4 Methoden der Proteinbestimmung 2: Entsalzen durch Gelchromatographie, Dialyse

Transkript

1 4 Methoden der Proteinbestimmung 2: Entsalzen durch Gelchromatographie, Dialyse Lerninhalt: Allgemeine Parameter der Größenauschlußchromatographie, Methoden der Entsalzung (Dialyse, Gelchromatographie). Geräte: Eppendorf-Pipetten, Eppendorf-Tubes mit Halter, Mikrotiterplatten-Photometer (595 nm), Leitfähigkeitsmesser, 96 well Mikrotiterplatte, Pasteurpipette, Styropor-Schiffchen, Säulchen, Stativ Hintergrund: Bei jeder Proteinreinigung erhält man an etlichen Stellen Lösungen, die in ihrer Ionenstärke oder Pufferzusammensetzung für den nächsten Reinigungsschritt oder Analyse ungeeignet sind. So ist zum Beispiel nach einer Ammoniumsulfatfällung der Salzgehalt einer Probe für eine direkt anschließende Ionenaustauschchromatographie praktisch immer zu hoch. Durch gute Planung der Reinigungsstrategie kann der Experimentator zusätzliche Schritte zur Entsalzung vermeiden. Vor einer analytischen Bearbeitung der Probe (SDS-PAGE) bietet sich auch die Verwendung flüchtiger Lösungsmittelsysteme an um salzfrei zu enden und die Elektrophorese nicht zu stören (siehe Experiment B.1.). Andererseits gibt es eine Reihe von Möglichkeiten der Um- und Entsalzung, die bei gut löslichen Proteinen meist auch mit guter Ausbeute ablaufen. Zwei wichtige Methoden der Entsalzung, die Dialyse und die Siebchromatographie werden Sie in diesen Praktikum kennenlernen. Dialyse Die am längsten bekannte Entsalzungsmethode ist die Dialyse. Die wichtigste Komponente einer Dialyse ist die Dialysemembran, die kleine Moleküle frei diffundieren läßt, während größere Moleküle zurückgehalten werden. Dialysemembranen unterscheiden sich in ihrer Porengröße, dem sog. Cutoff-Wert. Dieser Cutoff-Wert gibt das Molekulargewicht der Proteine an, die zu 90% von der Membran ausgeschlossen werden. Der Cutoff-Wert gibt keine scharfe Molekulargewichtsgrenze an, sondern gibt einen Anhaltspunkt dafür, welche Molekülgrößen die Membran relativ unbehindert penetrieren können. Für die Dialyse größerer Probenvolumina füllt man die Proteinlösung in einem Dialyseschlauch, der aus Dialysemembran besteht. Der Schlauch sollte nur zu 2/3 gefüllt sein, da sich durch Wassereinwanderung während des Dialysevorganges das Volumen im Schlauch erhöht. Der mit Klammern oder Knoten an beiden Enden verschlossene Schlauch wird in ein 1

2 Becherglas mit dem gewünschten Puffer gehängt. Die Diffusionsrate wird durch den Konzentrationsgradienten der diffundierenden Teilchen, der Membranoberfläche und der Temperatur bestimmt. Für eine effektive Entsalzung sollte der Puffer gerührt und einige Male gewechselt werden um einen möglichst großen Konzentrationsgradienten an der Membranoberfläche aufrechtzuerhalten. Der Fortschritt der Entsalzung kann durch Leitfähigkeitsmessung der Puffers überprüft werden (Faustregel: 2-3 maliger Pufferwechsel mit jeweils 4-6 h Äquilibrationszeit vorzugsweise bei 4 C um die Proteinstabilität zu erhöhen). Bei weitgehender Entsalzung wie Dialyse gegen Wasser kann es passieren, daß wegen der geringen Ionenstärke die Protein teilweise ausfallen. Bei physiologischer Ionenstärke werden die Ladungen der Proteine durch Salzionen kompensiert. Je geringer die Ionenkonzentration im Lösungsmittel ist umso eher neigen die Proteine dazu ihre Oberflächenladung gegenseitig durch Aggregatbildung zu kompensieren. Große Aggregate fallen dann aus. Die Niederschläge können abzentrifugiert werden und in einem kleinen Volumen einer Lösung mit etwas höherer Inenstärke wieder gelöst werden. Für kleine Probenvolumina werden keine Dialyseschläuche mehr verwendet (Adsorptionsverluste) sondern spezielle Konstruktionen aus kleinen Probenkammern (Eppendorf-Tubes), die auf einer Seite gegen den Puffer mit einer Dialysemembran abgedichtet sind (siehe Beispiel A.1.) 2

3 Entsalzung durch Gelchromatographie Bei der Entsalzung durch Gelchromatographie werden die in der Probe enthaltenen Substanzen nach ihrer Größe getrennt (Größenausschlußchromatographie, Size-exclusion chromatography). Salze und kleine Moleküle eluieren langsam, große Moleküle eluieren zuerst von der Säule. Quervernetzte Polymere (Dextran, Polyacrylamid u.a.) bilden eine Netz- oder Porenstruktur, in deren Räume kleine Moleküle eindringen oder sie durchwandern können. Übersteigt der Eigendurchmesser der Moleküle jedoch den Porenquerschnitt, so verbleibt für diese Moleküle nur das Außenvolumen der Partikel. Alle Moleküle, die größer sind als die Porengröße (Ausschlußgröße) verhalten sich gleich und bewegen sich nur in dem äußeren Flüssigkeitsraum. Sie treten nach Durchlaufen des Volumens außerhalb der Gelpartikel (Ausschlußvolumen (void volume) = Vo) zuerst aus der Säule. Sehr kleine Moleküle und Salze eluieren nach dem Durchlauf von etwa einem Säulenvolumen (Gesamtvolumen = Vt). Im Trennbereich der Säule eluieren Moleküle der Größe nach mit einem individuellen charakteristischen Elutionsvolumen Ve. Mit Hilfe eines Diagramms Ve/Vo gegen Molekulargewicht können (nach Eichung) Molekulargewichte bestimmt werden. Folgende Parameter gilt es bei Entsalzungen durch Gelchromatographie zu beachten: Das Probenvolumen darf 5 % des Säulenvolumens nicht übersteigen, da sonst die Trennung zwischen Proteinen und Salzen nicht mehr ausreicht. Gelchromatographiesäulen sollten auch nicht mit zu hohen Proteinmengen überladen werden, was auch zu einer Vermischung von Protein und Salzbereichen führt. Die Trennung ist bei geringerer Flussrate besser Das Volumen der Ausgangsprobe wird zumindest verdreifacht, was im nächsten Schritt eine Konzentrierung nötig macht. 3

4 Aufgabenstellung der Versuche: A.1. Dialyse einer Proteinlösung (gelöstes pellet) nach Ammoniumsulfatfällung gegen H 2 O. Leitfähigkeitsbestimmung vor und nach der Dialyse. B.1. Packen einer Chromatographiesäule mit Sephadex G-25 (Polydextran- Säulenmaterial mit einer Ausschlußgröße von etwa 10 kd; entspricht der Ausschlußgröße einer Dialysemembran). B.2. Durchführung einer Gelchromatographie mit Modellsubstanzen für Makromoleküle und kleinere Moleküle. Bestimmung von Vo und Vt. B.3. Entsalzen von Proteinen aus Hasenserum (gelöstes pellet) nach Ammoniumsulfatfällung mit anschließender Leitfähigkeitsmessung und Proteinbestimmung der Fraktionen. C.1. Bestimmung der Ionenkonzentration (Leitfähigkeitsmessung) D.1. Bradford-Proteinassay mit Mikrotiterplattenphotometer Durchführung: A.1. Dialyse von Proteinlösungen kleiner Volumina In den Deckel zweier Eppendorf-Tubes wird ein großes Loch geschnitten (bereits vorbereitet). Je 200 ul Präzipitat (= gel. pellet) bzw. 4 M Ammoniumsulfat werden in die Tubes eingefüllt und zwischen Deckel und Gefäß ein in Wasser gequollenes Stück Dialysemembran (etwa 2x2 cm) eingeklemmt. Die Tubes werden in ein Styroporschiffchen umgekehrt, schwimmend in ein Becherglas mit aqua.dest. gelegt und die Luftblasen unter dem Deckel des Gefäßes entfernt. Nach erfolgter Dialyse wird die Leitfähigkeit des Außenmediums und des Innenmediums der Dialyse bestimmt (Die Leitfähigkeit sollte außen zugenommen bzw. innen abgenommen haben.). 4

5 B.1. Packen einer Chromatographiesäule mit Sephadex G-25 Sephadex G-25 ist ein Polydextran-Säulenmaterial mit einer Ausschlußgröße von 10 kd was etwa der Auschlußgröße einer Dialysemembran entspricht. Es handelt sich um trockenes pulverisiertes Säulenmaterial. Das Säulenmaterial wird in Natrium-Phosphat Puffer aufgenommen und über Nacht quellen gelassen. Bruchstücke (fines) werden abgesaugt (wird für das Praktikum vorbereitet). Das Material wird im Mikrowellenherd zum Entgasen aufgekocht. Das aufgequollene, abgesetzte Gel wird mit einer Pipette luftblasenfrei eingefüllt (3.5 ml). Sobald die gesamte Suspension in die Säule gegossen ist, wird der Ausgang geschlossen, die Säule komplett mit Puffer gefüllt und die Fritte (erleichtert die Proben und Pufferapplikation) aufgesetzt (Achtung: Einschluß von Luftblasen unbedingt vermeiden). Nach vollständigem Sedimentieren des Gels wird die Fritte vorsichtig mit einer umgekehrten blauen Spitze nach unten geschoben, bis diese eben auf dem Gelbett aufliegt, ohne dieses zu quetschen. Prüfen der Durchflußgeschwindigkeit mit Eppendorf-Tube und Uhr (sollte ~ 1 ml/min betragen). B.2. Testen der Säuleneigenschaften (Vo und Vt) mit Dextranblau und Bromphenolblau Die Trenneigenschaft der Säule wird sichtbar gemacht, indem man eine Mischung farbiger Moleküle chromatographiert. Dextranblau (MW ~ 2 *10 6 ) ist ein Vertreter großer Moleküle, Bromphenolblau (MW 691) ein Vertreter kleiner Moleküle. Bei geschlossenem Auslauf werden 100µl des Farbstoffgemisches auf die Säule aufgetragen und das Eluat in ca. 120µl (2 Tropfen) Portionen in einer 96 well Mikrotiterplatte aufgefangen. Wenn die aufgetragene Probe in das Gelbett eingewandert ist, füllt man vorsichtig (!) wenige (!) Tropfen Puffer nach, um den Rest der Probe in das Gelbett einzuwaschen. Um eine möglichst scharfe Trennung zu erreichen, ist die Startzone so schmal wie möglich zu halten. Dann gibt man reichlich Puffer auf die Säule, eluiert und notiert das Elutionsvolumen bis zum Erscheinen des ersten blauen Tropfens (=v1). Beim weiteren Eluieren bestimmt man das Volumen, das zum völligen Durchlaufen des Dextranblaus (türkis) nötig ist (=v2). Das arithmetische Mittel aus v1+v2 ergibt das Ausschlußvolumen Vo. Die Chromatographie wird fortgesetzt (Ergänzung des Elutionspuffers nicht vergessen) bis zum Erscheinen des dunkelblau gefärbten Bromphenolblaus (=v3). In analoger Weise wird nun bis zum völligen Durchlaufen der dunkelblauen Farbe weiter eluiert (=v4). Aus dem arithmetischen Mittel von v3 + v4 ergibt sich das Gesamtvolumen, das der Salzfront entspricht (= vt). Die Absorption der einzelnen Fraktionen kann bei 620 nm bestimmt werden. Man zeichne ein Elutionsdiagramm entsprechend der Abbildung: 5

6 B.3. Entsalzen von Proteinen nach Ammoniumsulfatfällung Um nach der Ammoniumsulfatfällung das Salz aus der Proteinlösung zu entfernen, wird eine Gelchromatographie durchgeführt. Analog zu Punkt B.2. werden 100 µl der gefällten Proteine (= Präzipitat = gel. pellet) aus dem Ammoniumsulfatbeispiel auf die Säule aufgetragen und mit Natrium-Phosphat Puffer eluiert. Es werden jeweils 120µl Fraktionen in einer Mikrotiterplatte (2 Tropfen) aufgefangen. Proteinhältige Fraktionen werden mittels Bradford Reagens detektiert. Der Salzgehalt wird mittels Messung der elektrischen Leitfähigkeit ermittelt. Genaue Proteinbestimmung und Leitfähigkeitsbestimmung der gepoolten entsalzten Proteinfraktionen, der gefällten Proteine und Ausfüllen der untenstehenden Tabellen (siehe Anleitung C.1. und D.1.) sind durchzuführen. Die 3 Protein Fraktionen mit der höchsten Konzentration werden gepoolt und für weitere Versuche weggefroren (wichtig! Das ist das Ausgangsmaterial für das SDS-Gel). C.1. Die Bestimmung der Ionenkonzentration (Leitfähigkeitsmessung) Eichkurve: Es soll eine Verdünnungsreihe aus gesättigtem Ammoniumsulfat (4 M) in je 15 ml H 2 O hergestellt werden. Die gemessene Leitfähigkeit wird gegen die Ionenstärke in einer doppelt logarithmischen Skala aufgetragen (siehe letzte Seite im Protokoll). Es soll eine Eichgerade entstehen, aus deren Eigenschaften man die Geradengleichung y = k*x +d ablesen bzw. errechnen kann. Mit ihrer Hilfe kann man dann weitere gemessene Leitfähigkeitswerte in Molaritäten umrechnen. 6

7 (NH 4 ) 2 SO 4 [mm] Leitfähigkeit [µs] Messung: Anschließend werden jeweils 150 µl von Präzipitat und Überstand (entspricht einer 1:100 Verdünnung) und 50µl der wahrscheinlich salzenthaltenden Chromatographiefraktionen (entspr. 1:300) in 15ml H 2 O verdünnt und die Leitfähigkeit bestimmt. Bei den Fraktionen reicht es aus, jede 4. Fraktion zu messen, es sollten sich also ca. 10 bis 12 Messpunkte ergeben. Ausserdem soll auch die Leitfähigkeit vom Ausgangspellet und Überstand und die Werte der Dialyse bestimmt werden (siehe Tabelle unten). Die Ionenkonzentration kann aus der Eichkurve abgelesen bzw. errechnet werden, die Werte werden in die Tabelle eingesetzt. Fraktionen Verdünnungsfaktor H 2 O bidest control NaH 2 PO 4 1:300 Protein-Präzipitat 1:100 Protein-Überstand 1:100 Aussenmedium der AS: Dialyse Pellet: Innenmedium der AS: 1: 100 Dialyse Pellet: 1:100 Gepoolte Protein- Fraktion 1:300 Leitfähigkeit [ms] (NH 4 ) 2 SO 4 [mm] Volumen Salzhältige Fraktionen # (jede 4. Fraktion): 1:300 für alle Fraktionen 7

8 D.1. Bradford-Proteinbestimmung im Mikrotiterplattenphotometer Pipettiere für jede wahrscheinlich Protein enthaltende Fraktion 200 ul/well Bradford- Färbereagens (ist bereits 1+4 verdünnt) in eine 96 well Platte (dabei sollte man sich nach der Verteilung des Dextran-Blau-Farbstoffes richten). Ein well wird nur mit Färbereagens befüllt und dient als 0-Wert der Messung. Ausserdem wird auch der ursprüngliche Proteingehalt von pellet und Überstand bestimmt (beide Proben müssen dafür 1:10 in Puffer verdünnt werden). Jeweils 8 µl der Proben werden dem Färberagens zugefügt, sorgfältig gemischt und 2 min bei R.T. inkubiert. Die Messung erfolgt bei 620 nm im Mikrotiterplattenphotometer. Der 0-Wert muss von allen gemessenen Werten abgezogen werden. Es gilt die Formel: OD 0.4 = 1 mg/ml OD [620 nm] Volumen [µl] Gesamt Protein [mg] 0-Wert Bradford Protein-Präzipitat (AS) Überstand (AS) Fraktion #: Benötigte Lösungen: Natrium-Phosphat Puffer, ph 7.2 (0.200 mol/l) 8

9 Verdünnungsreihe Ammoniumsulfat ms ,1 mm 9