ENGLISH. REAADS Anti-dsDNA Test Kit For In Vitro Diagnostic Use

Transkript

1 ENGLISH REAADS Anti-dsDNA Test Kit For In Vitro Diagnostic Use Immunometric Enzyme Immunoassay for the quantitative determination of IgG autoantibodies to double-stranded DNA INTENDED USE Anti-dsDNA is an indirect solid phase enzyme immunoassay (ELISA) for the quantitative measurement of IgG class autoantibodies against double-stranded DNA in human serum or plasma. The assay is intended for in vitro diagnostic use only as an aid in the diagnosis of Systemic Lupus Erythematosus (SLE). SUMMARY AND EXPLANATION OF THE ANTI-dsDNA TEST Autoimmune diseases are characterized by the occurence of antibodies against own antigenic structures - so-called autoantibodies. Presence of autoantibodies to native Desoxyribonucleic acids (n-dna, dsdna, double-stranded DNA) is typical for the clinical picture of Systemic Lupus erytrematodes (SLE). Antibodies against dsdna belong to the group of Anti Nuclear Antibodies (ANA), which are directed against various structures of the nucleus of the cell. They appear in a variety of rheumatoid diseases. Besides the ANA antibodies another group of autoantibodies is of interest, which are directed against the so-called Extractable Nuclear Antigens (ENA). The ARA criteria of the American Rheumatism Association provide an extensive diagnostic scheme for the diagnosis of Systemic Lupus erythematodes (SLE). In case that at least 4 of the eleven ARA criteria are fulfilled, SLE is highly predictive [8]. Antibodies to dsdna are found during the active phases of SLE, where the serum concentration exhibits positive correlation to the severity of the disease. An ongoing therapy may be monitored by the aid of autoantibody determination. Diagnostic sensitivity of the anti-dsdna determination in cases of SLE is approximately 91 % combined with a diagnostic specificity of nearly 96 percent. Antibodies against DNA can be differentiated into two groups: 1. antibodies, that bind only to native double-stranded DNA (dsdna) 2. antibodies recognizing single-stranded DNA (ssdna) too. Measurement of anti nuclear antibodies (ANA, or anti nuclear factor (ANF) by indirect immunofluorescence test (IFT) is widely accepted as screening method in suspected SLE. Since in some stages of the diseases or during therapy IFT sometimes gives false results, a more specific test system is needed. Negative IFT for anti nuclear antibodies does not exclude the presence of anti-dsdna antibodies, since the antigenic structures may masked by other structures. Furthermore the ANA titers determined by IF test show only week correlation to the severity of the disease. Most antibodies against dsdna are directed against the phosphate units of DNA. Thus, these autoantibodies also bind to DNA single strains. For quantitation of anti-dsdna it has to be proven, that the antigen preparation exhibits no contamination with single stranded DNA. Autoantibodies against single-stranded DNA are mainly directed against its basic compound, which in the native DNA is masked inside the helical structure. In serum of SLE patients antissdna antibodies are found with a frequency of up to 87 percent during acute phases and 43 percent during inactive phases. SLE like diseases are caused by some drugs. For differential diagnosis of drug-induced LE the determination of antissdna is a valuable diagnostic tool. In drug-induced LE anti-ssdna is elevated in more the 50 percent of alle cases. Furthermore elevated anti-ssdna serum concentrations have been reported in Mononucleosis, Hepatitis and various forms of Leukemia. PRINCIPLE OF THE TEST Human recombinant double-stranded DNA (dsdna) is bound to microwells. Antibodies to this antigen, if present in diluted serum or plasma, bind to the respective antigen. Washing of the microwells removes unspecific serum and plasma components. Horseradish peroxidase (HRP) conjugated anti-human IgG immunologically detects the bound patient antibodies forming a conjugate/antibody/antigen complex. Washing of the microwells removes unbound conjugate. An enzyme substrate in the presence of bound conjugate hydrolyzes to form a blue color. The addition of an acid stops the reaction forming a yellow end-product. The intensity of this yellow color is measured photometrically at 450 nm. The amount of colour is directly proportional to the concentration of IgG antibodies present in the original sample. 1

2 WARNINGS AND PRECAUTIONS For In Vitro Diagnostic Use 1. All reagents of this kit are strictly intended for in vitro diagnostic use only. 2. Do not interchange kit components from different lots. 3. Components containing human serum were tested and found negative for HBsAg, HCV, HIV1 and HIV2 by FDA approved methods. No test can guarantee the absence of HBsAg, HCV, HIV1 or HIV2, and so all human serum based reagents in this kit must be handled as though capable of transmitting infection. 4. Avoid contact with the TMB (3,3,5,5 -Tetramethyl-benzidine). If TMB comes into contact with skin, wash thoroughly with water and soap. 5. Avoid contact with the Stop Solution which is acid. If it comes into contact with skin, wash thoroughly with water and seek medical attention. 6. Some kit components (i.e. Controls, Sample buffer and Buffered Wash Solution) contain Sodium Azide as preservative. Sodium Azide (NaN 3 ) is highly toxic and reactive in pure form. At the product concentrations (0.09%), though not hazardous. Despite the classification as non-hazardous, we strongly recommend using prudent laboratory practices (see 8, 9,10.). 7. Some kit components contain Proclin 300 as preservative. When disposing reagents containing Proclin 300, flush drains with copious amounts of water to dilute the components below active levels. Wear disposable gloves while handling specimens or kit reagents and wash hands thoroughly afterwards. 8. Do not pipette by mouth. 9. Do not eat, drink, smoke or apply makeup in areas where specimens or kit reagents are handled. 10. Avoid contact between the buffered Peroxide Solution and easily oxidized materials; extreme temperature may initiate spontaneous combustion. Observe the guidelines for performing quality control in medical laboratories by assaying controls and/or pooled sera. During handling of all kit reagents, controls and serum samples observe the existing legal regulations. Irritating to eyes (R 36). Avoid contact with skin (S 24). Avoid contact with eyes (S 25). In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice (S 26). If swallowed, seek medical advice immediately and show this container or label (S 46). Irritant Xi. Biological Risk. REAGENTS Store at 2-8 C. Do Not Freeze. Each REAADS Anti-dsDNA 96-microwell Test Kit contains the following reagents (volumes may vary depending on kit size and configuration): Qty.1 Divisible microplate consisting of 12 modules of 8 wells each, coated with human recombinant double-stranded DNA (dsdna). Ready to use. 6 vials, 1.5 ml each combined Calibrators with IgG class Anti-dsDNA antibodies (A-F) in a serum/buffer matrix (PBS, BSA, NaN3 <0,1% (w/w) containing: IgG: 0; 12.5; 25; 50; 100; and 200 IU/ml. Ready to use. 2 vials, 1.5 ml each Anti-dsDNA Controls in a serum/buffer matrix (PBS, BSA, NaN3 <0,1% (w/w) positive (1) and negative (2), for the respective concentrations see the enclosed package insert. Ready to use. 1 vial, 20 ml Sample buffer (Tris, NaN3 <0,1% (w/w), yellow, concentrate (5x). 1 vial, 15 ml Enzyme conjugate solution (PBS, PROCLIN 300 <0,5% (v/v), (light red) containing polyclonal anti-human IgG; labelled with horseradish peroxidase. Ready to use. 1 vial, 15 ml TMB substrate solution. Ready to use. 1 vial, 15 ml Stop solution (contains acid). Ready to use. 1 vial, 20 ml Wash solution (PBS, NaN3 <0,1% (w/w), concentrate (50x). * CAUTION: Contains sodium azide 2

3 STORAGE AND STABILITY 1. Store the kit at 2-8 C. 2. Keep microplate wells sealed in a dry bag with desiccants. 3. The reagents are stable until expiration of the kit. 4. Do not expose test reagents to heat, sun or strong light during storage usage. 5. Diluted sample buffer and wash buffer are stable for at least 30 days when stored at 2-8 C. MATERIALS PROVIDED: REAADS Anti-dsDNA Test Kit; see Reagents for a complete listing. MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED: Equipment Microplate reader capable of endpoint measurements at 450 nm Multi-Channel Dispenser or repeatable pipette for 100 µl Vortex mixer Pipettes for 10 µl, 100 µl and 1000 µl Laboratory timing device Data reduction software Preparation of reagents Distilled or deionised water Graduated cylinder for 100 and 1000 ml Plastic container for storage of the wash solution SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION 1. Collect whole blood specimens using acceptable medical techniques to avoid hemolysis. 2. Allow blood to clot and separate the serum by centrifugation. 3. Test serum should be clear and non-hemolysed. Contamination by hemolysis or lipemia is best avoided, but does not interfere with this assay. 4. Specimens may be refrigerated at 2-8 C for up to five days or stored at -20 C up to six months. 5. Avoid repetitive freezing and thawing of serum samples. This may result in variable loss of autoantibody activity. 6. Testing of heat-inactivated sera is not recommended. PROCEDURAL NOTES 1. Do not use kit components beyond their expiration dates. 2. Do not interchange kit components from different lots. 3. All materials must be at room temperature (20-28 C). 4. Have all reagents and samples ready before start of the assay. Once started, the test must be performed without interruption to get the most reliable and consistent results. 5. Perform the assay steps only in the order indicated. 6. Always use fresh sample dilutions. 7. Pipette all reagents and samples into the bottom of the wells. 8. To avoid carryover contamination, change the tip between samples and different kit controls. 9. It is important to wash microwells thoroughly and remove the last droplets of wash buffer to achieve best results. 10. All incubation steps must be accurately timed. 11. Control sera or pools should routinely be assayed as unknowns to check performance of the reagents and the assay. 12. Do not re-use microplate wells. For all calibrators, the respective concentrations are provided on the labels of each vial. Using these concentrations a calibration curve may be calculated to read off the patient results semi quantitatively. 3

4 REAGENT PREPARATION PREPARATION OF SAMPLE BUFFER Dilute the contents of each vial of the sample buffer concentrate (5x) with distilled or deionized water to a final volume of 100 ml prior to use. Store refrigerated: stable at 2-8 C for at least 30 days after preparation or until the expiration date printed on the label. PREPARATION OF WASH SOLUTION Dilute the contents of each vial of the buffered wash solution concentrate (50x) with distilled or deionized water to a final volume of 1000 ml prior to use. Store refrigerated: stable at 2-8 C for at least 30 days after preparation or until the expiration date printed on the label. SAMPLE PREPARATION Dilute all patient samples 1:100 with sample buffer before assay. Therefore combine 10 µl of sample with 990 µl of sample buffer in a polystyrene tube. Mix well. Controls/Calibrators are ready to use and need not be diluted. ASSAY PROCEDURE 1. Prepare a sufficient number of microplate modules to accommodate controls/calibrators and prediluted patient samples. 2. Pipette 100 µl of controls/calibrators and prediluted patient samples in duplicate into the wells A SA SE P1 P5 B SA SE P1 P5 SA-SF standards A-F C SB SF P2.. P1, P2..C patient sample 1,2... D SB SF P2.. C1 positive control E SC C1 P3 C2 negative control F SC C1 P3 G SD C2 P4 H SD C2 P4 3. Incubate for 30 minutes at room temperature (20-28 C). 4. Discard the contents of the microwells and wash 3 times with 300 µl of wash solution. 5. Dispense 100 µl of enzyme conjugate into each well. 6. Incubate for 15 minutes at room temperature. 7. Discard the contents of the microwells and wash 3 times with 300 µl of wash solution. 8. Dispense 100 µl of TMB substrate solution into each well. 9. Incubate for 15 minutes at room temperature. 10. Add 100 µl of stop solution to each well of the modules and incubate for 5 minutes at room temperature. 11. Read the optical density at 450 nm and calculate the results. Bi-chromatic measurement with a reference at nm is recommended. The developed colour is stable for at least 30 minutes. Read optical densities during this time. AUTOMATION The REAADS Anti-dsDNA Test Kit is suitable for use on open automated ELISA processors. The test procedure detailed above is appropriate for use with or without automation. RESULTS This test is only valid if the values for Positive Control (1) and Negative Control (2) as well as the optical density at 450nm for the Calibrator A and F complies with the respective range indicated on the Quality Control Certificate enclosed to each test kit. If any of these criteria is not met, the results are invalid and the test should be repeated. CALCULATION OF RESULTS For Anti-dsDNA IgG a 4-Parameter-Fit with lin-log coordinates for optical density and concentration is the data reduction method of choice. 4

5 RECOMMENDED LIN-LOG PLOT First calculate the averaged optical densities for each calibrator well. Use lin-log graph paper and plot the averaged optical density of each calibrator versus the concentration. Draw the best fitting curve approximating the path of all calibrator points. The calibrator points may also be connected with straight line segments. The concentration of unknowns may then be estimated from the calibration curve by interpolation. EXPECTED VALUES In a normal range study with serum samples from healthy blood donors the following ranges have been established with the Anti-dsDNA tests: Anti-dsDNA IgG [IU/ml] Cut-Off: 20 Positive results should be verified concerning the entire clinical status of the patient. Also every decision for therapy should be taken individually. It is recommended that each laboratory establishes its own normal and pathological ranges of serum Anti-dsDNA. The values above should be regarded as guidelines only. PERFORMANCE CHARACTERISTICS PARALLELISM In dilution experiments sera with high antibody concentrations were diluted with sample buffer and assayed in the Anti-dsDNA kit. Sample Dilution Observed (IU/ml) Expected (IU/ml) O/E 1 1/100 1/200 1/400 1/ ,2 50,6 24,9 11,2 52,1 26,1 13,0 97% 95% 85% 2 1/100 1/200 1/400 1/ ,3 68,9 35,2 18,2 67,7 33,8 16,9 102% 104% 108% PRECISION (REPRODUCIBILITY) Statistics for coefficients of variation (CV) were calculated for each of three samples from the results of 24 determinations in a single run for Intra-Assay precision. Run-to-run precision was calculated from the results of 5 different runs with 6 determinations of each sample: Intra-Assay Inter-Assay Sample No Mean (IU/ml) CV [%] Sample No Mean (IU/ml) CV [%] , , , , , ,2 SENSITIVITY The lower detection limit for Anti-dsDNA IgG has been determined at 1.0 IU/ml. SPECIFICITY The solid phase is coated with recombinant double-stranded DNA (dsdna). Due to a newly developed coating process the antigenic structure is conserved and during coating no sequences of single-stranded DNA occur. Therefore the Anti-dsDNA IgG test kit recognizes only autoantibodies specific for double-stranded DNA. CALIBRATION The quantitative test system for Anti-dsDNA IgG autoantibodies is calibrated against the WHO reference preparation for human Anti-dsDNA IgG Wo/80 finding a concentration of 200 IU/ml when reconstituted in 0.5 ml. 5

6 INCUBATION SCHEME LIMITATIONS OF THE TEST The anti-dsdna concentration values obtained from this assay are an aid to diagnosis only. Each physician must interpret these results in light of the patient s history, physical findings, and other diagnostic procedures. An elevated serum level of anti-dsdna antibodies is only one of 11 criteria to be considered for a diagnosis of SLE. 1 Some apparently normal individuals and individuals with other rheumatic diseases may produce measurable amounts of antidsdna antibodies; however, the levels are generally much lower than in patients with SLE. 8 INTERFERING SUBSTANCES No interference has been observed with haemolytic (up to 1000 mg/dl), lipemic (up to 3 g/dl triglycerides) or bilirubin (up to 40 mg/dl) containing sera. Nor have any interfering effects been observed with the use of anticoagulants. However for practical reasons it is recommended that grossly hemolyzed or lipemic samples should be avoided. WARRANTY This product is warranted to perform as described in this package insert. Corgenix, Inc. disclaims any implied warranty of merchantability or fitness for a particular use, and in no event shall Corgenix, Inc. be liable for consequential damage. For Technical or Customer Service in the United States, phone Outside the United States, phone , fax or contact a Corgenix authorized distributor. 6

7 DEUTSCH REAADS Anti-dsDNA Test Kit In-vitro-Diagnostikum Immunometrischer Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von IgG Autoantikörpern gegen Doppelstrang DNA (dsdna) KURZBESCHREIBUNG Anti-dsDNA ELISA ist ein indirekter Enzymimmunoassay für den Nachweis von Antikörpern gegen doppelsträngige DNA in humanem Serum als eine Hilfe bei der Diagnose von Systemischen Lupus Erythematodes (SLE). Dieser Assay ist ausschließlich für den diagnostischen In-vitro Gebrauch bestimmt. EINLEITUNG Der systemische Lupus erythematodes (SLE) ist eine chronische Multisystemerkrankung unbekannter Ätiologie, die durch einen vaskulitischen Organbefall charakterisiert ist. In Anbetracht der Schwierigkeiten einer Diagnose "systemischer Lupus erythematodes" wurde im Jahre 1982 vom American College of Rheumatology (ACR) ein Schema mit insgesamt 11 Diagnose-kriterien für den SLE herausgegeben. Schmetterlingserythem - auf beiden Wangen Diskoider Lupus - erythematöse, erhabene Flecken Photosensitivität - nach Sonnenexposition rasch auftretender Hautausschlag Schleimhautulzerationen - schmerzlose orale oder nasopharyngeale Ulzerationen Arthritis - nicht-erosive Arthritis an mehr als zwei peripheren Gelenken Serositis - dokumentierte Pleuritis oder Perikarditis Glomerulonephritis - anhaltende Proteinurie > 0,5g/Tag oder Zylindrurie Neurologische Symptome - Krampfanfälle oder Psychosen Hämatologische Befunde - immunhämolytische Anämie oder Leukopenie oder Lymphopenie oder thrombozytopenie Immunologische Befunde - positiver LE-Zell-Test oder dsdna-antikörper-nachweis oder Sm-Antikörper-Nachweis oder falsch positive Luesreaktion Antinukleäre Antikörper - abnorm hoher ANA-Titer bei fehlender Einnahme von Medikamenten, die zu einem medikamenteninduzierten SLE führen können. Mindestens vier dieser Kriterien müssen gleichzeitig oder im Verlauf eines beliebigen Zeitraums vorhanden sein, um mit einer etwa 95%igen Wahrscheinlichkeit die Diagnose eines SLE stellen zu können. Unter den labordiagnostischen Parametern bildet der Nachweis von antinukleären Anti-körpern (ANA) auf der HEp-2 Zelle als serologische Eingangsdiagnostik einen der Grundpfeiler in der Diagnose des SLE. Ein weiterer Schritt bei der Diagnosesicherung ist die Untersuchung auf krankheitsspezifische Markerantikörper. Wie auch der Nachweis von ANA stellt der Nachweis von Autoantikörpern gegen die doppelsträngige Form der DNA (dsdna) ein weiteres ACR-Kriterium für die Lupus-Diagnostik dar. Diese Autoantikörper haben eine diagnostische Spezifität für den SLE von ca. 96% sowie eine diagnostische Sensitivität von ca. 91%. Antikörper gegen dsdna werden überwiegend in den aktiven Sta-dien eines SLE beobachtet. Im Gegensatz zu allen anderen antinukleären Antikörpern korreliert bei den dsdna Antikörpern die Höhe der Serumkonzentration sehr gut mit der Krankheitsaktivität. An-hand der Antikörperkonzentration läßt sich sowohl die Therapie kontrollieren als auch erneute Krankheitsschübe voraussehen. INDIKATIONEN Eine Bestimmung von dsdna Antikörpern sollte durchgeführt werden bei: Eingangsdiagnostik des systemischen Lupus erythematodes Differentialdiagnostik bei systemischen Autoimmunerkrankungen Frühdiagnostik drohender Exazerbationen Therapiekontrolle 7

8 METHODIK Anti-dsDNA ELISA ist ein indirekter Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen doppelsträngige DNA (dsdna). Die Kavitäten der Mikrotiterplatte sind mit rekombinanter doppelsträngiger DNA beschichtet. Im Serum vorhandene Antikörper können an die immobilisierten Antigene binden. Durch Waschen werden nicht gebundene Serum-Antikörper entfernt. Enzym-markierte Detektions-Antikörper (HRP-konjugierte Antihuman IgG-Antikörper) heften sich anschließend an die Oberflächen-gebundenen Autoantikörper. Überschüssige Detektionsantikörper werden durch Waschen entfernt. Ein Enzymsubstrat wird in Anwesenheit von gebundenen Detektionsantikörpern zu einem blauen Reaktionsprodukt hydrolysiert. Die Zugabe von Säure stoppt die Reaktion ab und das Reaktionsprodukt verfärbt sich gelb. Die Intensität der Gelbfärbung kann photometrisch bei 450/620 nm bestimmt werden. Die Farbentwicklung ist direkt proportional zur gesuchten Autoantikörper-Konzentration. Auf einer Mikrotiterplatte können 96 Bestimmungen durchgeführt werden. Jede Mikrotiterplatte setzt sich aus 12 einzelnen Streifen mit jeweils 8 Kavitäten zusammen. Bei Bedarf können die Streifen in einzelne Kavitäten aufgeteilt werden. HINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN Alle Reagenzien dieser testpackung sind ausschließlich für den diagnostischen In-vitro Gebrauch bestimmt. Einzelne komponenten verschiedener Chargen und Testbestecke sollten nicht ausgetauscht werden. Die auf der verpackung und den Etiketten der einzelnen Komponenten angegebenen verfallsdaten sind zu beachten. Der Testkit enthält Reagenzien, die aus humanen Serum- oder Plasmabestandteilen hergestellt sind. Die Ausgangsreagenzien wurden mit Immunoassaymethoden auf die Parameter HIV 1, HIV2, HCV und auf das Hepatitis B untersucht und für negativ befunden. Das Substrat TMB (3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidin) ist toxisch bei Verschlucken und bei Hautkontakt. Bei Hautkontakt sofort mit viel Wasser und Seife abwaschen. Ein Kontakt mit der Säure enthaltenden Stopp-Lösung ist zu vermeiden. Bei Hautkontakt unverzüglich und kräftig mit Wasser abwaschen. Alle Geräte sofort nach Gebrauch gründlich reinigen. Einige Reagenzien dieses Testbestecks enthalten zum Schutz gegen bakterielles Wachstum Natriumazid als Konservierungsmittel; daher ist der Kontakt mit der Haut und/oder Schleimhäuten zu vermeiden. Während der Durchführung des Tests sollten Handschuhe getragen werden, um den Kontakt mit Reagenzien, Kontrollproben und Untersuchungsmaterial zu vermeiden. Die Proben dürfen nicht mit dem Mund pipettiert werden. Essen, trinken oder rauchen während der Bearbeitung der Kits vermeiden. Vermeiden Sie den Kontakt der Peroxidlösung mit leicht oxidierbaren Materialien. Extreme Temperaturschwankungen können zum spontanen Zerfall des Peroxids führen. LIEFERUMFANG DES TESTS Menge 1 Eine Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten. Jede Kavität ist mit rekombi nanter, doppelsträngiger DNA beschichtet. 6 Fläschchen à 1.5 ml Standardreihe mit Anti-dsDNA Antikörpern (IgG) in Serum/Puffer Matrix (PBS, NaN3 <0.1% (w/w). Anti-dsDNA IgG: 0, 12.5, 25, 50, 100, 200 IU/ml. gebrauchsfertig. 2 Fläschchen à 1,5 ml Anti-dsDNA Positivkontrolle (1) und Negativkontrolle (2) in Serum/Puffer Matrix (PBS, NaN3 <0,1% (w/w). gebrauchsfertig. 1 Flasche à 20 ml Probenpuffer (Tris, NaN3 <0,1% (w/w), gelb, Konzentrat (5x). 1 Flasche à 15 ml Konjugat; anti-human IgG, Peroxidase konjugiert, rosa (PBS, PROCLIN 300 <0.5% (v/v). gebrauchsfertig. 1 Flasche à 15 ml TMB Substratlösung, 3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidin. gebrauchsfertig. 1 Flasche à 15 ml Stopplösung (enthält Säure). gebrauchsfertig. 1 Flasche à 20 ml Waschpuffer (PBS, NaN3 <0.1% (w/w), Konzentrat (50x). *ACHTUNG: Enthält Natriumazid 8

9 LAGERUNG UND STABILITÄT Lagerung bei 2-8 C im Kühlschrank. Kavitäten/Streifen müssen in einem luftdicht verschlossenen Beutel mit Trockenmittel gelagert werden. Die Testreagenzien sind bei sachgemässer Lagerung bis zum Verfallsdatum des Testbestecks verwendbar. Testreagenzien vor Hitze und direktem Sonnenlicht schützen. Verdünnter Probenpuffer und Waschpuffer sind bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. ERFORDERLICHE LABORGERÄTE Plattenphotometer mit einem optischen Filter der Meßwellenlänge 450 nm (ggf. Referenzwellenlänge von 620 nm) Mehrkanalpipette oder Multipette Vortex Mixer Mikropipetten mit Einmalspitzen für 10 µl, 100 µl and 1000 µl destilliertes oder entionisiertes Wasser Meßzylinder für 100 ml und 1000 ml Gefäß zur Aufbewahrung der Waschlösung PROBENENTNAHME UND LAGERUNG Blutproben sind nach den geltenden Richtlinien und Verfahren zu gewinnen. Blut gerinnen lassen und Serum durch Zentrifugation gewinnen. Die Verwendung hämolytischer, lipämischer und ikterischer Seren ist zu vermeiden. Serum- und Plasmaproben können gekühlt bei 2-8 C bis zu 5 Tage aufbewahrt werden. Ist eine längere lagerung beabsichtigt, sollten die Proben aliquotiert und bei -20 C tiefgefroren werden. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden! Die Verwendung hitzeinaktivierter Seren wird nicht empfohlen. ALLGEMEINE HINWEISE Komponenten dieses Tests dürfen nicht nach Ablauf des Verfallsdatums benutzt werden. Einzelne Komponenten verschiedener Chargen und Testbestecke dürfen nicht ausgetauscht werden. Alle Reagenzien und Proben sollten vor Beginn des Testansatzes 30 Minuten bei Raumtemperatur bereitgestellt werden. Nach Beginn muss der Test gemäß der Vorgaben (Inkubationszeiten etc.) durchgeführt werden, um verlässliche und konstante Ergebnisse zu liefern. Immer frische Probenverdünnungen verwenden. Alle Reagenzien und Proben auf den Boden der Kavitäten pipettieren. Um Verschleppung zu verhindern sollten proben und die verschiedenen Kontrollen jeweils mit einer frischen pipettenspitze pipettiert werden. Zur laufenden Kontrolle der Richtigkeit wird empfohlen, jeden Ansatz anhand von kontrollseren zu überprüfen. Die Kavitäten der Mikrotiterplatten sind nicht wiederverwendbar. VORBEREITUNG DER REAGENZIEN Probenpuffer Der Inhalt jede Flasche des Probenpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 100 ml zu verdünnen. Der verdünnte Probenpuffer ist bei einer Lagerung bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Waschlösung Der Inhalt jede Flasche des Waschpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml (1 Liter) zu verdünnen. Die verdünnte Waschlösung ist bei einer Lagerung bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Probenvorbereitung Die Bestimmung der Autoantikörper wird im Serum oder Plasma durchgeführt. Die Serum- bzw. Plasmaproben werden vor der Messung 1:100 mit Probenpuffer verdünnt. Mikrotiterplatte Es werden je nach Probenaufkommen die nötige Anzahl von Streifen bzw. Kavitäten in den Rahmen der Mikrotiterplatte eingesetzt. Es sollte unbedingt darauf geachtet werden, daß die verpackte Mikrotiterplatte bereits Raumtemperaur angenommen hat, ehe die Folienverpackung geöffnet wird. Die nicht benötigten Streifen und Kavitäten werden in dem wiederverschließbaren Beutel bei 2-8 C im Kühlschrank aufbewahrt. Achtung: Werden bei einem Assayansatz nicht alle Kavitäten/Streifen benötigt, muß der Rahmen der Mikrotiterplatte aufbewahrt werden. Nach Beendigung eines Testansatzes sollten die verbrauchten Kavitäten/Streifen verworfen und der Rahmen der Mikrotiterplatte in den Kit zurück gelegt werden. 9

10 ASSAYDURCHFÜHRUNG Eine ausreichende Anzahl von Kavitäten bzw. Mikrotiterplatten-Module zum Ansatz von Standardreihe, Kontrolle und Patientenproben vorbereiten. Doppelbestimmungen werden empfohlen. Jeweils 100 µl, Kontrollen und vorverdünnte Patientenproben entsprechend der Plattenbelegung in die Mikrotiterplatte pipettieren. Vorschlag für ein Pipettierschema: A SA SE P1 P5 B SA SE P1 P5 C SB SF P2 P.. D SB SF P2 P.. SA-SF Standards A bis F E SC C1 P3 P1, P2... Patientenprobe 1, 2... F SC C1 P3 C1: Positivkontrolle G SD C2 P4 C2: Negativkontrolle H SD C2 P4 Inkubation: 30 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) Kavitäten entleeren und insgesamt 3 Mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden. Jeweils 100 µl Enzymkonjugatlösung in die Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettieren. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) Kavitäten entleeren und insgesamt 3 Mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden. Jeweils 100 µl TMB Substratlösung in die Kavitäten pipettieren. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) 100 µl Stopplösung in jede Kavität pipettieren und die Platte ca. 5 Minuten stehen lassen. Messung der optischen Dichte aller Proben im Plattenphotometer innerhalb von 30 Minuten bei einer Wellenlänge von 450 nm. AUSWERTUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE QUALITÄTSKONTROLLE Der Test ist nur gültig, wenn die Werte für die Positivkontrolle (1) und Negativkontrolle (2) sowie die optische Dichte bei 450nm Standard A und Standard F originelle Unterkunft angegebenen Bereich liegen die Qualitätskontroll-Zertifikat mit dem Kit beigelegt. Wenn eines dieser Kriterien nicht erfüllt sind, sind die Testergebnisse ungültig und der Test sollte wiederholt werden. AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE Eine Standardkurve erhält man durch Auftragen der gemessenen optischen Dichte gegen die vorgegebene Standardkonzentration. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE Im Rahmen einer umfangreichen Normbereichstudie wurden für den Anti-dsDNA IgG ELISA die folgenden Werte ermittelt: Anti-dsDNA IgG [IU/ml] Cut-Off: 20 10

11 TESTCHARAKTERISTIKA KALIBRIERUNG Das quantitative Meßsystem für Anti-dsDNA Antikörper ist gegen die Referenzpräparation der WHO für Doppelstrang- DNA Wo/80 kalibriert. Die WHO Referenzpräparation entspricht 200 IU/ml. LINEARITÄT Für die Bestimmung der Linearität wurden Seren mit hohen Antikörperkonzentrationen in steigenden Verdünnungsstufen (Verdünnung im Probenpuffer) im Assay eingesetzt. Fünf Verdünnungen von zwei Proben wurden auf zwei Anti-dsDNA Kits gemessen. Die folgende Tabelle zeigt die Mittelwerte und die Verdünnungsfaktor korrigierte Wiederfindung. Sample Dilution Observed [U/ml] 1 1: Expected [U/ml] O/E 1: % 1: % 1: % 2 1: : % 1: % 1: % PRÄZISION/REPRODUZIERBARKEIT In der untenstehenden Tabelle sind die Variationskoeffizienten (VK %), die für die Intra- und die Inter-Assay-Varianz des Anti-dsDNA Kits ermittelt wurden, aufgeführt. Zur Ermittlung der Intra-Assay-Varianz wurden drei Seren mit unterschiedlichen Anti-dsDNA Konzentrationen jeweils 9-fach auf einer Platte gemessen. Für die Bestimmung der Inter-Assay-Varianz wurden drei Proben mit unterschiedlichen Anti-dsDNA Konzentrationen auf drei Platten jeweils 24fach gemessen. Intra-Assay Inter-Assay Sample No Mean Mean CV (%) Sample No (IU/ml) (IU/ml) CV (%) SENSITIVITÄT Die untere Nachweisgrenze für Anti-dsDNA beträgt 1,0 IU/ml. SPEZIFITÄT Die Mikrotiterplatte ist mit humaner, rekombinant hergestellter Doppelstrang-DNA (dsdna) nach einem neu entwickelten, ladungsneutralen Verfahren beschichtet. Bei der Beschichtung bleibt die antigene Struktur unter Vermeidung von Einzelstrangsequenzen erhalten. Der Anti-dsDNA Kit erfaßt daher nur spezifisch Autoantikörper, die gegen dsdna gerichtet sind. GRENZEN DES VERFAHRENS Das Ergebnis des Anti-dsDNA ELISA ist im Zusammenhang mit der Anamnese und der daraus resultierenden Fragestellung zu sehen. INTERFERENZEN Es konnten keine Interferenzen mit hämolytischen (bis 1000 mg/dl), lipämischen (bis 3 g/dl Triglyceride) oder Seren mit erhöhten Bilirubinwerten (bis 40 mg/dl) beobachtet werden. 11

12 FRANÇAIS REAADS Anti-dsDNA Test Kit Pour utilisation diagnostique in vitro Dosage immunoenzymatique (ELISA) pour la détermination quantitative des anticorps IgG/IgM anti-dsdna dans le sérum humain. UTILISATION ENVISAGÉE Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de autoanticuerpos tipo IgG contra DNA de doble cadena (dsdna) PRINCIPE DU TEST Le test est un dosage immunoenzymatique indirect. Des sérums échantillons, étalons et de contrôle dilués sont incubés dans des micropuits enduits de dsdna, laissant les anticorps anti-dsdna présents dans l échantillon réagir avec l antigène immobilisé. Après élimination par lavage des protéines non liées du sérum, des anticorps spécifiques de IgG et IgM humaines marqués à la peroxydase du raifort (PR) sont ajoutés pour former des complexes avec les anticorps liés à dsdna. Après un deuxième lavage, le conjugué enzyme-anticorps lié est dosé par addition d une unique solution contenant de la tétraméthylbenzidine (TMB) et du peroxyde d hydrogène (H 2 O 2 ) à titre de substrat chromogène. La couleur se développe dans les puits à une intensité proportionnelle à la concentration d anticorps anti-dsdna dans le sérum. Le résultat s obtient par lecture de la D.O. (densité optique ou absorbance) de chaque puits dans un spectrophotomètre. Un sérum étalon est fourni, dont la concentration d anticorps anti-dsdna est exprimée soit en unités AU/ml (unité arbitraire normalisée sur une préparation de référence du Centers for Disease Control [Centres de contrôle des maladies]), soit en UI/ml (unité internationale normalisée sur une préparation de l Organisation mondiale de la santé). La division de la valeur de la concentration de l étalon par la valeur de l absorbance de cet étalon donne un facteur de conversion. La multiplication des valeurs de D.O. des contrôles et des échantillons par le facteur de conversion donne les valeurs des concentrations d anticorps, exprimées en unités soit AU/ml, soit UI/ml. RÉACTIFS Stocker entre 2 et 8 C. Ne pas congeler. Chaque kit de test Anti-dsDNA REAADS pour 96 micropuits contient les réactifs suivants (les volumes peuvent varier selon la taille et la configuration du kit): Qté : 1 Microplaque sécable composée de 12 barrettes de 8 puits, recouverts d'adn doublebrin (dsdna) humain recombinant. Prêt à l'emploi. 6 flacons, 1.5ml chacun Calibrateurs (A-F) avec des anticorps anti-dsdna de classe IgG dans une matrice sérum/tampon (PBS, BSA, NaN3<0.1% (pds/pds) aux concentrations de 0, 12.5, 25, 50, 100 et 200 UI/ml IgG. Prêt à l'emploi. 2 flacons, 1.5ml chacun Contrôles anti-dsdna positif (1) et négatif (2) dans une matrice sérum/tampon (PBS, BSA, NaN3<0.1% (pds/pds). Leurs concentrations sont indiquées sur le certificat de contrôle. Prêt à l'emploi. 1 flacon, 20 ml Tampon de dilution des échantillons (Tris, NaN3<0.1% (pds/pds), jaune, concentré 5x. 1 flacon, 15 ml Conjugué (PBS, PROCLIN 300 <0.5% (vol/vol)), rouge clair, contenant des anticorps polyclonaux anti-igg humain, marqués à la peroxydase de raifort. Prêt à l'emploi. 1 flacon, 15 ml Solution substrat TMB. Prêt à l'emploi. 1 flacon, 15 ml Solution d'arrêt (acide). Prêt à l'emploi. 1 flacon, 20 ml Solution de lavage (PBS, NaN3<0.1% (pds/pds), concentrée 50x * * ATTENTION : Contient de l azide de sodium 12

13 PRECAUTIONS D'USAGE Tous les réactifs de cette trousse sont strictement réservés à un usage de diagnostic in vitro. Ne pas mélanger les réactifs provenant de trousses de lots différents. Les composés contenant du sérum humain se sont révélés négatifs pour les antigènes HBs et HIV selon des méthodes approuvées par la FDA. Cependant, comme aucune méthode ne peut garantir l'absence d'antigène HBs ou HIV, tous les réactifs contenant du sérum humain doivent être manipulés comme des produits potentiellement infectieux. Eviter le contact direct avec le TMB (3,3,5,5 -tétraméthyl-benzidine). Le cas échéant, laver abondam-ment à l'eau et au savon. Eviter le contact direct avec la solution d'arrêt qui contient de l'acide. Le cas éché- ant, laver abondamment à l'eau et consulter un médecin. Certains réactifs, comme les contrôles, le tampon de dilution des échantillons et la solution de lavage, contiennent de l'azide de sodium comme conservateur. L'azide de sodium pur (NaN3) est hautement toxique. Aux concentrations utilisées dans nos réactifs, il n'est cependant pas dangereux. Nous recom-mandons malgré tout de bien respecter les bonnes pratiques de laboratoire (voir 8., 9., 10). Certains réactifs contiennent du Proclin 300 comme conservateur. Lors d'une éventuelle élimination de réactifs via l'évier, veiller à bien rincer afin de diluer en dessous des concentrations actives. Pour manipuler les échantillons ou les réactifs, porter des gants jetables et se laver abondamment les mains après usage. Ne pas pipeter avec la bouche. Ne pas manger, boire, fumer ou se maquiller dans les zones de manipulation des échantillons et des réactifs. Eviter le contact entre la solution tamponnée au peroxyde et des matériaux facilement oxydables ; une température élevée peut provoquer une combustion spontanée.suivre les recommandations pour réaliser le contrôle qualité adapté aux laboratoires d'analyse médica-le, en testant des sérums de contrôle et/ou des sérums poolés. Respecter les réglementations légales concernant la manipulation de tous les réactifs, les contrôles et les échantillons de sérum. STOCKAGE ET STABILITE Stocker la trousse entre 2 et 8 C. Conserver les barrettes non utilisées dans le sachet scellé avec les dessicants. Les réactifs sont stables jusqu'à la date de validité de la trousse. Ne pas exposer les réactifs à la chaleur, au soleil ou à la lumière vive pendant le stockage ou lors de leur utilisat Une fois dilués, les tampons de dilution des échantillons et de lavage sont stables pendant au moins 30 jours à 2-8 C. MATERIEL REQUIS MAIS NON FOURNI Divers matériels de laboratoire Lecteur de microplaque pouvant réaliser des mesures en point final à 450 nm. Pipette multicanaux ou multi-pipette pour 100 µl Mélangeur Vortex Pipettes de 10 µl, 100 µl et 1000 µl Minuterie Logiciel d'exploitation des données matériel pour la préparation des réactifs Eau distillée ou désionisée Eprouvette graduée de 100 et 1000 ml Récipient plastique pour le stockage de la solution de lavage OBTENTION, STOCKAGE ET MANIPULATION DES ECHANTILLONS Prélever les échantillons de sang total en utilisant les techniques médicales appropriées pour éviter l'hémolyse. Laisser le sang sédimenter et séparer le sérum par centrifugation. Une hémolyse ou une lipémie doit être évitée mais ne modifie pas le résultat de ce test. Les échantillons peuvent être stockés à 2-8 C pendant 5 jours maximum ou à -20 C pendant 6 mois maximum. Eviter les congélations et décongélations répétées des échantillons de sérum, celà pourrait occasionner une perte aléatoire d'activité auto-anticorps. Les manipulations réalisées sur sérums inactivés par la chaleur ne sont pas recommandées. 13

14 RECOMMANDATIONS Ne pas utiliser les réactifs au delà de leur date de validité. Ne pas mélanger les réactifs provenant de trousses de lots différents. Utiliser les réactifs à température ambiante (20-28 C). Tous les réactifs et les échantillons doivent être prêts avant de commencer le test. L'analyse doit être réalisée sans interruption pour obtenir des résultats fiables et cohérents. Respecter strictement l'ordre des étapes. Toujours utiliser des dilutions d'échantillons fraîchement préparées. Pipeter tous les réactifs et échantillons dans le fond des puits. Pour éviter les contaminations croisées, changer d'embout entre chaque échantillon, contrôle et calibrateur. Il est important de laver abondamment les puits et de veiller à enlever les dernières gouttes de tampon de lavage pour obtenir des résultats optimaux. Toutes les étapes d'incubation doivent être minutées précisément. Des sérums ou pools de contrôle doivent être inclus régulièrement dans les séries de dosage, pour vérifier le bon déroulement du test. Ne pas réutiliser les puits d'une microplaque. Les concentrations sont indiquées sur les étiquettes de chaque flacon de calibrateur. Une courbe de calibration peut être tracée à partir de ces concentrations pour obtenir un résultat quantitatif. PREPARATION DES REACTIFS TAMPON DE DILUTION DES ÉCHANTILLONS Diluer le contenu de chaque flacon de concentré (5x) de tampon de dilution des échantillons avec de l'eau distillée ou désionisée, pour obtenir un volume final de 100 ml. Conserver au réfrigérateur : le tampon est stable à 2-8 C pendant au moins 30 jours après la préparation ou jusqu'à la date d'expiration indiquée sur l'étiquette. SOLUTION DE LAVAGE Diluer le contenu de chaque flacon de concentré (50x) de solution de lavage avec de l'eau distillée ou désionisée pour obtenir un volume final de 1000 ml. Conserver au réfrigérateur : le tampon est stable à 2-8 C pendant au moins 30 jours après la préparation ou jusqu'à la date d'expiration indiquée sur l'étiquette. ECHANTILLONS PATIENT Diluer les échantillons au 1/100e avec du tampon de dilution avant de commencer le test. Pour cela, mélanger 10 µl d'échantillon avec 990 µl de tampon échantillon dans un tube en polystyrène. Bien homogénéiser. Les contrôles et calibrateurs sont prêts à l'emploi et ne nécessitent pas de dilution. MODE OPERATOIRE Préparer un nombre suffisant de barrettes pour pouvoir déposer tous les contrôles et échantillons dilués. Distribuer 100 µl de calibrateurs, de contrôles et d'échantillons dilués en double dans les puits. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante (20-28 C) Aspirer le contenu des puits et laver 3 fois avec 300 µl de solution de lavage. Distribuer 100 µl de conjugué dans chaque puits. Incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Aspirer le contenu des puits et laver 3 fois avec 300 µl de solution de lavage. Distribuer 100 µl de TMB dans chaque puits. Incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Ajouter 100 µl de solution d'arrêt dans chaque puits et incuber 5 minutes à température ambiante. Lire la densité optique à 450 nm et calculer les résultats. Il est recommandé de réaliser une mesure bichromatique avec une référence entre 600 et 690 nm. La couleur obtenue est stable pendant au moins 30 minutes. Lire la densité optique pendant ce laps de temps A SA SE P1 P5 B SA SE P1 P5 SA-SF standards A-F C SB SF P2.. P1, P2..C patient sample 1,2... D SB SF P2.. C1 positive control E SC C1 P3 C2 negative control F SC C1 P3 G SD C2 P4 H SD C2 P4 14

15 RESULTATS VALIDATION DU TEST Le test n'est valable que si les valeurs de contrôle positif (1) et le contrôle négatif (2) ainsi que la densité optique à 450 nm de l'étalon A et F est conforme woth la gamme respective indiquée sur le certificat de contrôle de la qualité fournie avec chaque kit de test. Si aucun de ces critères ne sont pas respectées, les résultats ne sont pas valides et le test doit être répété. Courbe lin-log recommandée Utiliser du papier millimétré en lin-log et porter les densités optiques moyennes de chaque calibrateur en fonction de la concentration. Tracer la meilleure courbe passant par tous les points. Les points de calibration peuvent aussi être reliés point par point. La concentration des échantillons est extrapolée à partir de la courbe. Interprétation des résultats Anti-dsDNA IgG (UI/ml) normal: < 20 positive: > 20 Les résultats positifs doivent être validés avec les données cliniques du patient. Chaque décision thérapeutique doit être adaptée individuellement. PERFORMANCES DE LA TROUSSE Linéarité : % Précision: % Répétabilité : % Sensibilité : 1.0 UI/ml LIMITATIONS DU TEST Les valeurs de concentration anti-dsdna obtenues avec ce dosage ne constituent qu une aide au diagnostic. Chaque médecin doit interpréter ces résultats au vu des antécédents du patient, de son examen médical et des autres procédures de diagnostic. Un taux sérique élevé d anticorps anti-dsdna n est qu un des 11 critères à prendre en compte dans un diagnostic de LES. 1 Certains sujets apparemment normaux et des sujets présentant une autre maladie rhumatismale peuvent produire des quantités mesurables d anticorps anti-dsdna ; ces taux sont toutefois bien plus bas qu en présence de LES. 8 GARANTIE Ce produit est garanti fonctionner ainsi que décrit dans la notice jointe au conditionnement. Corgenix, Inc. dénie toute garantie implicite d aptitude à la vente ou de conformité à une utilisation particulière et Corgenix, Inc. ne sera en aucun cas responsable d aucun dommage consécutif. Pour contacter le service technique ou client aux États-Unis : téléphone Au dehors des États- Unis : téléphone ; télécopie ; sinon, contactez un distributeur autorisé de Corgenix. 15

16 ESPAÑOL REAADS Anti-dsDNA Test Kit Para uso diagnóstico in vitro Un enzimoinmunoensayo (ELISA) para la determinación cuantitativa de anticuerpos IgG/IgM anti-dsadn en suero humano. INDICACIONES Detección y cuantificación de anticuerpos IgG/IgM antiácido desoxirribonucleico bicatenario (dsadn) como ayuda en el diagnóstico y tratamiento del lupus eritematoso diseminado (LED). PRINCIPIO DE LA PRUEBA La prueba se utiliza como un ELISA indirecto. Las diluciones de las muestras de suero, los calibradores y los controles se incuban en micropocillos recubiertos de dsadn, lo que permite que los anticuerpos anti-dsadn presentes en las muestras reaccionen con el antígeno inmovilizado. Tras la eliminación, mediante lavado, de las proteínas no unidas, se añaden anticuerpos específicos para IgG e IgM humanas marcados con peroxidasa (HRP), que forman complejos con los anticuerpos unidos al dsadn. Tras un segundo paso de lavado, el conjugado enzima retenida-anticuerpo se analiza añadiendo una solución de tetrametilbencidina y peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ) como sustrato cromógeno. La intensidad con la que se desarrolla el color en los pocillos es propor-cional a la concentración sérica de anticuerpos anti-dsadn. Los resultados se obtienen leyendo la D.O. (densidad óptica o absorbancia) de cada pocillo en un espectrofotómetro. Se suministra un suero calibrador con la concentración de anticuerpos anti-dsadn expresada en UA/ml (unidades arbitrarias que se han estandarizado respecto a una preparación de referencia de los Centers for Disease Control estadounidenses) o en UI/ml (unidades internacionales que se han estandarizado respecto a la preparación de referencia de la Organización Mundial de la Salud). Dividiendo el valor de la concentración del calibrador por el valor de absorbancia de dicho calibrador se obtiene un factor de conversión. Los valores de D.O. de los controles y las muestras de pacientes se multiplican por el factor de conversión para obtener las concentraciones de anticuerpos, expresadas en UA/ml o UI/ml. REACTIVOS Consérvelos a entre 2 y 8 C. No los congele. Cada equipo de determinación de anticuerpos anti-dsadn REAADS de 96 micropocillos contiene los siguientes reactivos (los volúmenes pueden variar dependiendo del tamaño y la configuración del equipo): CONTENIDO DEL KIT 1 Microplaca divisible compuesta por 12 tiras de 8 pocillos cada una, recubiertas con DNA humano recombinante de doble cadena. Listo para el uso. 6 viales, 1.5 ml c/u Con calibradores formados por anticuerpos tipo IgG Anti-dsDNA (A-F) en una matriz sérica tamponada (PBS, BSA, NaN3 <0,1% (w/w) conteniendo: IgG: 0; 12.5; 25; 50; 100; and 200 IU/ml. Listo para el uso. 2 viales, 1,5 ml c/u Con controles anti-dsdna en una matriz sérica tamponada (PBS, BSA, NaN3 <0,1% (w/w) positivo (1) y negativo (2), de concentraciones especificadas en la documentación incluída en el certificado de análisis. Listo para el uso. 1 vial, 20 ml Tampón de muestras (Tris, NaN3 <0,1% (w/w), amarillo, concentrado (5x). 1 vial, 15 ml Conjugado enzimático (PBS, PROCLIN 300 <0,5% (v/v)), (rojo débil) conteniendo un anticuerpo policlonal anti-igg humana marcado con peroxidasa de rábano. Listo para su uso. 1 vial, 15 ml Solución substrato TMB. Listo para su uso. 1 vial, 15 ml Solución de paro (contiene ácido). Listo para su uso. 1 vial, 20 ml Solución de lavado (PBS, NaN3 <0,1% (w/w), concentrado (50x). * PRECAUCIÓN: Contiene azida sódica 16

17 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Todos los reactivos del presente kit están estrictamente dirigidos a su uso in vitro. No intercambiar componentes de kits de diferentes lotes. El test contiene componentes de origen humano, que han resultado negativos para HBsAg y HIV mediante métodos aprobados por la FDA. Ningún test puede sin embargo garantizar la ausencia de HBsAg o HIV, por lo tanto todos los reactivos dy derivados de suero humano deben tratarse como material potencialmente capaz de transmitir infecciones. Evitar el contacto con el TMB (3,3,5,5 -Tetramethyl-benzidine). En caso de entrar en contacto con TMB, lavar la zona afectada con agua abundante y jabón. Evitar el contacto con la solución de paro que contiene ácido. En caso de entrar en contacto con dicho ácido, lavar la zona afectada con agua abundante y ponerse inmediatamente en contacto con personal médico especializado. Algunos componentes del kit (Controles, Tampón de muestra, Tampón de lavado) contienen azida sódica como conservante. La Azida sódica (NaN3) es altamente tóxica y reactiva en forma pura. En las concentraciones en que s encuentra en el producto no puede considerarse peligrosa. A pesar de ello, se recomienda utilizar practicas de laboratorio prudentes (ver 8., 9., 10). Algunos componentes del kit contienen Proclin 300 como preservativo. Cuando se desechen los productos conteniendo Proclin 300, dejar correr abundante agua para diluir el componente por debajo de los niveles activos. Utilizar guantes desechables para manejar muestras o reactivos del kit y lavarse las manos cuidadosamente al finalizar. No pipetear con la boca. No comer, beber, fumar o aplicarse maquillaje en áreas donde se manejen muestras o reactivos del kit. Evitar el contacto entre la solución tamponada de peróxido de hidrógeno y materiales fácilmente oxidables; las temperaturas elevadas pueden iniciar la combustión espontánea. Observe las directrices de control de calidad en laboratorios médicos procesando controles o pool de sueros. Durante el manejo de todos los reactivos del kit, controles y muestras de suero deben observarse las regulaciones legales existentes. CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD Conservar el kit a 2-8 C. Mantener las tiras selladas en una bolsa con desecantes. Los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad del kit. No exponer los reactivos al calor, luz solar o a fuentes luminosas intensas, durante su conservación o manejo. El tampón de muestras y el tampón de lavado, una vez diluidos son estables durante al menos 30 días, si se conservan a 2-8 C. MATERIAL NECESARIO Equipamiento Lector de microplacas capaz de leer a punto final a 450 nm Pipeta multicanal, o de repetición para 100 µl Vortex mixer Pipetas para 10 µl, 100 µl and 1000 µl Reloj de laboratorio Software para cálculo de resultados Preparación de reactivos Agua destilada o desionizada Contenedor graduado para 100 y 1000 ml Contenedor de plástico para la solución de lavado diluida RECOGIDA DE MUESTRAS Y PREPARACION Obtener muestras de sangre total utilizando técnicas médicas aceptadas y evitando la hemólisis. Dejar coagular y separa el suero por centrifugación. El suero debe ser claro y no-hemolizado. Debe evitarse la contaminación por hemólisis o lipemia, aunque no interfieren en el ensayo. Las muestras deben refrigerarse a 2-8 C un máximo de cinco días o guardarse a -20 C hasta seis meses. Evitar congelaciones y descongelaciones de las muestras de suero ya que pueden repercutir en perdida variable de la actividad de los autoanticuerpos. No es recomendable procesar suero inactivados por calor. 17

18 NOTAS TECNICAS No usar los componentes del kit después de la fecha de caducidad. No intercambiar componentes de diferentes lotes. Todos los componentes deben ser acondicionados a temperatura ambiente antes de su uso (20-28 C) Preparar todos los reactivos y muestras antes de empezar el ensayo. Una vez iniciado es test debe realizarse sin interrupción para obtener resultados fiables y consistentes. Procesar todos los pasos del test en el orden indicado. Utilizar siempre las diluciones de muestra recién preparadas. Pipetear los reactivos y muestras en el fondo del pocillo. Para eliminar arrastre, cambiar las puntas de pipeta entre las muestras y los controles. Es importante lavar exaustivamente los pocillos y eliminar las últimas gotas de tampón de lavado para obtener los mejores resultados. Los tiempos de incubación deben controlarse cuidadosamente. Se recomienda procesar rutinariamente sueros de control o pools como muestras para validar los reactivos de cada ensayo. Nunca deben reutilizarse los pocillos. La concentración correspondiente a cada calibrador viene indicada en la etiqueta de cada vial. Se calcula una curva de calibración con dichas concentraciones para obtener un resultado semi-cuantitativo de las muestras. PREPARACIÓN DE REACTIVO PREPARACIÓN DEL TAMPÓN DE MUESTRAS Diluir el contenido del vial de tampón de muestras concentrado (5x) con agua destilada o desionizada hasta un volumen final de 100 ml antes de su uso. Se puede conservar en refrigerador a 2-8ºC durante al menos 30 días después de su preparación o hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE LAVADO Diluir el contenido del vial de solución de lavado concentrado (50x) con agua destilada o desionizada hasta un volumen final de 1000 ml antes de su uso. Se puede conservar en refrigerador a 2-8ºC durante al menos 30 días después de su preparación o hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS Diluir las muestras de paciente 1:100 con tampón de muestra antes del ensayo. Mezclar 10 µl de muestra con 990 µl de tampón de muestra en un tubo de poliestireno. Agitar convenientemente. Los controles/ Calibradores se presentan listos para su uso y no deben ser diluidos. PROCEDIMIENTO Preparar el número suficiente de tiras de la microplaca para disponer los calibradores, controles y muestras prediluidas. Pipetear 100 µl de calibradores, controles y muestras prediluidas en los pocillos por duplicado. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-28 C). Vaciar los pocillos y lavar 3 veces con 300 µl de solución de lavado. Dispensar 100 µl de conjugado en cada pocillo. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente (20-28 C). Vaciar los pocillos y lavar 3 veces con 300 µl de solución de lavado. Dispensar 100 µl de substrato TMB en cada pocillo. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente (20-28 C). Añadir 100 µl de solución de paro a todos los pocillos e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Leer la densidad óptica a 450 nm y calcular los resultados. Se recomienda la medida bicromática con un filtro de referencia de nm.el color desarrollado en la reacción es estable durante 30 minutos. Leer la densidad óptica durante este periodo A SA SE P1 P5 B SA SE P1 P5 SA-SF standards A-F C SB SF P2.. P1, P2..C patient sample 1,2... D SB SF P2.. C1 positive control E SC C1 P3 C2 negative control F SC C1 P3 G SD C2 P4 H SD C2 P4 18

19 INTERPRETACION DE RESULTADOS CONTROL DE CALIDAD La prueba sólo es válida si los valores de control positivo (1) y el Control Negativo (2), así como la densidad óptica a 450 nm para el Calibrador A y F cumple valió la pena el rango correspondiente indicada en el Certificado de Control de Calidad que acompaña a cada equipo de prueba. Si alguno de estos criterios no se cumplen, los resultados no son válidos y la prueba debe repetirse. CÁLCULO DE RESULTADOS Para Anti-dsDNA se recomienda un gráfíco en escala semilogaritmica para una curva 4 parámetros que se ajusta a la relación entre densidad óptica y concentración. También son adecuados Smoothed Spline y Log-log. CURVA SEMILOGARÍTMICA RECOMENDADA Calcular primero las densidades ópticas promedio para cada calibrador. Utilizar papel semilogarítmico y definir una gráfica de la densidad óptica promedio frente a la concentración de cada calibrador. Dibujar la curva de mejor ajuste según los puntos de cada calibrador. Los puntos de calibración pueden también conectarse mediante segmentos individuales. La concentración de las muestras problema se obtendrá por interpolación en la gráfica así obtenida. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS En un estudio de rango de normalidad con muestras de suero de donantes de sangre sanos se establecieron los siguientes rangos para los test Anti-dsDNA: Anti-dsDNA IgG (IU/ml) negativo: < 20 positivo: > 20 Los resultados positivos deben verificarse contemplando el status clínico completo del paciente. Cualquier decisión terapéutica deberá ser tomada de manera individual. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de normalidad y sus rangos patológicos. Los valores indicados más arriba deben usarse solamente como guía. CARACTERISTICAS DE FUNCIONAMIENTO Paralelismo: % Precision (Reproducibilidad ): Intra-Ensayo: %; Inter-Ensayo: % Sensibilidad: 1.0 IU/ml LIMITACIONES DE LA PRUEBA Las concentraciones de anticuerpos anti-dsadn obtenidas en este ensayo constituyen únicamente una ayuda diagnóstica. Cada médico debe interpretar estos resultados basándose en los antecedentes del paciente, en los datos obtenidos en la exploración física y en otros procedimientos diagnósticos. La alta concentración sérica de anticuerpos anti-dsadn es tan sólo uno de los 11 criterios requeridos para un diagnóstico de LED. 1 Algunas personas aparentemente normales y personas con otras enfermedades reumáticas pueden producir cantidades mensurables de anticuerpos antidsadn; no obstante, las concentraciones son generalmente muy inferiores a las de las personas que padecen LED. 8 GARANTÍA Se garantiza que este producto funcionará según se describe en este prospecto. Corgenix, Inc. desautoriza cualquier garantía implícita de comerciabilidad o aptitud para un uso particular, y en ningún caso Corgenix, Inc. se hará responsable de daños emergentes. Para obtener servicio técnico o de atención al cliente en los EE.UU., llame al Fuera de los EE.UU., llame al , envíe un fax al , o póngase en contacto con un distribuidor autorizado de Corgenix. 19

20 ITALIANO REAADS Anti-dsDNA Test Kit Per uso diagnostico in vitro Un dosaggio immunoenzimatico ELISA per la determinazione quantitativa degli anticorpi anti-dsdna della classe delle IgG/IgM nel siero umano. USO PREVISTO Per la rilevazione e la determinazione quantitativa degli anticorpi della classe delle IgG/IgM diretti contro l acido desossiribonucleico a doppia elica (dsdna) nel quadro della diagnosi e della gestione del lupus eritematoso sistemico (LES). PRINCIPIO DEL DOSAGGIO L analisi va eseguita come un test immunoenzimatico ELISA indiretto. I campioni di siero, i calibratori e i controlli diluiti vengono incubati in micropozzetti rivestiti con dsdna, consentendo agli anticorpi anti-dsdna presenti nel campione di reagire con l antigene immobilizzato. Dopo la rimozione mediante lavaggio delle proteine sieriche non legate, vengono aggiunti gli anticorpi specifici per le IgG e le IgM umane marcati con perossidasi di rafano (HRP), per dar luogo alla formazione di complessi con gli anticorpi legati al dsdna. Dopo un ulteriore lavaggio, il coniugato enzima-anticorpo legato viene dosato mediante aggiunta di una singola soluzione contenente tetrametilbenzidina (TMB) e perossido di idrogeno (H 2 O 2 ) come substrato cromogeno. Nei pozzetti si sviluppa una colorazione di intensità proporzionale alla concentrazione sierica degli anticorpi anti-dsdna. I risultati si ottengono leggendo in uno spettrofotometro la densità ottica (o assorbanza) di ciascun pozzetto. Il kit include un siero di calibrazione con la concentrazione di anticorpi anti-dsdna espressa in AU/ml (unità arbitrarie standardizzate in base a una preparazione di riferimento del Centers for Disease Control) o in IU/ml (unità internazionali standardizzate in base a una preparazione di riferimento dell Organizzazione Mondiale della Sanità). Dividendo il valore della concentrazione del calibratore per il valore dell assorbanza di tale calibratore si ottiene un fattore di conversione. I valori di densità ottica dei controlli e dei campioni dei pazienti vengono moltiplicati per il fattore di conversione per ottenere i valori delle concentrazioni anticorpali espressi in AU/ml o IU/ml. REAGENTI Conservare a 2-8 C. Non congelare. Ciascun kit di analisi REAADS per gli anticorpi anti-dsdna a 96 micropozzetti contiene i seguenti reagenti (i volumi possono variare a seconda delle dimensioni e della configurazione del kit). Micropiastra a pozzetti separabili costituita da 12 strip da 8 pozzetti ciascuno, sensibilizzata con dsdna umane recombinante. Pronta all'uso. 6 flaconi da 1,5 ml cad. Calibratori contenenti anticorpi di classe IgG Anti-dsDNA in matrice serica tamponata (PBS, BSA, Sodio Azide< 0,1%(p/p) alle seguenti concentrazioni di IgG: 0; 12.5; 25; 50; 100; 200 IU/ml. Pronti all'uso. 2 flaconi da 1,5 ml cad. Controllo positivo (1) e negativo (2) Anti-dsDNA in matrice serica tamponata (PBS, BSA, Sodio Azide< 0,1% (p/p); le rispettive concentrazioni sono riportate nel certificato di analisiillustrativo. Pronti all'uso. 1 flacone da 20 ml Diluente campioni (TRIS, Sodio Azide <0,1% p/p), giallo, concentrato 5X 1 flacone da 15 ml Coniugato (PBS, Proclin 300 <0.5 % v/v), rosa, contenente anticorpi policlonali anti- IgG umane coniugati con perossidasi di rafano. Reagente pronto all'uso 1 flacone da 15 ml TMB Substrato. Reagente pronto all'uso. 1 flacone da 15 ml Soluzione Stoppante (contiene acido). Reagente pronto all'uso. 1 flacone da 20 ml Tampone di lavaggio (PBS, Sodio Azide <0,1% p/p),concentrato 50X ATTENZIONE: Contiene sodio azide 20

21 AVVERTENZEE PRECAUZZIONI Tutti i reagenti del kit si intendono per esclusivo uso diagnostico in vitro. Non scambiare reagenti del kit con altri aventi lotto diverso da quelli presenti nel kit stesso. Reagenti contenenti siero umano sono stati testati con esito negativo per la presenza di HBsAg e HIV, con kit approvati dalla FDA. Evitare il contatto con TMB (3,3', 5-5'-Tetrametilbenzidina); in caso di contatto di TMB con la pelle, lavare accuratamente con acqua e sapone. Evitare il contatto con la Stop Solution, che contiene acido. In caso di contatto con la pelle, lavare accuratamente con acqua e richiedere l'intervento medico. Determinati reagenti (controlli, tampone del campione, soluzione di lavaggio tamponata) contengono sodio azide come conservante. Sodio azide è un composto altamente tossico e reattivo allo stato puro, tuttavia alle concentrazioni di utilizzo non è pericoloso. Nonostante la classificazione di materiale non pericoloso, vengono raccomandate procedure di laboratorio prudenti (vedi punti 8., 9., 10.). L'eliminazione dei reagenti contenenti Proclin 300 come conservante, deve avvenire con una abbondante lavaggio delle tubature idrauliche al fine di diluire il componente sotto il livello di attività. Indossare guanti monouso nella manipolazione di campioni umani e dei reagenti contenuti nel kit, e lavare quindi le mani abbondantemente con acqua. Non pipettare con la bocca. Non mangiare, bere, fumare, usare cosmetici nelle aree dove i reagenti vengono usati. Evitare il contatto tra la soluzione tamponata di Acqua Ossigenata e materiali facilmente ossidabili; temperature elevate possono provocare combustione spontanea. Osservare le line guida per l'esecuzione delle procedure di controllo qualità nei laboratori medici, utilizzando materiali di controllo e pool di sieri di controllo. Osservare tutte le disposizioni di legge vigenti nella manipolazione dei reagenti contenuti nel kit, controlli, e campioni da analizzare. CONSERVAZIONE E STABILITÁ Conservare il kit a 4-8 C. Mantenere la micropiastra sigillata in una busta, con essicante, a tenuta di umidità. I reagenti sono stabili fino alla scadenza riportata sul kit. Mantenere i reagenti al riparo da calore, sole, luce solare diretta durante la conservazione e l'uso. Il diluente campioni e il tampone di lavaggio sono stabili almeno 30 gg, se conservati a 2-8 C, dopo la loro preparazione. MATERIALE NECESSARIO Strumentazione Lettore di micropiastre con possibilità di misurazione end point, a 450 nm Dispensatore multicanale o pipetta sequenziale da 100 ml Pipette da 10, 100, 1000 ml Agitatore di tipo vortex Orologio da laboratorio Software per l'elaborazione dei dati Preparazione dei reagent Acqua distillata o deionizzata Cilindri graduati da 100 m e 1000 ml Bottiglie di plastica per la conservazione della soluzione di lavaggio RACCOLTA, CONSERVAZIONE, MANIPOLAZIONE DEI CAMPIONI Il prelievo di sangue deve essere eseguito con le modalità necessarie per evitare l'emolisi del campione. Attendere che il campione sia coagulato e separare il siero per centrifugazione. Verificare che il siero sia non emolizzato. Sebbene emolisi e lipidi non interferiscono nella determinazione,è opportuno l'uso di campioni non lipemici e non emolizzati. I campioni possono essere conservati a 4-8 C fino a 5 giorni, oppure a -20 C fino a 6 mesi. Evitare di congelare e scongelare ripetutamente i campioni di siero.ciò può causare una perdita di attività auto anticorpale. Non è raccomandato testare sieri inattivati col calore. 21

22 AVVERTENZE OPERATIVE Non usare kit scaduti. Non intercambiare componenti di kit con diversi numeri di lotto. Tutti i materiali devono essere conservati a temperatura ambiente. Preparare tutte le soluzioni di lavoro prima di iniziare il ciclo analitico; questo deve essere completato senza interruzioni al fine di ottenere risultati affidabili e coerenti. Utilizzare la procedura analitica indicata. Usare sempre campioni freschi. Pipettare reagenti e campioni sul fondo del pozzetto. Lavare accuratamente i pozzetti e rimuovere tutte le goccioline di tampone di lavaggio al fine di ottenere i risultati più corretti. Rispettare accuratamente i tempi di incubazione. Cambiare i puntali dopo la dispensazione di ciascun campione e dei controlli, al fine di evitare fenomeni di trascinamento. I sieri e i pool serici di controllo vanno trattati come campioni anonimi al fine di valutare le prestazioni dei reagenti. Non riutilizzare piastre già usate. Le concentrazioni dei calibratore sono riportate sulle rispettive etichette; utilizzando queste concentrazioni è possibile costruire una curva di taratura ed ottenere dei risultati semiquantitativi. PREPARAZIONE DEI REAGENTI PREPARAZIONE DEL DILUENTE CAMPIONI Prima dell'uso, diluire il contenuto di ciascun flacone di Diluente campioni concentrato 5X con acqua distillata o deionizzata fino a un volume finale di 100 ml. Conservare in frigorifero. la stabilità è di almeno 30 gg a 2-8 C dalla data di preparazione, o fino alla data di scadenza stampata in etichetta. PREPARAZIONE DEL TAMPONE DI LAVAGGIO Prima dell'uso, diluire il contenuto di ciascun flacone di tampone di lavaggio concentrato 50X con acqua distillata o deionizzata fino a un volume finale di 1000 ml. Conservare in frigorifero: la stabilità è di almeno 30 gg a 2-8 C dalla data di preparazione, o fino alla data di scadenza stampata in etichetta. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Diluire tutti i campioni 1:100 con il Diluente campioni. Dispensare 10 µl di campione in 990 µl di Diluente campioni in una provetta di plastica. Miscelare bene. I controlli/calibratore sono pronti per l'uso e non necessitano di diluizioni. ESECUZIONE DEL TEST Prelevare il numero di strip necessario per l'analisi in funzione del numero di campioni, controlli e calibratori Dispensare nei rispettivi pozzetti 100 µl dei calibratori, controlli e campioni prediluiti. Incubare per 30' a temperatura ambiente (20-28 C) Svuotare i pozzetti e lavare 3 volte con 300 µl di soluzione di lavaggio Dispensare 100 µl di coniugato in ciascun pozzetto Incubare per 15' a T.A. Svuotare i pozzetti e lavare 3 volte con 300 µl di soluzione di lavaggio Dispensare 100 µl di TMB in ciascun pozzetto Incubare per 15' a T.A. Dispensare 100 µl di Soluzione Stoppante a ciascun pozzetto Leggere la Densità Ottica a 450 nm e calcolare il risultato. E' raccomandata una lettura in bicromatismo con una lunghezza d'onda di riferimento a nm. Il colore è stabile per almeno 30'. Leggere la Densità Ottica in questo periodo di tempo A SA SE P1 P5 B SA SE P1 P5 SA-SF standards A-F C SB SF P2.. P1, P2..C patient sample 1,2... D SB SF P2.. C1 positive control E SC C1 P3 C2 negative control F SC C1 P3 G SD C2 P4 H SD C2 P4 22

23 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI CONTROLLO DI QUALITÀ test è valido solo se i valori per il controllo positivo (1) e il controllo negativo (2) così come la densità ottica a 450 nm per il calibratore A e F rispetta woth rispettivi intervalli indicato nel certificato di controllo di qualità racchiusi in ogni kit di prova. Se uno qualsiasi di questi criteri non sono soddisfatti, i risultati sono validi ed il test deve essere ripetuto. CALCOLO DEI RISULTATI L'elaborazione della curva dose/risposta raccomandata è quella logaritmica lineare a 4 parametri; possono essere utilizzate anche curve log-log o Smoothed spline CURVA LOGARITMICA LIN-LOG Calcolare la D.O. media per ciascun pozzetto contenente i calibratori. Usare una carta diagrammata lin-log, riportare la media delle D.O e le rispettive concentrazioni, quindi estrapolare la curva. Alternativamente, costruire una curva collegando punto per punto i singoli punti di calibrazione. La concentrazione dei campioni da analizzare è determinata tramite la curva di calibrazione così estrapolata. Interpretazione dei risultati Anti-dsDNA IgG (IU/ml) normale: < 20 positivo: > 20 I risultati positivi devono essere confermati con un esame clinico del paziente. Ogni decisione clinica deve essere presa sulla base di una valutazione clinica individuale. PRESTAZIONI DEL Parallelismo: % Precisione: Intra-assay: %; Inter-assay: % Sensibilità: 1.0 IU/ml LIMITI DEL DOSAGGIO I valori della concentrazione degli anticorpi anti-dsdna ottenuti mediante il presente dosaggio costituiscono esclusivamente uno strumento diagnostico ausiliario. Il medico deve interpretare questi risultati tenendo contob dell anamnesi del paziente, degli esami clinici e di altre procedure diagnostiche. Un livello elevato di anticorpi antidsdna nel siero è solo uno degli undici criteri diagnostici per il LES. 1 Alcuni soggetti apparentemente normali e soggetti affetti da altre malattie reumatiche possono generare quantità rilevabili di anticorpi anti-dsdna; tuttavia, tali livelli sono generalmente molto più bassi rispetto a quelli dei pazienti affetti da LES. 8 GARANZIA Si garantisce che le prestazioni di questo prodotto corrispondono a quando descritto nel presente foglietto illustrativo. La Corgenix, Inc. non rilascia alcuna garanzia implicita di commerciabilità o idoneità a uno scopo particolare, e in nessuna circostanza la Corgenix, Inc. si riterrà responsabile di eventuali danni indiretti. Per ottenere assistenza tecnica o per rivolgersi al servizio assistenza clienti, negli Stati Uniti chiamare il numero Dagli altri Paesi, chiamare il numero , inviare un fax al numero o rivolgersi a un distributore Corgenix autorizzato. 23

24 REFERENCES 1. Condemi, John J. The Autoimmune Diseases. The Journal of the American Medical Associason 1987; Vo. 258, no. 20: Harley, John B. and Gaither, Kimberley K. Autoantibodies. Rheumatic Disease Clincs of Norht America 1988; Vo. 14, no. 1: Hartung, K, and Deicher, H. Systemischer Lupus erythematodes. Allergologie 1985; Jahrgang 8, Nr. 7: Feltkamp, T. E. W. et al. The first international standard for antibodies to double stranded DNA. Annals of the Rheumatic Diseases 1988; Vo. 47: Leon, S. A. et al. Avidity of Antibodies in SLE. Arthritis and Rheumatism 1977; Vo. 20, no.1: Smeenk, R. et al. Avidity of Antibodies to dsdna: Comparison of IFT on Crithidia Luciliae, Farr Assay andpeg Assay. The Journal of Immunology 1982, Vo. 128, no. 1: Smeenk, R. et al. Specificity in Systemic Lupus Erythematosus of Antibodies to doublestranded DNA measured with the Polyethylene Glycol Precipitation Assay. Arthritis and Rheumatism 1982; Vo. 25, no. 6: Egner, W. The use of laboratory tests in the diagnosis of SLE. J. Clin. Pathol., 2000, 53:

25 SYMBOL LEGEND Xi Manufacturer Authorized Representative In vitro diagnostic medical device Batch Code Use by/ Expiry Date Temperature Limitation Irritant Biological Risk Catalog Number European Conformity Consult Instructions for Use/ Package Insert Hersteller Bevoll-mächtigter In-vitro- Diagnostikum Chargennummer Verfallsdatum Reizend Biologisches Risiko Katalognummer Temperaturbeschränkungen CE- Konformitätskennzeichnung Gebrauchsanweisung im Inneren der Verpackung beachten Fabriqué par Fabricado por Représentant agréé Representante autorizado Dispositif de diagnostic in vitro Dispositivo médico para diagnóstico in vitro Code de Lot Código de Lote Utiliser jusqu à/ Date de péremption Usar antes de/ Fecha de caducidad Limites de température Limitación de temperatura Irritant Irritante Risque biologique Riesgo biológico Numéro de catalogue Número de catálogo Conformité aux normes européennes Conformidad europea Consulter le mode d emploi/ notice jointe au conditionnement Consultar las instrucciones de uso/ prospecto del envase Prodotta da Rappresentante autorizzato Dispositivo medicodiagnostico in vitro Codice del lotto Scade il/ data di scadenza Limite di temperatura Irritante Rischio biologico Numero di catalogo Conformità europea Consultare le istruzioni per l uso/ il foglietto illustrativo MT Promedt Consulting GmbH Altenhofstraße 80 D St. Ingbert/Germany Corgenix, Inc Main Street, Suite 400 Broomfield, Colorado 80020, USA REAADS is a registered trademark of Corgenix, Inc. 2012, Corgenix, Inc. US Patent # 5,183, Effective: