Wachstum von Escherichia coli mit Glucose oder Acetat

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1 Johannes Gutenberg-Universität Mainz Institut für Mikrobiologie und Weinforschung FI-Übung: Identifizierung, Wachstum und Regulation (WS 2004/05) Sebastian Lux Datum: Wachstum von Escherichia coli mit Glucose oder Acetat 1. Theoretische Grundlagen Escherichia coli ist in der Lage, auf verschiedenen Substraten zu wachsen. In diesem Versuch soll das aerobe Wachstum von E. coli auf Glucose und auf Acetat verglichen werden. Ermittelt wird die optische Dichte (OD), welche ein Maß für die Abschwächung einer Strahlung in einem Medium ist. Anhand der OD lässt sich die Zellzahl im Medium und somit eine Wachstumskurve erstellen. Aus dieser Kurve lassen sich Wachstumsparameter wie Generationszahl, Wachstumsrate oder Ertragskoeffizient berechnen. Mit Glucose als Substrat verwendet E. coli die Stoffwechselwege Glykolyse, Atmungskette, Citratzyklus und die davon abgeleiteten Baustoffwege. In der Glykolyse wird Glucose schrittweise zu 2 Pyruvat oxidiert, zudem entstehen netto 2 ATP sowie 2 Reduktionsäquivalente NADH+H +, die später in die Atmungskette eingespeist werden. Pyruvat wird von der Pyruvat-Dehydrogenase zu Acetyl-CoA und CO 2 oxidiert. Zudem entsteht ebenfalls ein NADH+H + für die Atmungskette, während Acetyl-CoA in den Citratzyklus überführt wird, um weiter oxidiert zu werden. Neben der Generation von wichtigen Reduktionsäquivalenten für die Atmungskette dient der Citratzyklus als Verteilersystem für Intermediärprodukte der Biosynthese (z.b. Oxalacetat, Succinat, 2-Oxoglutarat). Werden diese Säuren allerdings abgezweigt, sinkt die Konzentration des Acetyl-CoA-Akzeptors Oxalactetat. Ausgeglichen wird dieser Verlust durch anaplerotische Reaktionen (Auffüllreaktionen). Hauptreaktion bei E. coli ist die Carboxylierung von Phosphoenolpyruvat katalysiert durch die PEP-Carboxylase: Phosphoenolpyruvat + HCO 3 - Oxalacetat + P i Ist ausreichend Oxalacetat vorhanden, wird Acetyl-CoA vollständig zu 2 CO 2 oxidiert, dabei entstehen 3 NADH+H + und 1 FADH+H + pro Acetyl-CoA, die in die Atmungskette eingeschleust werden, Oxalacetat wird regeneriert. In der Atmungskette entsteht ATP, der universelle Energieträger der Zellen. Da E. coli die Cytochrome c und aa 3 nicht besitzt (stattdessen Chinoloxidase), können weniger Protonen aus der Zelle ausgeschleust werden, letztendlich entstehen 24 ATP.

2 Mit Acetat als Substrat verwendet E. coli die Stoffwechselwege Glyoxylatzyklus, Gluconeogenese, Citratzyklus und Atmungskette. Acetat wird zuerst entweder durch eine von Acetyl-CoA-Synthase katalysierte Reaktion oder mit Hilfe der Enzyme Transacetylase und Acetatkinase zu Acetyl-CoA umgesetzt. Dieses wird durch die Malat-Synthase an Glyoxylat addiert, wobei Malat ensteht. Glyoxylat wiederum entsteht bei einer von Isocitratlyase katalysierten Reaktion, bei der aus Isocitrat neben Glyoxylat auch Succinat gebildet wird. Fasst man die Reaktionen zusammen, werden aus je einem Molekül Isocitrat und Acetyl-CoA zwei Moleküle C 4 -Dicarbonsäuren, welche entweder der Gluconeogenese zugeführt werden (das Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase katalysiert die Reaktion von Oxalacetat zu Phosphoenolpyruvat) oder als Bausteine von Biosynthesen dienen. Als energiegewinnende Stoffwechselwege stehen Citratzyklus und Atmungskette zur Verfügung. Letztendlich ist bei Acetat als Substrat mit einem merklich langsameren Wachstum zu rechnen als bei Glucose, da netto nur etwa 7-8 ATP gebildet werden und die anabolen Reaktionen der Gluconeogenese sowie die Enzyme des Glyoxylatzyklus limitierend wirken. Die Zellzahl wird mit Hilfe der optischen Dichte der Bakterienlösungen bestimmt, welche photometrisch bei 578 nm gemessen wird. Bei Extinktionen 0,5 entspricht die gemessene OD der tatsächlichen, bei steigender optischer Dichte werden die Ergebnisse allerdings verfälscht, da sich die wachsenden Zellen gegenseitig beschatten. Daher muss gegebenenfalls entsprechend verdünnt werden. Aus den Wachstumskurven lassen sich Parameter wie Wachstumsrate µ und Verdopplungszeit t D bestimmen. Die Wachstumsrate ist ein Maß für die Geschwindigkeit des Zellwachstums und errechnet sich aus den zu den Zeiten t 0 und t gemessenen Bakteriendichten x 0 und x t. µ = (ln x t ln x 0 ) / (t t 0 ). Die Verdopplungszeit t D steht mit der Wachstumsrate im Verhältnis t D = ln 2 / µ. Bei diesem Versuch ist mit einer höheren Wachstumsrate bzw. einer geringeren Verdopplungszeit mit Glucose als Substrat zu rechnen als mit Acetat. Zudem wird der molare Ertragskoeffizient Y ermittelt, welcher sich errechnet aus: Y = g gebildete Zellmasse / mol verbrauchte Glucose. 2. Material und Methode Je eine Hauptkultur von Escherichia coli AN387 wird entweder mit Glucose oder mit Acetat gezüchtet. Von den Kulturen wird in regelmäßigen Abständen die optische Dichte bestimmt, anhand der sich eine Wachstumskurve erstellen lässt.

3 Aus dieser Kurve lassen sich die Parameter Wachstumsrate und Verdopplungszeit bestimmen. Mittels einer Glucoseeichgerade lässt dich der Glucosegehalt einer unbekannten Probe sowie zu Beginn und Ende der Zucht bestimmen. Glucose wird photometrisch bestimmt, wobei diese zuerst von Glucoseoxidase zu Glukonat und H 2 O 2 oxidiert wird. Das Peroxid, welches stöchiometrisch in der gleichen Konzentration vorliegt wie Glucose, wird mit Hilfe von ABTS nachgewiesen. Bei der von Peroxidase katalysierten Reaktion entsteht aus H 2 O 2 Wasser, zudem wird ABTS oxidiert und liegt in einer gefärbten Form vor, die photometrisch nachgewiesen wird. Mit Hilfe des LAMBERT-BEERschen Gesetzes wird der Extinktionskoeffizient von ABTS bestimmt, anhand des Glucoseverbrauchs und der berechneten Trockenmasse ergibt sich der molare Extinktionskoeffizient Y. Abweichend vom Skript wurde der Wachstumsversuch mit Glucose nach 180 Minuten abgebrochen, da die stationäre Phase schon erreicht war. 3. Ergebnisse Tabelle 1: Wachstum mit Glucose Blindwert: OD 578 = 0,06 Zeit in min OD 578 (unverdünnt - BW) 0,35 0,44 0,74 1,14 1,16 1,18 1,18 OD 578 (verdünnt - BW) - - 0,215 0,15 0,17 0,16 0,14 Verdünnungsfaktor OD 578 (Endwert) 0,35 0,44 0,86 1,5 1,7 1,6 1,4 Abbildung 1: Wachstum mit Glucose linear OD 578 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Zeit in h unverdünnt verdünnt

4 In Abbildung 1 erkennt man einen beträchtlichen Unterschied zwischen der verdünnten und der unverdünnten Kurve. Den steilen Anstieg nach ca. 30 Minuten haben aber beide Kurven gemeinsam, hier herrscht intensives Wachstum vor. Abbildung 2: Wachstum mit Glucose halblogarithmisch 10 OD , Zeit in h unverdünnt verdünnt linearer Bereich Bei halblogarithmischer Auftragung lässt sich die lag-phase zwischen 0 und 30 Minuten erkennen, die stationäre Phase beginnt nach ca. 90 Minuten. Somit ist die Phase exponentiellen Wachstums (hier linearer Bereich) zwischen 30 und 90 Minuten. Aus den Werten lässt sich zunächst die Wachstumsrate µ und aus dieser dann die Verdopplungszeit t D errechnen. µ = (ln x t - ln x 0 ) / (t t 0 ) = (ln 1,5 - ln 0,44) / (90 min 30 min) = (0,405 - (-0,821)) / 60 min = 1,226 / 60 min = 0,020 min -1 t D = ln 2 / µ = 0,693 / 0,020 min -1 = 33,98 min Tabelle 2: Wachstum mit Acetat Blindwert: OD 578 = 0,06 Zeit in min OD 578 (unverdünnt - BW) 0,235 0,30 0,40 0,50 0,63 OD 578 (verdünnt - BW) ,29 0,325 Verdünnungsfaktor OD 578 (Endwert) 0,235 0,30 0,40 0,58 0,65

5 Abbildung 3: Wachstum mit Acetat linear OD 578 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, Zeit in h unverdünnt verdünnt Abbildung 4: Wachstum mit Glucose halblogarithmisch 1 OD 578 0, Zeit in h unverdünnt verdünnt Leider lässt sich anhand der Abbildungen 3 und 4 nur grob abschätzen, wann bei Acetatverwertung die Phase exponentiellen Wachstums ist. Vielmehr lassen sowohl die Werte in Tabelle 2 als auch die beiden Schaubilder eher auf lineares Wachstum schließen. Erst nach ca. 120 Minuten lässt sich in der verdünnten Kurve exponentielles Wachstum erkennen, was bedeuten würde, dass die lag- Phase bei Acetatverwertung zwei Stunden andauert. Da der Versuch nach vier Stunden beendet wurde, wird in der Berechnung davon ausgegangen, dass die exponentielle Phase mit Versuchsende endet.

6 µ = (ln x t - ln x 0 ) / (t t 0 ) = (ln 0,65 - ln 0,40) / (240 min 120 min) = (-0,430 - (-0,916)) / 120 min = 0,486 / 120 min = 0,004 min -1 t D = ln 2 / µ = 0,693 / 0,004 min -1 = 173,25 min Aufgrund der nicht eindeutigen Schaubilder gelten die errechneten Werte allerdings nur unter Vorbehalt. Ob die Umwege Glyoxylatzyklus und Gluconeogenese die Wachstumsrate wirklich so erheblich negativ beeinflussen ist fraglich. Tabelle 3: Eichgerade Glucosebestimmung Glucosekonzentration 0µM (=BW) 100µM 200µM 300µM 400µM 500µM E 436 (1) 0,115 0,24 0,38 0,55 0,675 0,825 E 436 (2) 0,115 0,235 0,375 0,55 0,66 0,79 Mittelwert 0,115 0,2375 0,3775 0,55 0,6675 0,8075 Mittelwert Blindwert 0 0,1225 0,2625 0,435 0,5525 0,6925 Abbildung 3: Glucose-Eichgerade E 436 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, Messwerte Glucose-Konzentration Eichgerade y = 0,0014x R 2 = 0,9976 Für die Berechnung von ABTS werden die Eichgeraden-Werte verwendet. Das LAMBERT-BEERsche Gesetz umgeformt ergibt: = E / (c * d) Schichtdicke ist jeweils 1 cm, die Konzentration muss mit dem Faktor 50/1060 (1:21,2) multipliziert werden, da nur 50 µl Probe auf 1 ml Glucosereagenz + 10 µl Glucoseoxidase kommen.

7 Beispielrechnung mit c = 500µmol/l, E = 0,6925: ABTS = E / (c * 50/1060 * d) = 0,6925 / (500µmol/l * 50/1060 * 1 cm) = 0,0294 l / (µmol * cm) = 29,4 l / (mmol * cm) Tabelle 4: Molarer Extinktionskoeffizient von ABTS Konzentration 100µM 200µM 300µM 400µM 500µM Ø (in l/(mm*cm) 26,0 27,8 30,7 29,2 29,4 28,62 Somit ergibt sich als Durchschnittswert für ABTS = 28,62 l / (mm * cm) Tabelle 5: Bestimmung des Glucosegehalts Wasser Anfang der Zucht Ende der Zucht Unbekannte Probe Standard 500µmol Verdünnung - - 1:10 unverd. 1:10 1:20 - E 436 (1) 0,11 n.m. 0,45 0,085 1,6 0,73 0,860 E 436 (2) 0,11 n.m. 0,445 0,085 1,55 0,70 0,875 Mittelwert BW 0-0,3375-0,025 1,4475 0,605 0,7575 Glucosegehalt in mm 0 2,23 0 9,95 7,99 0,50 n.m. = nicht messbar Der Glucosegehalt errechnet sich per Dreisatz, wenn man davon ausgeht, dass eine Extinktion von 0,7575 einer Konzentration von 500 µm entspricht. 0,7575 = 500 µm 0,3375 = x x =222,8 µm x * 10 = 2,23 mm. Als t 0 -Wert erhält man nur mit der verdünnten Probe einen messbaren Wert, es ergibt sich ein Glucosegehalt von 2,23 mm. Zum Ende der Zucht ist sämtliche Glucose, nämlich besagte 2,23 mm verbraucht. Berechnung der gebildeten Zellmasse: Die gebildete Zellmasse ergibt sich aus der maximalen optischen Dichte (= 1,7) minus der optischen Dichte zu Versuchsbeginn (= 0,35), welche jeweils Abbildung 1 sowie Tabelle 1 zu entnehmen sind. Bei OD 578 = 1 liegen laut Skript 300 mg Zellmasse pro Liter Kulturvolumen vor, somit entspricht OD 578 = 1,35 einer Zellmasse von 405 mg pro Liter.

8 Berechnung des molaren Ertragskoeffizienten Y für Glucose: Der molare Ertragskoeffizient ergibt sich aus der gebildeten Zellmasse in g geteilt durch den Glucoseverbrauch in mol. Y Glucose = 405 mg / 2,23 mmol = 0,405 g / 0,00223 mol = 181,6 g/mol Abschätzung des molaren Ertragskoeffizienten Y für Acetat: Die maximale OD 578 beträgt im Acetatversuch 0,65, OD 578 bei Versuchsbeginn war 0,235. Maximale optische Dichte minus der Anfangs-OD ergibt 0,415, was 124,5 mg gebildeter Trockenmasse entspricht. Unter der Annahme, dass 3 mmol Acetat komplett verbraucht werden, ergibt sich als molarer Ertragskoeffizient: Y Acetat = 124,5 mg / 3 mmol = 0,195 g / 0,003 mol = 41,5 g/mol 4. Diskussion Vergleicht man die Wachstumskurven und die molaren Ertragskoeffizienten vom Wachstum auf Glucose bzw. Acetat stellt sich Glucose klar als das günstigere Substrat heraus. Die Verdopplungszeit mit Glucose ist mit knapp 34 Minuten erheblich geringer als mit Acetat (173,25 Minuten). Allerdings ist die Acetatwachstumskurve nicht optimal, die Schaubilder bei linearer bzw. halblogarithmischer Auftragung ähneln sich, der lineare Bereich lässt sich nicht eindeutig festlegen. Vermutlich ist der Unterschied zwischen den Wachstumsraten bzw. der Verdopplungszeit nicht so immens. Häufigere Messungen als alle 60 Minuten und eine längere Beobachtungszeit als vier Stunden wären evtl. dienlich. Auch ist der molare Ertragskoeffizient mit 65 g/mol wesentlich geringer als 228,7 g/mol mit Glucose als Substrat. Dies ist eine Folge des langsameren Wachstums und der damit verbundenen geringeren produzierten Trockenmasse. Geschwindigkeitsbestimmend für das langsamere Wachsen auf Acetat ist nicht die geringere ATP-Ausbeute, diese wird durch eine höhere Acetat-Aufnahme pro Zeiteinheit kompensiert. Tatsächlich sind die anabolen Reaktionen der Gluconeogenese und des Glyoxylatzyklusses entscheidend für die Geschwindigkeit des Wachstums. Diese können verhältnismäßig wenig Substrat umsetzen. Literatur: MADIGAN, MICHAEL T. et. al (2001): Brock. Mikrobiologie, Heidelberg. SCHLEGEL, HANS G. (1992): Allgemeine Mikrobiologie. Stuttgart.