmigung. 43

45 Qualitätssicherung in der Blutversorgung Wichtigste Ergebnisse In dem Institut Ulm wird die RHD-Genotypisierung unter neuen D negativen Blutspendern (zirka Blutspenden pro Jahr) als Routineverfahren seit Januar 2002 angewendet. Ungefähr 1 unter 500 scheinbar D-negativen Blutspendern weist ein RHD-Allel auf. Ungefähr 1 unter scheinbar D-negativen Blutspendern trägt einen DEL-Phänotype und wird permanent den D positiven Blutspendern zugeordnet. Seit 1. Januar 2007 werden auch die D negativen Erst- Blutspender der Institute Frankfurt und Kassel diesbezüglich untersucht. Summary At the blood center in Ulm RHD genotyping of D negative first-time donors (500,000 donations/year) has been a routine procedure since January About 1 in 500 seemingly D negative blood donors carry an RHD allele. About 1 in 1,000 seemingly D negative donors express an DEL phenotype and should be permanently moved to the D positive blood donor pool. Since 1. January 2007 the D negative frist-time donors of the Institute Frankfurt and Kassel were tested accordingly. Standort Arbeitsgruppe Projektleiter Mitarbeiter Kooperationen Förderung Laufzeit des Projektes Ulm Molekulare Diagnostik erythrozytärer Antigene Prof. Dr. med. Willy A. Flegel Dr. med. Ingeborg von Zabern Marianne Lotsch (MTA) alle für den Blutspender-Arbeitsplatz eingewiesenen medizinischtechnischen Assistenten P. Bugert, C. Geisen, G. Holzberger, E. A. Scharberg, DRK Blutspendedienst Baden-Württemberg Hessen, Institute Mannheim, Frankfurt, Kassel und Baden-Baden DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg - Hessen ggmbh Seit fortlaufend Weitere Informationen Flegel, W.A.: How I manage donors and patients with a weak D phenotype. Curr Opin Hematol 13(2006) Flegel, W. A.: Genetik des Rhesus-Blutgruppensystems. Deutsches Ärzteblatt 104(2007)A651-A657 Internetseite: 44

46 Qualtiätssicherung in der Blutversorgung Nationale Qualitätssicherung der derzeit empfohlenen Rhesus- Typisierungsstrategie Hintergrund und Projektbeschreibung Die Arbeitsgruppe wurde von der Deutschen Gesellschaft für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie (DGTI) am 10. Februar 1998 mit der Führung des Rhesus-Immunisierungs- Registers beauftragt. In diesem Register werden Fälle von Anti-D-Immunisierungen bei D- positiven Personen gesammelt und molekularbiologisch aufgeklärt. Klinische Probleme sind durch einige wenige RHD-Allele bedingt. Meist handelt es sich um Personen mit partial D- oder einigen wenigen seltenen weak D-Typen, die durch normales Antigen D immunisiert werden. Die D-Kategorie VI (DVI) ist darunter die wichtigste. Deshalb werden monoklonale Anti-D-Antikörper für die Typisierung empfohlen, die nicht mit DVI reagieren. Dieses Vorgehen ist seit 1996 unverändert in den deutschen Hämotherapie- Richtlinien implementiert. Die Träger von DVI werden daher bewusst falschnegativ typisiert, um eine Transfusion von D-positivem Blut mit der wahrscheinlichen Folge einer Anti-D- Immunisierung zu verhindern. Das Ziel ist es, einen Überblick über mögliche Probleme bei den derzeitigen Transfusionsverfahren zu bekommen, und, falls erforderlich, Vorschläge für verbesserte Typisierungs- und Transfusionsstrategien zu erarbeiten. Verteilung der molekularen weak D-Typen in Transfusionsempfängern mit anti-d-immunisierungen. Insgesamt wurden 31 Beobachtungen seit 1998 unter Patienten mit weak D-Phänotypen berichtet. Patienten mit den häufigen weak D- Typen wiesen nur Auto-anti-D auf (n = 24; weis und grau). Einzelne weak D-Typen, wie weak D-Typ 4.2, 11 und 15, die allesamt unter Europäern selten sind, ließen eine Allo-anti-D-Immunisierung zu (n = 4; schwarz und gestrichelt). 45

47 Qualitätssicherung in der Blutversorgung Wichtigste Ergebnisse Im Gegensatz zu partial D wurde bisher keine Allo-Anti-D-Immunisierung bei weak D Typ 1, Typ 2 oder Typ 3 beobachtet. Es ist aus klinischer Sicht überaus vorteilhaft, dass es sich um die häufigsten weak D-Allele handelt, die zusammen annähernd 90 % aller weak-d-typen in Deutschland ausmachen. Diese Patienten können mit D-positivem Blut transfundiert werden. Damit wird der unnötige Einsatz von D-negativen Erythrozytenpräparaten bei diesen Patienten vermieden. Mit diesem Vorgehen können bis zu 5 % aller D-negativen Erythrozytenpräparate eingespart und völlig problemlos durch D-positive ersetzt werden, um Engpässe in der Versorgung mit D-negativen Blutpräparaten zu mindern. Summary Unlike partial D, no anti-d isoimmunization has yet been reported for weak D type 1, 2 or 3. From a clinical perspective, it is helpful that this involves the commonest anti-d alleles, which make up almost 90% of all weak D types in Germany since these patients can receive D positive blood transfusions and do not require D negative products. This procedure saves up to 5% of all D negative erythrocyte products since they can perfectly well be replaced by D positive products, thus avoiding bottlenecks in the supply of D negative blood products. Standort Ulm Arbeitsgruppe Molekulare Diagnostik erythrozytärer Antigene Projektleiter Prof. Dr. med. Willy A. Flegel Mitarbeiter Dr. med. Ingeborg von Zabern Anita Hacker, Hedwig Teubl (MTA) Kooperationen Mitglieder der Sektion 5 Immunhämatologie/Gentechnik der DGTI Förderung DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg - Hessen ggmbh Laufzeit des Projektes Weitere Informationen Flegel WA. How I manage donors and patients with a weak D phenotype. Curr Opin Hematol 13(2006) Flegel, W. A.: Genetik des Rhesus-Blutgruppensystems. Deutsches Ärzteblatt 104(2007)A651-A657 Internetseite des Rhesus Immunisierungsregister: 46

48 Qualtiätssicherung in der Blutversorgung Leistungsbewertungsstudie eines neuen Verfahrens zur Blutgruppenbestimmung mittels Lateral-Flow-Technik: MDmulticard ABO-D-Rhsubgroups-K for patients Hintergrund und Projektbeschreibung Medion Diagnostics AG hat eine Lateral-Flow-Testkarte zur Bestimmung der Blutgruppeneigenschaften A-B-D-D-K-C-Cw-c-E-e in einem Ansatz entwickelt ( MDmulticard ABO-D-Rhsubgroups-K for patients ). Die Lateral-Flow-Technik erlaubt eine Bestimmung der Erythrozyteneigenschaften aus Vollblut innerhalb von 5 Minuten, ohne dass ein Zentrifugationsschritt erforderlich ist. Das Ziel der Studie ist der Nachweis der Leistungsfähigkeit der MDmulticard ABO-D- Rhsubgroups-K for patients in der Anwendung an statistisch signifikanten Spender- und Patientenpopulationen im Routinebetrieb im Vergleich zu State-of-the-Art Methoden (DiaMed Gel Test; Olympus PK-7200). Insgesamt wurden 4276 Blutproben (3550 Spander, 726 klinische Proben) vergleichend untersucht. Unter den Proben befanden sich 88 Proben mit schwacher Antigen-Expression (weak D, partial D, weak A, A, Ael, weak B) sowie 86 neonatale Proben. Abgesehen von wenigen im Folgenden aufgeführten Ausnahmen ergaben sich durchweg übereinstimmende Ergebnisse im Vergleich zu State-of-the-Art Methoden (DiaMed Gel Test; Olympus PK-7200). Bei einem Spender wurde ein möglicherweise qualitativ verändertes Rhesus e-antigen mit MDMultiCard nicht nachgewiesen. Bei einem weiteren Spender mit ausgeprägter Hyperlipidämie wurden im Regelansatz unter Verwendung der Vollblutmethode unspezifische Ergebnisse erhoben. Weiterhin ergaben sich bei einem Patienten mit hochtitrigen erythrozytären Auto-Antikörpern vom IgG-Typ zunächst unspezifische Ergebnisse. In beiden Fällen konnten unter Verwendung von gewaschenen Erythrozyten regelhafte Blutgruppenbefunde erhoben werden. Bei einem Patienten mit hochtitrigen kältereaktiven Auto- Antikörpern konnte erst nach vorheriger Inkubation bei 37 C ein korrekter Blutgruppenbefund erhoben werden. Insbesondere wurden bei neonatalen Proben keine Abweichung vom Referenz-Blutgruppenbefund festgestellt. Weiterhin ergaben sich bei Ansatz alternativer Antikoagulantien (EDTA-, ACD-, CPDA- sowie Citrat-Blut) keine Abweichungen von der Referenz-Blutgruppe. Ergebnis einer Blutgruppenbestimmung mittels MDmulticard ABO-D-Rhsubgroups-K for patients : Ist ein Blutgruppen- Merkmal vorhanden ergibt sich eine rote Bande, bei Fehlen des Blutgruppen-Merkmal ist keine Bande nachweisbar. Als interne Positiv- bzw. Negativ-Kontrollen dienen: val: Roter Punkt; ctl: Kein Signal. Im gezeigten Beispiel lautet das Ergebnis der Bestimmung der Erythrozyteneigenschaften: B Rh positiv (CcD.Ee) kk Wichtigste Ergebnisse MDmulticard ABO-D-Rhsubgroups-K for patients stellt ein hochsensitives und zugleich auch äußerst spezifisches Verfahren zur Bestimmung der Blutgruppeneigenschaften A-B-D-D-K-C- Cw-c-E-e mittels Lateral-Flow-Technik dar. Die verwendete Methode zeichnet sich durch eine einfache Handhabung aus, die aufgrund der wenigen erforderlichen Arbeitsschritte auch eine 47

49 Qualitätssicherung in der Blutversorgung sehr sichere Methode zur Bestimmung einer Blutgruppe darstellt. Als weiterer Vorteil der Methode erwies sich die sehr kurze Zeit zwischen Auftragung der Blutprobe auf den Testträger und der Befundung (5 Minuten ). Dies erlaubt insbesondere den Einsatz der Methode in der Notfalldiagnostik. Summary A novel lateral flow assay ( MDmulticard ) allows for simultaneous multi-parameter testing in a single assay, providing a stable end-point without centrifugation. Briefly, in the lateral flow method 100 µl of diluted blood or erythrocyte sediment are pipetted into the application zone of the MDmulticard, followed by 300 µl of a rinsing buffer. Results can be read after 5 minutes. Positive results are recognized as distinct red bands, negative results are recognized by the absence of the respective band.the aim of this study is to evaluate the performance of MDmulticard in routine testing on statistically significant donor and patient populations as opposed to state-of-the-art methods (DiaMed Gel Test; Olympus PK-7200). In 4271 samples ABO, D, K and Rhesus subgroup typing concurred. 5 samples showed discrepant results. In one sample Rhesus e-antigen was typed negative in the lateral flow assay while different monoclonal antibodies gave variable results in the gel agglutination assay suggesting a partial e-antigen. In two samples false positive results were observed initially, which were most likely due to excessive hyperlipaemia and high titer IgG-autoantibodies, respectively. After washing red blood cells regular results in the lateral flow assay could be obtained in both samples. In one sample with high cold agglutinin titer due to complete auto agglutination in the application zone of the lateral flow device no band could be observed. After preincubation of the sample at 37 C the lateral fl ow assay gave concurring results. In one A w sample a positive result with Anti-A could only be observed with MDmulticard but not with the gel agglutination test. The lateral flow assay MDmulticard represents a highly sensitive and specific method for ABO, D, K and Rhesus subgroup antigen typing within 5 minutes without a centrifugation step. Therefore MDmulticard is highly suitable for emergency diagnostics. Standort Frankfurt Arbeitsgruppe Immunhämatologie Projektleiter Dr. med. Christof Geisen Mitarbeiter Regine Bernhöft (TA) Monika Müller (TA) Elke Peters (TA) Sandra Wirsing (TA) Kooperationen Dr. P. Schwind, Medion Diagnostics AG, Düdingen, Schweiz Förderung Industriemittel, Medion Diagnostics AG, Düdingen, Schweiz Laufzeit des Projektes Weitere Informationen Geisen C, Schwind P, Seifried E. (2006). Performance evaluation of a novel lateral flow device for rapid multi-parameter blood grouping without centrifugation. Transfus Med Hemother, 33 (suppl. 1), 49 Geisen C, Schwind P, Seifried E. (2006). Rapid multi-parameter blood grouping without centrifugation - performance evaluation with donor, patient and neonatal samples. Transfusion 46, (9S), 143A 48

50 Qualtiätssicherung in der Blutversorgung Screening der Blutspender auf seltene Blutgruppen und Entwicklung von Antikörper-Identifizierungs-Panels Hintergrund und Projektbeschreibung Die Versorgung mit Blutpräparaten bei Patienten mit seltenen Blutgruppen und Antikörpern gegen hochfrequente Antigene sowie multiplen Antikörpern ist eine der schwierigsten Aufgaben der Transfusionsmedizin. In den letzten Jahren wurden am Institut Baden-Baden für mehrere solcher Patienten aus dem Gebiet der gesamten Bundesrepublik, für die keine kompatiblen Blutspender zur Verfügung standen, Screeningaktionen durchgeführt. Es handelte sich um Antikörper mit verschiedenen Spezifitäten (Anti-Lu(b), Anti-Yt(a), Anti-Kp(b), Anti-k, Anti-AnWj, u.a.). Wichtigste Ergebnisse Bei mehr als getesteten Blutspendern wurden ca. 70 Personen gefunden, die seltene Blutgruppenmerkmale besitzen. Sie konnten mehrfach für die Versorgung von Patienten in verschiedenen transfusionsmedizinischen Einrichtungen in Deutschland herangezogen werden und stehen in unserer Spenderdatei für besondere Anforderungen zur Verfügung. Blutproben dieser Blutspender wurden für Testzwecke im Rahmen des SCARF-Programms (Serum, Cells and Rare Fluid Exchange, Philadelphia, USA) an Referenzlabors in der ganzen Welt sowie im Rahmen des Austauschprogramms Seltene Blutgruppen der DGTI im deutschsprachigen Raum versendet. Eine besonders enge wissenschaftliche Kooperation mit Austausch seltener Proben/Seren besteht auch mit dem New York Blood Center, USA. Mehrere Präparate mit seltenen Blutgruppen sowie Antigen-getestete Erythrozytenkonzentrate wurden in Kooperation mit Industriepartnern (Fa. DiaMed/ Schweiz, Fa. BioRad/ Frankreich) für die Herstellung von Antikörper-Identifizierungs-Panels verwendet. Diese Panels sind unverzichtbar für die prätransfusionelle Diagnostik Summary The supply of red cell concentrates to patients with rare blood groups is a great challenge to blood centres and one of the most difficult tasks of the transfusion medicine. In the last few years the Institute for Transfusion Medicine and Immunohematology in Baden-Baden has performed several screening programs for patients with antibodies to high frequency antigens (anti-lu(b), anti-yt(a), anti-kp(b), anti-k, anti-anwj, etc.) who could not find compatible donors. More than 60,000 blood donors have been screened and about 70 donors with rare blood could be found. These donors have donated blood for patients in different parts of Germany. Their red cells have also been used for exchange programs of national and international reference laboratories like SCARF (Serum, Cells and Rare Fluid Exchange, Philadelphia, USA), the German Rare Donor Working Program or in cooperating with the New York Blood Center. Some of the extendedly typed red cells concentrated have also been included in the production of commercial antibody screening and identification panels (DiaMed and BioRad) which are used in pretransfusion diagnostics. Standort Arbeitsgruppe Projektleiter Mitarbeiter Kooperationen Förderung Laufzeit des Projektes Baden-Baden Sicherheit der Hämotherapie Dr. med. Erwin Andreas Scharberg Dr. Susanne Seyboth, Kathrin Panter (MTA), Marina Mujakic (MTA), Stefanie Penz (MTA), Andrea Ernst (MTA) Fa. DiaMed (Schweiz), Fa. BioRad (Frankreich), AG Seltene Blutgruppen DGTI, SCARF, New York Blood Center, The International Blood Group Reference Laboratory, Bristol/UK, Institute of Haematology and Blood Transfusion, Warsaw/Poland Firma DiaMed (Schweiz) Firma BioRad (Frankreich) bis auf weiteres 49

51 Qualitätssicherung in der Blutversorgung Qualitätsmanagement Beschreibung der Arbeitsgruppe: In Verbindung mit den hohen ethischen und medizinischen Anforderungen an das Sicherheitsprofil in der Transfusionsmedizin und den schonenden Umgang mit dem vom Spender zur Verfügung gestellten Blut, wurde durch die Geschäftsführung ein Qualitätsmanagementsystem entwickelt, dass höchsten nationalen und internationalen Anforderungen, einschließlich aller gesetzlicher Regelungen entspricht. Hierdurch soll eine wirksame Lenkung und Verbesserung der Arzneimittelherstellung und der Dienstleistungsqualität während sämtlicher Phasen der Herstellung und Prüfung sowie des Vertriebes gewährleistet werden. Dieses moderne Qualitätsmanagementsystem umfasst sämtliche Bereiche des Unternehmens, d.h. medizinische Diagnostik- und Arzneimittelbereiche, Lagerung und Vertrieb, Verwaltung, Werbung, den kaufmännischen Bereich sowie die EDV. Grundlage sind die Normen DIN EN ISO 9001: 2000 und 13485:2003 für die Zertifizierung aller Unternehmensbereiche und die DIN EN ISO für die Akkreditierung der labordiagnostischen Bereiche. Zusätzlich werden die Standards der European Federation for Immunogenetics (EFI) für die transplantationsimmunologischen Laborbereiche integriert. Entwicklungen im Unternehmen Der DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg - Hessen vereinbarte mit dem Universitätsklinikum Tübingen (Zentrum für Klinische Transfusionsmedizin ZKT Tübingen), und Universitätsklinikum Heidelberg (Institut für Klinische Transfusionsmedizin und Zelltherapie IKTZ Heidelberg) eine Integration beider Zentren in die Muttergesellschaft Baden-WürttembergHessen. Beide Tochtergesellschaften sind formal Anfang 2005 in Betrieb gegangen. Die ehemaligen Blutspendedienste Sachsen sowie Berlin und Brandenburg wurden im Jahr 2006 zum DRK-Blutspendedienst Ost ggmbh zusammengeschlossen. Dieser Blutspendedienst unterhält die Institute Dresden, Chemnitz, Plauen, Berlin, Potsdam, Cottbus sowie die Außenstellen in Zwickau und Görlitz. Durch diese Veränderungen ergibt sich die in Abb. A gezeigte geographische Entwicklung. In Abb. B ist die Struktur der Einrichtungen des DRK Blutspendedienstes Baden-Württemberg Hessen dargestellt. A B DRK Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen GMP, GLP DIN ISO 9001 : 2000 DIN ISO Kunde Patient Spender Laboratorien Diagnostik / Spenderscreening / Qualitätskontrolle Zelltherapie Gentherapie Molekulare Diagnostik Kunde Herstellung und Vertrieb von Blutkomponenten und Plasmaderivaten Krankenhaus (Arzt / Patient) Abbildung A: Geographische Entwicklung; Abbildung B: Struktur unserer Einrichtungen 50

52 Qualtiätssicherung in der Blutversorgung Zertifizierung des Qualitätsmanagementsystems und Akkreditierung der medizinischen Laboratoriumsanalytik Die Struktur und Aufgaben der Blutspendeeinrichtungen - insbesondere solche mit Universitätsanschluss - haben sich in den letzten Jahren durch die neuen medizinischen Herausforderungen stark verändert. Dies betrifft vor allem die Bereiche der Zell- und Gentherapie, sowie die vielfältigen Bereiche der patientenbezogenen Labordiagnostik. Hervorzuheben sind hierbei Untersuchungen auf molekularbiologischer Basis. Die komplexe Struktur dieser Einrichtungen bedarf einer engen Verzahnung und Abstimmung der Prozesse in allen Bereichen. Auch wenn die GMP-Bereiche, wie Entnahme, Produktion, Spenderscreening und Vertrieb schon immer den gesetzlichen und sonstigen regulatorischen Vorgaben angepasst waren und durch Inspektionen von den zuständigen Landes- und Bundesoberbehörden regelmäßig geprüft wurden, so war es der Geschäftsführung des DRK-Blutspendedienstes Baden-Württemberg Hessen ein großes Anliegen, alle sonstigen Bereiche, einschließlich Personal, Geräte, Einkauf, Lagerhaltung, Technik, Verwaltung und elektronische Datenverarbeitung analog zu den GMP- Bereichen in die Gesamtheit eines nach ISO zertifizierten Qualitätsmanagementsystems des Unternehmens einzubinden. Die GMP und GLP-Anforderungen auf der einen Seite sowie die DIN ISO Normen auf der anderen Seite wurden hierbei als sich qualitativ ergänzend angesehen. Aufgrund der zweijährigen guten Erfahrungen in Hessen hat die Geschäftsführung beschlossen, die Zertifizierung und Akkreditierung auf die Standorte in Baden-Württemberg (Mannheim, Ulm, Baden-Baden) auszudehnen, und in das bereits bestehende System zu integrieren. Das Verfahren in Baden-Württemberg wurde im Januar 2004 begonnen und im November 2004 ebenfalls erfolgreich abgeschlossen. Im Juli 2005 wurden alle Standorte in Sachsen (Plauen, Dresden und Chemnitz sowie den Außenstellen Zwickau und Görlitz) und im November 2006 die in Berlin und Brandenburg (Berlin, Potsdam, Cottbus) auf die gleiche Art und Weise erfolgreich zertifiziert und akkreditiert. Eine komplette Rezertifizierung und Reakkreditierung fand Ende 2006 statt. Somit sind nun alle Institute im DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg Hessen und seine Tochtergesellschaften auf der Basis eines einheitlichen Qualitätsmanagementsystems zertifiziert und akkreditiert. In zwei Instituten (Frankfurt und Ulm) erfolgte auch eine Zertifizierung für die Entwicklung, Herstellung und Vertrieb von Medizinprodukten. Als Zertifizierungstelle dient seit 2006 die Deutsche Gesellschaft zur Zertifizierung von Managementsystemen (DQS). CE-Kennzeichnung von In-vitro-Diagnostika Ein Teilaspekt der umfangreichen Aktivitäten des Blutspendedienstes in der medizinischen Laboratoriumsanalytik ist auch die Entwicklung neuer diagnostischer Verfahren und In-vitro- Diagnostika. Die CE-Kennzeichnung durch eine benannte Stelle bestätigt, dass ein In-vitro-Diagnostikum die einschlägigen Bestimmungen der IVD-Richtlinien (Direktive 98/79/EG) erfüllt, insbesondere dass ein Konformitätsbewertungsverfahren durchgeführt wurde. Alle In-vitro-Diagnostika müssen die anwendbaren grundlegenden Anforderungen hinsichtlich Funktion, Sicherheit und Kennzeichnung gemäß Annex 1 der In-vitro-Diagnostika-Direktive erfüllen. Im Institut für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie in Frankfurt wurde ein Verfahren zur Extraktion viraler Nukleinsäuren und zum Virusgenom-Nachweis für HIV-1, HCV und HBV mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) entwickelt. Die entsprechenden Testkits wurden im Jahre 2006 CE-zertifiziert (als Produkte gemäß Liste A von Annex II der In-vitro-Diagnostika- Direktive). Es handelt sich nach unserer Kenntnis um die bisher einzige CE-zertifizierte In house-methode zum direkten Virusgenom-Nachweis beim Blutspenderscreening. Dieses Verfahren wird einheitlich zum Screening der Blutspenden im Blutspendedienst Baden- Württemberg Hessen angewandt. 51

53 Qualitätssicherung in der Blutversorgung Im Institut für Klinische Transfusionsmedizin und Immungenetik Ulm wurde ein Kit für die hochauflösende HLA-A,-B- und C-Typisierung mittels "Sequence-Based Typing" (SBT) entwickelt, welcher aus Mastermix, PCR-Primergemischen und Locus-spezifischen Sequenzierprimern für die Sequenzierung der Exons 2 und 3 besteht. Auch dieses Inhaus-Verfahren konnte im Jahre 2006 erfolgreich CE-zertifiziert werden (Produkt nach Liste B von Annex II der In-vitro- Diagnostika-Direktive). Europäische Projekte zur Harmonisierung von Qualitätsstandards im Bereich der Transfusionsmedizin Die Aktivitäten des DRK Blutspendedienstes Baden-Württemberg - Hessen sind auch geprägt durch eine hohe Vernetzung auf europäischer und internationaler Ebene mit Institutionen aus dem Bereich der Transfusionsmedizin und angrenzenden Gebieten. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit bildet der Austausch von wissenschaftlichen Ergebnissen in der Entwicklung von Strategien zur Verbesserung der Sicherheit von Blutkomponenten. In diesem Zusammenhang ist es dem DRK Blutspendedienst gelungen, innerhalb des Rahmenprogramms im Bereich der öffentlichen Gesundheit der Europäischen Kommission (Health & Consumer Protection Directorate General) zwei Projekte zur Entwicklung von Europäischen Richtlinien und Empfehlungen für Qualitätsstandards in Blutspendeeinrichtungen zu erhalten. Neben diesen Projekten wurde im Jahr 2006 ein von der europäischen Kommission gefördertes Twinning Projekt zur Verbesserung der Blutsicherheit in Malta erfolgreich abgeschlossen. Standort Arbeitsgruppe Projektleiter Mitarbeiter Frankfurt Qualitätsmanagement MUDr. Walid Sireis, Prof.Dr.med. Christian Seidl Dr. med. Stefan Findhammer (Referent QM) Dr. Esther Schellenberg (Referentin QM) Dr. Thea Müller-Kuller (Referentin QM) Frau Sabine Frenda (QM Sachbearbeiterin) Frau Ines Henniker (QM Sachbereiterin) PD Dr.med.M.Schmidt (Abteilungsleiter Spenderscreening) Prof. Dr. med. Christian Seidl (QM/EU Project Coordinator) 52

54 Qualtiätssicherung in der Blutversorgung Europäisches Twinningprojekt Malta-Deutschland: Verbesserung der Qualität und Sicherheit in der Gewinnung und Herstellung von Blutkomponenten Hintergrund und Projektbeschreibung Unterstützung des Nationalen Blutspendedienstes Malta durch den DRK- Blutspendedienst Baden Württemberg Hessen im Rahmen des Twinningprojekts MT 04/IB/OT/04-TL.Upgrading the National Blood Transfusion Service to Quality Standards as specified in Directive 2002/98/EC. Arbeitstreffen in der Blutbank in L.Mangia, Malta. Oberes Bild (mitte): Prof. Dr. med. C. Seidl und Dr. Alex Aquilina sowie Mitarbeiter der Blutbank Unteres Bild (von links nach rechts): Dr. Alex Aquilina, Prof. Dr. med. Erhard Seifried, Peter Heimer, MUDr. Walid Sireis, PD Dr. med. Reinhard Henschler. 53

55 Qualitätssicherung in der Blutversorgung Besichtigung der Blutspendeeinrichtung auf Coso und Diskussion der Verbesserungsvorschläge. (von links nach rechts) Dr. Alex Aquilina, Degiorgio Angelo, Prof. Dr. Christian Seidl, Peter Heimer, MUDr. Walid Sireis, Prof. Dr. Erhard Seifried. Summary The overall objective is to ensure the provision of a safer supply of blood products for Malta, thereby assisting Malta to comply with EU requirements in this area. This project will support the Department of Institutional Health in guaranteeing a safer, more efficient national blood transfusion service, in compliance to Quality standards as specified in EU Directive 2002/98/EC on Setting Standards of Quality and Safety for the collection, testing, processing, storage and distribution of human blood and blood components. The National Blood Transfusion Service (NBTS) is aiming at the following results: An organisational set up and staff well acquainted with quality standards and implementation NBTS staff trained in maintaining the required standards. A Blood Processing Facility that is compliant with accepted standards required for Quality Systems implementation. Standort Frankfurt Arbeitsgruppe Medizinische Geschäftsführung und Qualitätsmanagementbereich Projektleiter Prof. Dr. med. Erhard Seifried Mitarbeiter MUDr. Walid Sireis, Prof. Dr. med. Christian Seidl, PD Dr. med. Reinhard Henschler Kooperationen Generalsekretariat des Deutschen Roten Kreuzes (Leiter, Herr Peter Heimer) Deutsche Gesellschaft für technische Zusammenarbeit (GTZ) Centru Nazzjonali ta't-trafuzjoni tad-demm (National Blood Transfusion Service) (Direktor Dr. Alex Aquilina) Gesundheitsministerium (Ministry of Health), Malta Förderung Twinningprojekts MT 04/IB/OT/04-TL: Deutsche Gesellschaft für technische Zusammenarbeit (GTZ) durch Mittel aus der Europäische Kommission und durch das Bundesministerium für Gesundheit Laufzeit des Projektes

56 Qualtiätssicherung in der Blutversorgung Europäisches Projekt EU-Q-Blood-SOP: Entwicklung von Standards zur Etablierung von Qualitätsmanagementsystemen in der Transfusionsmedizin Hintergrund und Projektbeschreibung The overall objective of the project is to contribute to good quality management (QM) in blood services, based on the requirements set out in Directive 2002/98/EC and its technical annexes. It will deliver this through the development of a manual that will assist blood services to implement or expand their standard operating procedures (SOPs). European Commission Initiative for Safety of Blood Donor Blood Establishment Product Hospital Monitore Evaluate EUBIS EU-Blood-SOP Project EU-Blood Inspection Project European blood inspection and quality management system EU-Optimal Use Directorate C Public Health and Risk Assessment - Call 2004/2005/2006 Area Safety of blood, tissues and cells, organs European Blood Legislation Directive 2002/98/EC and its technical annexes. Directive 2004/33/EC Blood and blood components Directive 2005/62/EC Quality management Directive 2005/61/EC Hemovigilance Wichtigste Ergebnisse The Projekt-manual will address the responsibilities of blood establishments, including those that carry out routine activities and those that are highly specialised, as well as hospital blood banks. Specifically the project will (1) assess the existence of SOP manuals and guidelines currently used in the 16 blood services involved in the project in order to identify (A) international and national SOP manuals already in place and (B) the current inspection practice; (2) develop a manual to assist blood establishments to develop and implement their own SOPs. (3) test this new SOP methodology among the partner institutions. (4) produce this manual in 5 languages and distribute it to the participating blood establishments. The project will support the public health programme on quality and safety of blood in delivering a practical SOP-based tool that will contribute to the understanding and management of quality processes in blood services. The EU-SOP tool will assist blood establishments in preparing for the inspection of their services related to the implementation of quality relevant elements required by the EU directive 2002/98/EC. 55

57 Qualitätssicherung in der Blutversorgung Standort Arbeitsgruppe Projektleiter Mitarbeiter Kooperationen Frankfurt Medizinische Geschäftsführung Prof. Dr. med. Erhard Seifried (Projekt Leader), Prof. Dr. med. Christian Seidl (Project Coordinator) MUDr. Walid Sireis (Project Manager), Saman Hosseini, MD (Project Trainee), Dr. Esther Schellenberg (Project Manager), PD Dr. med. Reinhard Henschler (Project Manager), Ulrike Ebling (Secretary) Blutspendeeinrichtungen aus 16 Europäischen Mitgliedsländern oder EFTA Ländern Project Participants and Centers ( Eduardo Fernandez-Zincke, Tapani Piha and Caroline Trouet (EC, European Commission, Directorate C, Bruessels, Belgium) Inge Buyse and Philippe Vandekerckhove, HBRK (Belgium) Svetla Bakalova and Andrey Andreev, NBT (Bulgaria), Zoe Sideras MOH (Cyprus); Petr Turek, GTH (Czech Republic); Tatjana Plahhova and Riima Niidas, EBS (Estonia); Leslie Sobaga, Alain Beauplet and Claudine Hossenlopp EFS (France); Martin Gorham and Alan Slopecki NBS (UK), Klára Barótine-Tóth and Eszter Miskovits, HNBT (Hungary); Sveinn Gudmundsson BTS (Iceland); Marie O Connell and William Murphy, IBTS (Ireland); Hamisa Jane Hassan ISS (Italy), Frances M. Delaney (Luxemburg), Alex Aquilina IBT (Malta); Magdalene Letowska and Elzbieta Lachert, IHBT (Poland); Carmen Tatu, FMP (Romania); Brian McClelland, Anne Forrest and Ian Franklin, SNBTS (Scotland), Angus McMillan Douglas, AMD (Scotland). Förderung durch Mittel aus der Europäische Kommission: Directorate C, Public health program on quality and safety of blood, Project Grant Agreement n Laufzeit des Projektes Weitere Informationen Eu-q-blood-sop.de 56

58 Qualtiätssicherung in der Blutversorgung Europäisches Projekt EU-Blood-Inspection (EUBIS): Entwicklung von Standards und Kriterien entsprechend Direktive 2002/98/EC und 2005/62/EC für die Inspektion von Blutspendeeinrichtungen Summary The EU-Q-Blood-Inspection Project has been design to continue the work on safety of blood that has been started through the EU-Q-Blood-SOP project in The project comprises blood establishments and inspection agencies in order to address the scope defined in Area of the work plan 2006 ensuring equivalent recognition of inspections of blood establishments among all Member States through the development and implementation of commonly accepted criteria and standards leading to comparable quality systems and inspection procedures. It will deliver this through the development of: 1. an inspection manual for blood establishments, 2. an inspector training programme, which will assist the inspection of blood establishments and will develop common inspection criteria that are accepted among the Member States. This inspection manual will address the responsibilities of blood establishments, including those that carry out routine activities and those that are highly specialised. It will give European guidelines for national institutions or authorities performing inspections based on minimum requirement for good practice, based on the requirements set out in Directive 2002/98/EC and its technical annexes. The strategic objectives are to: 1. enable that blood components are collected and prepared to a consistently high standard of safety across Europe. 2. define requirements for the quality management system for blood establishments based on the Directive 2005/62/EC in order to prepare blood establishments for inspections. 3. develop pan European standards and criteria for the inspection of blood establishments based on GMP guidelines to assist national inspections in implementing the Directive 2002/98/EC and its technical annexes. 4. establish a common benchmark system for deviations and improvements to allow for comparative analysis of inspections between Member States or European regions. This benchmark system should develop practical assistance and advice to optimise processes based on good practice among blood establishments. 5. develop a training programme for inspectors to implement common interpretations of inspection standards across Europe. This training programme also intends to strengthen the exchange of information and knowledge on blood establishment quality system GMP standards between the national institutions and authorities performing inspections. The overall objective of the project is to contribute to good quality management (QM) in blood services, based on the requirements set out in Directive 2002/98/EC and its technical annexes. It will deliver this through the development of a manual that will assist blood services to implement or expand their standard operating procedures (SOPs). 57

59 Qualitätssicherung in der Blutversorgung EUBIS European blood inspection and quality management system 18 Participants from EU member states: BE, CZ, DE, EE, FR, IE, IT, CY, HU, MT, NL, PL, UK (acceding) new member states: BG, RO EFTA states: IS EUBIS (European blood inspection and quality management system) participants from 16 European member and EFTA states. Standort Frankfurt Arbeitsgruppe Medizinische Geschäftsführung Projektleiter Prof. Dr. med. Erhard Seifried (Projekt Leader), Prof. Dr. med. Christian Seidl (Project Coordinator and Manager) Mitarbeiter MUDr. Walid Sireis (Project Manager) Dr. Veronika Brixner (Assistant Project Manager) Dr. Thea Müller-Kuller (Assistant Project Manager) Ulrike Ebling (Secretary). Kooperationen European Commission Directorate C (Public Health and Risk Assessment) (Brüssel) Public health Executive Agency (PHEA) (Luxemburg) National Blood Service (England and North Wales) Scottish National Blood Transfusion Service (Schottland ) Sanquin (Netherlands), Establissement Francais du Sang (EFS) (Frankreich) Het Belgische Rode Krius (Belgien) Irish Blood Transfusion Service Board (Irland) Istituto Superiore di Santa (Italien) National Center of Haematology and Transfusiology (Bulgarien) Ustav hematologie a krevni transfuze (Tschechien) Orszagos Verellato Szolgalat (OVSZ) (Ungarn) Institute of Hematology and Blood transfusion (Polen) Blood Transfusion Service (Rumänien) North-Estonina Blood Centre (Estland) FNSP Faculty Hospital (Slovakei) Ministry of Health (Zypern) Icelandic University Hospital (Island) National Blood Transfusion Service (Malta) Irish Medicinal Board (Ireland) Regierungspräsidium Darmstadt (Deutschland) Förderung durch Mittel aus der Europäische Kommission, Grant Agreement Project A80053, Directorate C. Public Health and Risk Assessment Laufzeit des Projektes

60 Qualtiätssicherung in der Blutversorgung EUBIS Project working and decision making structure including the linking activities to external consortiums as described in Annex I of the Grant Agreement. Weitere Informationen Eu-q-blood-sop.de 59

61 Qualitätssicherung in der Blutversorgung Entwicklung neuer Filter für die Leukozytendepletion bei Blutprodukten Hintergrund und Projektbeschreibung Die Größe des LCR5 Filters der Firma MacoPharma führt zu einem erheblichen Hb Verlust und damit zu einem geringeren Hb Gehalt von Erythrozytenkonzentraten im Vergleich zu Beutelsystemen anderer Hersteller. MacoPharma modifizierte den Filter mit einem kleineren Gehäuse und weiteren Filterlagen. Das Ziel der Arbeit war die Effizienz von 3 neuen Designs zu prüfen. Dafür wurden 10 Pools à 4 Vollbluten hergestellt und wieder in 4 Vollblute aufgeteilt. Jede Einheit wurde mit dem Standard top & bottom Procedere weiterverarbeitet. Die Filtration wurde mit den 3 neuen Filtern A, B und C durchgeführt. Als Kontrolle wurde mit dem bisherigen LCR5 filtriert. Zusätzlich wurden 34 Einzelpräparate hergestellt und unter Standardbedingungen mit dem Filter A Leukozyten depletiert. Volumen, Anzahl Leukozyten, Hb-Gehalt und Recovery, Hämatokrit und Hämolyse Parameter wurden vor und nach Lagerung von 35 und 42 Tagen bestimmt. Proben wurden vor und nach Filtration gezogen. Weitere Tests zur Prüfung von Filterentwicklungen im Auftrag für die Fa. ASAHI A 52 Hb content B 80 Hb recovery g % % Filter A LCR5 66 different Filter Filter A Filter B Filter C LCR5 Abbildung A: Gegenüberstellung Hb Gehalt des neuen Filters A mit modifizierter Filterform und Filterlagen mit dem LCR5 Abbildung B: Gegenüberstellung der Hb recovery der 3 neuen Filter mit dem bisherigen LCR5 Wichtigste Ergebnisse Filter A zeigte die besten Resultate bezüglich der Leukozytendepletion. Volumen und Hb-Gehalt waren bei allen 3 Filtern ähnlich mit 273 ml für Filter A, 274 ml für B und 272 ml für C vs. 262 ml für LCR5. Erythrozytenkonzentrate, die mit den neuen Filtern hergestellt wurden, hatten durchschnittlich einen Hb- Gehalt von 52 g/einheit verglichen mit 50 g/einheit mit dem LCR5 und eine Recovery von 75% für A and C, und von 76% für B. Mit LCR5 gefilterte Einheiten hatten eine Recovery von 70%. Auf Grund der Testergebnisse wurde Filter A für die weiteren Teste mit den Einzelpräparaten ausgewählt. Diese Untersuchungen bestätigten die Ergebnisse. Der durchschnittliche Hb-Gehalt betrug 59 g/einheit, der Leukozytengehalt lag unter 0.06x10 6. Nach der Lagerung war die Hämolyse Rate bei 0.31%. Summary The test results were within the specification of European Guidelines. Regarding hemoglobin content and recovery the new filters had similar results. Compared with LCR5 the new filters showed a higher volume of approximately 10 ml, and a higher hemoglobin content and recovery. Filter A with the new pouch and 2 additional filter layers performed best regarding leukocyte reduction. With filter A an improvement for RBC's could be achieved. Filter A can be recommended for routine procedure. Standort Baden-Baden Arbeitsgruppe Dr. E. Richter Projektleiter Dr. A. Agildere Mitarbeiter Frau G. Haungs; Herr Blizil Kooperationen MacoPharma; ASAHI-KASEI medical Förderung MacoPharma; ASAHI Laufzeit des Projektes MacoPharma: Juli bis Dezember 2006 ASAHI: September 2006 Weitere Informationen poster presentation ISBT Madrid

62 Stammzellen und Zelltherapie 61

63 Stammzellen und Zelltherapie 2 Stammzellllen und Zelllltherapiie HS LV MV GMV EV N Intracoronary infusion E Adhesion Migration Mobilisation VEGF SDF-1 G-CSF GM-CSF EPO Statins Exercise PPAR Homing Invasion 62

64 Stammzellen und Zelltherapie Markierung von Stammzellen für die Detektion von Migration und Homing Interaktion von Nanopartikeln mit Stammzellpopulationen Hintergrund und Projektbeschreibung Eine wesentliche Voraussetzung, um die Wirkung neuer Zelltherapeutika zu verbessern, ist das Verständnis des Verbleibs der applizierten Zellen. In diesem Projekt werden zur Markierung von mesenchymalem Stammzellen und anderen Zellpopulationen Nanopartikel verwendet. Hierdurch können Homing und Migration dieser Zellen mittels FACS und Laser Scanning Mikroskopie (LSM) untersucht werden. Es werden sowohl klinisch zugelassene als auch in Zusammenarbeit mit der Institut für Organische Chemie III speziell hergestellte Partikel verwendet und Interaktionen dieser neuartigen Materialien mit Zellen nachgewiesen. Zur Optimierung der zellulären Aufnahme wurde die Oberflächenladung der Partikel verändert (anionisch, kationisch) und in einem weiten Bereich variiert. Ziel ist die Aufnahme von Nanopartikeln in Zellen zu erhöhen und eine bessere Detektion der Zellen mittels MRT zu erreichen. In Zusammenarbeit mit der Klinik für Innere Medizin II (Kardiologie) und der Klinik für Diagnostische und Interventionelle Radiologie des Universitätsklinikums Ulm sind weitere Untersuchungen am MRT geplant. Mesenchymale Stammzellen markiert mit Resovist. Eisennachweis mittels Berliner-Blau-Reakion. Wichtigste Ergebnisse Durch gezielte Veränderung der Oberflächeneigenschaften von superparamagnetischen Nanopartikeln konnten die wesentlichen Faktoren für eine Aufnahme dieser Kontrastmittel in Zellen bestimmt werden. Diese präklinischen Versuche mit adäquaten Markierungen der Zellen stellen die Basis für klinische Zellmarkierungsstudien dar. FACS Messungen lieferten ein quantitatives Maß für die Aufnahme und Untersuchungen am LSM und am Transmissionselektronenmikroskop zeigten die subzelluläre Verteilung. Somit können die Prozesse der Interaktion von Nanopartikeln und Zellen besser verstanden werden. Summary Superparamagnetic nanoparticles can be loaded into different clinically interesting cell types and can be detected in-vitro and in animal models enabling studies on migration and homing of e.g. mesenchymal stem cells. This should enhance the assessment of cell therapeutics and should booster the development of better cell populations with a higher therapeutical impact. 63

65 Stammzellen und Zelltherapie Standort Ulm Arbeitsgruppe Zelluläre Immuntherapie und Stammzelltransplantation Projektleiter Dr. med. Volker Mailänder Mitarbeiter Myriam Lorenz (Biologie Doktorandin), Karin Fuchs (MTA) Kooperationen Institut für Organische Chemie III, Universität Ulm Klinik für Innere Medizin II, Klinik für Diagnostische und Interventionelle Radiologie, Universitätsklinikum Ulm Förderung DFG Schwerpunktprogramm (SPP1104, MA 3271/1) Bausteinprojekt der Medizinischen Fakultät Universität Ulm (P.871) Laufzeit des Projektes DFG Schwerpunktprogramm: bis Bausteinprojekt: bis Weitere Informationen Lorenz, M. R., V. Holzapfel, A. Musyanovych, K. Nothelfer, P. Walther, H. Frank, K. Landfester, H. Schrezenmeier and V. Mailander (2006). Uptake of functionalized, fluorescent-labeled polymeric particles in different cell lines and stem cells. Biomaterials 27(14): Epub 2006 Jan 23. Holzapfel, V., M. Lorenz, C. K. Weiss, H. Schrezenmeier, K. Landfester and V. Mailander (2006). Synthesis and biomedical applications of functionalized fluorescent and magnetic dual reporter nanoparticles as obtained in the miniemulsion process. J. Phys.: Condens. Matter 18: S2581 S2594. Mailänder V., Lorenz M., Schmitz B., Musyanovych A., Holzapfel V., Landfester K., Aschoff A., Wiesneth M., Schrezenmeier H.: Methods and tools for labelling cellular therapeutics for MRI detection. 32 nd Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT), Hamburg (2006) Bone Marrow Transplant 37: Suppl. 1, S63 (No. P387) (2006) 64

66 Stammzellen und Zelltherapie Charakterisierung von immunogenen Leukämie-assoziierten Antigenen zur Peptid-Vakzinierung von Patienten mit Leukämie Hintergrund und Projektbeschreibung In Vorversuchen wurden bei Patienten mit Akuter Myeloischer Leukämie (AML) und Chronisch Myeloischer Leukämie (CML) spezifische Leukämie-assoziierte Antigene (LAA) charakterisiert. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass AML-Blasten zur Antigen-Präsentation fähig sind, zu einer Induktion zytotoxischer T-Lymphozyten gegen LAA führen und somit Leukämiezellen lysieren können. Im Rahmen eines Immunmonitorings wurden CD8 + zytotoxische T-Zellen und CD4 + / CD25 + regulatorische T-Zellen bei Patienten mit AML, MDS, MM nach RHAMM-R3- Peptid-Vakzinierung bestimmt. Ziel des Projektes war die klinische Prüfung einer Immuntherapie von Leukämie-Patienten durch Vakzinierung mit Leukämie-assoziierten Antigenen als komplementärer Behandlung. / CML Immunzytochemische Färbung der RHAMM-Expression auf Leukämiezellen (K562/CML), normalen Blutstammzellen (PBSC) und Knochenmarkstammzellen (BMSC) (M. Schmitt et al, Exp Hematol 2006) Spezifische Lyse von RHAMM-R3-Zellen ( ) durch CD8 + zytotoxische T-Zellen eines Patienten mit chronisch myeloischer Leukämie (M. Schmitt, Exp Hematol 2006) Wichtigste Ergebnisse Im Rahmen einer Phase I/II-Pilot-Studie wurden inzwischen 14 Patienten mit malignen hämatologischen Erkrankungen (AML, MDS, MM) mit einer RHAMM-R3-Peptid-Vakzinierung komplementär behandelt. Bei 50 Prozent der protokollgemäß behandelten Patienten fand sich ein immunologisches und hämatologisches Ansprechen mit Rückgang der Blasten bzw. des Paraproteins, so dass das Protokoll zwischenzeitlich auf Patienten mit Chronisch Lymphatischer 65

67 Stammzellen und Zelltherapie Leukämie (CLL) ausgeweitet wurde und eine Folge-Studie mit einer polyvalenten Peptid- Vakzinierung (RHAMM, G250, PRAME) geplant ist. Summary Malignant cells of patients with acute or chronic myeloid leukemia (AML, CML) express specific leukemia-associated antigens (LAA). Furthermore in-vitro assays have shown that these LAA can serve as targets for cytotoxic T lymphocytes. In a phase I/II study 14 patients with AML, MDS and multiple myeloma were vaccinated with a RHAMM-R3 peptide. In 50 percent of the patients an immunological or hematological response was achieved and this therapeutic approach was extended to chronic lymphocytic leukemia patients. Furthermore a consecutive study is planned to combine supplementary epitopes of LAA (RHAMM, G250, PRAME) as polyvalent vaccine produced under GMP-conditions. Standort Ulm Arbeitsgruppe Zelluläre Immuntherapie und Stammzelltransplantation Projektleiter Prof. Dr. med. Michael Schmitt und Dr. med. Markus Wiesneth Mitarbeiter Marlies Götz (MTA), PD Dr. med. Jochen Greiner (Wissenschaftler), Dr. med. Li Li (Wissenschaftlerin), Dr. med. Anita Schmitt (Wissenschaftlerin), Dr. rer. medic. Markus Rojewski (Wissenschaftler) Kooperationen Arbeitsgruppe Tumorimmunologie, Klinik für Innere Medizin III, Universitätsklinikum Ulm Förderung Deutsche José Carreras Leukämie-Stiftung e.v. Laufzeit des Projektes bis Weitere Informationen Schmitt, M., Li, L., Giannopoulos, K., Chen, J., Brunner, C., Barth, T., Schmitt, A., Wiesneth, M., Döhner, K., Döhner, H., Greiner, J.: Chronic myeloid leukemia cells express tumorassociated antigens eliciting specific CD8+ T cell responses and are lacking costimulatory molecules. Experimental Hematology 34: (2006) Greiner, J., Li, L., Ringhoffer, M., Barth, T. F., Giannopoulos, K., Guillaume, P., Ritter, G., Wiesneth, M., Döhner, H., Schmitt, M.: Identification and characterization of epitopes of the receptor for hyaluronic acid-mediated motility (RHAMM/CD168) recognized by CD8+ T cells of HLA-A2-positive patients with acute myeloid leukemia. Blood 106 (3): (2005) Li, L., Reinhardt, P., Schmitt, A., Barth, T.F.E., Greiner, J., Ringhoffer, M., Döhner, H., Wiesneth, M., Schmitt, M.: Dendritic cells generated from acute myeloid leukemia (AML) blasts maintain the expression of immunogenic leukemia associated antigens. Cancer Immunol Immunother 54 (7): (2005) 66

68 Stammzellen und Zelltherapie Genetische Markierung und Modifikation von hämatopoetischen und mesenchymalen Stammzellen zum direkten in vivo-nachweis und Verbesserung des Therapieeffektes Hintergrund und Projektbeschreibung Die mögliche Regeneration ischämisch geschädigten Gewebes, z. B. bei Myokardinfarkt oder cerebralem Insult, durch Applikation autologer hämatopoetischer Stammzellen wird weiterhin kontrovers diskutiert. Um ein "Homing" adulter Stammzellen in vivo direkt nachweisen zu können, wurde eine transiente, genetische Markierung von CD34-positiven Blutstammzellen mit Elektroporation für die klinische Anwendung etabliert. Basierend auf diesen Ergebnissen erfolgt derzeit eine Weiterentwicklung mittels mrna-transfektion zur Modifikation von Stammzelleigenschaften, insbesondere dem "Migrations- und Homing-Verhalten" sowohl hämatopoetischer als auch mesenchymaler Stammzellen. FACS nach 3 h Mock LNGFR 44% % positive cells cells Expressionskinetik LNGFR expression of transfected of transfected CD34- CD34- positive PBSC PBSC h 36 h h 84 h h 120 h h 200 h h time Immunhistochemie Vitalitätskinetik % viable cells Viability of Viability deltalngfr of transfected CD34 CD34 positive positive PBSCs h h 120 h 200 h 4 h 36 h 84 h 120 h 200 h time % viable cells time Mock LNGFR E Expression und Vitalität der CD34+ Zellen nach genetischer Markierung mit LNGFR Wichtigste Ergebnisse Für die genetische Markierung von hämatopoetischen (PBSC) und mesenchymalen Stammzellen (MSC) wurde die Elektroporation mit Plasmid DNA Delta-LNGFR (Low Affinity Nerve Growth Factor Receptor) für den klinischen Einsatz etabliert. Die Transfektionseffizienz betrug bei peripheren Blutstammzellen mit cdna bis zu 45 %. Mit mrna ließ sich die Transfektionseffizienz sowohl bei hämatopoetischen als auch bei mesenchymalen Stammzellen auf 90 % steigern, ohne dass es zu einer Beeinträchtigung der Viabilität und der Proliferations- Fähigkeit der Zellen kam. In vitro assays zeigten eine normale Ausdifferenzierung der transfizierten MSC zu Adipozyten, Chondrozyten und Osteoblasten. Für das Verfahren der mrna Nucleofektion, das zur Modifikation des "Migrations- und Homing-Verhaltens" adulter Progenitorzellen geplant ist, wurde inzwischen vom Deutschen Patent- und Markenamt die Erteilung eines Patentes beschlossen. 67

69 Stammzellen und Zelltherapie Summary There is an ongoing debate about the impact and mechanism of tissue repair by autologous stem cells. Especially questions about homing and integration of hematopoietic stem cells into the damaged tissue are not yet solved in humans. Therefore a transient genetic labelling of CD34 positive peripheral stem cells by electroporation of plasmid DNA Delta-LNGFR (low affinity nerve growth factor receptor) was established. While plasmid DNA showed a transfection efficiency of up to 45 %, mrna transfection was even more effective with about 90 % in hematopoietic as well as in mesenchymal stem cells (MSC) without affecting viability and proliferation of the cells. In vitro assays showed a normal differentiation of transfected MSC into adipocytes, chondrocytes and osteoblasts. In the future genetic modification of stem cells should improve migration and homing for an enhanced therapeutic effect. For the procedure of genetic modification by mrna nucleofection a patent has been granted by the German Patent and Trade Mark Office. Standort Arbeitsgruppe Projektleiter Mitarbeiter Kooperationen Förderung Laufzeit des Projektes Ulm Zelluläre Immuntherapie und Stammzelltransplantation Prof. Dr. med. Jan Torzewski und Dr. med. Markus Wiesneth PD Dr. med. Jochen Greiner, Dr. rer. medic. Markus Rojewski, Dr. med. Klaus Schwarz, Dr. hum. biol. Juliane Wiehe Klinik für Innere Medizin II, Klinik für Innere Medizin III, Universitätsklinikum Ulm DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg Hessen und Universitätsklinikum Ulm Seit 01/2003, andauernd. Weitere Informationen Greiner, J., Wiehe, J., Wiesneth, M., Zwaka, T.P., Prill, T., Schwarz, K., Bienek-Ziolkowski, M., Schmitt, M., Döhner, H., Hombach, V., Torzewski, J.:Transient genetic labeling of human CD34-positive hematopoietic stem cells using nucleofection. Transfus Med Hemother 31: (2004) Wiehe, J.M., Zimmermann, O., Greiner, J., Homann, J.M., Wiesneth, M., Hombach, V., Torzewski, J.: Labeling of adult stem cells for in vivo-application in the human heart. Histol Histopathol. 20 (3): (2005) Greiner, J., Torzewski, J., Ponsaerts, P., Rojewski, M.T., Kronawitter, D., Schrezenmeier, H., Hombach, V., Döhner, H., Schmitt, M., Wiesneth, M., Zimmermann, O., Wiehe, J.M.: Highly efficient mrna- and cdna-based transient gene delivery into human progenitor cells. 48th Annual Meeting - American Society of Hematology (ASH), Orlando, Florida (USA). Blood 108 (No. 11): 464b (No. 5471) (2006) 68

70 Stammzellen und Zelltherapie Erythrozyten aus Stamm- und Vorläuferzellen Hintergrund und Projektbeschreibung Die ex vivo Expansion von Stammzellen zu Erythrozyten bietet die Möglichkeit, möglichst selektiv erythropoetische Zellen in Kultur herzustellen. Solche Zellen könnten angewendet werden (1) bei Patienten mit Unverträglichkeiten gegen praktisch alle zur Verfügung stehenden Erythrozytenkonzentrate aufgrund von irregulären Antikörpern gegen hochfrequente Antigene, oder als (2) möglichst universelle Quelle zum Beispiel für Blutgruppe 0, Rhesus(D) negative Erythrozyten. Stamm- und undifferenzierte Vorläuferzellen werden aus dem Knochenmark oder dem peripheren Blut isoliert und in vitro in Gegenwart hämatopoetischer Wachstumsfaktoren gezielt zur Proliferation und Differenzierung in die rote Blutzellreihe stimuliert (Abb. 1). HS LV MV GMV EV N Abb. 1: Schema der Differenzierung erythrozytärer Zellen aus hämatopoetischen Stammzellen. Die Reifung von hämatopoetischen Stammzellen zu Erythrozyten erfolgt über verschiedene Differenzierungs-Zwischenstufen: HS = pluripotente hämatopoetische Stammzelle; LV = Lymphopoetische Vorläuferzelle; MV = Myelopoetische Vorläuferzelle; GMV = Granulopoetische / Monozytopoetische Vorläuferzelle; EV = Eosinophile Vorläuferzelle; MEV = Megakaryozytäre / Erythroide Vorläuferzelle; N = Normoblast; E = Erythrozyt. E Wichtigste Ergebnisse Menschliche CD34+ Stammzellen wurden in Gegenwart von Erythropoetin und weiterer blutbildender Wachstumsfaktoren (Interleukin-3, Stammzellfaktor, Granulozyten-Makrophagen Kolonie-Stimulierender Faktor (GM-CSF) in Kulturmedium über 19 Tage vermehrt. Wir fanden eine Ausreifung zu ca. 50% erythropoetischen Zellen, die den Reifungsmarker Glycophorin A tragen (Abb. 2). Pro eingesetzte CD34+ Stammzelle konnten hierbei ca. 120 Glycophorin A- positive Zellen generiert werden. Wird ein alternatives Kulturschema mit einer zusätzlichen Zellschicht humaner Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) verwendet, wurde eine weitere Ausreifung beobachtet, teilweise zu kernlosen Zellen (Erythrozyten). Der gesamte Vermehrungsfaktor lag nunmehr bei über fach pro eingesetzte CD34+ Zelle. Summary Ex vivo expansion of stem cells to erythrocytes provides an approach to selectively generate erythropoietic cells in culture. Such cells could be of value (i) for patients with incompatibilities due to the presence of antibodies against high frequency antigens on red cells, or (ii) as a universal source for e.g. Blood Group 0, Rhesus (D) negative red cells. Stem and undifferentiated progenitor cells are isolated from bone marrow or peripheral blood and cultureexpanded into a majority of erythropoietic cells in the presence of a combination of hematopoietic growth factors including Erythropoietin. 69

71 Stammzellen und Zelltherapie Tag 4 Tag 19 CD71 Unreife Vorläuferzelle 75,2% 2,1% CD71 Unreife Vorläuferzelle 42,9% 10,6% 17,1% 5,7% 7,0% 39,6% Glycophorin A erythrozytärer Reifungsmarker Glycophorin A erythrozytärer Reifungsmarker Abb. 2: Durchflusszytometrische Analyse der Induktion des erythrozytären Reifungsmarkers Glycophorin A während der Differenzierung von primitiven hämatopoetischen Vorläuferzellen in Gegenwart Erythropoese stimulierender Wachstumsfaktoren. Für vier Tage vorkultivierte unreife CD34+ Vorläuferzellen aus dem peripheren Blut von G-CSF stimulierten Spendern exprimieren den Transferrin-Rezeptor CD71 hoch, jedoch kaum Glycophorin A. Mit zunehmendem Grad der Differenzierung zu Erythrozyten in Differenzierungsmedium wird Glycophorin A exprimiert, die Oberflächenexpression von CD71 nimmt ab. Standort Frankfurt Arbeitsgruppe Stammzellbiologie Projektleiter PD Dr. med. Reinhard Henschler Mitarbeiter Dipl. Biotechnol. Christine Ströbele, Dr. rer. nat. Brigitte Rüster Kooperationen Prof. Dr. J. Hescheler, Institut für Neurophysiologie, Universität zu Köln Förderung Industriemittel Laufzeit des Projektes

72 Stammzellen und Zelltherapie Stammzellen der Leukämie Hintergrund und Projektbeschreibung Neue Erkenntnisse weisen auf eine hierarchische Ordnung von verschiedenen undifferenzierten Zellpopulationen in Leukämien, möglicherweise auch generell in Tumoren, hin. Da für die Heilung von Leukämien eine dauerhafte Eliminierung der leukämischen Stammzellen - als Subpopulation der Gesamtheit der leukämischen Zellen eines Organismus - von grundlegender Bedeutung sein dürfte, sollen hier die sogenannten Leukämie-initiierende Zellen (L-IC) näher charakterisiert werden. Es werden neue Erkenntnisse zum Phänotyp von L-IC und der Steuerung ihres Überlebens und malignen Wachstums erwartet. Diese Daten sollen die Voraussetzungen für die Entwicklung von Therapieverfahren zur Bekämpfung von Leukämien in Patienten verbessern, indem sie die Entwicklung von präferentiell auf die Bekämpfung von Leukämie-Stammzellen ausgerichteten Therapien ermöglichen. Lin - Sca1 + c-kit + flk2 - Lin - Sca1 + c-kit + flk2 + dendritische Zellen Erythrozyten Thrombozyten Granulozyten Makrophagen T-Lymphozyten NK- B-Lympho- Zellen zyten Kandidaten-Zellpopulationen für leukämische Stammzellen in dieser Studie: LT-HSC (Langzeit-aktive Hämatopoetische Stammzellen) und ST-HSC (Kurzzeit-aktive Hämatopoetische Stammzellen) mit den Phänotypen Linienmarker (Lin) - Sca1 + c-kit + flk2 - bzw. Lin - Sca1 + c-kit + flk2 -. Weiterhin werden Multipotente Progenitorzellen (MPP), Common Myeloid Progenitors (CMP) und Granuloyzten-Makrophagen-Progenitorzellen (GMP) als mögliche Ursprungszellen induzierter Leukämien untersucht. Weitere Abkürzungen: MEP, Myeloerythrozytäre Progenitorzellen, CLP, Common Lymphoid Progenitor, Pro-DC/-T/-B/-NK Pro-dendritische/-T/-B/-NK Zellen. Nach Passegue et al Wichtigste Ergebnisse Durch Zellsortierungs- und Transplantationsexperimente in Mäusen wurden für die Leukämogenese verantwortliche Stamm- und Vorläuferzellpopulationen phänotypisch definiert. Die Ergebnisse zeigen, dass je nach eingesetztem leukämogenem Onkogen die leukämogene Transformation auf verschiedenen Differenzierungsstufen erfolgen kann. Genexpressionsanalysen solcher Subpopulationen legen ausserdem nahe, dass die untersuchten leukämogenen Onkogene unterschiedliche Wachstumsstimuli für ihr Überlegen und ihre weitere Entwicklung nutzen. 71

73 Stammzellen und Zelltherapie Summary Recent data in the literature point to a hierarchical order of various cell surface-marker defined undifferentiated cell populations not only in normal healthy stem and progenitor cells, but also in leukemia. Since for the therapeutic elimination of leukemias the eradication of leukaemiainitianting stem cells (L-IC) is thus of utmost importance, we wish to characterize L-IC in more detail in this project. We expect new insights into the phenotype and the signals which determine survival and growth of L-IC. These data shall contribute to substantiate the basis for more efficient anti-leukemic treatment regimens. Standort Frankfurt Arbeitsgruppe Stammzellbiologie Projektleiter PD Dr. med. Reinhard Henschler, gemeinsam mit PD Dr. M. Ruthardt, Zentrum der Inneren Medizin, Medizinische Klinik II (Hämatologie, Onkologie, Rheumatologie) Mitarbeiter Dr. phil. nat. Brigitte Rüster (wissenschaftliche Mitarbeiterin) Sabrina Boehme (MTA) Kooperationen PD Dr. M. Ruthardt, Medizinische Klinik II Hämatologie, Onkologie, Rheumatologie, Zentrum der Inneren Medizin, Klinikum der J. W. Goethe-Universität Frankfurt (gemeinsame Projektleitung). Dr. Markus Rojewski, Institut für Klinische Transfusionsmedizin, DRK-Blutspendedienst, Ulm Förderung Deutsche José Carreras Leukämie-Stiftung e.v. Laufzeit des Projektes Weitere Informationen Zheng X, Seshire A, Ruster B, Bug G, Beissert T, Puccetti E, Hoelzer D, Henschler R, Ruthardt M. Arsenic but not all-trans retinoic acid overcomes the aberrant stem cell capacity of PML/RARalpha-positive leukemic stem cells. Haematologica. 92: (2007) 72

74 Stammzellen und Zelltherapie Charakterisierung und Optimierung der Migration Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) als kritischer Schritt in der Toleranzinduktion gegenüber Allotransplantaten Hintergrund und Projektbeschreibung Die Induktion einer Toleranz gegen Allotransplantate stellt eine der wesentlichen ungeklärten Fragen im Bereich des Tissue-Engineerings dar. Innerhalb eines Verbundprojektes gemeinsam mit Arbeitsgruppen an den Universitäten München und Düsseldorf - soll eine effektive Strategie zur Verhinderung der Transplantatabstoßung mit Hilfe mesenchymaler Stammzellen (MSCs) erarbeitet werden. Im Teilprojekt in Frankfurt werden die Rolle der Migration von MSCs und ihre Interaktion mit Effektorzellen des Immunsystems für die Toleranzinduktion näher charakterisiert. Im Mittelpunkt steht das Homing transplantierter MSCs in lymphatische Organe, ihre Interaktion mit Immuneffektorzellen wie z.b. Antigenpräsentierenden Zellen, sowie die Ausnutzung der Manipulation von Rho- und Rac-GTPasen zur Verbesserung des Migrationsverhaltens transplantierter MSCs. Leber Blutgefäß Homing (= Austreten aus dem Blutstrom) von in Kultur expandierten humanen Mesenchymalen Stammzellen (MSCs, markiert durch Pfeile), die vor Infusion mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff markiert wurden, in die Leber im Tiermodell 24 Stunden nach Transplantation. Blau markiert sind Zellkerne, grün Endothelzellen (= Auskleidung der Blutgefäße). Fluoreszenz-mikroskopische Aufnahme, Vergrößerung 400 fach. Wichtigste Ergebnisse Unsere Untersuchungen zeigten, dass MSCs sich im Blutstrom überraschend gut bewegen können und ein gewebespezifisches Homing -Verhalten aufweisen. Dies macht sie für zelltherapeutische Anwendungen im Sinne der Beeinflussung zellvermittelter körpereigener Reaktionen, etwa innerhalb des Immunsystems oder der Geweberegeneration, überaus interessant. Unsere MSCs zeigen in vitro im Flusskammermodell koordiniertes Rolling verhalten mit der millisekundenschnellen Ausbildung und Retraktion von Podien. Nach Transplantation in immundefekte Mäuse unterliegen sie einer geordneten Interaktion mit dem Endothel und rollen in Abhängigkeit des Rollingfaktors P-Selektin auf der Oberfläche von Endothelzellen. Mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte transplantierte MSCs verlassen die Blutbahn durch Endothelzellen und gelangen in den interstitiellen Raum der Leber und der Milz. Die Inaktivierung des kleinen GTPase-Signalmoleküls Rho bewirkt eine Verstärkung dieser Bindungen in den bisher durchgeführten in vitro-analysen. 73

75 Stammzellen und Zelltherapie Summary The induction of tolerance against allotransplants is one of the main questions in the area of tissue engineering. Within the collaborative research group between the Universities of Düsseldorf, Frankfurt and Munich, an effective strategy shall be created to suppress transplant rejection using Mesenchymal Stem Cells (MSCs). In the project located in Frankfurt, the role of the migration of MSCs and their interaction with effector cells of the immune system to induce tolerance induction will be more closely characterized. The focus will be on the homing of transplanted MSCs into lymphatic organs, their interaction with immune effector cells e.g. antigen-presenting cells, as well as the manipulation of signalling through Rho family small GTPases to improve the migration function of MSCs. Standort Frankfurt Arbeitsgruppe Stammzellbiologie Projektleiter PD Dr. med. Reinhard Henschler, Dr. med. Rudolf Richter Mitarbeiter Dr. Erika Deak, Dr. phil. nat. Brigitte Rüster Kooperationen PD Dr. D. Dilloo, Universität Düsseldorf, Prof. Dr. J. Seißler, Ludwig-Maximilians-Universität, München, Prof. Dr. J. Priller, Universitätsklinikum Charité Berlin. Förderung Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), Förderschwerpunkt Zellbasierte Regenerative Medizin (01GN0525) Laufzeit des Projektes Weitere Informationen Ruster, B., Gottig, S., Ludwig, R.J., Bistrian, R., Muller, S., Seifried, E., Gille, J., Henschler, R. (2006) Mesenchymal stem cells (MSCs) display coordinated rolling and adhesion behavior on endothelial cells. Blood 108: Rüster B, Grace B, Seitz O, Seifried E, Henschler R. (2005) Induction and Detection of Human Mesenchymal Stem Cell Migration in the 48 well Re-usable Transwell Assay. Stem Cells and Development 14:

76 Stammzellen und Zelltherapie Rolle von Rho-GTPasen in der Tumorangiogenese Hintergrund und Projektbeschreibung Vorläuferzellen aus dem Knochenmark leisten einen wesentlichen Beitrag zur Entstehung von Gefäßen während der Tumorbildung. Kürzlich wurde gezeigt, dass durch Transplantation von mit einem Suicide (=Selbstmord)-Gen ausgerüsteten, aus dem Knochenmark abgeleiteten blutbildenden Vorläuferzellen das Tumorwachstum im Tiermodell stark gebremst werden kann, bis hin zum Verschwinden der Tumoren. Rho-GTPasen sind als intrazelluläre Signalmoleküle insbesondere an der Aktivierung der Zelladhäsion und Migration beteiligt. In dem vorliegenden Projekt soll die Rolle von sog. Rho- GTPasen in blutbildenden Vorläuferzellen und Endothelzellen für die Tumorangiogenese aufgeklärt werden. Für die Untersuchungen werden Mausstämme verwendet, denen entweder beide Allele des Rac1-Gens, beide Allele des Rac2-Gens, oder sowohl das Rac1 und das Rac2-Gen in hämatopoetischen und/oder in Endothelzellen fehlen. In vitro-untersuchungen mit solchermassen genetisch veränderten Vorläufer- und Endothelzellen dienen zur Klärung verantwortlicher Adhäsionsmoleküle und zur Identifizierung von Steuerungsmechanismen für eine verbessertes Tumor-Homing. Darüber hinaus werden in diesem präklinischen Modell in Kultur expandierte hämatopoetische Vorläuferzellen für eine Tumor-suppressive Therapie eingesetzt. Einbau von aus dem Knochenmark stammenden blutbildenden Zellen in einen subkutanen Tumor, dargestellt durch Anfärbung aus dem Knochenmark stammender Zellen mittels des Transgens Grün Fluoreszierendes Protein (GFP) in grün. Blutgefäße sind durch Anfärung des CD31 Proteins in rot sichtbar gemacht. Vergrößerung 400fach. Wichtigste Ergebnisse In den bisher durchgeführten Experimenten zeigte sich, dass das Wachstum subkutan applizierter epithelialer Tumorzellen sowie von Lungenmetastasen eines malignen Melanoms in Abwesenheit des Rac2-Gens überraschenderweise verstärkt erfolgt. Parallel hierzu zeigten Rac2-defiziente Mäuse eine konstitutive Mobilisierung hämatopoetischer Progenitorzellen in die Blutbahn. Unabhängig von der Anwesenheit des Rac2-Gens lokalisierten ins Blut injizierte Vorläuferzellen nach i.v. Injektion bereits innerhalb von 24 Stunden in Tumore. Wir haben Hinweise, dass aus den Vorläuferzellen oro-angiogene sog. endotheliale Progenitorzellen (EPCs) und Tumor-infiltrierende Monozyten (TEMs) differenzieren. Gegenwärtig werden die in den Tumoren detektierten EPCs und TEMs qualitativ und quantitativ näher charakterisiert. Summary The contribution of bone marrow-derived progenitor cells (BM-PCs) to vessel growth in malignant and ischemic tissues is increasingly being recognized. Consolidating evidence suggests that BM-PCs complement neovascularization by in situ-differentiation into endothelial cells of newly shaped vessels and/or by releasing angiogenic growth factors at tumour sites. Pertinent to these data, we have recently observed that BM-PCs also localize to metastatic sites of cancer. As BM-PCs preferentially home to tumour sites in different experimental tumour models, they may constitute suitable cellular carriers for gene therapy to target tumour growth. 75

77 Stammzellen und Zelltherapie As important molecular switches of a wide range of signal transduction pathways, Rho GTPases (with particular importance of Rac1 and Rac2) have been demonstrated to regulate the homing efficiency of hematopoietic stem/progenitor cells (HPCs). At the same time, Rho GTPase engagement in both endothelial cells (ECs) and in circulating populations coordinates adhesion and transendothelial migration. Hence, manipulation of Rho GTPase activities in BM-PCs and host ECs is likely to affect the ability of BM-PCs to home to angiogenic sites and to modulate neovascularization. We therefore hypothesize that the activity of distinct Rho GTPases in BM- PCs and host ECs will decisively control the recruitment efficiency of BM-PCs to local tumour and metastatic sites. Standort Frankfurt Arbeitsgruppe Stammzellbiologie Projektleiter PD Dr. med. Reinhard Henschler, gemeinsam mit Prof. Dr. J. Gille, Zentrum der Dermatologie und Venerologie Mitarbeiter Dipl. Biol. Stephan Göttig Dr. rer. nat. A. Jochheim-Richter Dipl. Ing. Christine Ströbele Kooperationen Prof. Dr. Jens Gille, Zentrum der Dermatologie und Venerologie, Klinikum der J. W. Goethe Universität Frankfurt (gemeinsame Projektleitung) Prof. Dr. Stefanie Dimmeler, Dr. E. Chavakis, Medizinische Klinik III, Zentrum der Inneren Medizin, Klinikum der J. W. Goethe Universität Frankfurt Prof. Dr. Thomas Wieland, Institut für Pharmakologie, Universität Mannheim. Förderung Deutsche Forschungsgemeinschaft Laufzeit des Projektes Weitere Informationen Gottig S, Mobest D, Ruster B, Grace B, Winter S, Seifried E, Gille J, Wieland T, Henschler R. Role of the monomeric GTPase Rho in hematopoietic progenitor cell migration and transplantation. Eur J Immunol. 36: (2006). Gille J, Heidenreich R, Pinter A, Schmitz J, Boehme B, Hicklin DJ, Henschler R, Breier G. Simultaneous blockade of VEGFR-1 and VEGFR-2 activation is necessary to efficiently inhibit experimental melanoma growth and metastasis formation. Int J Cancer 120: (2007). 76

78 Stammzellen und Zelltherapie Zentralprojekt: Mausmodelle der Leukämie (Teil der Forschergruppe: Pathologische Genprodukte und ihre Wirkungsmechanismen ) Hintergrund und Projektbeschreibung Innerhalb der 2005 neu gegründeten Forschergruppe Pathologische Genprodukte und ihre Wirkmechanismen bearbeitet das Projekt zentral sämtliche Tiermodelle zur Induktion von Leukämien. Ziel ist dabei, hinsichtlich der in vivo Endpunkte ein Höchstmaß an Vergleichbarkeit des Projektverbundes sicherzustellen. Darüber hinaus stellt das Projekt durch die hier etablierte Leukämie-Zellbank einheitlich charakterisierte Proben weltweit zur Verfügung. Zur Induktion der murinen Leukämien wird das so genannte Transduktions- Transplantationsmodell verwendet. Nach retroviraler Transduktion aufgereinigter Knochenmarkzellpopukationen und Transplantation in vorbestrahlte Mäuse wird das leukämogene Potential der untersuchten Onkogene zusätzlich zu den international etablierten Leukämie - Diagnosekriterien (entsprechend der Bethesda-Klassifikation, Blood 100:280, 2002) auch im sogenannten Milz-Koloniebildungsassay (CFU-S) sowie in der kompetitiven Stammzell- Repopulation untersucht und dargestellt. Das Projekt möchte einen zentralen Beitrag zur Etablierung geeigneter präklinischer Modelle der am Standort Frankfurt untersuchten und therapierten Leukämiezelltypen leisten. Diese dienen in dem Forschungsverbund vor allem der Erarbeitung neuer Therapieansätze multimodaler Natur unter Einbeziehung sogenannter Biologicals. Nachweis leukämischer Zellen im Blut von Mäusen nach Transplantation mit Knochenmarkzellen, die mit einem retroviralen Vektor transduziert wurden der das leukämogene Onkogen PML-RARalpha enthält. Vergrößerung 100fach. Wichtigste Ergebnisse Nach Transduktion mit verschiedenen leukämogenen Onkogenen (Transkripte der Fusionsgene Bcr-Abl, PML-RARalpha, AML1-ETO, MLL-AF4) fanden wir Veränderungen im Proliferationsund Differenzierungsverhalten primitiver Knochenmark-Vorläuferzellen sowohl in vitro und im Milzkoloniebildungsassay in vivo. Darüber hinaus wurden nach Transplantation in bestrahlte Empfängermäuse durch die meisten überprüften Onkogenen jeweils typische Leukämien induziert. Es wurde damit begonnen, das somit validierte einheitliche Testmodell für Studien der Kooperation mehrerer verschiedener leukämogener Onkogene einzusetzen. 77

79 Stammzellen und Zelltherapie Summary To date, common standards for the modelling of leukemia in mice have not been set. Rather, individual research groups have generally adapted murine models to their needs. Moreover, both transgenic and transduction-transplantation models have been developed; their results remain difficult to compare. The current project aims at defining standards for reproducible leukemia induction. Standort Frankfurt Arbeitsgruppe Stammzellbiologie Projektleiter PD Dr. med. Reinhard Henschler Mitarbeiter Dr.phil. nat. Brigitte Rüster Dr. rer. nat. A. Jochheim-Richter Sabrina Boehme (MTA) Kooperationen Prof. Dr. Rolf Marschalek, Zentrum der Pharmazie und Biochemie, J. W. Goethe Universität PD Dr. Martin Ruthardt, Medizinische Klinik II (Hämatologie, Onkologie, Rheumatologie), Klinikum der J.W. Goethe-Universität Frankfurt Dr. Elena Puccetti, Medizinische Klinik II (Hämatologie, Onkologie, Rheumatologie), Klinikum der J.W. Goethe-Universität Frankfurt Dr. Manuel Grez, Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg Speyer-Haus Frankfurt Prof. Dr. M.. Hansmann, Institut für Pathologie, Klinikum der J.W.Goethe-Universität Frankfurt Förderung Mildred-Scheel-Stiftung der Deutschen Krebshilfe e.v. Laufzeit des Projektes Weitere Informationen Henschler R, Gottig S, Junghahn I, Bug G, Seifried E, Muller AM, Fichtner I. Transplantation of human acute myeloid leukemia (AML) cells in immunodeficient mice reveals altered cell surface phenotypes and expression of human endothelial markers. Leuk Res. 29: (2005). 78

80 Stammzellen und Zelltherapie Isolation und Charakterisierung endothelialer Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut, Subprojekt des Teilprojektes C3 Analysis of the multistep nature of homing and incorporation of circulating progenitor cells during tumor angiogenesis im Rahmen des TR-SFB 23 Hintergrund und Projektbeschreibung Angiogenese beschreibt den Prozess der postnatalen Blutgefäßneubildung. Dies ist ein notwendiger Prozess bei der Heilung von Wunden, bei der Bildung der Plazenta, beim Menstruationszyklus und bei der Ovulation. Leider spielt Angiogenese auch eine wichtige Rolle bei der Vaskularisation maligner Tumoren und Metastasen. Ein essentieller Schritt während der Angiogenese ist die Rekrutierung endothelialer Zellen an dem Ort der mikrovaskulären Proliferation. Ausgehend aus präexistenten Gefäßen können Endothelzellen migrieren und proliferieren, um neue Gefäße zu formieren. Alternativ können endotheliale Vorläufer- oder Stammzellen aus der Zirkulation rekrutiert werden. Insbesondere in der Therapie pathologischer Angiogenese und Vaskularisierungsstörungen bieten die endothelialen Vorläuferzellen viele Möglichleiten. Daher ist das Ziel des Projektes, zunächst Techniken zur Isolierung endothelialer Vorläuferzellen aus Knochenmark und Nabelschnurblut zu etablieren und das Differenzierungspotential dieser Zellen zunächst in vitro zu analysieren. Im Weiteren soll das Homing und die Integration dieser Zellen, vergleichend zu embryonalen endothelialen Vorläuferzellen, in einem Tumorangiogenese-Modell analysiert werden. Wichtigste Ergebnisse Im Gegensatz zu Knochenmark, scheint Nabelschnurblut Endothelvorläuferzellen zu enthalten, die in Zellkultur zu Endothelzellen ausreifen. Wir nennen diese Zellen Endothelvorläuferabgeleitete Zellen (EPDC). Diese Zellen zeichnen sich durch eine typische endotheliale Morphologie aber auch funktionelle Charakteristika aus. Die proliferative Kapazität dieser Zellen unterscheidet sich von reifen Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVEC). Im Gegensatz zu diesen reifen Zellen zeichnen sich die EPDC nicht nur durch stärke Expansion sondern auch durch eine leicht verstärkte Expression der Stammzellmarker CD34, CD133 und VEGFR-2 aus. Insbesondere weitergehende funktionelle Studien werden weitere Einsichten in die Hierarchie der endothelialen Vorläuferzellen ergeben. In vitro Gefäßbildung (links) und Nachweis der Expression von von-willebrand-faktor (rechts) von EPDC isoliert aus dem humanen Nabelschnurblut. 79

81 Stammzellen und Zelltherapie Summary Mature endothelial cells are terminally differentiated cells with a low proliferation potential. Accumulating data suggest that the peripheral blood contains a unique subtype of circulating, bone marrow derived cells exploiting the capacity of embryonal angioblasts. These cells have the capacity to proliferate and differentiate into mature endothelial cells. According to this potency they were termed endothelial progenitor cells (EPC). After prolonged culture a monolayer with typical endothelial morphology is obtained consisting of cells with a mature endothelial phenotype and function: endothelial progenitor derived cells (EPDC). EPC may contribute to new blood vessel formation and thus promote neovascularistaion during tissue ischemia, vascular trauma or tumour growth. However the molecular and cellular mechanisms underlying EPC recruitment are poorly understood. To analyse the hierarchy of EPC, EPDC and mature endothelial cells in terms of the multistep nature of homing and incorporation into the tumour vasculature, we isolated and characterised EPC and EPDC from umbilical cord blood comparing them with embryonal EPC. Standort Mannheim Arbeitsgruppe Zell- und Immuntherapie Projektleiter PD Dr. P Vajkoczy (Klinik für Neurochirurgie, Universitätsklinikum Mannheim); Prof. Dr. Harald Klüter, Dr. Karen Bieback Mitarbeiter Susanne Elvers-Hornung Kooperationen AG von PD Dr. P. Vajkoczy, insbesondere Mara Vinci Partner des TR-SFB Förderung DFG (Kosten Gesamtprojekt) Laufzeit des Projektes Weitere Informationen Vorträge und Poster standen bisher im Zusammenhang mit TR-SFB internen Veranstaltungen: (Kick-Up Meeting: K. Bieback, Summer-School: M. Vinci, K. Bieback, Statusmeeting: P. Vajkoczy, Subgroupmeeting: M. Vinci, K. Bieback) 80

82 Stammzellen und Zelltherapie Vergleichende Analyse mesenchymaler Stammzellen aus Knochenmark, Nabelschnurblut oder Fettgewebe Hintergrund und Projektbeschreibung Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind adulte Stammzellen und können aus unterschiedlichen Geweben gewonnen werden. Sie sind multipotent, unterstützen die Hämatopoese, sind nicht immunogen und weisen sogar immunsuppressive Aktivitäten auf. Mit diesen Eigenschaften ausgezeichnet stellen sie eine Alternative zu embryonalen Stammzellen dar, um sie beispielsweise für zelltherapeutische Zwecke autolog oder allogen einzusetzen. Die ursprünglichste und am besten charakterisierte Quelle für MSC ist Knochenmark (KM). Neuere und weniger gut charakterisierte alternative Quellen sind z.b. Nabelschnurblut (NSB) und Fettgewebe. Zentrales Thema des Projektes ist die vergleichende Analyse der MSC aus den drei unterschiedlichen Quellen. Hierbei werden zum einen Profile der Gen- und Proteinexpression undifferenzierter MSC erstellt, um idealerweise einen Marker identifizieren zu können, der die prospektive Isolation von MSC erlaubt. Für den klinischen Einsatz ist insbesondere das Differenzierungspotential von MSC von Interesse. Daher überprüfen wir quantitativ und qualitativ die Expression von Differenzierungsmarkern. In einem weiteren Schritten untersuchen wie die Kinetik der Differenzierung, um eine bessere Einsicht in die Kaskaden der Differenzierungsprozesse zu erhalten. Dies bietet die Möglichkeit einer Optimierung im Rahmen des Tissue-Engineerings, z.b. durch Modifikationen der biomimetischen Scaffolds. Die Sicherheit der Therapie mit MSC ist ein weiterer wichtiger Punkt unserer Analysen. Daher wurden in den vergangenen Jahren sensitive Testsysteme entwickelt, um z.b. eine Kontamination mit Mykoplasmen im Verlauf der Expansionskultur zu überprüfen. Darüber hinaus analysieren wir derzeit, ob die Langzeitkultur negative Effekte auf die Qualität der MSC hat. Daher überprüfen wir das Seneszenzverhalten, die Verkürzung der Telomerlängen und die mögliche Expression von Telomerase als Anzeichen einer möglichen Transformation der Zellen in Kultur. Eine Vielzahl von offenen Fragen müssen noch beantwortet werden, bevor sich eine klinische Anwendung mit mesenchymalen Stammzellen etabliert: z.b. : Aus welchen Quellen lassen sich MSC isolieren und unterscheiden sie sich? Welchen Einfluss haben Grunderkrankungen, z.b. Diabetes, auf die MSC-Qualität? Wie lässt sich ein MSC- Produkt standardisiert herstellen und welche Produktspezifikation gilt es zu erreichen? Wie verhalten sich MSC in dreidimensionalen Matrizes, die z.b. für die Rekonstruktion von Knochen vonnöten sind? Wie lässt sich das Anwachsen eines MSC-Präparates nachweisen? Wichtigste Ergebnisse In den vergangenen Jahren konnten wir feststellen, dass sich MSC aus Knochenmark, Fettgewebe und Nabelschnurblut funktionell relativ wenig unterscheiden. Sie zeichnen sich durch starke Expansions- und Differenzierungsfähigkeit aus. Unterschiedlich sind allerdings die Frequenzen der MSC in den einzelnen Quellen. Basierend auf unsren Erfahrungen enthält Lipoaspirat MSC in höchster Zahl, gefolgt von Knochenmark und dann von Nabelschnurblut. Bei der Analyse des Transcriptoms ergaben vorläufige Untersuchungen jedoch frappierende Unterschied in der Genexpression. Ob sich diese auch im Proteom feststellen lassen, werden weiterführende Untersuchen zeigen. Beim Differenzierungspotential fiel lediglich auf, dass unter identischen Kulturbedingen vermehrte MSC aus Nabelschnurblut keine Anzeichen einer adipogenen Differenzierung zeigen. Erste molekulare Analysen deuten daraufhin, dass erst ein später Schritt in der Differenzierungskaskade blockiert scheint. Insbesondere die Arbeiten zur chondrogenen Differenzierung, konnten durch Unterstützung der Kooperationspartner Einblicke in die Regulation der chondrogenen Differenzierungskaskade generieren (Gößler et al. und Prante et al.). In einem weiteren Kooperationsprojekt mit der Augenklinik des Universitätsklinikums Mannheim entwickeln wir Protokolle, die eine gerichtete Differenzierung humaner MSC aus dem Lipoaspirat in retinales 81

83 Stammzellen und Zelltherapie Pigmentepithel erlauben. Diese Zellen sind als Folge der altersbedingten Makuladegeneration nicht mehr funktionsfähig, so dass Patienten unter Erblindung leiden. Einige wenige Publikationen deuten an, dass MSC in Kultur transformieren können. Unsere vorläufigen Ergebnisse implizieren jedoch, dass MSC in Langzeitkultur replikativer Seneszenz unterliegen. Dies wird gestützt durch eine Verkürzung der Telomerlängen als Folge der Kultur und durch das Fehlen der Telomerase-Aktivität. Mesenchymale Stammzellen verfügen über ein weites Differenzierungspotential. Daher sind es attraktive Kandidaten für zell-basierte Ansätze insbesondere des Tissue Engineerings. Summary The main focus of our research activities is dedicated to investigate the origin and biological properties of post-natal mesenchymal stem cells (MSC) that form supportive connective tissues such as fat, bone, and cartilage but also the hematopoiesis-supporting stroma. We have previously identified different MSC populations from a variety of adult tissues including bone marrow, umbilical cord blood, and adipose tissue. These MSC can be expanded in culture as potential therapeutic agents for the repair of either connective tissue defects or as hematopoiesis supportive stroma. In the first instance we were interested in revealing whether MSC derived from different tissue organs exhibit similar MSC characteristics. Gene and protein expression profiles revealed that despite comparable functional characteristics, MSC derived from the three tissues differ strongly. The safety of clinical MSC application is evaluated since a few publications indicated that longterm culture of MSC can pose a risk of transformation. Our own preliminary data however imply, that MSC suffer from replicative senescence, induced by telomere shortening. Standort Mannheim Arbeitsgruppe Zell- und Immuntherapie Projektleiter Dr. Karen Bieback Mitarbeiter Dr. sc. hum. Susanne Kern, Dr. rer. nat. Sandra Kühl, Andrea Hecker, Marianna Karagianni, Kathrin Ferlik, Dirk Hofmeister, Birthe Lauer, Monika Latta Kooperationen Universitäts-HNO-Klinik Mannheim (Dr. U. Gößler) Augenklinik des Univeritätsklinikums Mannheim (Dr. S. Kühl, Dr. U. Vossmerbäumer); Institut fur Laboratoriums und Transfusionsmedizin, Herz und Diabeteszentrum NRW, Universitatsklinik der Ruhr-Universitat Bochum, Bad Oeynhausen (Dr. C. Götting); Neurologische Klinik des Universitätsklinikums Mannheim (Dr. M. Stroick) Förderung Teilprojekte werden anteilig finanziert durch BMBF und EU Laufzeit des Projektes Weitere Informationen Kern S, Eichler H, Stoeve J, Klüter H, Bieback K: Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells 24:S (2006). Prante C, Bieback K, Funke C, Schon S, Kern S, Kuhn J, Gastens M, Kleesiek K, Gotting C: The formation of extracellular matrix during chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells correlates with increased levels of xylosyltransferase I. Stem Cells 24: S (2006) Gössler UR, Bugert P, Bieback K, Sadick H, Baisch A, Hörmann K, Riedel F: In vitro analysis of differential expression of collagens, integrins, and growth factors in cultured human chondrocytes. Otolaryngol Head Neck Surg. 134: (2006). Gössler UR, Bieback K, Bugert P, Heller T, Sadick H, Hörmann K, Riedel F:In vitro analysis of integrin expression during chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells and chondrocytes upon dedifferentiation in cell culture. Int J Mol Med. 17: (2006). Gössler UR, Bugert P, Bieback K, Bag S, Sadick H, Klüter H, Hörmann K, Riedel F: A comparison of the gene expression patterns of human chondrocytes and chondrogen differentiated mesenchymal stem cells for tissue engineering. HNO. 54: (2006). 82

84 Stammzellen und Zelltherapie OsteoCord Bone from Blood: Optimised isolation, characterisation and osteogenic induction of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood Hintergrund und Projektbeschreibung Für die Heilung ausgedehnter Knochendefekte stellt das Tissue Engineering einen erfolgversprechenden Ansatz dar. Die für das Tissue Engineering von Knochen einzusetzenden Zellen sollten neben ihrer Immunkompatibilität einfach und in ausreichenden Mengen isolierbar sowie in der Lage sein, den osteogenen Phänotyp auszubilden. Aufgrund ihres Differenzierungspotenzials sowie der im Gegensatz zu bereits differenzierten Zellen (Osteoblasten) hohen Proliferationskapazität in vitro stellen mesenchymale Stammzellen (MSC) eine viel versprechende Zellpopulation für diesen Ansatz dar. Ziel des von der europäischen Union geförderten Verbundprojektes, ist es mesenchymale Stammzellen (MSC) aus dem humanen Nabelschnurblut zu isolieren, expandieren und insbesondere ihr osteogenes Differenzierungspotential zu optimieren, um ihre Eignung für den therapeutischen Knochenersatz zu optimieren. Durch die Verbundpartner werden genomische, proteomische und Bioimpedanz Profile, vor und nach osteogener Differenzierung erstellt, im Vergleich zu Knochenmark-MSC aber auch embryonalen Stammzellen. Zudem werden Veränderungen des Immunophänotyps aber auch der Alloreaktivität bestimmt. Als Riskoabschätzung erfolgt zudem eine Bestimmung der Telomerlängen und der Telomeraseaktivität. Neuartige Expansionstechniken, sowie biomimetrische Scaffolds werden mit scale-up Prozeduren kombiniert. Wichtigste Ergebnisse Unsere Arbeitsgruppe verfolgt in diesem Konsortium folgende Projekte: 1. Die Etablierung einer Nabelschnurblut-MSC Bank, um Zellen in ausreichender und definierter Qualität und Quantität den Verbundpartner zur Verfügung zu stellen. 2. Mesenchymale Stammzellen werden als hypoimmunogen und immunsuppressiv beschrieben. Dies impliziert, dass MSC möglicherweise ohne Immunsuppression allogen transplantiert werden können. Nabelschnurblut-MSC wurden jedoch noch nie im Vergleich zu Knochenmark-MSC auf ihre immunmodulierenden Eigenschaften untersucht. Notwendige Methoden, um diesen Vergleich zu tätigen, wurden etabliert. 3. Der translationelle Ansatz des Projektes beinhaltet auch scale-up Prozeduren und die Etablierung GMP-konformer Herstellungsprozesse. In einem ersten Schritt wurden SOPs für die Isolation und Expansion von MSC erstellt. In einem zweiten Schritt erfolgt die Evaluierung FCS-freier Expansionsmedien supplementiert durch humane alternative Komponenten (siehe hierzu Projekt START-MSC). Summary There is an urgent clinical requirement for appropriate bone substitutes that are able to replace current autologous and allogeneic grafting procedures for the repair of diseased or damaged skeletal tissues. Mesenchymal stem cells (MSCs), found predominantly in the bone marrow, are able to differentiate into osteogenic, chondrogenic, adipogenic and tenogenic lineages, thus offering considerable therapeutic potential for tissue engineering applications. However, invasive extraction procedures and insufficient viable cell yields have necessitated the identification of alternative tissue sources of MSCs. Growing evidence suggests that umbilical cord blood (UCB) contains a population of rare MSCs that are able to undergo multilineage differentiation. The aim of this proposal is optimise the isolation and expansion of MSCs from human UCB (CB- MSCs). The differentiation capacity of CB-MSCs will be examined, with a specific focus on osteogenesis. The CB-MSCs will be characterised by genomic, proteomic and bioimpedance profiling, pre- and post-osteogenic differentiation, and compared to MSCs isolated from human bone marrow as well as embryonic stem cells. Full bioinformatics integration of datasets will allow us to identify specific and/or novel signalling factors associated with CB-MSCs. The immunophenotype and alloreactivity of CB-MSCs will be determined. Comparative analyses of the population doubling times, telomere length and telomerase activity will identify the lifespan of CB-MSCs in culture. Novel expansion techniques will be combined with scale-up procedures and the generation of CB-MSC lines for banking using optimised cryopreservation protocols. In 83

85 Stammzellen und Zelltherapie vitro and in vivo biocompatibility assays using a range of biomimetic scaffolds will be exploited, complementing in vivo homing and engraftment models. Our integrated approach using existing and complementary expertise will provide a timely and thorough evaluation of CB-MSCs and define appropriate routes for their therapeutic implementation. Standort Mannheim Arbeitsgruppe Zell- und Immuntherapie Projektleiter Dr. Karen Bieback Mitarbeiter Andrea Hecker, Susanne Kern, Asli Kocaömer, Anh-Thu Ha, Monika Latta Kooperationen OsteoCord-Verbund: Dr. PG. Genever, Departments of Biology, Philosophy and Sociology, University of York, UK; Prof. Kassem, Department of Endocrinology, University Hospital of Odense, Denmark; JS. Andersen, Center for Experimental Bioinformatics (CEBI), Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark, Odense, Denmark: Dr. H. Thielecke Fraunhofer Institute for Biomedical Engineering, Germany; Dr. L. Buttery, School of Pharmacy, University of Nottingham, UK; Dr. H Cruz, ECBio- R&D in Biotechnology,S.A., Oeiras, Portugal; Dr. R. Quirk, RegenTec Ltd, BioCity Nottingham, Pennyfoot Street, Nottingham, UK V. Mailaender, H. Schrezenmeier: Institut für Klinische Transfusionsmedizin und Immungenetik Ulm K.Schallmoser, D. Strunk: Medizinische Universität Graz, Abt. Blutgruppen Serologie und Transfusionsmedizin, Graz, Österreich Förderung RP der Europäischen Union Laufzeit des Projektes Weitere Informationen Kocaoemer A, Kern S, Klueter H, Bieback K: Human AB-Serum as well as Thrombinactivated Platelet-Rich-Plasma are suitable Alternatives to Fetal Calf Serum for the Expansion of Mesenchymal Stem Cells from Adipose Tissue. Stem Cells Jan 25; [Epub ahead of print] 84

86 Stammzellen und Zelltherapie Standardisierung für die Regenerative Medizin (START-MSC) Stammzellbank mesenchymaler Stammzellen aus Nabelschnurblut und Entwicklung GMP-konformer Prozessierungstechniken Hintergrund und Projektbeschreibung Das Fehlen von international gültigen Standards und Protokollen, die der Guten Herstellungspraxis (Good Manufacturing Practice, GMP) entsprechen, erscheint als die größte Hürde bei der Umsetzung experimenteller Ergebnisse in klinische Applikationen. Daher ist es das Ziel des Konsortiums START-MSC, Standards und Richtlinien zu definieren, die erstens eine standardisierte Gewinnung von MSC und daraus abgeleiteter Hepatozyten und Kardiomyozyten ermöglichen und zweitens eine systematische Charakterisierung dieser Zellen im Vergleich zu MSC aus Knochenmark und reifen Hepatozyten und Kardiomyozyten erlauben. Um diese Ziele zu erreichen, wird eine Stammzellbank aus Nabelschnurblut (cord blood, CB) abgeleiteten MSC aufgebaut. Die Grundlage hierfür ist eine standardisierte Isolation, Expansion und Qualitätskontrolle dieser Zellen. Anschließend werden sie durch die Verbundpartner im Vergleich mit MSC aus Knochenmark und Fettgewebe systematisch charakterisiert. Die klinische Relevanz und die Perspektive einer klinischen Anwendbarkeit erfordert die Entwicklung standardisierter und validierter Protokolle. Da es derzeit weltweit jedoch kein etabliertes, validiertes System für die Isolation und Expansion von MSC gibt, das frei ist von bovinem Serum, werden wir ein Protokoll entwickeln, das als Alternative humanes Serum, Thrombozytenfaktoren bzw. rekombinante Proteine und gleichzeitig eine Kultivierung im geschlossenen System erlaubt. Dies sehen wir als eine obligatorische Grundlage für eine zukünftige klinische Anwendung gemäß der internationalen GMP-Standards. Wichtigste Ergebnisse Für die Stammzellbank wurden MSC unter standardisierten Bedingungen aus humanem Nabelschnurblut isoliert, expandiert und grundlegend charakterisiert. Im Rahmen der Qualitätskontrolle erfolgte eine durchflusszytometrische Charakterisierung der Markerexpression, um eine Kontamination mit hämatopoetischen oder endothelialen Zellen auszuschließen. Das Differenzierungspotential wurde anhand von in vitro Differenzierungstesten in die osteogene, adipogene und chondrogene Richtung quantifiziert. Von allen MSC-Chargen erfolgte eine Überprüfung auf Sterilität und Kontrolle auf Mykoplasmenkontamination. Im Anschluss an die Qualitätsüberprüfung wurden diese Zellen kryokonserviert und entsprechende Aliquots werden den Partnern über den gesamten Verlauf der Projektphase zur Verfügung gestellt. Bovines Serum, das derzeit noch als essentielle Komponente von MSC Isolations- und Expansionsmedien gilt, wurde durch humane alternative Supplemente ersetzt, um internationalen GMP-Standards konforme Verfahren zur Isolation und Expansion zu entwickeln. Ergebnisse an MSC aus Lipoaspirat zeigten, dass sowohl humanes AB-Serum als auch thrombin-aktiviertes plättchenreiches Plasma in der Lage sind, die Isolation und Expansion von MSC zu gewährleisten. Die Expansion von Lipoaspirat-MSC wurde durch die alternativen humanen Zusätze gegenüber bovinem Serum als Vergleich sogar signifikant erhöht, ohne die Differenzierbarkeit zu beeinträchtigen (Kocaömer et al. STEM CELLS 2007). Im Gegensatz dazu zeigte sich bei MSC aus dem Knochenmark keine gesteigerte Proliferation. Im Vergleich zu bovinem Serum erwiesen sich humanes AB-Serum und thrombin-aktiviertes plättchenreiches Plasma als gleichwertig. Plättchenlysat jedoch hatte einen eindeutig wachstumsstimulierenden Effekt, ohne das Differenzierungspotential zu beeinträchtigen. Summary There is a lack of international valid standards and protocols hampering the translation of research protocols into a GMP-compliant manufacturing process of MSC. To achieve this, we established a cell bank of cord blood, adipose tissue and bone marrow derived MSC. These cells processed and defined according to standardised protocols are used by the collaborating partners for further analysis. With regard to clinical exploitation, there is a demand for GMP-compliant protocols for MSC manufacturing. At the moment, however, most isolation and expansion protocols for clinical- 85

87 Stammzellen und Zelltherapie scale production of MSC use culture media supplemented with Fetal Calf Serum. The first step therefore is to avoid the use of Fetal Calf Serum in the isolation and expansion medium of MSC. Our aim was to compare the effectiveness of human serum and platelet factors in promoting MSC growth with FCS. We decided to use pooled human AB-Serum (AB-HS) instead of autologous serum because for clinical use an off-the-shelf product which is available in large quantities is more desirable. After testing several protocols for the derivation of a platelet-factor rich supernatant, we chose thrombin-activated Platelet-Rich-Plasma (tprp) pooled from AB donors as the most suitable supplement. With both cell populations, adipose tissue-derived MSC and bone marrow-derived MSC, we observed that the human alternatives served as suitable alternatives in isolating and expanding MSC, maintaining their phenotype, immune phenotype and differentiation potential. Standort Mannheim Arbeitsgruppe Zell- und Immuntherapie Projektleiter Prof. Dr. Harald Klüter, Dr. Karen Bieback Mitarbeiter Asli Kocaömer, Andrea Hecker, Anh-Thu Ha, Marianna Karragianni Kooperationen START-MSC-Verbund: AG Prof. Ho, Medizinische Klinik V der Universität Heidelberg, Abteilung Hämatologie, Onkologie und Rheumatologie; AG Dr. Besser, Max-Delbrück- Zentrum für Molekulare Medizin Berlin; AG Prof. Franke Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg; AG Prof. Müller; Institut für medizinische Strahlenkunde und Zellforschung, Universität Würzburg; AG PD Dr. Stamm; Klinik und Poliklinik für Herzchirurgie, Universität Rostock; AG Prof. Ott, Abteilung Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der Medizinischen Hochschule Hannover; Prof Dresel, PROGEN Biotechnik GmbH V. Mailaender, H. Schrezenmeier: Institut für Klinische Transfusionsmedizin und Immungenetik Ulm K. Schallmoser, D. Strunk: Medizinische Universität Graz, Abt. Blutgruppen Serologie und Transfusionsmedizin, Graz, Österreich Förderung BMBF Laufzeit des Projektes Weitere Informationen Kocaoemer A, Kern S, Klueter H, Bieback K. Human AB-Serum as well as Thrombinactivated Platelet-Rich-Plasma are suitable Alternatives to Fetal Calf Serum for the Expansion of Mesenchymal Stem Cells from Adipose Tissue. Stem Cells Jan 25; [Epub ahead of print] 86

88 Stammzellen und Zelltherapie Deutsches Register für Stammzelltransplantationen Hintergrund und Projektbeschreibung Das Deutsche Register für Stammzelltransplantationen erfasst im Auftrag der Deutschen Arbeitsgemeinschaft für Blut- und Knochenmarktransplantationen (DAG-KBT) alle in Deutschland durchgeführten allogenen und autologen Stammzelltransplantationen. Das Register wird in Zusammenarbeit von ZKRD und Institut für Transfusionsmedizin in Ulm in Kooperation mit DRST-Einrichtungen in Essen und Frankfurt (Pädiatrisches Register) geführt. Neben dem Aufbau eines vollständigen Datenbestandes zur Qualitätssicherung und als Basis von Studienplanungen im Stammzelltransplantationsbereich verfolgt das DRST spezifische Fragestellungen zur Optimierung der allogenen Stammzelltransplantation Fallzahlen verw. unverw Jahr Entwicklung der Fallzahlen von allogenen Stammzelltransplantationen mit verwandten und unverwandten Spendern in Deutschland im Zeitraum von 1998 bis Wichtigste Ergebnisse 2006 stand die Auswertung der Entwicklung in der hämatopoetischen Stammzelltransplantation in Deutschland seit 1998 im Vordergrund. Die Zahl allogener Stammzelltransplantationen nahm stetig zu wurden bereits 62 % der Ersttransplantationen mit Stammzellen von unverwandten Spendern durchgeführt. In 85 % der Fälle wurden Blutstammzellen eingesetzt, in 15 % Knochenmark. Nabelschnurblut kam nur ganz selten (im Jahr 2005: n = 10) als allogene Stammzellquelle zur Anwendung. Das DRST hat sich als Instrument zur flächendeckenden Evaluation der nationalen Aktivitäten in der Stammzelltransplantation etabliert. Es dient als Basis für Qualitätssicherung und ist Grundlage wissenschaftlicher Auswertung zur weiteren Optimierung der Stammzelltransplantation. 87

89 Stammzellen und Zelltherapie Summary Since 1998 the number of allogeneic stem cell transplantations in Germany has increased steadily. In % of allogeneic transplantations were performed with stem cells from unrelated donors. 85 % of allogeneic stem cell transplants were performed with peripheral blood stem cells, 15 % with bone marrow. Cord blood was only rarely used (2005 n = 10). The DRST has successfully established itself as the national registry for haematopoietic stem cell transplantation in Germany. It provides the basis for quality assurance methods and can serve as a platform for scientific studies with the aim of further improvement of stem cell transplantation. Standort Ulm Arbeitsgruppe Deutsches Register für Stammzelltransplantation (DRST) Projektleiter Dr. Dr. C. Müller; Prof. Dr. H. Schrezenmeier Mitarbeiter Dr. Dr. C. Müller (ZKRD), Frau S. Allgaier, Frau A. Müller Kooperationen Prof. W. Beelen, PD Dr. H. Ottinger, Universitätsklinik Essen Prof. Dr. T. Klingebiel, Unversitätsklinik Frankfurt Förderung Deutsche José Carreras Leukämie-Stiftung e.v. Laufzeit des Projektes aktuelles Projekt: Weitere Informationen Ottinger H., Müller C., Beelen D.W., Ehninger G., Schmitz N., Zander A., Schrezenmeier H.: Entwicklungen in der hämatopoetischen Stammzelltransplantation. Daten des Deutschen Registers für Stammzelltransplantationen. Deutsches Ärzteblatt 103(37): A2381-AA2386 (2006) Weitere Informationen finden sich auf der DRST-Internetseite: 88

90 Stammzellen und Zelltherapie Adoptive Immuntherapie maligner Erkrankungen mittels der immortalisierten natürlichen Killerzelllinie NK-92 Hintergrund und Projektbeschreibung Natürliche Killer (NK-) Zellen können einen substantiellen Beitrag zum GvL-(Graft-versus- Leukemia)-Effekt leisten, ohne das Risiko einer GvH-(Graft-versus-Host)-Reaktion mit sich zu bringen. NK-Zellen stellen die erste Welle des Immunsystems gegen virusinfizierte und maligne entartete Zellen dar. NK-Zellen sind in ihrer Immunantwort nicht MHC-restringiert, ihre Aktivität wird aber über eine Vielzahl inhibitorischer und aktivierender Rezeptoren reguliert, die verhindern, dass sie gesunde körpereigene Zellen attackieren. Vor diesem Hintergrund gibt es eine Reihe von Therapieansätzen, die versuchen allogene oder autologe NK-Zellen im Rahmen einer Tumortherapie einzusetzen, wobei die verwendeten NK-Zellpopulationen Mischpopulationen darstellen und die Wirkung der Therapie daher schwer vorherzusagen ist. Die Arbeitsgruppe versucht daher die klonale Zelllinie NK-92 für eine Krebstherapie zu etablieren. Vorteile der immortalisierten NK-Zelllinie NK-92 begünden sich in dem Fehlen inhibitorischer Rezeptoren bei erhaltener zytotoxischer Aktivität, was eine breit gefächerte und hohe Aktivität gegen verschiedene hämatologische und solide Tumore bewirkt. Neben der Durchführung klinischer Studien bei Patienten mit unheilbar fortgeschrittenen Tumorerkrankungen eine Phase I Studie konnte kürzlich erfolgreich abegeschlossen werden steht die Untersuchung der Resistenzmechanismen von Tumorzellen gegenüber NK Zellen im Vordergrund der wissenschaftlichen Arbeiten. Besonders akute lymphatische Leukämien sind gegenüber einer Lyse durch NK-Zellen resistent. Durch systematische Untersuchung der Interaktion von akuten lymphatischen Leukämie-Zellen und NK-Zellen konnten wichtige Erkenntnisse erlangt werden, die zu neuen Therapieoptionen bei vorher nicht behandelbaren Tumoren führen. In Kooperation mit Prof. Winfried Wels (Georg-Speyer Haus) und PD Dr. Oliver Ottmann (Universitätsklinikum Frankfurt/Main) untersuchen wir ob ein genetisches Retargeting von NK-Zellen bestehende Resistenzen überkommen kann. Bei diesem Therapieansatz werden NK-Zellen genetisch so programmiert, dass sie einen antigenspezifischen Rezeptor auf der Oberfläche exprimieren. Die hierdurch herbeigeführte Spezifität der NK-Zellen für bestimmte Tumorantigene führte in unseren Experimenten zu einer hochsignifikanten Aktivität der NK-92 Zellen gegen ansonsten resistente Tumore. Wichtigste Ergebnisse Es zeigte sich, das die Transfusion von hohen Dosierungen bestrahlter NK-92 Zellen zu keinen Nebenwirkungen führte und sehr gut vertragen wird. Bei Patienten, die an Lungenkrebs erkrankt sind, zeigte sich unter der Therapie mit NK-92 ein teilweises Ansprechen auf die Immuntherapie. Die Resistenz akuter lymphatischer Leukämien gegenüber NK-Zellen ist auf eine fehlende Aktivierung und nicht wie bisher angenommen auf eine aktive Inhibition der NK-Zellen zurückzuführen. Die Expression von chimären Antigenrezeptoren in NK-Zellen mit einer Spezifität für bekannte Tumorantigene, kann diese mangelnde Aktivierung überwinden und führt zu hocheffektiven, tumorspezifischen Zelltherapeutika. 89

91 Stammzellen und Zelltherapie Dargestellt ist der Angriff einer genetisch manipulierten NK-92 Zelle (links) auf eine Krebszelle (rechts). Das tumorspezifische Antikörperfragment (3, ScFv) erkennt und bindet das Tumorantigen (4, z.b. ErbB2) und führt dann über die mit dem Antikörperfragment verbundene Signaltransduktionskette (5) zu einer Auslösung der lytischen Aktivität der NK-92 Zelle. An deren Ende steht die Verdauung der Krebszelle durch die von den NK-Zellen freigesetzten Enzyme Perforin und Granzyme (6) Standort Arbeitsgruppe Projektleiter Mitarbeiter Kooperationen Förderung Frankfurt Somatische Zelltherapie PD Dr. med. Torsten Tonn Dipl. Ing. biotech. Nicola Krzossok, Nadine Sorg (TA) Prof. Dr. Klingemann, Tufts New England Medical Center, Boston (USA) PD Dr. Oliver Ottmann, Med. Klinik III, Universität Frankfurt/Main Prof. Dr. Klingebiel, PD Dr. Schwabe, Dr. U. Koehl, Päd. Hämato- Onkologie, Universität Frankfurt/Main Prof. Dr. Wels, Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg- Speyer Haus Deutsche José Carreras Stiftung e.v. Deutsche Krebshilfe e.v. Weitere Informationen Romanski A, Bug G, Becker S, Kampfmann M,Seifried E, Hoelzer D, Oliver G. Ottmann, Tonn T. Multiple mechanisms of resistance to NK cell-mediated cytotoxicity are not operable in Acute Lymphoblastic Leukemia. Exp Hematology 2005: 3(3):

92 Stammzellen und Zelltherapie Adoptive Immuntherapie der chronischen CMV-Infektion nach allogener Knochenmark- oder peripherer Blutstammzelltransplantation: eine Phase I/II-Studie Hintergrund und Projektbeschreibung Die CMV-assoziierte Erkrankung stellt eine der häufigsten und bedrohlichsten Komplikationen nach allogener Stammzelltransplantation dar. CMV-seropositive Transplantatempfänger und/oder Patienten, die ein Transplantat von einem seropositiven Spender erhalten, entwickeln in 60% eine CMV Infektion nach allogener Stammzelltransplantation und wiederum 40-50% dieser Patienten eine CMV-Erkrankung. Die Letalität der manifesten CMV-Erkrankung, insbesondere der interstitiellen Pneumonie, beträgt trotz einer kombinierten Therapie mit Ganciclovir und CMV-Hyperimmunglobulin 50-70% (10-15). Aufgrund dieser hohen Mortalität wurden Interventionsstrategien zur Vermeidung der symptomatischen CMV-Infektion entwickelt. Im Rahmen dieser Phase I/II Studie soll die Toxizität aber auch die Effektivität einer adoptiven Immuntherapie mit Streptamer-selektionierten, CMV-spezifischen CD8+ T-Zellen evaluiert werden. Patienten nach allogener Knochenmark- oder peripherer Blutstammzell- Transplantation, die nach CMV-Antigen Nachweis auf eine 14-tägige antivirale Therapie mit Ganciclovir nicht ansprechen und einen CMV-positiven Spender haben, sollen mit CMV-CD8+ T-Zellen behandelt. Die Gewinnung der CMV-spezifischen CD8+ T-Zellen wird bei erstem Auftreten einer Virämie eingeleitet. Nach dem Immuntransfer sollen die Studienteilnehmer im Rahmen der KMT-Nachsorge auf ihre CMV-spezifische Immunrekonstitution hin untersucht werden, um Risikofaktoren für die späte CMV-Erkrankung und das Ansprechen auf die Immuntherapie zu dokumentieren. Die Studie wird von der Studiengruppe klinische Zelltherapie der DGHO inhaltlich unterstützt und so haben sich bereits mehr als 8 große Transplantationszentren in Deutschland der Studie angeschlossen. Die AG somatische Zelltherapie des Instituts Frankfurt hat die Isolation der CMV spezifischen Zellen im klinischen Maßstab etabliert und übernimmt diese Aufgabe zentral für alle an der Studie beteiligten Zentren. Anreicherung von CMV-spezifischen T-Lymphozyten mittels Immunmagnetverfahren (Clinimacs) und Streptamer- Technologie in der Reinraumanlage des Instituts Frankfurt. Wichtigste Ergebnisse Es konnte gezeigt werden, dass sich mit Hilfe der Streptamer-Technologie CMV-spezifische T-Lymphozyten im klinischen Maßstab vom jeweiligen Stammzellspender hochrein isolieren lassen. Bisher wurden zwei Jugendliche behandelt, die nach einer haploidenten Transplantation an einer vital bedrohlichen CMV-Infektion litten. Die Verabreichung kleinster Dosierungen CMVspezifischer Spenderlymphozyten führte in beiden Patienten zu einer Rekonstitution der zellulären Immunantwort gegen CMV und zu einem drastischen Abfall des CMV Virustiters unterhalb der Nachweisgrenze. 91

93 Stammzellen und Zelltherapie A e A2 8.37e % CD CD8 APC e-3 B7 5.57e % CD8 APC B A2 75% B7 82 % CD8 APC CD8 APC Dargestellt ist die durchflußzytometrische Analyse CMV-spezifischer (pp65) T-Lymphozyten eines HLA A 2 positiven und eines HLA-B7 positiven Spenders vor Selektion (A) und nach immunomagnetischer Anreicherung (B). Es zeigt sich, dass die Reinheit der virusspezifischen T-Zellen bei dem HLA-A2 positiven Spender in Bezug auf die T-Lymphozyten von 0,03 % auf über 75% Reinheit angehoben werden konnte. Bei dem HLA-B7 positiven Spender, der vor Selektion eine etwas höhere Frequenz virusspezifischer T-Lymphozyten im Blut hatte (0,5%) liess sich die Reinheit sogar auf 82% steigern. Diese hohe Reinheiten virusspezifischer T-Lymphozyten ermöglichen die Transfusion hochreiner T- Zellpräparate, spezifisch nur gegen das jeweilige Virusepitop. Die Übertragung von sogenannten alloreaktiven T- Lymphozyten, die eine Spender-gegen-Wirt (GvH)-Erkrankung auslösen können, wird durch die hohe Reinheit weitgehend vermieden. Standort Frankfurt Arbeitsgruppe Somatische Zelltherapie Projektleiter PD Dr. med. Torsten Tonn Mitarbeiter Dipl. Ing. biotech. Nicola Krzossok, Nadine Sorg (TA), Dipl. Ing. Biotech. Katrin Führer (studentische Hilfskraft) Kooperationen Prof. Dr. Hermann Einsele, Medizinische Klinik, Universitätsklinikum Würzburg Prof. Dr. Dirk Busch, Med. Mikrobiologie, Technische Universität München Dr. Lothar Germeroth, Stage Pharmaceuticals, Göttingen Studiengruppe klinische Zelltherapie der deutschen Gesellschaft für Hämatologie Onkologie (DGHO) Förderung Intern Laufzeit des Projekts Seit 2002 Weitere Informationen Romanski A, Bug G, Becker S, Kampfmann M,Seifried E, Hoelzer D, Oliver G. Ottmann, Tonn T. Multiple mechanisms of resistance to NK cell-mediated cytotoxicity are not operable in Acute Lymphoblastic Leukemia. Exp Hematology 2005: 3(3):

94 Stammzellen und Zelltherapie Stammzellen für die regenerative Medizin Hintergrund und Projektbeschreibung Verschiedene präklinische und klinische Studien weisen auf einen therapeutischen Nutzen der Verabreichung von autologen Knochenmarkprogenitorzellen bei der Behandlung des akuten Myokardinfarkts hin. Knochenmarkstammzellen wird hierbei ein positiver Effekt bei der Revaskularisierung des geschädigten Myokards zugesprochen, was letztlich zu einer Steigerung der Herzleistung führt. Gemeinsam mit der kardiologischen Klinik des Universitätsklinikums Frankfurt am Main, hat das Institut Frankfurt die Koordination und Logistik der Zellpräparationen im Rahmen der bisher weltweit größten randomisierten, multizentrischen Studie zur Untersuchung eines therapeutischen Nutzens von Knochenmarkstammzellen bei akutem Myokardinfarkt übernommen. Diese Studie, die insgesamt 202 Patienten in 18 Zentren eingeschlossen hat, konnte im Jahr 2006 erfolgreich abgeschlossen werden. Die, weltweit beachteten Ergebnisse dieser Studie deuten auf einen therapeutischen Nutzen der Stammzelltherapie bei Herzinfarkt hin. Zwischenzeitig sind in Kooperation mit der Kardiologie des Universitätsklinikums Frankfurt am Main, verschiedene weitere klinische Studien initiiert worden, die einen therapeutischen Nutzen von Knochenmarkstammzellen bei arterieller Verschlusskrankheit und diabetisch bedingten Durchblutungsstörungen untersuchen. Im Rahmen dieser Projekte beschäftigt sich die Arbeitsgruppe insbesondere mit der Optimierung der Verfahren zur Herstellung und Qualitätskontrolle von Knochenmarkvorläuferzellen für eine Verwendung in regenerativen Therapieansätzen. Wichtigste Ergebnisse Die REPAIR-AMI Studie konnte erstmals in einem großen, randomisierten Patientenkollektiv zeigen, dass die intrakoronare Stammzelltherapie sicher ist und zu einer signifikanten Steigerung der Herzpumpleistung führt. Die 1-Jahres Daten der Studie zeigen darüber hinaus, dass jene Patienten die eine Stammzelltherapie erhalten hatten, ein signifikant geringeres Risiko für das Auftreten schwerwiegender Komplikationen des Herzinfarktes hatten (Tod, Rehospitalisierung, Verschluss Infarktgefäßes). Unsere Ergebnisse zur Validierung der Zellprozessierung und die vergleichende Untersuchung von Zellisolationsprotokollen klinischer Studien mit negativem Ausgang, konnte zeigen, dass die Präparation des Knochenmarks einen sensiblen und kritischen Faktor darstellt, der für den therapeutischen Nutzen der Stammzelltherapie entscheidend ist. 93

95 Stammzellen und Zelltherapie Intracoronary infusion Adhesion Migration Mobilisation VEGF SDF-1 G-CSF GM-CSF EPO Statins Exercise PPAR Homing Invasion Möglichkeiten einer direkten Applikation von Stammzellen in das geschädigte Infarktgebiet durch intrakoronare Applikation aufbereiteter Knochenmarkvorläuferzellen (links oben) oder durch systemische Moblisierung der Knochenmarkvorläuferzellen durch Wachstums- und andere Faktoren (links unten). Derzeit nimmt man an, dass insbesondere eine Gefäßneubildung im Infarktgebiet für eine Regeneration des Herzmuskels verantwortlich ist. Für eine Gefäßneubildung (Neoangiogenese) sind für die durch Mobilisierung oder direkte Applikation in das Koronargefäß eingebrachten Stammzellen die aufgeführten Homing - Mechanismen entscheidend (rechte Bildhälfte). modifiziert nach Dimmeler et al, JCI 2005 [12] Standort Arbeitsgruppe Projektleiter Mitarbeiter Kooperationen Förderung Laufzeit des Projekts Frankfurt Somatische Zelltherapie PD Dr. med. Torsten Tonn Dipl. Ing. biotech. Nicola Krzossok, Nadine Sorg (TA) Prof. Dr. S. Dimmeler / Prof. Dr. A. Zeiher, Kardiologie, Universitätsklinikum Frankfurt am Main und 18 weitere kardiologische Studienzentren im gesamten Bundesgebiet und der Schweiz (REPAIR-AMI Zentren) Exzellenzinitiative des Bundes und der Länder; Cardiopulmonary System der Universitäten Giessen und Frankfurt (09/2006) Transantlantic Network of Excellence for Cardiac Regeneration (Leduq Foundation) Nicht begrenzt Weitere Informationen T. Tonn, N. Krzossok, W. Siegel, E. Seifried. Regulatorische Aspekte zur Gewinnung und Herstellung von Stammzellen. In: Stammtzelltherapie in der Kardiologie- Stand und Perspektiven: Hersg. S. Dimmeler und AM Zeiher. UNI-MED, 2005, ISBN

96 Stammzellen und Zelltherapie Genomische Stabilität von hämatopoetischen Stammzellen nach Bestrahlung mit hochenergetischen schweren Ionen Hintergrund und Projektbeschreibung Schwerionenstrahlung besitzt ebenso wie dünnionisierende Strahlung kanzerogene und mutagene Eigenschaften. Durch die Etablierung von Schwerionen-Krebstherapien konnte der Schwerionenstrahlung jedoch auch eine heilende Wirkung zugeschrieben werden. Die besondere biologische Wirksamkeit von Schwerionenstrahlung beruht auf ihren charakteristischen physikalischen Eigenschaften. Insbesondere das invertierte Dosisprofil erlaubt bei der Anwendung von schweren Ionen in der Krebstherapie eine hohe Dosisdeposition in tief liegenden Tumoren, während die Dosisdeposition im gesunden Gewebe entsprechend niedrig ist und dieses weitgehend geschont wird. Die Abschätzung des Gesundheitsrisikos von ionisierender Strahlung basiert auf experimentellen Studien sowie auf epidemiologischen Untersuchungen von exponierten Personen, in denen chromosomale Veränderungen (Chromosomenaberrationen) nach Bestrahlung untersucht werden. Als Untersuchungsobjekte dienen primäre Zellen, vor allem Lymphozyten, die leicht aus dem Blut exponierter Personen gewonnen werden können. Bei peripheren Lymphozyten wird ein von der Dosis und der Qualität der Strahlung abhängiger Anteil von geschädigten Zellen durch Apoptose aus der Population entfernt und so die genetische Stabilität gesichert. Andererseits wird das Auftreten klonaler Aberrationen in Lymphozyten von Spendern berichtet, die viele Jahre nach Strahlenexposition untersucht wurden. Diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass die entsprechenden Aberrationen von Stamm- oder Progenitorzellen an Tochterzellen weitergegeben wurden und damit in den ausdifferenzierten Lymphozyten als klonale Aberrationen erscheinen. Die Etablierung von Techniken, welche die Untersuchung von Chromosomenveränderungen in den für die Vererbung auf Tochterzellen relevanten Stamm- und Progenitorzellen ermöglichen, wird die Risikoabschätzung verbessern. Die Vorteile von Stamm- und Progenitorzellen als Modell liegen darin, dass die in vitro - Proliferation die natürliche Proliferationskapazität dieser Zellen widerspiegelt und außerdem die Schäden sichtbar macht, die im Organismus auch potentiell an Tochterzellen über viele Generationen weitergegeben werden können. Ziel dieses Forschungsprojektes ist es, in Dosiseskalations-Studien festzustellen, welche Schwerionen-Strahlendosis zu einer Beeinträchtigung des Differenzierungspotentials von Blutstammzellen führt und ob unterschiedliche Sensitivitäten verschiedener hämatopoetischer Vorläufer auftreten. Die Effekte von Schwerionenstrahlung sollen anhand von chromosomalen Schäden verfolgt werden. Außerdem sollen Auswirkungen auf das Differenzierungsmuster und die Apoptoserate untersucht werden. Hierbei soll die Wirkung von in der Krebstherapie verwendeten Kohlenstoffionen mit Röntgenstrahlung verglichen werden, um eine verbesserte Abschätzung der zu erwartenden Langzeitwirkungen zu ermöglichen. 95

97 Stammzellen und Zelltherapie (a) (b) (a) CFU-GEMM (colony-forming unit-granulocyte, erythrocyte, macrophage, megakaryocyte) Progenitor Zelle im CFU- Assay nach 14 Tagen Inkubation in MethoCult GF H4444 (StemCell Technologies Inc). (b) mit Giemsa angefärbtes Chromosomenpräparat der CFU-GEMM Summary The increasing application of heavy ions in radiotherapy is a strong motivation to expand the fundamental research in radiation biology, especially with respect to long term effects in different cell systems. Major advantages of heavy charged particles in comparison to conventional photon therapy are the inverted dose profile resulting in a maximum energy deposition within in the tumor volume. This allows the treatment of deep seated local tumors while the surrounding normal tissue is preserved effectively. However, studies on the biological responses in the healthy tissue, e.g. in the stem cell compartment, are desirable. The classical cytogenetic assay to estimate the radiation effect relies on the measurement of chromosome aberrations in lymphocytes. But especially regarding long term effects after heavy ion therapy it is important to understand the occurrence of chromosomal aberrations in haematopoietic stem cells, which are responsible for the constant renewal of blood with the ability to differentiate to a variety of specialized blood cells. Therefore during this work we will focus on the genomic stability (e.g. differentiation, chromosomal aberrations, apoptosis) of haematopoietic stem cells after irradiation with heavy ions in comparison to conventional photon irradiation. Standort Frankfurt Arbeitsgruppe Molekulare und zelluläre Therapie Projektleiter PD Dr. med. Torsten Tonn Mitarbeiter Dipl. Ing. biotech. Daniela Becker Kooperationen Gesellschaft für Schwerionenforschung (Abteilung für Biophysik) in Darmstadt-Wixhausen, Dr. Claudia Fournier / Dr. Sylvia Ritter / Prof. Dr. Gerhard Kraft (Leiter der Abteilung) Förderung Gesellschaft für Schwerionenforschung, Darmstadt-Wixhausen Laufzeit des Projektes

98 Stammzellen und Zelltherapie Langzeit-Sicherheitsbeobachtung im Rahmen der Gewinnung allogener Blutstammzellen (allopbsc) von gesunden Fremdspendern nach Vorbehandlung mit rhug-csf (Filgrastim oder Lenograstim) Hintergrund und Projektbeschreibung Die Transplantation hämatopoietischer Stammzellen (HSC) gesunder, HLA-kompatibler Fremdspender bei Patienten mit hämatopoietischen Systemerkrankungen nach myeloablativer Vorbehandlung ist inzwischen ein Standardverfahren mit kurativem Ansatz in der Erwachsenenund Kinder-Hämatologie und -Onkologie. Die Stammzellen der gesunden Fremdspender, die in der Frankfurter Knochenmark-Spenderdatei registriert sind, können entweder durch Knochenmarkspunktion (in Vollnarkose) oder nach entsprechender Mobilisation mit Wachstumsfaktoren (G-CSF) aus dem peripheren Blut mittels Stammzellapherese gewonnen werden. Das letztgenannte Verfahren stellt heute bei der überwiegenden Anzahl der Entnahmen die letztlich gewählte Methode aufgrund der einfacheren, ambulanten Durchführung und des schnelleren Anwachsens der Stammzellen im Knochenmark des Empfängers (sog. Engraftment ) dar. Die für die Mobilisierung der Stammzellen aus dem Knochenmark ins periphere Blut verwendeten Wachstumsfaktoren, rekombinante humane Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktoren (rhug-csf), werden zwar seit Jahren bei Patienten eingesetzt, für gesunde Fremdspender liegen allerdings bislang nur unzureichende Langzeit-Sicherheitsdaten vor. Die Hersteller der G-CSF-Präparate und 8 bzw. 9 des Transfusionsgesetzes (TFG) sehen die Durchführung der Mobilisierung und Entnahme peripherer HSC im Rahmen von Aufklärung, Einwilligung, Vorbehandlungsplan, ärztlicher Kontrolle und Vorbehandlungsprotokoll inklusive Meldung unerwünschter Ereignisse vor. Zur systematischen Erfassung der Langzeit-Sicherheitsdaten der gesunden Fremdspender (allopbsc) wird diese Studie seit 2002 an bisher knapp 150 Fremdspendern der Frankfurter Datei durchgeführt. Die Spender werden voruntersucht, vor, während und nach der Apherese sowie einen Monat, ein, drei sowie fünf Jahre nach der Spende nachuntersucht. Der Prüfplan inklusive Spenderinformation und Einwilligungserklärung ist von der Ethikkommission des Klinikums der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main geprüft und freigegeben worden. Wichtigste Ergebnisse Bisher sind keine schwerwiegenden unerwünschten Nebenwirkungen (UAW) bei den bis heute knapp 150 in die Studie eingeschlossenen und bis zu fünf Jahren nachuntersuchten Stammzell- Spendern aufgetreten, so dass wir gesunde Fremdspender vor Stammzell-Apherese zwischenzeitlich mit guten eigenen Daten beraten können. Ein endgültiges Studienresultat an über 200 freiwilligen Stammzellspendern, die dann jeweils über fünf Jahre nachuntersucht sein werden, liegt Ende 2012 vor. Für die über 500 Stammzell-Apheresen, die wir hier in Frankfurt pro Jahr durchführen, können aber bisherige Trends und Zwischenergebnisse schon heute direkt in die tägliche ärztliche Beratung unserer freiwilligen Stammzellspender einfließen. Summary This long-term safety study revealed no severe adverse events in about 150 healthy volunteer haematopoietic stem cell (HSC) donors followed for up to five years after stem cell apheresis to date. The preliminary study data guide us, when we give advice to our volunteer HSC donors. Final study results in more than 200 HSC donors followed for five years will only be available end of But even today, trends and interim analyses of this study serve as information in the daily counselling with annually more than 500 healthy volunteer HSC donors here in the Frankfurt institute. 97

99 Stammzellen und Zelltherapie Anzahl (n) Entnahmeformen/Jahr bei Spendern aus der Frankfurter Datei PBSC-E KM-E Stand: Ende 2006 Kumulativ N = 131 N = 49 Start PBSC-Studie Jahr Standort Frankfurt Arbeitsgruppe Stammzell-Transplantation Projektleiter Dr. med. Markus M. Müller Mitarbeiter PD Dr. med. Torsten Tonn, Frau Dr. med. Heike Bialleck, Frau Dr. med. Barbara Bomke, Dr. med. Jörg Schüttrumpf, Frau cand. med. dent. Ivana Saric, Frau cand. med. dent. Kristina Varga Kooperationen PD Dr. med. Hans Martin (Medizinische Klinik II KMT des Klinikums der J.W. Goethe-Universität Frankfurt/Main) Förderung DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg - Hessen ggmbh Laufzeit des Projektes 02/ /2012 Weitere Informationen M. M. Mueller, H. Bialleck, T. Tonn, B. Bomke, S. Zoeller, K. Buchholz, H. Martin, C. Seidl and E. Seifried: Long-term Safety, Feasibility and Efficacy of Allogeneic Peripheral Blood Stem Cell Apheresis in Healthy Donors After rhug-csf Mobilisation with Either Filgrastim or Lenograstim. Transfus Med Hemother 2004;31:15-16 (Postervortrag + Poster auf dem DGTI-Kongress 2004 in Mannheim) 98

100 Stammzellen und Zelltherapie CD34-positive Stammzellen im peripheren Blut als "Repair- Mechanismus" nach cerebralem ischämischem Insult Hintergrund und Projektbeschreibung In Tiermodellen konnte gezeigt werden, dass bei einem Schlaganfall Knochenmarkstammzellsuspensionen das funktionelle Defizit verbessern und histologisch in die Infarktbezirke integriert werden. Darüber hinaus konnte eine Migration hämatopoetischer Stammzellen aus dem Blut in das Gehirn und ein Tropismus dieser Zellen für erkranktes Hirngewebe nachgewiesen werden. Beim Menschen sind diese Vorgänge bisher nicht ausreichend untersucht. Ziel dieses Projektes war somit zu untersuchen, ob im Rahmen eines schweren cerebralen ischämischen Insults bei den Patienten CD34-positive hämatopoetische Stammzellen in das periphere Blut mobilisiert und damit regenerative Prozesse nach dem Schlaganfall beeinflusst werden. Leukozyten und CD34 + Zellen im peripheren Blut bei Patienten mit cerebralem Insult Wichtigste Ergebnisse Bei 30 Patienten mit Schlaganfall wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem cerebralen ischämischen Insult die Leukozyten- und CD34 + -Zahl im peripheren Blut im Vergleich zu 10 gesunden Blutspendern gemessen. Es zeigte sich weder ein signifikanter Anstieg der CD Zellzahl nach dem cerebralen ischämischen Insult noch ein signifikanter Unterschied zwischen der Patienten- und Kontrollgruppe. In der Subgruppenanalyse fand sich allerdings ein Trend zur Korrelation zwischen kortikalen, subkortikalen und territorialen Insult und der CD34 + -, Leukozyten- und Granulozytenzahl. Zur weiteren Klärung dieses Trends sind Untersuchungen eines größeren Patientenkollektivs notwendig. Zudem könnte es sein, dass die CD34 + Zellen rasch im Infarktgebiet integriert werden, ohne dass es zu einem signifikanten Anstieg im peripheren Blut kommt. 99

101 Stammzellen und Zelltherapie Darstellung der CD34 + Zellen im peripheren Blut in der FACS-Analyse Summary Animal models have shown that bone marrow stem cells improve functional defects caused by stroke and can be integrated in ischemic cerebral region. Our objective was to determine whether stroke patients have elevated CD34 + cells in peripheral blood which would support the hypothesis of an autologous hematopoietic stem cell repair process. In 30 patients the leukocyte and the CD34 + cell count were measured up to 7 days after the stroke and compared to 10 healthy blood donors as control group. There was no significant difference in the leukocyte count or the CD34 + cell number between stroke patients and the control group and no evidence of a general increase of circulating CD34 + cells indicating an involvement in the repair process. Subgroup analysis between cortical, subcortical and territorial stroke patients seems to show a trend for correlation with the CD34 + cell number and the leukocyte count. However, it remains possible that CD34 + cells home to the site of tissue damage without an increase in the peripheral blood. Standort Ulm Arbeitsgruppe Zelluläre Immuntherapie und Stammzelltransplantation Projektleiter Frau Dr. med. Britta Höchsmann und Dr. med. Markus Wiesneth Mitarbeiter Dr. med. Peter Schauwecker (Wissenschaftler), Claudia Fischer (MTA) Kooperationen Klinik für Neurologie, Universitätsklinikum Ulm Förderung Mittel des DRK-Blutspendedienstes Baden-Württemberg Hessen und des Universitätsklinikums Ulm Laufzeit des Projektes bis Weitere Informationen Höchsmann, B., Schauwecker, P., Fischer, C., Huber, R., Storch, A., Schrezenmeier, H., Wiesneth. M.: Circulating CD34-positive stem cells in stroke patients. Gemeinsame Jahrestagung der Deutschen, Österreichischen und Schweizerischen Gesellschaften für Hämatologie und Onkologie, Hannover (2005). Onkologie 28: Suppl. 3, 267 (No. 830) (2005) Höchsmann, B., Schauwecker, P., Fischer, C., Huber, R., Storch, A., Schrezenmeier, H., Wiesneth, M.: Circulating CD34+ Stem Cells in Patients with an Acute Ischemic Cerebral Event. 38. Jahreskongress der Deutschen Gesellschaft für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie (DGTI), Erfurt (2005). Transfus Med Hemother 32: Suppl. 1, 71 (No. P10.1) (2005) Huber, R., Schauwecker, P., Höchsmann, B., Schrezenmeier, H., Wiesneth, M., Ludolph, A.C., Storch, A.: Fehlende Mobilisation CD34-positiver hämatopoetischer Stammzellen nach ischämischem Insult. 78. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Neurologie, Wiesbaden (2005). Akt Neurol 32: 1055 (2005) 100

102 Stammzellen und Zelltherapie Knochenmarkstammzellen zur intrakoronaren Therapie bei akutem Myokardinfarkt im Rahmen einer placebo-kontrollierten, randomisierten, doppelt-blind Studie Hintergrund und Projektbeschreibung Verschiedene Pilotstudien berichten, dass die intrakoronare Applikation von autologen Knochenmarkstammzellen in der Post-Akutphase eines Myokardinfarktes zu einer Verbesserung der links-ventrikulären Funktion führt. Der Effekt adulter hämatopoetischer Stammzellen auf die Myokardregeneration wird jedoch weiterhin kontrovers diskutiert, da der Mechanismus unklar ist. Zur weiteren Untersuchung dieses offensichtlich positiven Therapieeffektes wurde eine placebokontrollierte, randomisierte, doppelt-blind Studie in Kooperation mit der Klinik für Innere Medizin II des Universitätsklinikums Ulm zur intrakoronaren Applikation von autologen Knochenmarkstammzellen bei Patienten mit schwerem akutem Myokardinfarkt initiiert. Für die Therapiebeurteilung werden zusätzlich hoch auflösende Bildgebungsverfahren (MRT) zur Auswertung des Infarktareals und verschiedener Funktionsparameter, insbesondere der Wandmotilität und der links-ventrikulären Ejektionsfraktion eingesetzt. Darstellung der Gefäßstenose ( ) des Ramus interventricularis anterior bei einem Myokardinfarkt Wichtigste Ergebnisse Im Rahmen dieser klinischen Studie wurde ein Standardtherapieverfahren zur Herstellung und intrakoronaren Applikation von Knochenmarkstammzellen sowie eines adäquaten Placebopräparates etabliert. Bisher wurden insgesamt 26 Patienten im Rahmen der Studie behandelt, ohne dass unerwünschte Wirkungen auftraten. Das Projekt dient somit auch als Basis für künftige klinische Studien zur Markierung und Transfektion von Stammzellen. 101

103 Stammzellen und Zelltherapie Summary Pilot studies have reported that intracoronary application of autologous bone marrow stem cells improves outcome of patients with acute myocardial infarction. A randomized, placebo controlled, double-blind study was initiated in cooperation with the Clinic of Internal Medicine II of the University Hospital Ulm. Till now 26 patients have been included and treated without side effects. This project will also serve as a platform for clinical studies in which stem cells will be labelled and transfected to assess the fate of the cells and to improve the therapeutic effects. Standort Ulm Arbeitsgruppe Zelluläre Immuntherapie und Stammzelltransplantation Projektleiter Dr. med. Volker Mailänder und Dr. med. Markus Wiesneth Mitarbeiter Andrea Brink (MTA), Birgit Maccari (MTA) Dr. med. Martin Bommer (Wissenschaftler), Dr. med. Thorsten Nusser (Wissenschaftler) Dr. med. Peter Schauwecker (Wissenschaftler), PD Dr. med. Jochen Wöhrle (Wissenschaftler) Kooperationen Klinik für Innere Medizin II, Klinik für Innere Medizin III, Universitätsklinikum Ulm Förderung Mittel des DRK-Blutspendedienstes Baden-Württemberg Hessen und des Universitätsklinikums Ulm Laufzeit des Projektes bis

104 Stammzellen und Zelltherapie Untersuchungen zu mesenchymalen Stammzellen: Isolierung, Charakterisierung, Differenzierung, Seneszenz, GMP-konforme ex vivo Expansion und Migrations-Monitoring Hintergrund und Projektbeschreibung Ein Schwerpunkt der Arbeitsgruppe besteht in der Etablierung der Therapie mit nicht-hämatopoetischen adulten Stammzellen aus dem Knochenmark (Dr. M. Wiesneth, Dr. V. Mailänder, Dr. M. Rojewski). Hierbei stehen die Suche nach geeigneten Parametern zur prospektiven Isolierung dieser mesenchymalen Stammzellen mittels Hochgeschwindigkeits-Zellsortierung (FACSAria), die GMP-konforme Isolierung und Expansion von mesenchmalen Stammzellen in einem geschlossenen Zellkultursystemystem sowie die Verwendung von Medien und Medienzusätzen nicht-tierischen Ursprungs (z. B. humanes Plättchenlysat) im Vordergrund. Die detaillierte durchflusszytometrische Charakterisierung, das Seneszenzverhalten und die Untersuchung des Differenzierungspotentials von mesenchymalen Stammzellen bilden einen weiteren Schwerpunkt der Arbeitsgruppe. Diese Untersuchungen stehen auch im Zusammenhang mit der Etablierung einer Qualitätskontrolle expandierter mesenchymaler Stammzellen für den klinischen Einsatz. Ferner wird die Interaktion mit malignen und nicht-malignen Zellen untersucht, vor allem die potentielle proliferationsinhibierende und apoptoseinduzierende Wirkung auf Tumorzelllinien und die immunsuppressiven Eigenschaften von mesenchymalen Stammzellen. Die Migration und das Homing mesenchymaler Stammzellen durch einen nicht-invasiven Nachweis von superparamagnetischen Nanopartikeln ist ein weiterer Forschungsschwerpunkt. Apoptose-Induktion durch MSC. Mononukleäre Zellen aus peripherem Blut und die Zelllinien 697, CS-1, Jurkat, K-562, KG-1a, LOUCY und U937 wurden ohne MSC (w/o MSC) in unmittelbarem Kontakt mit MSC (direct contact) oder in einem Transwell-System mit einer Porengröße von 1 µm zusammen mit MSC (transwell) über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert (n = 2-6). Die Abbildung zeigt Ergebnisse einer repräsentativen MSC-Präparation (UL-SARK01). Vergleichbare Ergebnisse konnten mit anderen MSC-Präparationen erzielt werden. Wichtigste Ergebnisse Ein GMP-konformes Expansionssystem befindet sich im Test. Für die Expansion mesenchymaler Stammzellen kann auf Reagenzien zurückgegriffen werden, die nicht tierischen Ursprungs sind. Meschenchymale Stammzellen können in der malignen leukämischen T-Zelllinie Jurkat Apoptose induzieren und die Proliferation maligner Zellen in Kultur inhibieren. Assay-Systeme zur funktionellen Charakterisierung der MSCs durch Nachweis der Immunmodulation in der gemischten Lymphozytenkultur und Quantifizierung der Proliferation wurden etabliert. 103

105 Stammzellen und Zelltherapie In Zusammenarbeit mit dem Institut für Organische Chemie III (Prof. Dr. K. Landfester) konnten Mechanismen der Interaktion von Nanopartikeln mit mesenchymalen Stammzellen geklärt werden (siehe weitere Projektbeschreibung). Vergleich des Einflusses zweier Plättchenlysat-Präparationen (PL#1, PL#2) mit fötalem Kälberserum (FCS) auf das Zellwachstum bei drei MSC-Präparationen. Die initiale Zellkonzentration betrug in jedem Ansatz 10 Zellen/cm2. Die Inkubation erfolgte über 7 Tage ohne Mediumwechsel. Die Experimente wurden als Dreifachansätze durchgeführt. Angegeben sind die Mittelwerte. Summary Our group is establishing a closed system for GMP compliant expansion of human adult mesenchymal stem cells ex vivo without the need for reagents of animal origin. This is mandatory for the clinical application of these cells. Besides this main topic, we are characterizing mesenchymal stem cells in detail and analyze their characteristics, mainly their differentiation and migration potency and their ability to interact with other cells and nano particles. Nanoparticles are used for non-toxic labeling to track migration of mesenchymal stem cells in vivo. Standort Ulm Arbeitsgruppe Zelluläre Immuntherapie und Stammzelltransplantation Projektleiter Prof. Dr. H. Schrezenmeier Mitarbeiter Thomas Becker (MTLA), Gisela Baur (MTLA), Karin Nothelfer (UTA), cand. med. Barbara Weber, cand. med. Eva Hennel, Dipl.- Biol. Myriam Kern, Dr. rer. medic. Markus Rojewski, Dr. med. Volker Mailänder Kooperationen Abteilung Organische Chemie III der Universität Ulm (Prof. Dr. K. Landfester) Förderung Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), Medizinische Fakultät Universität Ulm Laufzeit des Projektes Seit Weitere Informationen V. Mailänder, E. Hennel, M. Rojewski, M. Wiesneth, H. Schrezenmeier (2006); Mechanism of immunosuppression by mesenchymal stem cells of normal adults and aplastic anemia patients; Transfusion Medicine and Hemotherapy 33(S1), 38 M. T. Rojewski, T. Becker, G. Baur, M. Wiesneth, H. Schrezenmeier (2006); Ex vivo expansion of mesenchymal stem cells for regenerative therapy: impact of stem cell source and plating density; Transfusion Medicine and Hemotherapy 33(S1), 7 M. T. Rojewski, B. M. Weber, H. Schrezenmeier (2006); Bone marrow derived human mesenchymal stem cells induce apoptosis in Jurkat cells and modulate proliferation of other malignant cell lines: MSC as new tool for anti-tumor therapy? Bone Marrow Transplantation 37(S1), S

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107 Transplantationsmedizin und Immungenetik 3 Transpllantatiionsmediiziin und IImmungenetiik KIR KIR HLA HLA 106