PROTEINBESTIMMUNG. Vergleich Bradford und BCA

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1 PROTEINBESTIMMUNG Vergleich Bradford und BCA

2 ÜBERSICHT Einleitung Theorie Durchführung Resultate und Diskussion Fragen

3 EINLEITUNG Aufgabenstellung: Vergleich der Methoden zur quantitativen Proteinbestimmung Standardkurven mit BSA und IgG Spiking mit Störsubstanzen Realproben messen Durchführung eines TCA-Fällung Versuchsplanung: 1. Versuchstag: Literaturstudium,Einarbeitung Versuchstag: Standardkurven sowie Spiking mit Störsubstanzen 4. Versuchstag: Auswertung / Wiederholung 5. Versuchstag Reserve / Präsentationsvorbereitung Mögliche Probleme: Zeitfaktor Pipettieren Methodisch bedingte Unsicherheiten

4 THEORIE BCA-METHODE 1. Schritt: Biuretreaktion 2. Schritt: Cu(I)-Ionen bilden mit Bicinchinon-Säure (BCA) einen violetten Farbkomplex hohe Empfindlichkeit geringe Störanfälligkeit

5 THEORIE: BRADFORD Coomassie-Brillantblau G250 Absorptionsmaximum wird von 465 auf 595nm verschoben unspezifische Bindung an kationische und nichtpolare Seitenketten am wichtigsten ist WW mit Arginin, weniger mit Lysin, Histidin, Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin

6 DURCHFÜHRUNG METHODEN Allgemein: Küvetten-Assay Standardreihen sowohl mit bovinem Serumalbumin (BSA) und Immunoglobulin (IgG) Doppelbestimmung Graphische Auswertung mittels linearer Regression Bradford-Assay: Stammlösungen 1 mg / ml 1:10 verdünnt 500 µl Probe mit 500 µl Farbstoff versetzt. 10 min bei RT inkubiert Bei 595 nm gemessen Probe BSA- Standard 100 µg/ml [µl] Wasser [µl] BSA-Konz. [µg/ml] A B C D E F G

7 DURCHFÜHRUNG METHODEN BCA-Assay: Stammlösungen 1 mg / ml nicht weiter verdünnt Mit und ohne Trichloressigsäure Fällung (TCA) Ohne Fällung: 50 µl Probe vorlegen Zugabe von 1 ml WR Probe BSA- Standard 1 mg/ml [µl] Wasser [µl] BSA-Konz. [µg/ml] A B C D E F G min bei 37 C inkubiert, bei 562 nm innerhalb von 10 min messen

8 DURCHFÜHRUNG METHODEN TCA-Fällung: Identische Konzentrationen für Stammlösungen 50 µl Probe mit 1 µl 10 % Triton X-100 und 12,5 µl 50 % TCA- Lösung versetzen Während 20 min bei 4 C inkubieren Während 15 min bei 4 C bei rpm zentrifugiere n Überstand vorsichtig verwerfen und Pelett mit Aceton versetzen Während 15 min bei 4 C bei rpm zentrifugiere n Aceton entfernen Pellet an Luft trocknen 50 µl 5 % SDS Zugeben und für 5 min bei 95 C inkubieren 1 ml WR zusetzten und 30 min bei 37 C inkubieren Bei 562 nm innerhalb von 10 min messen

9 DURCHFÜHRUNG METHODEN Spiking mit Störsubstanzen: Bradford BSA-Konzentration: 10 µg/ml Zugabe der Störsubstanzen in verschiedenen Konzentrationen BCA BSA-Konzentration: 250 µg/ml Zugabe der Störsubstanzen in verschiedenen Konzentrationen

10 RESULTATE BCA MIT UND OHNE FÄLLUNG

11 RESULTATE BRADFORD

12 RESULTATE Β-GALACTOSIDASE UND ROHEXTRAKT Substanz Methode Konzentration [mg/ml] β-galactosidase im Endprodukt BCA Bradford Bradford (Praktikumsversuch) UV (Praktikumsversuch) Rohextrakt BCA Bradford Bradford (Praktikumsversuch)

13 RESULTATE STÖRUNG MIT AMMONIUMSULFAT Literaturwerte: BCA 1.5 mm Bradford 1 mm

14 RESULTATE STÖRUNG MIT EDTA Literaturwerte: BCA 10 mm Bradford 100 mm

15 RESULTATE STÖRUNG MIT GLUCOSE Literaturwerte: BCA 10 mm Bradford 1 mm

16 RESULTATE STÖRUNG MIT SDS Literaturwerte: BCA 5 % Bradford %

17 RESULTATE STÖRUNG MIT TRITON-X-100 Literaturwerte: BCA 5 % Bradford %

18 DISKUSSION Standardkurven Üben um mit Methode umzugehen Reproduzierbarkeit Fällung mit TCA Ergebnis Andere Möglichkeiten

19 DISKUSSION Β-Galactosidase Übereinstimmung mit Werten von Praktikumsversuchen Rohextrakt BCA etwas höherer Wert

20 DISKUSSION Spiking mit Störsubstanzen Ammoniumsulfat Bradford: Störung 0.8 mm sollte nicht, jedoch kleine BCA: Übereinstimmung EDTA Bradford: bereits Störung bei 50 mm (Literatur 100mM) BCA: Übereinstimmung Glucose Bradford: keine Störung bei 5 mm, erst bei 20 mm (L:1 mm) BCA:bereits bei 5 mm (L:10mM) Störung (30% Abweichung)

21 DISKUSSION Spiking mit Störsubstanzen SDS Bradford: Störung bereits schon bei kleiner BCA: Triton-X-100 Konzentration Bei kleinster Konzentration bereits Störung Bradford: bereits grosse Störung bei 0.1 % (L:0.125%) BCA: auch bei 7% nur kleine Störung (L:5%)

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