3. Clustermeeting NanoCare und NanoNature. Horst-Dieter Lemke für das Konsortium aus B I O F I L M C E N T R E

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1 Nanosilberpartikel (AgNP) Wirkmechanismen und Untersuchungen ihrer möglichen Interaktionen mit Geweben, Zellen und Molekülen - Definition ihres relevanten Unverträglichkeitspotentials 3. Clustermeeting NanoCare und NanoNature Horst-Dieter Lemke für das Konsortium aus B I O F I L M C E N T R E

2 Implantatmaterialien mit Nanosilber (AgNP) AgNP-Vlies (Kollagen ) AgNP- Osteosynthesematerialien (Titan) Wundauflage für Brandverletzungen mit antimikrobiellen Eigenschaften Antimikrobiell ausgerüstete Knochenplatten und Schrauben für die Fixierung von Frakturen Ausgangsprodukt AgNP (AgPURE W1 oder AgPure W5) Wässrige Nanosilberdispersion (1/5 Gew.-%) AgNP- Knochenzement (PMMA) Knochenzement auf Acrylbasis mit antimikrobiellen Eigenschaften für die Verankerung von Endoprothesen 2

3 Ag-Gehalt Oberfläche (µg.cm -2 ) Ag + Freisetzung (ppm.cm -2 ) AgNP-Beschichtung für die Osteosynthese SEM Charakterisierung der Oberfläche Ag-Gehalt Oberfläche 15 14,3 1 5 E2.5_AgPW5,25,2,15,1,5 Ag + Freisetzung nag-beschichteten-stäbchen Ag-Stäbchen Elutionszeit in SBF (Tage) 3

4 AgNP-haltige Kollagenfolie (2 ppm) REM Charakterisierung der Oberfläche Ag + Freisetzung 4

5 eluierte Silbermenge bezogen auf Probenmasse (ppm) AgNP-haltiger Knochenzement (3. ppm) REM Charakterisierung der Oberfläche Ag + Freisetzung 3, 2, nag-zement nag-zement+gentamicyn 1,,,2,4,8,17, Elutionszeit (T) 5

6 P. aeruginosa (KBE oder Zellen/Kavität) P. aeruginosa (KBE oder Zellen/Kavität) B I O F I L M C E N T R E P. aeruginosa (KBE oder Zellen/Kavität) P. aeruginosa (KBE oder Zellen/Kavität) Einfluss von AgNP auf die Kultivierbarkeit von Biofilmen und planktonischen Bakterien (Beispiel: P. aeruginosa) 1,E+1 Biofilme Planktonische Bakterien 1,E+1 1,E+8 1,E+8 1,E+6 1,E+6 1,E+4 1,E+2 1,E+ 5 1 Ag - AgNP (ppm) 1,E+4 1,E+2 1,E+ 5 1 Ag - AgNP (ppm) AgNP FISH GZZ KBE FISH GZZ KBE 1,E+1 1,E+1 1,E+8 1,E+8 1,E+6 1,E+6 1,E+4 1,E+2 1,E+4 1,E+2 AgNO 3 1,E Ag Silbernitrat (ppm) FISH GZZ KBE 1,E Ag Silbernitrat (ppm) FISH GZZ KBE Entionisiertes Wasser 36 C, 24 h, N=3

7 Antimikrobielle Aktivität von Knochenzement nach JIS Z 281 Modifizierter JIS Z 281 (ISO 22916) mit S. aureus ATCC 6538 Testung des Ausgangsmaterials und des eluierten Materials Material Ausgang vor Elution Nach 6 Tage Elution Knochenzement ohne Zusätze Keine antimikrobielle Aktivität Keine antimikrobielle Aktivität Knochenzement mit Antibiotikum Sehr starke antimikrobielle Aktivität Starke antimikrobielle Aktivität Knochenzement mit AgNP (4. ppm) Sehr starke antimikrobielle Aktivität Sehr starke antimikrobielle Aktivität Knochenzement mit AgNP + Antibiotikum Sehr starke antimikrobielle Aktivität Sehr starke antimikrobielle Aktivität 7

8 Zytotoxizität Osteosynthesematerial und Kollagenfolien (ISO ) Direktkontakt mit humanen Endothelzellen (HUVEC) und humanen, dermalen Keratinozyten (NHEK) Osteosynthesematerial mit AgNP beschichtet Morphologie Mit AgPURE W1 Änderung Mit AgPURE W5 o.k. AgNP-haltige Kollagenfolien Leichte Vitalitätsabnahme bei Keratinozyten 8

9 Zytotoxizität Osteosynthesematerial (Titan) und Kollagenfolien (ISO ) Extraktuntersuchung (nach Vorspülung) Endothelzellen: vital Keratinozyten: Titan mit AgNP (AgPURE W1): Spülung nicht effizient Kollagenfolien mit AgNP: keine Toxizität nach Vorspülung Morphologie: Titan mit AgNP (AgPURE W5) o.k. Titan mit AgNP (AgPURE W1) anormal 9

10 Zellvitalität [% der Kontrolle] Zellvitalität [% der Kontrolle] Zellvitalität [% der Kontrolle] Zellvitalität [% der Kontrolle] AgNP: Wirkung auf Humane Knochenzellen ex vivo Zytotoxizitätstestung: Präosteoblasten 24 h aktive Osteoblasten 24 h TEM: AgNO₃ 1 AgNO₃ 5 Ag₂SO₄ AgNP 5 Ag₂SO₄ AgNP Matrix Matrix Ag-Konzentration [ppm] Ag-Konzentration [ppm] Präosteoblasten 21 d aktive Osteoblasten 21 d AgNO₃ 1 AgNO₃ 5 Ag₂SO₄ AgNP 5 Ag₂SO₄ AgNP Matrix Matrix Ag-Konzentration [ppm] Ag-Konzentration [ppm] N = 5 Präosteoblasten + 3 ppm AgNP, Ernte Tag 7 AgNP-induzierte Zytotoxizität stark dosis- & zeitabhängig AgNP induziert die Bildung von Endozytosestrukturen 1

11 AgNP: Wirkung auf Humane Präosteoblasten mrna Expressionsanalyse mittels RT-PCR 1 8 Relative Expression PICALM -3w- * 1 8 Relative Expression CCND1-3w- *** ppm AgNP ppm AgNP ppm Matrix 4 3 Clathrin-vermittelte Endocytose Relative Expression Nqo1-3w- *** 15 1 Proliferation Relative Expression CHOP -3w- *** 1 ppm Matrix Kontrolle je N= REDOX-Stress ER-Stress Keine Expressionsveränderungen bei niedriger AgNP Konzentration Hohe AgNP Konzentration erhöht die Expression von Stressmarkern 11

12 Zellvitalität [% der Kontrolle] Zellvitalität [% der Kontrolle] AgNP-Knochenzement Wirkung auf Humane Knochenzellen Zytotoxizitätstestung: Präosteoblasten Aktive Osteoblasten Z Kontrolle Z + G Z + AgNP 5ppm Z + G + AgNP 5ppm 1 Tag 1 Woche 3 Wochen Z = PMMA Knochenzement, Z + G = PMMA Knochenzement + Gentamicin, Z + AgNP = PMMA Knochenzement + Silbernanopartikel, Z + G + AgNP = PMMA Knochenzement + Gentamicin + Silbernanopartikel 1 5 Z Kontrolle Z + G Z + AgNP 5ppm Z + G + AgNP 5ppm 1 Tag 1 Woche 3 Wochen N = 5 Präosteoblast & Z + G + AgNP 5 ppm Aktiver Osteoblast & Z + G + AgNP 5 ppm Knochenkompatibilität der Nanosilber-funktionalisierten Zementimplantate gegeben 12

13 Zusammenfassung: AgNP Antibakterielle Effekte von AgNP ex vivo: Minimale Hemmkonzentrationen liegen bei ppm Ag Untersuchte Stämme: P. aeruginosa AdS, S. aureus ATTCC 29213, S. epidermis ATCC Ag + hat eine etwa 7-23fach höhere antibiotische Wirkung als AgNP Antibakterielle Effekte von AgNPs auf Biofilme ex vivo: Der hemmende Effekt von AgNP auf die Biofilmbildung (Mikrotiterplattenassay) und das Wachstum von Bakterien, sowie der inaktivierende Effekt auf etablierte Biofilme ist geringer als der von Ag + Biofilme sind deutlich toleranter gegenüber Ag + und AgNPs als planktonische Bakterien P. aeruginosa, dessen Kultivierbarkeit durch Ag vollständig abnimmt, zeigt noch das Vorhandensein intakter DNA (DAPI-Färbung) und ribosomaler RNA (FISH). Hinweis auf einen viable but not culturable (VBNC)-Zustand B I O F I L M C E N T R E 13

14 Zusammenfassung: AgNP Zytotoxizität nach ISO ex vivo: LC 5 von AgNP nach 24h liegt je nach Zelltyp bei ppm Ag Untersuchte Zelltypen: Endothelzellen (HUVEC, Blutgefäße), glatte Muskelzellen (HUASMC, Blutgefäße), dermale Fibroblasten, dermale Keratinozyten (NHEK, Haut) LC 5 von AgNP liegt um ca. Faktor 1 über der von Ag + -Salzen Der LC 5 von Präosteoblasten und aktiven Osteoblasten (Knochen) ist stark zeitabhängig und liegt nach 21d bei 5-1 ppm Ag Hohe AgNP Konzentrationen erhöht die Expression von Stressmarkern (auf Knochenzellen) B I O F I L M C E N T R E 14

15 Zusammenfassung: AgNP-funktionalisierte Biomaterialien Releaseverhalten Ag + ex vivo: Ist im AgNP-haltigen Knochenzement abhängig von der Formulierung (mit/ohne Antibiotikum) Ohne Gentamicin:.9 ppm nach 8 Tagen, Gleichgewicht wird erreicht Mit Gentamicin: 2.5 ppm nach 8 Tagen, aber Gleichgewicht noch nicht erreicht. Grund: erhöhte Porosität des Zementes durch Gentamicinzusatz AgNP-beschichtete Osteosysthesematerialien 1.1 ppm nach 8 Tagen, Gleichgewicht wird erreicht Antimikrobielle Aktivität ex vivo (mod. JIS Z 281 / ISO 22916): Ist im AgNP-haltigen Knochenzement abhängig von der Formulierung (mit/ohne Antibiotikum) Aktivität wird durch Gentamicin und AgNP gegenüber dem nur antibiotikahaltigen Zement verstärkt und bleibt über einen längeren Zeitraum erhalten ( längere Wirkung AgNP plus Gentamicin im Vergleich zu Gentamicin allein). B I O F I L M C E N T R E 15

16 Zusammenfassung: AgNP-funktionalierte Biomaterialien Zytotoxizität (ISO ) und Hämokompatibilität (ISO ) ex vivo: Keine Zytotoxizität des untersuchten AgNP-haltigen Knochenzementes mit Endothelzellen Leichte Aktivierung des Komplementsystems Knochenkompatibilität des Knochenzementes gegeben Herstellungsprozess kritisch für die Eigenschaften von AgNP-beschichteten Osteosynthesematerials In Abhängigkeit von der Herstellung der Titan-Oberflächen und der AgNP- Suspension keine Zytotoxizität mit Endothelzellen und Keratinozyten Keine Zytotoxizität der AgNP-haltigen Kollagenfolien nach Vorspülung Ausblick: Komplettierung einzelner ex vivo Versuchsreihen zur antimikrobiellen Aktivität, der Biofilmbildung und der Zytotoxizität von Implantatmaterialien Etablierung eines therapeutischen Fensters basierend auf ex vivo Daten Austestung der AgNP-funktionalisierten Implantate in vivo B I O F I L M C E N T R E 16