Chemisch-Analytische und Pharmakologische Untersuchungen von Allium ursinum L. und Sedum telephium L.

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1 Dissertation der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Ludwig-Maximilians-Universität München Chemisch-Analytische und Pharmakologische Untersuchungen von Allium ursinum L. und Sedum telephium L. von Anna Sendl aus T a n n» : ^ ->. %.«.'» 1992

2 INHALTSVERZEICHNIS Einleitung ALLIUM Seite 1. Allgemeiner Kenntnisstand Systematik von Bärlauch und Knoblauch Allium ursinum Allium sativum 1.2. Botanische Charakterisierung und Verbreitung Bärlauch Knoblauch Bisher bekannte Inhaltsstoffe von Bärlauch und Knoblauch Bärlauch Knoblauch Volksmedizinische Anwendung Bärlauch Knoblauch Chemie und und Pharmakologie von Allium ursinum Chemische und vergleichende analytische Untersuchungen von A. ursinum und A. sativum " Verwendete Extrakte und Präparationen des Bärlauchs und Knob lauchs Verwendete Isolierungsverfahren und Ausgangsextrakte für die Identifizierung von Bärlauch- Inhaltsstoffen Isolierung und Strukturaufklärung der S-haltigen Verbindung Bl aus Allium ursinum Isolierung und Strukturaufklärung von B2 aus Allium ursinum und Allium sativum Isolierung und Nachweis von AUicin (B6) in Chloroformextrakten von Allium ursinum Isolierung und Strukturaufklärung der S-haltigen Verbindung B3 aus dem Aceton/Chloroform-Extrakt von Allium ursinum Isolierung und Strukturaufklärung der S-Verbindung 7A aus dem Aceton/Chloroformextraktes von Allium ursinum Isolierung und Strukturaufklärung der S-Verbindung 7X aus dem Aceton/Chloroformextrakt von Allium ursinum 33

3 Isolierung und Nachweis von Diallylmonosulfid, Diallyldisulfid, Diallyltrisul fid und Diallyltetrasulfid in Wasserdampfdestillaten von Allium ursinum Isolierung und Nachweis von Dimethyldisulfid, Dimethyltrisulfid in Extrakten von Allium ursinum Isolierung und Nachweis von Allylmethylmonosulfid, Allylmethyldisulfid, Allylmethyltrisulfid Extrakten von Allium ursinum Isolierung und Nachweis von 2-Vinyl-4H-l,3-dithiin sowie von 3-Vinyl-4H-l,2-dithiin aus Aceton/Chloroform- und n-hexanextrakten von Allium ursinum Nachweis von Inhaltsstoffen aus wässrigen Bärlauch-Extrakten Nachweis von Adenosin Identifizierung von Glutamylpeptiden Vergleichende HPLC- und dünnschichtchromatographische Untersuchungen von Bärlauch und Knoblauch- Extrakten DC- Untersuchungen DC- Untersuchung von Chloroform- und n- Hexan- Extrakten beider Drogen DC-Untersuchung der enthaltenen Aminosäuren in beiden Drogen DC-Untersuchung der Aminosäuren nach Dabsyl-Derivatisierung HPLC- Untersuchungen von mit verschiedenen Lösungsmitteln hergestellten Extrakten aus Bärlauch und Knoblauchzwiebeln bzw. deren Blättern HPLC- Untersuchungen eines wässrigen Extraktes HPLC-Analyse der S-haltigen und S-freien Aminosäuren in Bärlauch und Knoblauchextrakten Fingerprintanatyse und Zuordnung der in Bärlauch und Knoblauch enthaltenen S-haltigen und S-freien Aminosäuren 50 a) Extraktionsverfahren und Derivatisiemng 51 b) HPLC-Analyse und Zuordnung der Hauptaminosäuren Versuche zur Basislinientrennung der Hauptaminosäuren von Allium ursinum und A. sativum Extrakten HPLC-Analyse von frisch hergestellten und gelagerten Chloroformextrakten 60 Frisch zubereitete Chloroformextrakte 60 Gelagerte Chloroformextrakte 61 HPLC-Analyse von frisch hergestellten und gelagerten n- Hexan-

4 extrakten von Allium ursinum und Allium sativum HPLC-Analyse von Wasserdampfdestillaten HPLC-Analyse von Aceton/Chloroform Extrakten HPLC-Analyse eines Etherextraktes von Bärlauch und Knoblauch HPLC-Analyse der sowie der 1+3- Acetonfällungen von A. ursinum und A.sativum Quantitative Untersuchungen von Bärlauch- und Knoblauchextrakten Quantitative Untersuchungen von Cysteinsulfoxiden in Bärlauchund Knoblauchextrakten Extraktion und Probenaufbereitung Chromatographisches System Referenzsubstanzen und Linearität der Eichgeraden Quantitative Bestimmung von (+)-S-Alk(en)yl-L-cysteinsulfoxiden in 71 Blättern und Zwiebeln von verschiedenen Bärlauch- und Knoblauchmustern 4.2. Quantitative Bestimmung des AUicins, Dhnethylthiosulflnat sowie Allylmethylthiosulfinat in Chloroformextrakten des Bärlauchs und Knoblauchs Quantitative Untersuchungen von Ajoenen in Bärlauch- und Knoblauchextrakten Quantitative Bestimmung von Adenosin in Bärlauch- und Knoblauchextrakten 80 a) Bisherige Methoden 80 b) neue Bestimmungsmethode 81 c) Ergebnisse der Gehaltsbestimmung 83 d) Diskussion der Ergebnisse Stabilitäts- und Lagerungsversuche von Extrakten und Reinstoffen aus Bärlauch und Knoblauch Allgemeine Lösungsmitteleinflüsse und Lagerbedingungen 85 a) Stabilitätsuntersuchungen von n-hexanextrakten 86 b) Stabilitätsuntersuchungen von Chloroformextrakten 88 c) Stabilitätsuntersuchungen von in Tetrahydrofuran gelagerten Extrakten 89 d) Stabilitätsuntersuchungen von Chloroformextraktrückständen 90 e)bei Raumtemperatur in verschiedenen Lösungsmitteln gelagerte Aceton/Chloroformextrakte 92

5 5.2. Stabilitätsuntersuchungen von Reinstoffen Pharmakologie 97 Für A. sativum wissenschaftlich belegte Wirkungen und Wirksamkeiten 97 Antimikrobielle Wirkung 97 Wirkung auf den Lipidstoffwechsel, Plasmalipide und Atherosklerose 98 Atherosklerose 98 a) Lipidstoffwechsel 98 b) Hypercholesterinämie und Atherosklerose Wirkungen des Knoblauchs auf den Lipidstoffwechsel und die Atherosklerose Blutdrucksenkende Wirkung Wirkung auf die Fibrinolyse, Thrombozytenaggregation und die Blutrheologie Weitere Wirkungen Eigene pharmakologische Untersuchungen mit Bärlauch- und Knoblauchextrakten sowie daraus isolierten Verbindungen Hemmung der Cyclooxygenase und 5-Lipoxygenase durch Bärlauchund Knoblauchextrakte sowie isolierte Reinstoffe daraus Cyclooxygenase-Test Lipoxygenase-Test Thrombozytenaggregationstest ACE-Hemmung Cholesterinbiosynthesehemmung Testsystem " Verwendete Knoblauch-und Bärlauch-Extrakte und Reinstoffe Ergebnisse des Cholesterinbiosynthese-Testes Cholesterinbiosynthese in vivo- Versuch-Methodik Pharmakologie, Klinik und mögliche Bedeutung von Adenosin für die Wirksamkeit von A. sativum und A. ursinum 125 SEDUM TELEPHIUM L. 130 Einleitung Kenntnisstand über Sedum telephium L Systematik von Sedum telephium L Vorkommen und volksmedizinische Verwendung von Sedum

6 telephium Bisher bekannte Inhaltsstoffe Isolierung und Strukturaufklärung von Polysacchariden aus Blättern von Sedum telephium L Isolierung und Fraktionierung von Rohpolysaccharidfraktionen aus Blättern von Sedum telephium L Isolierung der Einzelkomponenten H1A, H1A1, H1A3 aus Hl Anionenaustauschchromatographie Reinigung der sauren Fraktion H1A durch Gelchromatographie Darstellung der Einzelkomponenten NAS1, NAS2 und N0.5S2 aus der 1+0,5-FäÜung des Natronlaugeextraktes Anionenaustauschchromatographie Gelfiltration der sauren Fraktion N0.5S der Rohfraktion N0, Homogenitätsprüfung und Molekulargewichtsbestimmung der Polysaccharide H1AM, NAS1, NAS2 und N0.5S Strukturaufklärung des Polysaccharids H1AM Allgemeine Parameter: optische Drehung und N-Gehalt Qualitative und Quantitative Zuckeranalyse Pektinaseabbau von H1AM Bestimmung des Veresterungsgrades von Hl AM Methylierungsanalyse von Hl AM Reduktion der Galakturonsäure in H1AM Methylierungsanalyse des reduzierten Polysaccharides H1AMR Partialhydrolyse des reduzierten Polysaccharids H1AMR U -C-NMR-Spektroskopie Strukturvorschlag für das Polysaccharid H1AM Strukturaufklärung des Polysaccharids NAS2 sowie Charakterisierung von NAS1 und NAS Optische Drehung Qualitative und quantitative Zuckeranalyse der Polysaccharide NAS3, NAS2, NAS Veresterungsgrad Methylierungsanalyse von NAS Reduktion der Uronsäureneinheiten in NAS Methylierungsanalyse des reduzierten Polysaccharids NAS2R Partialhydrolyse des reduzierten Polysaccharides NAS2R u C-NMR-Spektroskopie 167

7 10.9. Strukturvorschlag für das Polysaccharid NAS Pharmakologischer Teil 169 Motivierung Entzündung Begriffsbestimmung In vitro und in vivo- Wirkmodelle zur Testung auf antiphlogistische Wirkung Bisher bekannte Verbindungen mit antiphlogistischer Wirkung Eigene pharmakologische Untersuchungen Testssysteme 175 a) Granulozytentest 175 b) Komplementtest 176 c) TNF-a-Test 177 d) Chemotaxis-Test 177 e) Carbon-Clearance Test Rattenpfotenödemtest 178 g) In vivo- Bestimmung des topischen Sensibilisierungsvermögens einer Substanz 178 h) Cyclooxygenasetest Ergebnisse der pharmakologischen Untersuchungen und Diskussion Ergebnisse des Granulozytentestes Ergebnisse des Komplementtestes Ergebnisse des Tumomekrosefaktortestes Ergebnisse der Testung auf Hemmung der Leukozytenmigration Ergebnisse des Carbon-Clearance- Testes Ergebnisse des Rattenpfotenödemtestes Ergebnisse der Bestimmung des Sensibilisierungsvermögens von Sedum telephium L Ergenisse des Cyclooxygenasetestes Diskussion und Bewertung der pharmakologischen Versuche mit Sedum telephium ZUSAMMENFASSUNG 193 Experimenteller Teil 198 Allium ursinum Untersuchungsmaterial 198

8 2. Allgemeine Arbeitsmethoden Analytische Dünnschichtchromatographie Adsorbens Derivatisierung der Aminosäuren mit Dabsylchlorid = 4- Dimethylaminoazobenzol-4-Sulfonylchlorid Laufmittelsysteme Detektionsmethoden Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) Apparative Daten Mobile Phasen Stationäre Phasen Trennsysteme Mitteldruckflüssigchromatographie (MPLC) mit Glassäulen Spektroskopische Methoden UV-Spektroskopie Massenspektroskopie 'H-NMR-Spektroskopie "C-NMR-Spektroskopie Spezielle Arbeitsmethoden 4.1. Extraktbereitung aus Bärlauch-, Knoblauchzwiebeln und -blättern Wässriger Extrakte Chloroformextrakte KC und BC n- Hexan- Extrakte Aceton/ Chloroformextrakte KA und BA Etherextrakte Wasserdampfdestillate Wasser/Methanol- Extrakte und 1+3-Acetonfällungen des Wasserextraktes Isolierung und Nachweis der S-freien und S-haltigen Verbindungen Isolierung bzw. Nachweis der S-freien Verbindungen Adenosin y-glutamylpeptide Nachweis und Identifizierung der Alk(en)ylcysteinsulfoxide bzw. Aminosäuren in A. ursinum und A. sativum- Extrakten Isolierung und Identifizierung der S-haltigen Verbindungen aus Bärlauch- und Knoblauchzwiebeln Isolierung und Identifizierung der Thiosulfinate Dimethyl-, Diallyl-, Me- 6 A

9 thylallyl-und AUylmethylthiosulfinat aus den frisch zubereiteten Chloroformextrakten des Bärlauchs und Knoblauchs Isolierung und Identifizierung der S-haltigen Sekundärprodukte Ajoen, Methyl- und Dimethylajoen, Diallylmono-, di-, tri-, tetrasulfid, Dimethylmono-, disulfid, Allylmethylmono-di-,trisulfid, und 2-Vinyl-4H-l,3-dithhin sowie 3-Vinyl-4H-l,2-dithiin in Bärlauch- und Knoblauchzwiebeln Synthesen der S-Alk(en)yl-L-cysteine und- cysteinsulfoxide Verwendete Reagentien S-Alk(en)yl-L-cysteine S-Alk(en)yl-L-cysteinsulfoxide Quantitative Untersuchungen Quantitative Bestimmungen der Thiosulfinate in frisch bereiteten Chloroformextrakten von Bärlauchzwiebeln und -blättern sowie von Knoblauchzwiebeln Gehaltsbestimmung der Ajoene in den Aceton/Chloroformextrakten Gehaltsbestimmung der Alk(en)ylcysteinsulfoxide in Bärlauch- und Knoblauchzwiebeln und -blättern Quantitative Bestimmung des Adenosins in Blättern und Zwiebeln von 212 Bärlauch und Knoblauch 4.5. Isolierung der Alliinase Physikalische Daten Verbindung Bl: Dimethylthiosulfinat Verbindung B2: Allylmethyl- bzw. Methylallylthiosulfinat Allicin Verbindung B3: (E,Z)-Ajoen Verbindung 7A: E-Methylajoen Verbindung 7A': Z-Methylajoen Verbindung 7X: E-Dimethylajoen Verbindung 7X': Z-Dimethylajoen Diallylmonosulfid Diallyldisulfid Diallyltrisulfid Diallyltetrasulfid ' Dimethyldisulfid Dimethyltrisulfid Allylmethylmonosulfid 217

10 Allylmethyldisulfid Allylmethyltrisulfid Vinyl-4H-l,3-dithiin Vinyl-4H-l,2-dithiin Stabilitätsuntersuchungen Stabilitätsuntersuchung der Reinsubstanzen AUicin und MethaUyl- bzw. AUylmethylthiosulfinat Stabilitätsuntersuchgen der Extrakte Pharmakologische Methoden Beeinflussung der Cyclooxygenaseaktivität (Wagner et al. 1986) Beeinflussung der 5-Lipooxygenaseaktivität Thrombocytenaggregationshemmtest Angiotensin-Converting-Enzym Test Cholesterinbiosynthesetest In vivo- Cholesterinbiosynthesetest 222 Sedum telephium Herkunft der Drogen Allgemeine Arbeitsmethoden Physikalisch-chemische Untersuchungen 'H-und "C-NMR-Spektroskopie CHN-Analysen Polarimeter Messungen Bestimmung der optischen Drehung DAB Zuckeranalyse Gaschromatographie Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS-Verfahren) HP-GPC-Methode Säulenchromatographie Dünnschichtchromatographie Monosaccharide Dialyse Uronsäurebestimmung Proteinbestimmung Neutralzuckerbestimung 227 8

11 Bestimmung des Veresterungsgrades mit Methanol nach WOOD et al. (1971) sowie mit Protonen-NMR-Spektroskopie nach Grasdalen (1989) 227 SpezieUe Arbeitsmethoden 227 Isolierung der Polysaccharide aus Sedum teleph. L. 227 Gewinnung der Rohpolysaccharidfraktionen H 1 und H 4 aus wässrigem Extrakt Isolierung der Einzelkomponenten Hl und H4 aus der Ethanol- Fällung des Wasserextraktes 228 Anionenaustauschchromatographie 228 Gelfiltrationschromatographie 229 Gewinnung von Rohpolysacchariden aus alkalisch-wässrigem Extrakt 229 modifiziert nach CALDES et al Isolierung der Polysaccharide NAS2, NAS1, N0.5S2 230 Anionenaustauschchromatographie 230 Gelfiltrationschromatographie 231 Molekulargewichtsbestimmung (M w ) mit HP-Gelpermeationschromatographie 231 Hydrolysebedingungen 232 Darstellung der Alditol-Acetate 232 Enzymatische Hydrolyse der Polysaccharide mit Pektinase 232 Partialhydrolyse der Polysaccharide 233 Methylierungsanalyse 233 a) Darstellung der methylierten Alditolacetate nach Hakomori 233 b) Darstellung der methylierten Alditolacetate nach Harris Reduktion der Uronsäuren in Poysacchariden nach Taylor und Conrad Pharmakologische Methoden Granulocytentest Carbon-Clearance-Test Hämolytische Testsysteme zur Bestimmung der Gesamtkomplementaktivität, Klassischer Weg CP1 und CP Hemmung des Rattenpfotenödems Stimulierung des Tumor-Nekrose-Faktors (TNFa) Chemotaxis- Test Bestimmung des Sensibilisierungsvermögens einer Substanz Beeinflussung der Cyclooxygenaseaktivität 240