FTIR-Spektroskopie in der klinischen Mikrobiologie Erste Erfahrungen

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1 Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene FTIR-Spektroskopie in der klinischen Mikrobiologie Erste Erfahrungen Dr. J. Liese MALDI Biotyper Anwendertreffen Bremen 23. November 2017

2 Warum Typisierung? Identifizierung von Übertragungsereignissen und Erregerquellen Über Speziesidentifizierung hinaus z.b. multiresistente Stämme

3 Dunkle Materie der Epidemiologie im Krankenhaus Antibiotika-empfindliche Stämme? Übertragungen? Endemische Krankenhausstämme?

4 Typisierung: Parameter Zeit Probenvorbereitung, Analysendauer, Auswertung Auflösung Subspezies, Serogruppen, clonal complexes, Sequenztypen Kosten pro Isolat, Gerät

5 Typisierungsverfahren nicht DNA-basiert DNA-basiert Serotypisierung Pulsfeld Gelelektrophorese (PFGE) Phagentypisierung rep-pcr Resistotyping Single locus sequence typing (SLST) Metabolic typing Multilocus sequence typing (MLST) MALDI-TOF cgmlst, wgmlst FTIR-Spektroskopie Whole genome sequencing (WGS) Spektrum-basierte Typisierung

6 Fourier-Transform Infrarot (FTIR) Spektroskopie SP SP Q Pr D

7 Fourier-Transform Infrarot (FTIR) Spektroskopie Absorption von Infrarotlicht (Energie) durch chemische Bindungen Spektrum als Abbild der chemischen Zusammensetzung z.b. Veränderung in der Zusammensetzung von bakt. Zellwand oder Kapsel Anwendung in der Mikrobiologie: - Speziesidentifizierung von Bakterien - v.a. in Veterinär- und Lebensmittelmikrobiologie

8 Typisierung mit FTIR-Spektroskopie Erreger Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes Acinetobacter baumannii Escherichia coli Yersinia enterocolitica Campylobacter spp. Salmonella enterica Referenz Johler et al. (2016) Syst Appl Microbiol Fetsch et al. (2014) Int J Food Microbiol Grunert et al. (2013) J Clin Microbiol Bertsch et al. (2013) Int J Syst Evol Microbiol Sousa et al. (2014) J Photochem Photobiol Dawson et al. (2014) Eur J Clin Micrbiol Infect Dis Sousa et al. (2013) Sci Rep Davis et al. (2012) Food Microbiol Kuhm et al. (2009) Appl Environ Microbiol Mouwen et al. (2005) Appl Environ Microbiol Preisner et al. (2010) Appl Environ Microbiol

9 FTIR: Analyse 1300 cm cm -1 Summenspektren (technische oder biologische Replikate) Differenz als Maß der Ähnlichkeit der Spektren Clustering oder Vergleich mit Datenbank

10 Clustering cutoff Ähnlichkeitsmatrix (z.b. Euklidische Distanz) Clustering-Algorithmen (z.b. hierarchisch: single linkage, Ward)

11 Kongruenz von Typisierungsverfahren Adjusted Wallace Coefficient (AWC) Adjusted Rand Index (ARI) A B C D A B C D A B C D ARI = 1.0; AWC = 1.0 ARI = 0.658; AWC = ARI = 0; AWC = 0

12 FTIR: Workflow Standardisierte Wachstumsbedingungen (Agar, Temperatur, Dauer)

13 FTIR: Workflow Silikat-Probenträger nach Trocknen

14 FTIR: Workflow Software: Isolatmanager und Analyse

15 FTIR: Workflow Software: Auswertung

16 Klebsiella pneumoniae 38 Isolate aus Neonatologie-Screening Rep-PCR (Diversilab) als Referenz MALDI Spezifische MALDI peaks FTIR Spektroskopie

17 Klebsiella pneumoniae 8 rep-pcr cluster 7 FTIR cluster AWC: ARI: Reproduzierbar in verschiedenen Laboren

18 Enterobacter aerogenes

19 Piperacillin Piperacillin+Tazobactam Cefotaxim Ceftazidim Cefepim Cefpodoxim Imipenem Meropenem Enterobacter aerogenes 17 besiedelte Neugeborene über 2 Monate Aufnahmestopp, Kohortierung Isolate teilweise mit variabler Koloniemorphologie und (phänotypischer) Resistenz S S S S S S S S I S S S S S S S I I S S S R S S R R R R S R S S R R S S S R S S R R R R I R S S R R R I S R S S R S I I S R S S R S I S S R S S R R S R S R S S

20 Enterobacter aerogenes FTIR Spektroskopie - 4 techn. Replikate - 3 biol. Replikate 2 oder 3 Cluster???

21 Enterobacter aerogenes rep-pcr * * * * unrelated isolates

22 Enterobacter aerogenes Whole genome sequencing 2 Stämme: Abstand >20000 SNPs Cl. 1: 5 Kinder; Cl. 2: 12 Kinder keine Doppelbesiedlungen

23 WGS cluster Pseudomonas aeruginosa 36 Isolate (WGS) von Patienten und der Patientenumgebung FTIR cluster Total A 1 1 B 1 1 C D E 1 1 F 2 2 G 9 9 H 2 2 I 1 1 J 1 1 K L 1 1 M 1 1 N 2 2 O 1 1 P Q 2 2 R 1 1 Total Adjusted Wallace coefficient: ( )

24 Pseudomonas aeruginosa 167 konsekutive Blutkulturisolate Ganzgenomsequenzierung und SNP-basierte Phylogenie M. Willmann

25 Pseudomonas aeruginosa paarweiser Vergleich von core genome-snps

26 Pseudomonas aeruginosa Ähnlichkeit der Einzelspektren - je 4 technische Replikate: 93,4% ± 3,9% - je 3 biologische Replikate: 90,8% ± 5,8%

27 Pseudomonas aeruginosa FTIR: paarweiser Vergleich der Summenspektren

28 Pseudomonas aeruginosa SNPs: 80.8% >18000 SNPs: 55.6%

29 Pseudomonas aeruginosa ST-308 M. Willmann

30 Pseudomonas aeruginosa FTIR Spektroskopie: Distanz innerhalb ST-308: 83,0% außerhalb: 44,5%

31 VRE: FTIR vs. WGS 77 Stämme (WGS vorhanden) FTIR similarity vs. core genome SNP difference Similarity TechRepl: 92,9% ± 2,8% Similarity BiolRepl: 90,5% ± 6,8% 0-20 SNPs: 86.4% >20 SNPs: 75.0% within outside ST ST ST ,8% 75,7% ST-17 75,9% 73,0% ST ,0% 73,7% ST-80 77,4% 74,8% ST ,9% 71,8% ST ,6% 71,4%

32 ST-117 ST-17 ST-192 ST-80 VRE: Künstliches Neuronales Netzwerk

33 Klebsiella oxytoca Mikrobiologisches Neonatologie-Screening Übertragungen sind von Zimmerbelegung abhängig

34 Klebsiella oxytoca: FTIR

35 Klebsiella oxytoca: Timeline (K) A A A O O O P P P M G G G G G G G G G G G R C H/Q Q G G B B B B B E D D D J B F F N N (K) N (K) N L K P P S

36 Real-Time Surveillance? Routinemäßige Typisierung aller Isolate (oder Gruppen) (z.b. multiresistente Erreger) Identifizierung von Transmissionsclustern oder endemischen Stämmen im Krankenhaus Angepasste Präventionsmaßnahmen FTIR als Screening für andere Typisierungsverfahren (z.b. WGS)?

37 Real-Time Surveillance? Identifizierung Antibiogramm (Vorläufige) Typisierung Mikrobiologischer Befund Stationsbelegungsdaten Isolat-Datenbank Hinweis für Krankenhaushygiene

38 Zusammenfassung FTIR-Spektroskopie: Analyse der chemischen Zusammensetzung eines Bakterienisolats Vergleich von FITR-Spektren möglich Einfache und günstige Methode der Erregertypisierung Robuste Validierung gegen Referenzmethoden notwendig

39 Danke! UK Tübingen Angelina Röchner Ariane Dinkelacker Sebastian Grashorn Sophia Vogt Matthias Marschal Silke Peter Matthias Willmann Ingo Autenrieth CVUA Fellbach Jörg Rau Bruker Daltonics GmbH Dr. Jan Liese Institut für Med. Mikrobiologie und Hygiene Universitätsklinikum Tübingen Norman Mauder Markus Kostrzewa