St. Gallen Hämostaseologisch relevante Proteine da war doch was? HICC Haemostasis In Critical Care

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1 HICC Haemostasis In Critical Care St. Gallen 2007 Hämostaseologisch relevante Proteine da war doch was? André Haeberli Departement Klinische Forschung Universität Bern

2 Vorgeschichte > Ca. 150 Proteine, die eine hämostaseologische Bedeutung haben > Ca. 60 Tests, die im Verlaufe der Jahre etabliert wurden > - proteinchemisch > - immunologisch > - funktionell HICC 2007 St. Gallen,

3 Woher kommen wir in der Proteinanalytik? Tiselius freie Elektrophorese 1930 Wieland, Fischer Papierelektrophorese 1948 Ornstein, Davis PAGE, Disc 1964 Shapiro SDS-PAGE 1967 O'Farrell 2D-Elektrophorese 1975 Mikkers Kapillarelektrophorese 1979 Wilkins Proteomics 1994 HICC 2007 St. Gallen,

4 Immunologische Methoden Vielfalt an verschiedenen immunologischen Methoden > Präzipitationsmethoden > - Ouchterlony > - Immunelektrophorese > - Elektroimmunodiffusion (Laurell) > - Nephelometrie > Bindungsreaktionen > - Radioimmunoassay > - Enzymimmunoassay (ELISA, EIA, u.a.) > - Lumineszenezimmunoassay (LIA) HICC 2007 St. Gallen,

5 Funktionelle Tests > - Blutungstests > - Thrombinzeit > - APTT > - Thrombelastographie > - Thrombozytenaggregation > - Thrombingeneration > - u.v.a. HICC 2007 St. Gallen,

6 Einige Titel zur Bedeutung einzelner Faktoren zu. Tissue factor and total tissue factor pathway inhibitor levels in coronary artery disease: correlation with the severity of atheromatosis TFPI plasma levels in women with pre-eclampsia Plasma thrombomoduin in pre-eclampsia Increased TAFI levels and the risk of thromboembolism Clinical evaluation of a new quantitative highly sensitive D-Dimer assay for exclusion of deep vein thrombosis and pulmonary embolism Einige Titel von Abstracts vom ISTH Kongress, Genf 2007 HICC 2007 St. Gallen,

7 Signifikanz eines Tests Wer hat das nicht schon mehrmals erlebt, man ist überzeugt, den Test zu kennen, der mit hoher Präzision eine Diagnose bestätigt. Grössere Studien machen dann den Test, von dem man überzeugt war, wieder fragwürdig. Tausende von Artikeln, die Resultate von einzelnen oder gelegentlich mehreren Tests präsentieren, und daraus auf eine signifikante Bedeutung hinstreben. Jahre später wird dann die Bedeutung des Tests wieder relativiert. Aussagen aus eigener Erfahrung HICC 2007 St. Gallen,

8 Wohin gehen wir? Weitere einzelne Tests werden entwickelt Single Plex Eine Vielfalt von einzelnen Tests wird kombiniert Multiplex Bekannte Proteine werden identifiziert und quantifiziert, Neue Proteine werden gefunden (Massenspektrometrie) Proteomics HICC 2007 St. Gallen,

9 Single Plex - Multiplex Heute In Zukunft Vorteile Multiplex Bestimmung einzelner Parameter, gelegentlich mehrerer Parameter, funktionell oder immunologisch = Single Plex Bestimmung eines Satzes von und mehr Parametern in einer Probe und einem Ansatz = Multiplex Sehr kleines Probenvolumen (< 50 Mikroliter) Relativ schnell (< 4 Stunden) Kostengünstiger (< 10 Fr./Test) HICC 2007 St. Gallen,

10 Luminex Systeme Bioplex (BioRad) LiquiChip (Qiagen) Beide Systeme basieren auf dem Luminex-Prinzip xmap Technologie Farb-codierte Microsphären erlauben die simultane Bestimmung von bis zu 100 verschiedenen Analyten in einer Probe mit einem Volumen < 50 µl. HICC 2007 St. Gallen,

11 Genom & Genomics Gene Genom Genomics Ein Gen stellt den Code für verschiedene Protein-Sequenzen, 4 Bausteine (Nukleotide) Komplement der DNA Sequenz eines Organismus, statisch Analyse des DNA Satzes eines Organismus Identifikation von partiellen Squenzen, die die Eigenschaften eines Organismus bestimmen Verstärkungstechniken vorhanden und etabliert! (PCR) HICC 2007 St. Gallen,

12 Proteom & Proteomics Proteine Proteom Proteomics Übersetzungsprodukte der Gene, 20 Bausteine (Aminosäuren) Ein Gen kann verschiedene Proteine kodieren. Proteine sind dynamische und strukturelle Elemente, verantwortlich für Funktion, Form, etc. Gesamtheit des Protein Profils in einer biologischen Probe zu einer gegebenen Zeit (dynamisch!) Analyse der Gesamtheit des Protein Gehalts in einer biologischen Probe zu einer gegebenen Zeit (qualitativ und quantitativ) HICC 2007 St. Gallen,

13 Genom & Proteom Raupe und Schmetterling Gleiches Genom, aber unterschiedliches Proteom? HICC 2007 St. Gallen,

14 Functional Genomics (Phenomics) DNA Komplete Beschreibung der Gene in einem Organismus Genom Genomics RNA Komplete Beschreibung der mrna im Genom Transcriptom Transcriptomics Proteine Komplete Beschreibung der Proteine, die vom Genom exprimiert sind Metaboliten Komplete Beschreibung der Metaboliten, die durch das Genom entstehen Proteom Proteomics Metabolom Metabolomics Katalog aller Protein-DNA, Protein-RNA und Protein-Protein Interaktionen Interactom System Biology HICC 2007 St. Gallen,

15 Analytische Methoden Multiplex Analysen Protein Chip Protein Protein Interaktion Elektropherese HPLC Massenspektrometrie Luminex (BioRad) Ciphergen Biacore 1D, 2D HICC 2007 St. Gallen,

16 Protein Chip Technology Ciphergen, Zyomyx, etc. Klassische Oberflächen Antigen Chip Antikörper Chip Protein Chip Ligand Chip Kohlehydrat Chip Versch. Protein Interaktionen Antigen-Antikörper Bindung Antikörper-Antigen Bindung Markierte Proteine, Liposomen, Medikamente, Enzyme Rezeptoren Antikörper HICC 2007 St. Gallen,

17 Ciphergen Technologie oder jede andere Protein Chip Technologie Analyse der Proteine, die auf dem Chip zurückbleiben, nachdem dieser selektiv gewaschen wurde (Kombinationen von nicht- ionischen und ionischen Detergentien oder Puffer mit verschiedenen Ionenstärken SELDI (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization) MS Analysis HICC 2007 St. Gallen,

18 2D-Gel Elektrophorese Elektrophoretische Trennung 1. Dimension: Isoelektrische Fokussierung 2. Dimension: SDS-PAGE Färben (Coomassie oder Sypro Ruby) Spots Ausschneiden Verdauen mit Trypsin Massenspektrometrie (Maldi-TOF, MS-MS) HICC 2007 St. Gallen,

19 2D-Gel Elektrophorese 2. Dimension: Trennung durch Mol.gewicht 1. Dimension: Trennung durch pi ph 3 ph 10 HICC 2007 St. Gallen,

20 Massenspektrometer = Universal-Detektor Massenspektrometrie in Proteomics und Medizin 1. Mindestens 1000-fach empfindlicher als die Fluoreszenzfärbung bei der 2D Elektrophorese (Sypro Ruby) 2. Strukturelle Charakterisierung der Proteine; e.g. Mikroheterogenität, post-translationelle Modifikationen, genetisch unerwartete Protein-Sequenzen 3. Definition von Protein-Teilen die unter gegebenen Bedingungen exprimiert werden 4. Messung der Veränderung der Protein Expression in Biologie und Medizin HICC 2007 St. Gallen,

21 Vorteile Massenspektrometrie > - Identifikation des Proteins, AS-Sequenzbestimmung > - Quantitative Bestimmung > - Hohe Empfindlichkeit > - Bestimmung mehrerer Proteine in einem Ansatz > bis zu 50 Proteine identifiziert und quantifiziert > - Entdeckung von "unbekannten" Proteinen, d.h. > Proteine, die man für ein Krankheitsbild nicht gekannt > oder als nicht relevant erachtet hat. HICC 2007 St. Gallen,

22 Die 22 "wichtigsten" Proteine im Plasma = 99% des Proteingehalts HICC 2007 St. Gallen,

23 Dynamischer Bereich der Proteine in Flüssigkeiten Zell Extrakte bis zu 10 5 Körper Flüssigkeiten * bis zu Blut bis zu10 8 * Schweiss, Tränen, Urin, u.a. HICC 2007 St. Gallen,

24 Blut Plasma Albumin 50 g/l ~ 1 mmol/l Factor VIII 0.2 mg/l ~ 1 nmol/l Somatotropin ng/l - mg/l pmol/l nmol/l Dynamischer Bereich pmol mmol 10 9 Normal pmol µmol 10 6 HICC 2007 St. Gallen,

25 Vielfalt der Proteine Humanes Genom Im Mittel ~ 7 Proteine/Gen Gene Proteine - Isoformen - posttranslationelle Modifikationen (~100 Modifikationen) Gerinnung: Vitamin-K abhängige Faktoren - proteolytische Fragmente, funktionell bedeutsam Gerinnung: Aktivierung von Prothrombin zu Thrombin Heute ~ Proteine identifiziert ~ 2 % Spitze des Eisbergs HICC 2007 St. Gallen,

26 HUPO HPPP Human Proteome Organisation (HUPO) Human Plasma Proteome Project (HPPP) 3020 humane Proteine sind in EDTA-Plasma identifiziert und in der Protein Datenbank deponiert Zahl der identifizierten Proteine wird schnell wachsen HICC 2007 St. Gallen,

27 Zusammenfassung Mit der Analyse des Proteoms in klinischen Proben werden neue Konstellationen erfasst werden. Dazu werden bis jetzt unbekannte oder nur erahnte Verknüpfungen von Proteinen als diagnostisch interessant erscheinen. Es werden in Zukunft vorwiegend Proteinmuster signifikant für ein Krankheitsbild und dessen Verlauf dastehen. Es ist zu hoffen, dass diese Proteinmuster höhere Aussagekraft als die Bestimmung einzelner Proteine (Marker) haben wird. Die Technologie wird innerhalb von wenigen Jahren Routine sein. HICC 2007 St. Gallen,

28 Ausblick Das Proteinmuster kann in eine Chip-Technologie umgesetzt werden. Die Chip-Technologie kann automatisiert werden. Proteinmuster werden mit Krankheitsbildern korreliert und ergeben hoffentlich hoch signifikante Korrelationen. Proteinmuster, die mit einem Krankheitsbild korrelieren, werden eine Frühdiagnose einer Krankheit ermöglichen. HICC 2007 St. Gallen,