Eine Calciumabhängige Proteinkinase aus Lycopersicon esculentum: Klonierung, Expression und Charakterisierung

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1 ETH Zürich Abteilung für Biologie XA Eine Calciumabhängige Proteinkinase aus Lycopersicon esculentum: Klonierung, Expression und Charakterisierung Institut für Pflanzenwissenschaften ETH Zürich Biochemie und Physiologie der Pflanzen Prof. Dr. N. Amrhein Diplomarbeit vorgelegt von Urs Gregor Stalder Betreut durch: Dr. Andreas Schaller Zürich April 2000

2 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Pflanzenabwehr Induzierte Abwehr Die Rolle der Plasmamembran H + ATPase Aufgabenstellung 7 2. Material und Methoden Material Lösungen und Medien Pflanzenmaterial Bakterienstämme Molekularbiologische Methoden Klonierung des 3 Endes der CDPK cdna in den pbluescript SK() Vektor RACEPCR und Klonierung in den pcr 2.1TOPO Vektor Isolierung von PlasmidDNA DNASequenzanalyse GesamtRNA Extraktion NorthernBlot Analyse Isolierung der Genomischen DNA SouthernBlot Analyse Klonierung der CDPK cdna in pgexg Transformation von E. coli DH5α mit pgexg/cdpkl/k Transformation von E. coli BL21(DE3)RIL mit pgexg/cdpkl/k Anzucht von E. coli BL21(DE3)RIL Zellen Aufschluss von E. coli BL21(DE3)RIL Zellen 21 II

3 Inhaltsverzeichnis 2.3 ProteinAnalytische Methoden SDSPAGE / WesternBlot Reinigung der GSTCDPK Fusionsproteine Bindung von 45 Ca Autophosphorylierung immobilisierter CDPK Phosphoaminosäuretrennung mittels DC Aktivitätstest Resultate Klonierung des 3 Endes einer CDPK aus Tomate Southern Blot Analyse Northern Blot Analyse Amplifizierung des 5 Endes mittels RACEPCR Amplifizierung und Klonierung von CDPKL und K Expression der CDPK in E. coli Reinigung des Fusionsproteins Bindung von 45 Ca Autophosphorylierung der CDPK Phosphoaminosäure Trennung Aktivität gegenüber synthetischen Peptiden Diskussion Literaturverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Anhang 63 III

4 Zusammenfassung Zusammenfassung Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine cdna einer Calciumabhängigen Proteinkinase (CDPK) aus Tomate (Lycopersicon esculentum cv. Castelmart II), die der von Yoon et al. (1999) beschriebenen CDPK aus Tabak homolog ist, unter Einsatz der RACE Methode kloniert, heterolog exprimiert und charakterisiert. Das offene Leseraster kodiert ein Polypeptid von 553 Aminosäuren und weist zu der CDPK aus Tabak eine Aminosäuresequenzidentität von 94% auf. Durch Southern Blot Analyse wurde gezeigt, dass eine Sonde, die der 3 untranslatierten Region der cdna entspricht, spezifisch mit nur einem Gen der CDPK Genfamilie hybridisiert. Eine Induktion des entsprechenden CDPKTranskriptes nach Verwundung liess sich mittels Northern Blot Analyse nicht nachweisen. Es konnte aber festgestellt werden, dass Transkripte der CDPK ca. 4 Stunden nach FusicoccinBehandlung von Tomatenpflanzen akkumulierten. Das Protein wurde in Fusion mit GlutathionSTransferase in E. coli exprimiert und aus bakteriellen Extrakten gereinigt. Mit radioaktiv markiertem 45 Ca 2+ konnte gezeigt werden, dass die C terminale, aber nicht die katalytische Domäne, Calcium bindet und folglich alleinig für die Calciumbindefähigkeit der CDPK und vermutlich für deren Ca 2+ abhängige Aktivierung verantwortlich ist. Das gereinigte Fusionsprotein wies eine Ca 2+ abhängige Ser/Thr Kinaseaktivität auf und war zur Autophosphorylierung in der Lage. Für das synthetische Oligopeptid Substrat Syntide2 wurde ein apparenter K M Wert zwischen 82 und 89 µm ermittelt. I

5 Einleitung 1. EINLEITUNG 1.1 Pflanzenabwehr Die Abwehrmechanismen von Pflanzen sind ihrer sessilen Lebensweise angepasst und daher kaum mit den entsprechenden Vorkehrungen bei tierischen Organismen zu vergleichen. Pflanzen im Freiland unterliegen einer Vielzahl von Herausforderungen: infektiösen Mikroorganismen, pflanzenfressenden Tieren und konkurrierenden Arten sowie Schwankungen von Temperatur, Strahlung und Wasserversorgung. Daher überrascht es nicht, dass sie komplexe chemische Anpassungen entwickelten, die ihr Überleben sichern. Hierin ist sicherlich eine Ursache für die beeindruckende Strukturvielfalt der Sekundärverbindungen zu suchen, welche wohl erst adäquates Reagieren auf die unterschiedlichsten Herausforderungen ermöglicht. Offensichtlich sind jene Sekundärverbindungen, welche als chemische Schutzstoffe agieren, unter dem Druck einer sich stetig wandelnden Umwelt entstanden; ihre Abwehrfunktion wurde weiterentwickelt. So haben sich bestimmte Alkaloide unter Selektionsdruck als zweckmässig für die Arterhaltung erwiesen und ihre Synthesekapazität wurde im Laufe der Evolution optimiert. Zur Abwehr von Herbivoren, Mikroorganismen und Viren stehen den höheren Pflanzen im wesentlichen vier Strategien zur Verfügung: Akkumulation toxischer Verbindungen im Gewebe, Bildung selbiger aus nichttoxischen Vorstufen bei Gewebeverletzung, Bildung mechanischer Barrieren und induzierte Bildung von Schutzstoffen bei Angriff. 1.2 Induzierte Abwehr Während bei den beiden erst genannten Mechanismen die Abwehrstoffe permanent einsatzbereit sind, werden sie bei letzteren erst als Reaktion auf eine Infektion bzw. Verletzung gebildet: induzierte Abwehr. Sie beinhaltet u. a. die Verstärkung der Zellwände durch Quervernetzung und Kalloseablagerung, die Synthese von Phytoalexinen, antimikrobiell wirksamen Substanzen von geringer Spezifität. Ihre Bildung beschränkt sich auf den Ort der Infektion, wo bei inkompatibler Wechselwirkung zwischen Pathogen und pflanzlichem Gewebe, meist lokal begrenzt, Zellen und Angreifer absterben und eine 1

6 Einleitung Abwehrnekrose hervorrufen. Diese Gewebeläsionen werden dadurch abgedichtet, dass die Zellwände der umgebenden noch lebenden Zellen Lignifizierung, Verkorkung und/oder Imprägnierung mit Polyphenolen erfahren (Greenberg et al., 1994; Somssich und Hahlbrock, 1998). Phytoalexine fehlen in der gesunden Pflanze oder liegen nur in geringen Quantitäten vor. Ihre denovosynthese wird generell durch spezifische Signalsubstanzen, die Elicitoren, ausgelöst. Dabei handelt es sich oft um Oligosaccharide, welche am Infektionsort als Abbauprodukte der Zellwände von Pilz oder Pflanzen anfallen (Yoshikawa et al. 1993). Induktion von Abwehr ist auch über die Aktivierung von Genen möglich, deren Produkte dann eine Schutzfunktion gegenüber dem Schädling übernehmen. Beispiel eines solchen Mechanismus ist die wundinduzierte Produktion und Akkumulation von Proteinase Inhibitoren bei Vertretern der Familien Cucurbitaceae, Fabaceae, Salicaceae und Solanaceae (Ryan, 1992 und dort angegebene Referenzen; Constabel et al., 1998). Die Wundantwort ist systemisch, das heisst, die Expression der Abwehrproteine erfolgt nicht nur in unmittelbarer Umgebung der Verletzung, sondern zeitlich versetzt auch in weiter entfernten Teilen der Pflanze. Die ursprünglich gefundenen InhibitorProteine der Tomate wurden zwei Familien, Inhibitor I und II, zugeordnet (Bishop et al., 1984). Angriffsziele dieser Inhibitoren sind SerinProteinasen, wie sie im tierischen Verdauungstrakt vorliegen. Über das gefressene Blattmaterial kann der Inhibitor in das Verdauungssystem einer Raupe gelangen. Diese stellt bald darauf ihr Wachstum ein, weil die essentiellen proteinogenen Aminosäuren nicht mehr aus dem Abbau der aufgenommenen Pflanzenproteine zur Verfügung stehen und damit die Synthese körpereigener Proteine behindert ist (OrozcoCardenas et al., 1993). Später wurde gezeigt, dass die systemische Wundantwort die Akkumulation einer Vielzahl weiterer Proteine beinhaltet (Schaller et al., 1995; Bergey et al., 1996), die unter dem Begriff SWRPs (systemic wound response proteins) zusammengefasst sind. Dabei handelt es sich nebst Proteinaseinhibitoren um Polyphenoloxidase (Constabel et al., 1995), Proteasen (Hildmann et al., 1992; WalkerSimmons und Ryan, 1977; Pautot et al., 1993; Schaller und Ryan, 1996), sowie um Proteine, die möglicherweise eine wichtige Funktion bei der Transduktion des Wundsignals einnehmen (McGurl et al., 1992; Heitz et al., 1997; Bergey et al., 1999). Eine systemische Induktion von SWRPs setzt die Existenz einer SignaltransferKette unter Beteiligung von Signalmolekülen voraus. Die Suche nach Molekülen mit Signalisierungseigenschaften, hat eine Vielzahl von Verbindungen hervorgebracht, wie Pektin (Bishop et al., 1981), Chitosan und ChitinFragmente (WalkerSimmons und Ryan, 1984) aus pflanzlichen bzw. pilzlichen Zellwänden, die Hormone Ethylen (O Donnell et al., 1996), Abscisinsäure (PẽnaCortés et al., 1989) und Jasmonsäure (Farmer und Ryan, 1992), 2

7 Einleitung sowie Methyljasmonat (Farmer und Ryan, 1990) und das Oligopeptid Systemin (Pearce et al., 1991), die alle an der Übermittlung des Wundsignals beteiligt zu sein scheinen. Von der Verwundung bis zur Akkumulation der Abwehrproteine führt ein komplexer Signaltransduktionsweg (Abb. 1). Nach der gängigen Modellvorstellung von Farmer und Ryan (1992) entsteht im geschädigten Gewebe aus Prosystemin, einem VorstufenPolypeptid aus 200 AminosäureResten, durch proteolytische Spaltung das 18 AminosäurePolypeptid Systemin als eigentliches Peptidhormon, welches über das vaskuläre System der Pflanze transloziert wird (NarváezVásquez et al., 1995). Die Transkription von ProsysteminmRNA ist auf tiefem Niveau konstitutiv und wird durch Verwundung systemisch markant erhöht (McGurl et al., 1992). Die Perzeption von Systemin durch seinen Rezeptor im Plasmalemma einer intakten Blattzelle (Scheer und Ryan, 1999) führt zur Aktivierung einer bestimmten Lipase, welche die Freisetzung von Linolensäure aus Membranlipiden katalysiert (Farmer und Ryan, 1992; NarváezVásquez et al., 1999). Über mehrere Reaktionsschritte des sogenannten OctadecanoidWeges, entsteht aus αlinolensäure die Jasmonsäure (Vick und Zimmermann, 1984). Als Signalsubstanz aktiviert Jasmonsäure auf bisher unbekannte Weise die SWRP Gene. Als erste messbare Antwort auf die Interaktion von Systemin mit seinem Rezeptor kommt es zu veränderten Ionenströmen über die Plasmamembran. In Mesophyllzellen von Tomatenpflanzen bewirkt Systemin eine rasche Depolarisation des Plasmamembran Potentials und in Zellkulturen von L. peruvianum eine Alkanisierungsantwort (Moyen und Johannes 1996; Felix und Boller 1995). Inhibierung der H + ATPase führt die Akkumulation der Transkripte wundinduzierbarer Proteine mit sich (Schaller und Oecking, 1999). Dagegen bewirkt eine Hyperpolarisation des PlasmamembranPotentials durch Aktivierung der H + ATPase eine Unterdrückung der Alkanisierungsantwort und der Expression von wundinduzierbaren Abwehrgenen. Aufgrund dieser Daten besteht der Verdacht, dass die Depolarisation des PlasmamembranPotentials für die Auslösung der Wundantwort notwendig ist. Dabei könnte die Inhibierung der H + ATPase Aktivität eine Vermittlerrolle spielen. Die systemininduzierte Alkanisierungsantwort in L. peruvianum erfordert den Einstrom von Ca 2+ Ionen und die Aktivität einer Proteinkinase (PK) (Schaller und Oecking, 1999). Somit könnte ein Zusammenhang zwischen dem Calciumeinstrom und/oder der Proteinkinase und der Inhibierung der H + ATPase bestehen. Einen indirekten Beweis für die Beteiligung von Ca 2+ im Wundsignaltransduktionsweg erbrachten Bergey und Ryan (1999). Sie beobachteten einen Anstieg der Calmodulin mrna und ProteinKonzentration in den Blättern von 3

8 Einleitung Tomaten nach Verwundung, sowie bei Fütterungsexperimenten mit Systemin, Methyljasmonat und Linolensäure. Sie stellten weiter fest, dass die Induktion der Calmodulinexpression zeitlich mit der von anderen Signalisierungskomponenten zusammenfällt, sich jedoch von der späteren Expression der Abwehrgene unterscheidet. Ob Calmodulin aber an der Regulation der Aktivität einer Proteinkinase beteiligt ist, ist noch unklar. Wahrscheinlicher, weil erheblich rascher, ist die direkte Aktivierung einer Calciumabhängigen Proteinkinase durch erhöhten Spiegel cytosolischen Calciums, wie von Schaller (1999) in einem Modell der systemininduzierten Wundantwort vorgeschlagen (Abb. 1). Nach diesem Modell bewirkt die Interaktion von Systemin mit seinem Rezeptor SR160 einen Anstieg der freien cytoplasmatischen CalciumionenKonzentration, hervorgerufen durch das Öffnen von plasmamembranständigen Ca 2+ Kanälen, sowie das Entlassen von organellgebundenem Ca 2+. Als Folge der erhöhten cytosolischen Ca 2+ Konzentration kommt es zur Inhibierung der H + ATPase, wobei die Beteiligung einer CalciumabhängigenProteinkinase (CDPK) vermutet wird. Die Depolarisation des PlasmamembranPotentials könnte den Anstieg des Ca 2+ Gehalts verstärken und so zur Aktivierung einer Phospholipase A 2 (PLA 2 ) beitragen. Die Aktivität der PLA 2 scheint weiterhin durch eine Proteinkinase aus der Familie der Mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPKs) kontrolliert zu sein (Stratmann und Ryan, 1997; Ryan und Pearce, 1998). Phospholipidhydrolyse durch eine aktivierte Phospholipase setzt Linolensäure als Ausgangssubstrat der durch den OktadekanoidBiosyntheseweg gebildeten Jasmonsäure frei. Letztere aktiviert ihrerseits auf bisher unbekannte Weise die Abwehrgene. 4

9 Einleitung Abb. 1: Modell des durch Systemin ausgelösten Signalisierungsweges; nach Schaller (1999), modifiziert. 5

10 Einleitung 1.3 Die Rolle der Plasmamembran H + ATPase Die H + ATPase der pflanzlichen Plasmamembran ist ein Enzym von etwa 100 kda. Ihre Funktion liegt in der Schaffung eines transmembranen H + Gradienten. Das errichtete H + elektrochemische Potential nutzt die Zelle für den Antrieb vieler transmembranen Transportvorgänge aber auch zur Regulation des intrazellulären phwertes sowie des Zell Turgor (Serrano 1989, 1990; Michelet und Boutry 1995). In Anbetracht der wichtigen Funktionen, die diesem Gradienten zukommen, und dem enormen Energieverbrauch der zu dessen Aufrechterhaltung erforderlich und der bis zu einem Viertel des zellulär gebildeten ATPs ausmachen kann, ist es nicht erstaunlich, dass die H + ATPase komplexen Regulationsvorgängen unterworfen ist. Ihre Aktivität wird in vivo über die Autoinhibitor Domäne am CTerminus reguliert. Bei derer Entfernung stellt sich eine deutliche Steigerung der Aktivität ein (Palmgren et al., 1991). Das Pilzgift Fusicoccin von Fusicoccum amygdali Del. aktiviert die H + ATPase durch Interaktion mit ihrer AutoinhibitorDomäne (Johansson et al., 1993). Es konnte gezeigt werden, dass Fusicoccin einen Komplex aus 1433 Proteinen mit dem CTerminus der ATPase stabilisiert (Jahn et al., 1997; Oecking et al., 1997; Baunsgaard et al., 1998). Die Interaktion von 1433 Proteinen mit dem CTerminus der H + ATPase hängt von dessen Phosphorylierungsstatus ab. Nur wenn ein kritischer Threoninrest im CTerminus der Protonenpumpe phosphoryliert vorliegt, ist eine Bindung von 1433 Proteinen und damit die Aktivierung der ATPase möglich (Svennelid et al., 1999). Weiterhin wurde die Phosphorylierung eines Serinrestes zwischen Transmembransegmenten 8 und 9 als wichtig für die 1433 Proteinbindung beschrieben (Marra et al., 2000). Bereits Schaller und Sussman (1988) zeigten die Ca 2+ abhängige Phosphorylierung an Serin und ThreoninResten der Plasmamembran H + ATPase. Phosphorylierungsereignisse, die die Bindung von 1433 Proteinen ermöglichen würden zu einer Aktivierung der Protonenpumpe führen. In der Tat ist eine Aktivierung der ATPase durch Phosphorylierung beobachtet worden (Bidway und Takemoto, 1987; Suzuki et al., 1992). Desweitern scheint aber auch eine Inaktivierung durch Phosphorylierung möglich zu sein (VeraEstrella et al., 1994; Xing et al., 1996; Lino et al., 1998, De Nisi et al., 1999). Die für diese beiden Phosphorylierungsereignisse verantwortlichen Proteinkinasen sind bislang nicht identifiziert worden. Es wird aber vermutet, dass daran calciumabhängige Proteinkinasen (CDPKs) beteiligt sind (Camoni et al., 1998; De Nisi et al., 1999). CDPKs weisen eine für sie charakeristische Struktur auf. Die Nterminale Kinase Domäne ist über ein 6

11 Einleitung autoinhibitorisches Verbindungsstück mit der calmodulinähnlichen Domäne am CTerminus verbunden (Harper et al., 1994; Harmon et al., 1994). Einige dieser CDPKs fand man als plasmamembranständige Enzyme in verschiedenen Spezies (Schaller et al., 1992; Verhey et al., 1993). Kürzlich wurde von Yoon et al. (1999) eine CDPK aus Tabak kloniert. Einige Hinweise zeigen an, dass es sich bei dieser CDPK möglicherweise um die Kinase handelt, die für die Inaktivierung der H + ATPase nach Verwundung verantwortlich sein könnte. Denn zum einen ist die von Yoon et al. (1999) beschriebene Kinase auf transkriptioneller Ebene wundinduzierbar, zum anderen handelt es sich dabei um ein plasmamembranständiges Enzym, dessen Substrat sich wahrscheinlich ebenfalls in der Plasmamembran befindet. Zudem wird die Aktivität der CDPK durch Ca 2+ erhöht. All dies sind Kriterien, die für die Proteinkinase des Wundsignalwegs zu erwarten sind. 1.4 Aufgabenstellung Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte daher die Klonierung und Charkerisierung einer CDPK aus Tomate (Lycopersicon esculentum cv. Castelmart II) versucht werden, die der von Yoon et al. (1999) beschriebenen CDPK aus Tabak entspricht. Ein Datenbankvergleich mit der CDPK aus Tabak wies auf die Existenz mehrerer ESTs der Tomate hin, die hohe Sequenzübereinstimmung mit dem Tabakenzym aufwiesen. Unglücklicherweise umfasste der EST mit der höchsten Sequenzübereinstimmung lediglich das 3 Ende der cdna, welches die 3 untranslatierte Region und nur einen kleinen Teil der kodierenden Sequenz beinhaltete. Ausgehend von dieser Sequenzinformation sollte sowohl das 3 Ende als auch das 5 Ende der cdna unter Einsatz der RACEMethode kloniert werden. Die CDPK sollte anschliessend heterolog exprimiert und charakterisiert werden. 7

12 Material und Methoden 2. MATERIAL UND METHODEN 2.1 Material Lösungen und Medien Die Chemikalien stammen, sofern nichts anderes angegeben ist, von FLUKA Chemie AG, Buchs SG, Schweiz. LBMedium: 2.5% w/v LB Broth, Miller (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 2x YT Medium: 1.6% w/v Bactotrypton (Difco) 1.0% w/v Bactoyeastextrakt (Difco) 0.5% w/v NaCl Plasmid DNA, genom. DNA Isolierung MiniPrep Puffer: 25 mm Tris/HCl, ph mm Glucose 10 mm EDTA CTABExtraktionspuffer: 2% w/v CTAB 100 mm Tris/HCl, ph 8 20 mm EDTA, ph M NaCl CTABNaCl Puffer: 10% w/v CTAB 50 mm Tris/HCl, ph 8 10 mm EDTA, ph 8 8

13 Material und Methoden CTAB/NaCl Fällungspuffer: 1% w/v CTAB 50 mm Tris/HCl, ph 8 10 mm EDTA, ph 8 Sequenzierung, Northern, Southernblotting 20x SSC: g NaCl 100 g Natriumcitrat x 3 H 2 O aqua dest. ad 1 Liter ph 7, autoklaviert 50x Denhardt s Reagenz: 5 g Ficoll 5 g Polyvinylpyrrolidon 5 g Rinderserum Albumin aqua dest. ad 500 ml steril filtriert 1 M Kaliumphosphatpuffer: 1 M K 2 HPO 4 1 M KH 2 PO 4 ph 7 aqua dest. ad 1 Liter 10x STE: 0.1 M NaCl 10 mm Tris/HCl 1 mm EDTA ph 8, autoklaviert TE: 10 mm Tris/HCl 1 mm EDTA ph 8, autoklaviert 9

14 Material und Methoden 1x TAE: 40 mm Tris/AcOH, ph mm EDTA autoklaviert 6x Ladepuffer: 0.25% w/v Bromphenolblau 0.25% w/v Xylencyanol 30% v/v Glycerin 10x Gelpuffer: 0.4 M MOPS 100 mm Natriumacetat 10 mm EDTA ph 7, autoklaviert Dentaturierungslösung: 1.5 M NaCl 0.5 M NaOH Neutralisierungslösung: 1.5 M NaCl 0.5 M Tris/HCl 0.5 M EDTA ph 8, autoklaviert Hybridisierungslösung: 50% Formamid 5x SSC 50 mm Kaliumphosphatpuffer, ph 7 2x Denhardt s 100 µg/ml HeringsspermienDNA 0.5% w/v SDS Sequenzierladepuffer: 80% Formamid 20% 25 mm EDTA 50 mg/ml Blue Dextran 10

15 Material und Methoden 1% Agarose Gel: 1 g Agarose 100 ml aqua dest. 1x TAE 10 µl EtBr (5 mg/ml) Glutathion Sepharose 4B Affinitätschromatographie Puffer A: 10 mm NaCl 1 mm EDTA 50 mm Tris/HCl, ph 8 1 mg/ml Lysozym 1 mm PMSF Spatelspitze DNAse / pro 30 ml Waschpuffer: 1% Nonidet 40 (NP 40) inpuffer A Elutionspuffer: 5 mm red. Glutathion in 50 mm Tris/HCl, ph 8 SDSPAGE, Westernblotting Trenngelpuffer: 1.5 M Tris/HCl, ph % SDS 25% Glycerin Sammelgelpuffer: 0.5 M Tris/HCl, ph % SDS 30% Monomerengemisch: 29.2% Acrylamid 0.8% Bisacrylamid 11

16 Material und Methoden 2x Probenpuffer: 1.5 ml Sammelgelpuffer 1 ml 20% SDS 0.5 ml Glycerin 0.5 ml Mercaptoethanol 5 ml aqua dest. Spatelspitze Bromphenolblau 10x Laufpuffer: 30 g Tris 144 g Glycin 10 g SDS aqua dest. ad 1 Liter Blottingpuffer: 25 mm Tris 192 mm Glycin 20% v/v Methanol aqua dest. ad 1 Liter 12

17 Material und Methoden Pflanzenmaterial Für alle Untersuchungen wurde Lycopersicon esculentum cv. Castelmart II Tomatenpflanzen eingesetzt. Ihre Anzucht erfolgte im Phytoschrank mit einem hell/dunkel Zyklus von 16.5 h Licht (>140 µmolm 2 s 1, 25 C) und 7.5 h Dunkel (18 C) bei 75% relativer Luftfeuchtigkeit. Im Alter von 23 Wochen wurden sie zur Isolierung genomischerdna oder für Fütterungsversuche mit Fusicoccin (3 µm) eingesetzt. In beiden Fällen wurde das gesamte Sprossmaterial oberhalb der Kotyledonen verwendet Bakterienstämme E. coli TOP10F F {lacl q Tn10 (Tet R )} mcra (mrrhsdrmsmcrbc)φ80lacz M15 lacx74 reca1 deor arad139 (araleu)7697 galu galk rpsl(str R ) enda1 nupg E. coli DH5α supe44 hsdr17 reca1 enda1 gyra96 thi1 rela1 E. coli BL21CodonPlus (DE3)RIL F ampt hsds (r B m B ) dcm + Tetr galλ(de3) enda Hte [argu iley leuw Cam r ] 13

18 Material und Methoden 2.2 Molekularbiologische Methoden Klonierung des 3 Endes der CDPK cdna in den pbluescript SK() Vektor Mit der Polymerase Kettenreaktion (PCR) wurde das 3 Ende der CDPK cdna aus cdna Banken von der Tomatenblüte und dem Tomatenspross amplifiziert und mit Restriktionsschnittstellen für die Enzyme EcoRI und XhoI versehen. Die PCR Reaktion erfolgte in einem 50 µl Ansatz. Dieser enthielt 200 ng des Templats, 5 µl 10x MMLV RT Reaktionspuffer (Promega, Madison,WI, USA), 5 µl 5 Primer (10 µm), 5 µl 3 Primer (10 µm), 3 µl 25 mm MgCl 2, 1 µl 10 mm dntp s und 26 µl nukleasefreies Wasser. Zudem wurde der Mix mit einem TaqBead TM (HeissStartPolymerase, Promega) versetzt und mit 2 Tropfen Mineralöl überschichtet. Das PCRProgramm umfasste 45 Zyklen (95 C, 30 sec; 60 C, 45 sec; 72 C, 1 min). Die DNA wurde durch eine Ethanolfällung aus dem Reaktionsansatz gereinigt, mit den Enzymen EcoRI und XhoI restringiert, über ein 1 % (w/v) AgaroseGel aufgetrennt und mit dem Biorad Kit prep@gene aus dem Gel eluiert. Der pbluescript SK() Vektor wurde in gleicherweise restringiert, mit CIAP (2 U Calf Intestine Alkaline Phosphatase) dephosphoryliert und durch Agaroseelektrophorese gereinigt. Die Ligation mit T4DNA Ligase wurde bei 16 C über Nacht durchgeführt. Transformation von E. coli DH5α erfolgte auf gleiche Weise wie in Abschnitt beschrieben RACEPCR und Klonierung in den pcr 2.1TOPO Vektor Die Amplifizierung des 5 Endes der unvollständigen CDPKcDNA erfolgte mit Hilfe des Smart RACE cdna amplification Kit von Clontech (Palo Alto, Cal., USA). In einem ersten Schritt erfolgte die Synthese der einzelsträngigen cdna aus der GesamtRNA mittels reverser Transkriptase. Dabei wurde das Protokoll des Herstellers unverändert übernommen (im Manual Seite 8). Die auf diese Weise erhaltene einzelsträngige cdna diente als Matrize für die 5 RACE PCR. Abgesehen vom PCRProgramm wurde auch hier die Anleitung des Herstellers (im Manual Seite 11) befolgt. Die dazu verwendeten Primer sind im Anhang aufgeführt. Das leicht modifizierte touch down PCRProgramm umfasste je 5 Zyklen (94 C, 30 s; 74 C, 3 min), (94 C, 30 s; 72 C, 3 min), (94 C, 30 s; 70 C, 30 s; 72 C, 3 min) 14

19 Material und Methoden sowie 35 Zyklen (94 C, 30 s; 68 C, 30 s; 72 C, 3 min). Die PCRProdukte wurden durch Agarosegelelektrophorese gereinigt und mit dem Biorad Kit prep@gene aus dem Gel eluiert. Zur Klonierung wurde das TOPO TA Clonig Kit von Invitrogen (Groningen, Nierderlande) verwendet und gemäss Protokoll des Herstellers eingesetzt. Rekombinante Klone wurden auf Vollmedium in Gegenwart von Ampicillin, IPTG und XGal selektioniert Isolierung von PlasmidDNA PlasmidDNA wurde nach dem Prinzip der alkalischen Lyse isoliert (Birnboim und Doly, 1979). Die Anzucht der Bakterien erfolgte in 2 ml LB/AmpMedium (100 ng Ampicillin/ml LBMedium) über Nacht bei 37 C und 220 rpm. Die ÜbernachtKultur wurden bei 14'000 rpm für 2 min abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in 100 µl MiniPrep Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von 150 µl 0.2 N NaOH, 1% (w/v) SDS und 5 min Inkubation auf Eis, wurde die Suspension ergänzt mit 150 µl 3 M Kaliumacetat und für weitere 5 min auf Eis gestellt. Durch Zentrifugation wurde das Präzipitat entfernt und der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäss mit 800 µl vorgelegtem Ethanol transferiert. Es folgten weitere 15 min Inkubation auf Eis und 15 min Zentrifugation der präzipitierten PlasmidDNA, die anschliessend in 200 µl TE mit 1µl pankreatischer RNAse (10 mg/ml) aufgenommen und 30 min bei 37 C inkubiert wurde. Daran schloss sich je eine Extraktion mit Phenol und mit Phenol/Chloroform (1:1) an, gefolgt von einer weiteren Ethanolfällung. Das Präzipitat wurde in 50 µl H 2 O aufgenommen und bei 20 C gelagert DNASequenzanalyse Die DNASequenzierung erfolgte nach der von Sanger et al. (1977) beschriebenen Kettenabbruchmethode unter Einsatz von fluoreszenzmarkierten Dideoxynukleotiden. Diese waren im Reaktionsmix enthalten (Perkin Elmer, Rotkreuz, Schweiz), ebenso die Taq Polymerase und der Puffer. In einem PCRAnsatz von 10 µl wurden ng Plasmid DNA, 1.6 pmol Primer und 4 µl Reaktionsmix eingesetzt. Es wurden 25 Reaktionszyklen wie folgt durchgeführt: 95 C, 30 s; 50 C, 15 s; 60 C, 4 min. Die Reaktionsprodukte wurden mit 15

20 Material und Methoden Ethanol gefällt, in 4 µl Ladepuffer aufgenommen und 2 min bei 95 C denaturiert. Die Trennung der Nukleotidstränge erfolgte über ein 5% (w/v) PolyacrylamidGel in Gegenwart von 8 M Harnstoff. Als Laufpuffer wurde 1x TBE verwendet. Die Elektrophorese dauerte bei 2500 V und 38 W 17 Stunden (ABI 373 DNA Sequencer, Perkin Elmer). Analysiert und ausgewertet wurden die Daten mit Hilfe des SoftwarePaketes der University of Wisconsin Genetics Computer Group GesamtRNA Extraktion Die GesamtRNA wurde aus zwei Wochen alten Pflanzen L. esculentum cv. Castelmart II gewonnen, die in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bis zur Verwendung bei 80 C gelagert worden waren. Das gefrorene Pflanzenmaterial von jeweils 6 Pflanzen (ca. 0.8 g Frischgewicht) wurde mit Mörser und Pistill in flüssigem Stickstoff zu einem feinem Pulver zerrieben. Die Extraktion erfolgte mit 300 µl Phenol, equilibriert in 100 mm Tris/HCl, ph 8, und 300 µl Tris/HCl, ph 8. Die wässrige Phase wurde anschliessend vier weiteren Phenol (equilibriert in 100 mm Tris, ph 8), sowie einer Phenol/Chloroform (1:1) Extraktion unterzogen. An die sich Ethanol, Lithiumchlorid und Ethanolfällungen anschlossen. Aufgenommen wurde das Pellet in 50 µl TE. Die RNAKonzentration wurde anhand der Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt und auf 1 µg/µl eingestellt NorthernBlot Analyse Es wurden 5.5 µl RNA (1µg/µl) mit 1 µl 10x Formaldehydgelpuffer (Sambrook et al., 1989), 3.5 µl Formaldehyd und 10 µl Formamid gemischt, während 15 min bei 65 C denaturiert und auf Eis abgekühlt. Nach Zugabe von 2 µl FormaldehydLadepuffer wurde die Probe auf einem 1.2% (w/v) Agarosegel in Gegenwart von 6.5% (v/v) Formaldehyd während 5 h bei 120 V elektrophoretisch aufgetrennt. Nach erfolgter Elektrophorese wurde das Gel 2x 20 min in Wasser gewaschen. Die RNA wurde entweder mit Ethidiumbromid angefärbt oder mittels 16

21 Material und Methoden Kapillartransfer auf eine Nitrocellulosemembran (BA 85, Schleier & Schuell, Dassel, Deutschland) übertragen und mit einer radioaktiv markierten DNASonde hybridisiert. Für die Ethidiumbromidfärbung wurde das Gel 30 min in Wasser mit Ethidiumbromid (1 µg/ml) inkubiert und über Nacht in Wasser entfärbt. Die Nukleinsäurebanden wurden unter UVLicht (354 nm) sichtbar gemacht und dokumentiert (Eagle Eye, Stratagene, La Jolla, Cal., USA). Der Kapillartransfer der RNA auf eine Nitrocellulosemembran erfolgte über Nacht in Gegenwart von 10x SSC. Die Membran wurde danach für kurze Zeit in 2x SSC gewaschen und im UVCrosslinker (Stratagene) bestrahlt, um die RNA kovalent auf die Membranoberfläche zu binden. Die Vorhybridisierung sowie die Hybridisierung wurden in 5x SSC, 50 mm KPP, ph 7, 2x Denhardt s, 100 µg/ml Heringssperma DNA und 0.5% SDS bei 42 C für 4 h bzw. über Nacht durchgeführt. Die radioaktive Markierung der Sonde erfolgte nach der Methode von Feinberg und Vogelstein (1983). Dabei wurde ein kommerzielles Produkt vorbereiteter Reagenzien (Primeit) nach Angaben des Herstellers Stratagene verwendet. Nichtinkorporierte Nukleotide wurden mittels Gelfiltration über Sephadex G50 (Amersham Pharmacia Biotech, Dübendorf, Schweiz) von der markierten Sonde getrennt. Der Einbau radioaktiven datp s wurde im Scintillationszähler überprüft. Die sich an die Hybridisierung anschliessenden Waschschritte erfolgten mit abnehmenden Salzkonzentrationen. Sie wurden alle bei 60 C für je 30 min durchgeführt. Der erste Waschschritt erfolgte mit einer 1x SSC, 0.5% (w/v) SDS Lösung. Auf diesen folgten zwei weitere mit jeweils einer 0.2x SSC, 0.5% (w/v) SDS Lösung. Die Membran wurde dann über Nacht auf einer PhosphorImager Kassette exponiert und anschliessend am PhosphorImager unter Anwendung der entsprechenden Software (Image Quant, Molecular Dynamics, Sunnyvale, Cal., USA) analysiert Isolierung der Genomischen DNA Das in flüssigem Stickstoff schockgefrorene und bei 80 C gelagerte Pflanzenmaterial (10 g Frischgewicht) wurde mit Mörser und Pistill in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver zerrieben. Dieses wurde in 50 ml vorgewärmten (65 C) CTABExtraktionspuffer, welcher 2% (v/v) 2Mercaptoethanol enthielt, überführt. und für 30 min bei 65 C inkubiert. Während dieser Zeit wurde der Ansatz mehrmals vorsichtig gemischt. Die anschliessende Extraktion mit Chloroform wurde mit einem dem Ansatz entsprechenden Volumen durchgeführt. Bei 17

22 Material und Methoden 5000 xg wurde 5 min zentrifugiert. Dann wurde der zuvor abgenommenen wässrigen Phase 1/10 Volumenteil CTABNaCl Puffer zugesetzt und vorsichtig geschüttelt. Es schloss sich eine weitere ChloroformExtraktion an, worauf die wässrige Phase mit dem gleichen Volumen CTABFällungspuffer versetzt wurde. Da sich das Präzipitat nicht sogleich bildete, wurde die Lösung für 30 min bei 65 C inkubiert. Nach einem zweiten Zentrifugationsschritt bei 5000 xg für 5 min wurde das Pellet in 10 ml STE für 30 min bei 65 C resuspendiert und anschliessend mit 6 ml Isopropanol überschichtet. Die ausgefallene DNA wurde mittels einer Pasteurpipette aus der Interphase gefischt und in 80% (v/v) Ethanol gewaschen. Das luftgetrocknete Pellet wurde in 2.5 ml TE aufgenommen und zur Elimination von RNA mit 10 µg/ml RNAse versehen. An die Inkubationszeit von 30 min bei 37 C folgte eine weitere Präzipitation mit 800 µl 10 M Ammoniumacetat und 6.5 ml Ethanol. Das Präzipitat wurde bei 7500 xg und 4 C für 15 min sedimentiert, anschliessend in 80% (v/v) Ethanol gewaschen, vacuumzentrifugiert (Savant) und in 0.5 ml TE aufgenommen. Die Konzentration der DNA Lösung wurde durch Messen der OD 260 einer 1/50 Verdünnung bestimmt SouthernBlot Analyse Die genomische DNA aus Sprossen von 20 Tage alten Tomaten wurde mit den Enzymen DraI, EcoRI, HindIII und XbaI restringiert. Das Gesamtvolumen der einzelnen Reaktionsansätze betrug 100 µl und beinhaltete 10 µg genom. DNA, 0.1 mg/ml BSA und 50 U der Restriktionsendonuclease im entsprechenden Puffer (MBI Fermentas, Vilnius, Lithauen). Nach einer Reaktionszeit von 2 h bei 37 C wurden erneut 50 U des Restriktionsenzyms zugegeben und für weitere 2 h inkubiert. Es folgten Hitzeinaktivierung des Enzyms und Ethanolfällung der DNA. Die elektrophoretische Trennung der Restriktionsfragmente wurde über Nacht bei einer Spannung von 40 V auf einem 0.8% Agarose Gel durchgeführt. Als Elektrophoresepuffer wurde 1x TAE unter Zusatz von 0.25 µg/ml EtBr eingesetzt. Die im Gel immobilisierten DNA Fragmente wurden partiell hydrolysiert (20 min in 500 ml 0.25 N HCl), denaturiert (30 min in 500 ml 1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH) und neutralisiert (2x 15 min in je 500 ml 1.5 M NaCl, 0.5 M Tris/HCl ph 8). Der anschliessende Kapillartransfer der DNA Fragmente auf die Nitrocellulosemembran erfolgte über Nacht in Gegenwart von 20x SSC. Alle weiteren Schritte wurden gemäss (2.2.6) durchgeführt. 18

23 Material und Methoden Klonierung der CDPK cdna in pgexg Beim pgexg Vektor (Schmid und Görlach, 1996) handelt es sich um ein Derivat des pgex3x Vektors (Amersham Pharmacia Biotech). Der Vektor erlaubt die Expression eines Proteins in Nterminaler Fusion mit Glutathion STransferase (GST) unter der Kontrolle des mit IPTG induzierbaren tacpromoters. Die Trennung des zu exprimierenden Proteins (CDPK) von der GST Domäne ist durch proteolytische Spaltung mit Faktor Xa möglich. Das offene Leseraster der CDPK cdna wurde mittels PCR amplifiziert. Der eingesetzte 5 und 3 Primer (im Anhang aufgeführt) war am 5 Ende phosphoryliert, bzw. wies am Ende eine Restriktionsschnittstelle für das Enzyme KpnI auf. Im Reaktionsansatz von 100 µl Volumen wurden 500 ng cdna, 0.5 µm beider Primer, 0.1 mm dntps und 2.5 U Pwo Polymerase im entsprechenden MgCl 2 Puffer (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Schweiz) eingesetzt. Die PCR im DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus) umfasste 25 Zyklen (95 C, 15 s; 52 C, 30 s; 72 C, 2 min; nach dem zehnten Zyklus wurde die Reaktionszeit bei 72 C jeweils um 20 s gegenüber dem vorhergegangenen Zyklus verlängert. Die amplifizierten PCRProdukte wurden mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und mit KpnI restringiert. Die über ein Agarosegel aufgetrennten Produkte wurden mit dem Kit prep@gene (BioRad) gereinigt. Entsprechend wurde der pgexg Vektor mit StuI und KpnI restringiert und mit CIAP dephosphoryliert. Die Ligation erfolgte mit T4DNA Ligase über Nacht bei 16 C und resultierte in pgexg/cdpkl. Auf gleiche Weise wurde eine C terminal um die calmodulinähnliche Domäne verkürzte Form der CDPK amplifiziert und kloniert (Primer sind im Anhang aufgeführt). Der resultierende Expressionsvektor wurde mit pgexg/cdpkk bezeichnet Transformation von E. coli DH5α mit pgexg/cdpkl/k Für die Transformation wurden die Ligationsansätze aus zu je 200 µl kompetenten E. coli DH5α Zellen, die auf Eis aufgetaut wurden, zugegeben und 30 min auf Eis, 30 s bei 42 C und 5 min auf Eis inkubiert. Der Ansatz wurde mit 800 µl LBMedium ergänzt und für 45 min bei 37 C auf dem Schüttler inkubiert. Zum Ausplattieren wurden 50 µl bzw. 500 µl des Ansatzes auf LBPlatten mit 100 mg/l Ampicillin gebracht und über Nacht bei 37 C inkubiert. Mit den auf LB/AmpPlatten gewachsenen Kolonien wurden 2 ml LB/AmpFlüssigkulturen, 19

24 Material und Methoden (100 ng Ampicillin/ml LBMedium) inokuliert. Die Flüssigkulturen wurden erneut über Nacht bei 37 C und 220 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Nach der PlasmidIsolation (2.2.3) wurde deren Identität anhand von Restriktions und Sequenzanalyse (2.2.4) bestätigt Transformation von E. coli BL21(DE3)RIL mit pgexg/cdpk L/K Zur Transformation von E. coli BL21(DE3)RIL wurden Aliquots von 50 µl auftauender kompetenter E. coli Zellen mit je 1 µl verdünntem βmercaptoethanol (1:10) versetzt und 10 min auf Eis gehalten. Während dieser Inkubationszeit wurden die Bakterien alle 2 min vorsichtig gemischt. Nach der Zugabe von je 50 ng der pgexg/cdpkl/k PlasmidDNAs (2.2.10) folgten 30 min Inkubation auf Eis, 20 s Hitzeschock bei 42 C und weitere 2 min auf Eis. Die Ansätze wurden mit 450 µl LBMedium ergänzt und für ca. 45 min im 37 C Wasserbad inkubiert. Auf LB/AmpPlatten (100 mg/l Ampicillin) wurden jeweils 50 µl bzw. 200 µl des Transformationsansatzes ausplattiert und über Nacht bei 37 C inkubiert Anzucht von E. coli BL21(DE3)RIL Zellen Die Anzucht der Bakterien erfolgte in 5 ml LBFlüssigkulturen in Gegenwart von 100 mg/l Ampicillin. Die über Nacht bei 37 C und 220 rpm gewachsenen Zellen wurden andern Tags in 500 ml LB/AmpFlüssigkulturen transferiert und wie zuvor bei 37 C und 220 rpm bis zu einer optischen Dichte von 1.0 angezogen. Durch Zugabe von IPTG zu 1 mm wurde die Expression des Fusionsproteins induziert. Daraufhin wurden die Schüttelkulturen bei Raumtemperatur oder bei 30 C gehalten. Die Zellen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten abzentrifugiert (3 min, 2400 xg, 4 C) und das Sediment wurde bei 80 C gelagert. 20

25 Material und Methoden Aufschluss von E. coli BL21(DE3)RIL Zellen Das Zellsediment einer 250 ml Kultur wurde mit Hilfe einer 10 ml Stabpipette in 30 ml Puffer A (10 mm NaCl, 1 mm EDTA, 50 mm Tris/HCl, ph 8), 1 mg/ml Lysozym, 1 mm PMSF und einer Spatelspitze DNAse resuspendiert. Die Lyse erfolgte während 20 min auf Eis. Der Zellaufschluss erfolgte am Sonicator (W380, Heat Systems, Ultrasonics). Dazu wurde die Zellsuspension 5x 30 s mit Ultraschall behandelt. Zelltrümmer sowie unlösliche Proteine, sogenannte Inclusion Bodies, wurden durch Zentrifugation (30 min, 2800 xg, 4 C) entfernt. Der Überstand wurde über einen Faltenfilter filtriert und bis zu seiner Verwendung bei 4 C gelagert. Zur Reinigung der unlöslichen Proteine wurde das Sediment unlöslicher Proteine mit 1% NP40 in 30 ml Puffer A gewaschen und erneut in 30 ml Puffer A resuspendiert. Aliquote des Überstands als auch des Sediments wurden durch SDSPAGE analysiert. 2.3 ProteinAnalytische Methoden SDSPAGE / WesternBlot Die Auftrennung des Proteingemisches erfolgte über ein 8% SDSPolyacrylamidgel, in einem diskontinuierlichen Gelsystem nach Lämmli (1970), welches sich aus einem 4.5%igen Sammelgel und einem 8%igen Trenngel zusammensetzt. Vor dem Laden des Gels, wurde die Proteinlösung mit SDS Lämmli Probenpuffer versehen und während 5 min bei 95 C denaturiert. Die Elektrophorese dauerte 2.5 h bei 150 V. Zur Anfärbung der Proteinbanden wurde Coomassie Brillant Blue R 250 eingesetzt. Der Transfer (Western Blot), der mittels SDSPAGE aufgetrennten Proteine auf eine Nitrocellulosemembran (Schleicher & Schuell), erfolgte während 1 h bei 200 ma im Blottingpuffer (gemäss 2.1.1) Reinigung der GSTCDPK Fusionproteine Das Reinigungsprinzip der Glutathion Sepharose Affinitätschromatographie beruht auf der Fähigkeit des GST Anteils des Fusionsproteins, an die Säulenmatrix zu binden. 21

26 Material und Methoden Glutathion Sepharose 4BSäulen von 2 ml Bettvolumen wurden bei 4 C mit Puffer A (aus ) äquilibriert. Die Kapazität der Matrix beträgt 5 mg Fusionsprotein je 1 ml Bettvolumen. Bei einer Flussrate von 4 ml/h wurde der Proteinextrakt (2.2.13) auf die Säule aufgetragen und anschliessend bei erhöhter Flussrate (7 ml/h) mit 50 ml Puffer A gewaschen. Nach einem weiteren Waschgang mit 15 ml 50 mm Tris/HCl, ph 8, wurden GSTCDPK Fusionsproteine mit 5x 2 ml 10 mm reduziertem Glutathion in 50 mm Tris/HCl, ph 8, von der Säule eluiert und bei 4 C oder 20 C gelagert. Die Bestimmung der Proteinkonzentration der gesammelten Eluatfraktionen erfolgte nach Bradford (1976). Das Farbreagens (basierend auf Coomassie Brilliant Blue G250, Pierce Chem. Co.) wurde 1:10 (v/v) mit der zu analysierenden Proteinlösung gemischt und anschliessend im Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 595 nm gemessen. Die Proteinkonzentrationen wurde anhand einer BSA Eichgerade errechnet Bindung von 45 Ca 2+ Die mittels SDSPAGE (2.3.1) aufgetrennten Proteine wurden elektrophoretisch auf eine Nitrocellulosemembran übertragen (Western Blot, 2.3.1). Nach erfolgtem Transfer wurde die Membran 3x 20 min in (60 mm KCl, 5 mm MgCl 2, 10 mm Imidazol/HCl, ph 6.8) gewaschen. Zum Test auf Bindung von 45 Ca 2+ wurde die Membran in 20 ml einer Lösung von 60 mm KCl, 5 mm MgCl 2, 10 mm Imidazol/HCl, ph 6.8 und 20 µci 45 CaCl 2 für 10 min im Mini Hybridisierungsofen bei RT inkubiert. Anschliessend wurde die Membran in Wasser gewaschen und für 12 h auf Kodak XOmat Röntgenfilm exponiert Autophosphorylierung immobilsierter CDPK Die mittels SDSPAGE (2.3.1) aufgetrennten Proteine wurden elektrophoretisch auf eine Nitrocellulosemembran übertragen (Western Blot, 2.3.1; ohne Methanol im Transferpuffer). Nach erfolgtem Transfer wurde die Membran zunächst in 30 mm HEPES mit 5% (w/v) Magermilchpulver 30 min bei Raumtemperatur abgesättigt. Dann wurde die Membran mit Denaturierungspuffer (7 M Guanidin Hydrochlorid, 50 mm Tris/HCl, ph 8.3, 50 mm DTT, 2 mm EDTA, 0.25% (w/v) Magermilchpulver) für 1 h bei RT inkubiert. Auf die Denaturierung 22

27 Material und Methoden folgte eine Renaturierung. Der dazu eingesetzte Renaturierungspuffer (50 mm Tris/HCl, ph 7.5, 100 mm NaCl, 2 mm DTT, 2 mm EDTA, 0.1% Nonidet P40, 0.25% (w/v) Magermilchpulver) wurde während 16 h mehrmals ausgetauscht. Die Membran wurde danach in 30 mm HEPES, ph 7.5 grüdlich gewaschen und anschliessend in calciumhaltigen (50 mm HEPES, ph 7.5, 10 mm MgCl 2, 1 mm EGTA, 2 mm DTT, 1.1 mm CaCl 2, 0.01µM ATP, µm [γ 32 P]ATP (4500 Ci/mmol)) bzw. calciumfreiem Kinase Puffer (50 mm HEPES, ph 7.5, 10 mm MgCl 2, 5 mm EGTA, 2 mm DTT, 0.01µM ATP, µm [γ 32 P] ATP (4500 Ci/mmol)) während 30 min bei RT im MiniHybridisierungsofen inkubiert. Es folgten Waschschritte mit 30 mm HEPES, ph 7.5, gefolgt von 1 N HCl (1 h, 40 C), gefolgt von 30 mm HEPES, ph 7.5. Daraufhin wurde die Membran 24 h auf einer PhosphorImager Kassette (Molecular Dynamics) exponiert. Die Auswertung erfolgte mit der Software Image Quant (Molecular Dynamics) Phosphoaminosäuretrennung mittels DC Die Analyse von Phosphoaminosäuren wurde nach der Methode von Shi et al (1999) in leicht abgeänderter Form übernommen. Das nach (2.3.2) gereinigte GSTCDPKL Protein (5 µg) wurde zur Autophosphorylierung in einem Reaktionsvolumen von 500 µl mit 50 mm HEPES, ph 7.5, 10 mm MgCl 2, 1 mm EGTA, 1.1 mm CaCl 2, 2 mm DTT, µm ATP und µm [γ 32 P]ATP (4500 Ci/mmol) für 30 min bei 30 C inkubiert. Zur Präzipitation des Proteins mit 10% (w/v) Trichloressigsäure wurde der Ansatz 10 min auf Eis gehalten und anschliessend 10 min zentrifugiert. Daran schlossen sich drei Waschschritte mit je 5% TCA und ein weiterer mit 95% (w/v) Ethanol an. Das Protein wurde in 200 µl 6 N HCl bei 110 C für 1 h hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde in vacuo eingetrocknet, dann in 6 µl einer wässrigen Lösung nichtradioaktiver Phosphoaminosäuren (je 2 mg/ml PThr, PTyr und P Ser) resuspendiert und auf eine cellulosebeschichtete Dünnschichtplatte (E. Merck, Darmstadt, Deutschland) aufgetragen. Die zweidimensionale Auftrennung der hydrolysierten Aminosäuren erfolgte in erster Dimension während 10 h in Isobuttersäure:0.5 M NH 4 OH (5:3, v/v). In zweiter Dimension erfolgte die Trennung während 7 h in Propionsäure:1 M NH 4 OH:2Propanol (45:17.5:17.5, v/v/v). Die Platte wurde getrocknet und zur Aminosäureanfärbung mit einer 0.25% Ninhydrin/Aceton Lösung besprüht und 10 min bei 60 C inkubiert. Zur Autoradiographie wurde die Platte für 20 min auf Kodak XOmat 23

28 Material und Methoden Röntgenfilm exponiert. Durch Vergleich des Röntgenfilms und der gefärbten Platte konnten die in der CDPK autophosphorylierten Aminosäuren identifiziert werden Aktivitätstest Kinetische Analysen der CDPK Aktivität mit dem Oligopeptid Syntide2 (PLARTLSVAGLPGKK) als Substrat wurden nach Harmon et al. (1994) durchgeführt. In einem 50 µl Reaktionsansatz wurden 30 nm CDPK mit unterschiedlich hohen Substratkonzentrationen (10 µm, 20 µm, 30µM, 40 µm, 50 µm, 100 µm 150 µm) und dem Kinase Puffer (50 mm HEPES, ph 7.5, 10 mm MgCl 2, 1 mm EGTA, 1.1 mm CaCl 2, 2 mm DTT, 0.1 mg/ml BSA) zusammengebracht. Nach einer Inkubationszeit von 5 min bei 30 C, wurde die Reaktion durch Zugabe von 60 µm [γ 32 P]ATP (500 cpm/pmol) gestartet und für weitere 15 min bei 30 C inkubiert. Abgestoppt wurde die Reaktion durch Auftragen von 10 µl des Reaktionsansatzes auf einen Streifen (1 cm x 2 cm) Phosphocellulosepapiers (Whatman P81). Die Streifen wurden anschliessend gründlich in 150 mm H 3 PO 4 gewaschen und zum Trocknen mit Aceton gespült. Die luftgetrockneten Proben wurden mit 4 ml Scintillationslösung versetzt und am Scintillationszähler gemessen. 24

29 Resultate 3. RESULTATE Mittels eines Datenbankvergleichs wurde ein EST der Tomate (tomest: expressed sequence tag der Tomate) identifiziert, der hohe Sequenzierähnlichkeit mit der von Yoon et al. (1999) beschriebenen Calciumabhängigen Proteinkinase aus Tabak aufwies. Ein volllänge cdna Klon dieser CDPK aus Tomate sollte mittels PCR kloniert werden. 3.1 Klonierung des 3 Endes einer Calciumabhängigen Proteinkinase (CDPK) aus Tomate Zur Klonierung des 3 Endes dieser CDPK cdna wurden cdnabanken von der Tomatenblüte und dem Tomatenspross, die in den pbluescript SK() Vektor konstruiert worden waren (angelegt von Andreas Schaller), als Matrize eingesetzt. Die Amplifikation der CDPK cdna erfolgte mittels PCR. Als 5 Primer wurde ein Oligonukleotid eingesetzt (vgl. Abb. 2), dessen Sequenz von dem EST (tomest) abgeleitet worden war. Der T7 Primer des pbluescript Vektors diente als 3 Primer. Von den 22 Klonen, die der Sequenzierung zugeführt wurden, wiesen alle 22 Klone dieselbe Sequenz auf. Lediglich die Länge der 3 untranslatierten Regionen unterschied sich in den cdnas die aus der Spross, bzw. BlütenBank isoliert worden waren. Die erhaltene Nukleotidsequenz des 3 Endes der CDPK cdna stimmte vollständig mit dem EST der Datenbank überein (Abb. 2). Die cdna wies eine singuläre HindIIISchnittstelle auf. Durch Restriktion mit HindIII und mit XhoI im Bereich des Polylinkers des Vektors konnte ein Fragment generiert werden, welches der 3 untranslatierten Region der mrna entspricht. Dieses Fragment wurde als Sonde bei Northern und Southern Blot Analysen eingesetzt. 26

30 Resultate 1 50 LePK52 klon GGTATGGGTG ATGAGGCCAC tomest GATGAATTGG AAAACGCTAT GAAGGAATAT GGTATGGGTG ATGAGGCCAC klon25 CATCAAGGAG ATAATCGCAG AGGTGGGCAC TGACAATGAC GGTAGGATCA tomest ATTACGAGGA GTTCTGTGCT ATGATGAGAA GTGGAACAAC ACAACCACAA klon25 CAAAAGCTTT TCTAGTGCAT CGAGAGCAAA TTACCCTTGC AACGAGCAGA tomest CAAAAGCTTT TCTAGTGCAT CGAGAGCAAA TTACCCTTGC AACGAGCAGA klon25 GAACGTTCAC CAGCCAGCAC GATGGAGAGA TGTCTATCAC GAGAGGATCA tomest GAACGTTCAC CAGCCAGCAC GATGGAGAGA TGTCTATCAC GAGAGGATCA klon25 GTAACTTAAC ATACTTCCAT ATTTCTTCAA TCCTTCAGCT ATCTTCAAAA tomest AGCACTGGAG TACATGAGAC CTTTTTCGTG TAGGTTGAGT TCGCGTGGAA klon25 AATGTGTGTA TAGCTAGTTA ATGGTATATT TCGAGTTTCT TGTAATGTAT tomest AATGTGTGTA TAGCTAGTTA ATGGTATATT TCGAGTTTCT TGTAATGTAT klon25 TTGATCCCCC TTCGTAATTT TGTGTGGATC GCGTTGTGAA GTTGACCTCC tomest TTGATCCCCC TTCGTAATTT TGTGTGGATC GCGTTGTGAA NNAAA klon25 CGTAGAGATT ATAACAAGAC AATCTGAATA TAGCTTTATG CTTGAAAAAA tomest Abb. 2: Nukleotidsequenz des 3 Endes der CDPK cdna, isoliert aus der BlütenBank. Die kursiv gedruckten Nukleotide bilden die Schnittstelle für HindIII. Der PCR Primer (LePK32) ist hervorgehoben. Die cdnas, welche aus dem Spross isoliert wurden, waren um die unterstrichene Nukleotidsequenz kürzer. 3.2 Southern Blot Analyse 27

31 Resultate Genomische DNA der Tomatenpflanze wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen (DraI, EcoRI, HindIII und XbaI) restringiert und nach Trennung über ein Agarosegel (Abb. 3A) auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. Die Hybridisierung der Membran erfolgte mit dem HindIII/XhoIFragment der bislang erhaltenen CDPKcDNA (s. 3.1), welches der 3 untranslatierten Region des Transkriptes entspricht. DNAFragmente, welche mit der Sonde hybridisierten, weisen im Southern Blot eine Markierung auf (Abb. 3B). In jeder Spur konnte nur ein Fragment nachgewiesen werden. Offensichtlich ist die eingesetzte Sonde genspezifisch, d.h. sie hybridisiert mit nur einem Gen der CDPKGenfamilie. Die Sonde ist demnach geeignet, in weiterführenden Experimenten die Expression dieser CDPKIsoform auf Northern Blots zu untersuchen. A XbaI HindIII EcoRI DraI B XbaI HindIII EcoRI DraI kb kb Abb. 3: SouthernAnalyse genomischer DNA aus Lycopersicon esculentum cv. Castelmart II, die mit XbaI, HindIII, EcoRI und DraI geschnitten wurde. Es wurden jeweils 10 µg genom. DNA verwendet, elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und dort mit einer CDPKSonde (entsprechend dem 3 untranslatierten Bereich der mrna) hybridisiert. Die Lage und Grösse bekannter DNA Fragmente (Gibco/BRL, Basel, Schweiz) sind links der Abbildungen angegeben. Sowohl das EtBr gefärbte Gel (A), als auch der davon erhaltene GelBlot (B) sind gezeigt. 3.3 Northern Blot Analyse 28

32 Resultate Zunächst wurden die organspezifische Expression in Tomatenpflanzen untersucht. Dazu wurde die GesamtRNA aus Kotyledonen, Blättern, Wurzeln, Blüten und aus in Suspension kultivierten Zellen isoliert, aufgetrennt und zur Sichtung der entsprechenden mrnas mit der unter 3.2 beschriebenen Sonde hybridisiert. Es zeigte sich, dass die CDPK in allen hier untersuchten Organen exprimiert ist. Die Transkriptspiegel waren jedoch in Kotyledonen und Blättern wesentlich geringer als in Wurzeln, Blüten oder undifferenzierten Zellen (Abb. 4) CDPK UBQ Abb. 4: Northern Blot Analyse der CDPK Expression in verschiedenen Organen der Tomate. Jeweils 4.5 µg GesamtRNA aus Kotyledonen (1), Blättern (2), Wurzeln (3), Blüten (4) und Zellkulturen (5) wurden der RNA Gelblot Analyse unterzogen. Die Blots wurden mit einer spezifischen CDPK und einer Ubiquitin Sonde hybridisiert und mittels des PhosphorImagers analysiert. Weiterhin wurde eine mögliche Induzierbarkeit durch Verwundung oder Fusicoccin untersucht. Während sich die Transkriptspiegel der CDPK in Blättern verwundeter Tomatenpflanzen nicht änderten (Daten nicht gezeigt), war eine deutliche Akkumulation des 29

33 Resultate Transkripts in Blättern Fusicoccin behandelter Pflanzen zu beobachten (Abb. 5). Die Induktion war 4 h nach Gabe des Toxins maximal, danach nahm der steady state Gehalt des CDPK Transkriptes wieder ab. Die Induktion der CDPK Expression durch Fusicoccin ist daher schneller als die von typischen Pathogenesis related (PR) Proteinen (Abb. 5). Das in Abbildung 5 gezeigte, mit Ethidiumbromid gefärbte Gel ist mit jenem identisch, von dem die RNA auf eine Membran transferiert wurde. Es zeigt, dass die GesamtRNAKonzentration in den entsprechenden Spuren gleich war. 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 4 h 6 h 8 h CDPK Saure Chitinase 25s rrna Ethidiumbromidgel 18s rrna Abb. 5: Northern Blot Analyse Fusicoccin gefütterter Tomatenpflanzen. Zur Analyse wurden jeweils 4.5 µg GesamtRNA eingesetzt. Die RNAGel Blots wurden mit radioaktiv markierten Sonden der CDPKcDNA (dem HindIII/XhoIFragment) und zur Kontrolle mit einer sauren Chitinase hybridisiert. Ein weiteres Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt. 0 8 h: Zeitangabe nach Beginn der FusicoccinBehandlung. 3.4 Amplifizierung des 5 Endes mittels RACEPCR 30

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