Protein Expression. Expression, homolog oder heterolog?
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- Artur Hertz
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1 Protein Expression Expression, homolog oder heterolog? Heterologe Expression in anderem Host Kompartment Codon usage Posttranslationale Modifikationen Kofaktoren Chaperone 1
2 promoter Expressionssystem Polymerase Gen zur Expression Repressor LacI Zielprotein Polymerase Repressor Lac Operon genomische DNA Non-leaky Expression Ein Expressionsytem soll möglichst dicht - non-leaky sein. Grund: Proteine, die exprimiert werden sollen, können toxisch sein. Das kann zur Folge haben, dass sich der Expressionshost gar nicht transformieren lässt, da die transformierten Zellen sofort sterben. Stirbt der Expressionshost nicht, kann aber das Zielprotein, das durch leaky Expression produziert wird, eine negative Selektion gut exprimierender Zellen bewirken. Erklärung: Gut exprimierende Zellen produzieren viel Zielprotein, aber weniger eigene Proteine, d.h. wachsen schlechter. Die gut exprimierenden sind nach einigen Verdopplungsrunden fast nicht mehr vorhanden. Man selektioniert also auf schlecht exprimierende Zellen. Das pet System von Studier für Expression in E.coli ist extrem dicht aufgrund verschiedener Vorkehrungen. 2
3 E.coli BL21 (DE3)- pet Expressionssystem T7 Polymerase T7 Repressor Gen zur Expression Zielprotein T7 High copy plasmid T7 Repressor Repressor Repressor T7 LacI Repressor Gen T7 Polymerase genomische DNA E.coli BL21 (DE3)- pet Expressionssystem E.coli Genom E.coli Polymerase Repressor Lac T7 Polymerase Keine Expression ohne Induktion da -Repressor Protein auf region sitzt und Bindung der E.coli Polymerase verhindert, d.h es wird keine T7 Polymerase synthetisiert. Plasmid T7 Repressor Gen zur Expression Ohne T7 Polymerase keine Expression des Zielproteins. Als zusätzliche Sicherung sitzt auch beim T7 noch eine region. Sollten T7 Polymerase dennoch in geringen Mengen synthetisiert worden sein, kann das Gen trotzdem nicht abgelsen werden. Zusätzliche Kopien des Lac Repressors sind Plamid kodiert. So wird genügend Repressor synthetisiert. 3
4 E.coli BL21 (DE3)- pet Expressionssystem E.coli Genom E.coli Polymerase Lac T7 Polymerase Zusätzliche Sicherung Eine weitere Absicherung gegen T7 Polymerase, die in geringen Mengen synthetisiert wurde, ist die Co-Expression von Lysozym, welches auch als Inhibitor der T7 Polymerase wirkt. Die T7-Polymerase wird abgefangen, bevor die Expression des Zielgens stattfindet. Das Lysozym wird auf einem zweiten Vektor kodiert. Lysozym Plasmid T7 Repressor Gen zur Expression E.coli Genom Lac Repressor INAKTIV Gatose / IPTG T7 Polymerase E.coli BL21 (DE3)- pet Expressionssystem Expression erst nach Induktion da -Repressor von (Genom) abfällt E.coli Polymerase liest Gen für T7 Polymerase ab. Repressor von (Plasmid) fällt ab. T7 Polymerase liest Gen für Zielprotein ab. Repressor INAKTIV Gatose / IPTG Plasmid T7 Gen zur Expression Zielprotein 4
5 Kompartment Cytosol => Cytosol (E.coli, Hefe, Insektenzellen) Membran => Spezieller E.coli Stämme Walker strains C41, C43 Extrazellulär Expression in Hefe, Sekretion ins Medium Signalpeptid & Sekretion ins Periplama von E.coli Expression im Cytosol in E.coli Stämmen mit defizienter Thioredoxin- und Glutathionreduktase Expression, homolog oder heterolog? Heterologous Expression in different Host Compartment Codon usage Posttranslational Modifications Cofaktors Chaperone 5
6 Codon usage Verschiedene Codon Präferenz Verschiedene trna levels in Organismen Bei seltenen Codons => Translationsstop 6
7 Rare Codons 7
8 Rare Codons- Expression in Rosetta Nicht induziert BL21(DE3) BL21(DE3) plys BL21(DE3) Rosetta Rare Codons- Synthetische Gene Gensynthese Zielgen wird synthetisiert optimiert für codon usage des Hosts Synthese durch PCR mit überlappenden Primern 5 3 8
9 Expression; Inclusion bodies was nun Löslich, aber auch gefaltet? Inclusion bodies Intrazelluläre Aggregate von missgefaltetem Protein Bilden sich bei Expression, wenn Protein sich nicht richtig faltet. 9
10 Inclusion bodies, im Mikroskop erkennbar Inclusion bodies EM Bild 10
11 Inclusion bodies Proteine teils gefaltet; oder IB enthalten auch gefaltetes Protein; Bsp Green Fluorescent Protein GFP, leuchte nur wenn es gefaltet ist. Bild C, E, die Punkte sind Inclusion bodies, die gefaltetes GFP enthalten. Cytoplasmatische Expression als lösliches Protein z.b. in Bild B. Inclusion Bodies Sind also eine Mischung aus ungefaltetem Protein, teilgefaltetem Protein und auch gefaltetem Protein. 11
12 Inclusion bodies vermeiden Richtiges Expressionskompartiment? Bsp Expression einer Ig Domäne mit essentiellem Disulfid in Origami Stamm (erlaubt Disulfide im Cytoplasma) in Bild A, Gelspur 1, Gesamtzellprotein, Protein wird exprimiert. Gelspur 3, Lösliche Proteine => Protein ist löslich In Bild B, Expression in normalen Stämmen: Gelspur 1 und 3 Gesamtzelllprotein, es wird also Zielprotein exprimiert. Aber die Fraktionen mit löslichem Protein in Gelpsur 2 und in 4 zeigen kein Zielprotein => Inclusion bodies Inclusion bodies vermeiden Optimierung Expressionskonstrukt Verkürzung / Verlängerung um wenige Aminosäuren kann Faltung extrem beeinflussen Verminderung Protein de Novo Synthese durch Induktionsstärke / Tuner B Strains Erniedrigen der IPTG Konzentration Expressionstemperatur Vermindern der Expressionstemperatur auf 30 oder 20 C 12
13 Inclusion bodies vermeiden Durch Chaperone Induktion Ethanol 3% Zugabe von Ethanol Induziert Expression von Heat Shock Proteinen= Chaperonen= Faltunsghelfern Inclusion bodies vermeiden Chaperone Co-expression seit ca 20 Jahren bekannt. 13
14 Inclusion bodies vermeiden Chaperone Co-expression Inclusion bodies vermeiden Chaperone Co-expression 14
15 Inclusion bodies vermeiden Chaperone Co-expression Kombination von Chaperonen ermöglicht auch Expression von Schwierigen Proteinen Refolding 15
16 Unfolding Chaotrope Substanzen stören die geordnete Wasserstruktur, => vermindern den hydrophoben Effekt. Dadurch wird der hydophobe Core von Proteinen zerstört, => das Protein entfaltet sich. Kosmotrope Substanzen fördern die geordnete Wasserstruktur, => verstärken den hydrophoben Effekt; z.b. Ammoniumsulfatfällung. Refolding => Es sollten verschiedene Refoldingpuffer probiert werden. Man kann hier auf eien Reihe von Publikationen zurückgreifen. Bsp 16
17 Refolding Refolding Während dem Refolding können teils gefaltete Intermediate aggregieren und die vollständige Faltung ins Native Protein verhindern. Abhilfe: Zugabe von Aggregationshemmern, z.b.arginin, Glycerin 17
18 CD Spectroscopy Optisch aktive Substanzen können polarisiertes Licht drehen Licht besteht aus E- Vektor und H-vektor. Bei Polarisation werden E- Vektoren ausgeblendet. Polarisationsfilter Proteine sind optisch akive Substanzen Jeder Sekundärstrukturtyp hat charakteristisches CD Spektrum. Aus Kombination von den drei Grundtypen lassen sich CD Spektren von Proteinen fitten => Gehalt an α-helix, β-sheet, random coil. Beispiele 18
19 Overlay and elimination of CD bands => β-sheets diffcult to predict Co-factors contribute to CD spectrum => wrong prediction Far UV CD So weit wie möglich CD Spektren sollten soweit wie möglich ins kurzwellige UV aufegnommen werden. Anteile der Spektren mit hohem Anteil and struktureller Informationen befinden sich gerade auch zwischen 200 und 180 nm. Problem: Viele Puffersubstanzen, Salze, etc absorbieren sehr stark ab ca. 210 nm und maskieren so das Spektrum des Peptidbindungen des Proteins. Bsp. Prion Protein im Vergleich zu Mutante: Strukturelle Änderungen erst unter 200 nm im Spektrum dutlich erkennbar. 19
20 CD: Nahes und fernes UV Fernes UV: Bereich zwischen 250 und 180 nm Nahes UV zwischen 350 und 250 nm. Nah, wegen Nähe zum sichtbaren Bereich (ca nm). CD Signale im nahen UV von den Aromaten ist Fingerprint für gefaltete Proteine FTIR of Proteins Fourier Transformierte InfraRot Spektroskopie Infrared bands of peptide bond (s) : stretch ; (b): bend; (t): torsion Band Wavenumber /cm -1 Origin A 3300 N-H (s) B 3100 N-H (s) I C=O (s) 80%, N-H (b) 10%, C-N (s) 10% II N-H (b) 60%, C-N (s) 40% III C-N (s) 30%, N-H (b) 30%, C=O (s) 10% O=C-N (b) 10%, Bands cm -1 secondary structure in D 2 O β-sheet, 3 10 helix, α-helix,unordered α-helix 1644 unordered turn, β-sheet (s) O (s) N H (s) 20
21 FTIR spectra of model peptides IR Absorption of H 2 O Wellenzahl / cm -1 M. Holtzhauer, Methoden in der Proteinanalytik p. 145; p. 150; Experimental setup Measurement in H 2 O => 6-10 µm cell path 10 mg/ml Measurement in D 2 O => 100µM (= 0.1 mm) cell path 1 mg/ml -> complete exchange of H 2 O to D 2 O -> complete exchange of N-H to N-D -> no H 2 O in atmosphere (dry N 2 chamber) -> time expense ~ like in CD spectroscopy Advantage of FTIR over CD: no contribution from cofactors like flavins, heme, Zn 2+, other metals... In region for secondary structure analysis. 21
22 Analyse FTIR Analyse mittels Fit der Kurve durch ein Set von Gausskurven. Die Lage der Maxima, die im Gesamtspektrum nur als Schultern sichtbar sind, lässt sich durch die zweite Ableitung der Spektren bestimmen. Analyse FTIR Je mehr Maxima erkennbar sind, desto mehr Gausskurven lassen sich fitten. Der Gesamtfir wird dadurch besser und zuverlässiger. 22
23 Analyse FTIR Bsp. Anwendung von FTIR bei Prion Protein Mutante: Die Mutante ΔTM zeigt etwas mehr ß-sheet als der Wildtyp, was zu einer Stabilisierung führt. Thaa et al. BBA Mol Cell Res. 1783,
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