Aus der Medizinischen Klinik 1 der Friedrich Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. med. Markus F. Neurath

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1 Aus der Medizinischen Klinik 1 der Friedrich Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. med. Markus F. Neurath Einfluss der Transglutaminase 2 auf HCV-induzierte Leberfibrose anhand HCV-exprimierender Hepatomzellen und Hepatischer Sternzellen Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nünberg vorgelegt von Thomas Christian Hantzsch aus Erlangen

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3 Meinen Eltern

4 I Inhaltsverzeichnis I II Zusammenfassung... IV I.I Hintergrund und Ziele... IV I.II Methoden... IV I.III Ergebnisse und Beobachtungen... IV I.IV Praktische Schlussfolgerungen... IV Abstract... V 1 Einleitung Das Hepatitis C Virus Epidemiologie, Ätiologie, Aufbau und Replikationszyklus Klinisches Erscheinungsbild Diagnostische Nachweisverfahren Therapie Die Rolle der Transglutaminase 2 im Organismus Allgemeines zur Enzymfamilie Aufbau und Funktion der Transglutaminase Die Regulierung der Transglutaminase Funktionen der Transglutaminase 2 im Organismus Auftreten der Transglutaminase 2 bei verschiedenen Krankheitsbildern Mechanismen der Leberfibrose Ätiologie und Pathogenese der Organfibrose Leberfibrose und ihre wichtigsten Mediatoren Pathogenese der HCV-induzierten Leberfibrose Ziel der Arbeit Materialien und Methodik Zellbiologische Methoden Anzucht und Kultivierung von Zelllinien Herstellung von konditioniertem Medium (KM) Herstellung von TG Proteinbiochemische Methoden Western-Blot ELISA Proliferationsassay Apoptoseassay Molekularbiologische Methoden Isolierung von RNA aus Zelllinien Photometrische Bestimmung des RNA-Gehaltes Polymerase-Ketten-Reaktion Reverse Transkriptase-PCR Quantitative Echtzeit -PCR Ergebnisse Morphologie der Zellen Charakterisierung der TG2-Synthese HCV-exprimierender Hepatomzellen nach Inkubation mit TG

5 II 3.3 Charakterisierung der Proliferationsrate HCV-exprimierender Hepatomzellen nach Inkubation mit TG Charakterisierung der Apoptoserate HCV-exprimierender Hepatomzellen nach Inkubation mit TG Charakterisierung der mrna-expression fibrose-assoziierter Gene in HCV-exprimierenden Hepatomzellen nach Inkubation mit TG mrna-expression von TGFb1 in HCV-exprimierenden Hepatomzellen nach Inkubation mit TG mrna-expression von CTGF in HCV-exprimierenden Hepatomzellen nach Inkubation mit TG mrna-expression von TNFa in HCV-exprimierenden Hepatomzellen nach Inkubation mit TG mrna-expression von Bax in HCV-exprimierenden Hepatomzellen nach Inkubation mit TG mrna-expression von TG2 in HVC-exprimierenden Hepatomzellen nach Inkubation mit TG mrna-expression von NS3 in HCV-exprimierenden Hepatomzellen nach Inkubation mit TG Charakterisierung der mrna-expression fibroseassoziierter Gene in HCV-exprimierenden Hepatomzellen nach Inkubation mit TG2/TG2-AK mrna-expression von CTGF in HCV-exprimierenden Hepatomzellen nach Inkubation mit TG2/ TG2-AK mrna-expression von Bax in HCV-exprimierenden Hepatomzellen nach Inkubation mit TG2/ TG2-AK mrna-expression von TG2 in HCV-exprimierenden Hepatomzellen nach Inkubation mit TG2/TG2-AK mrna-expression von NS3 in HCV-exprimierenden Hepatomzellen nach Inkubation mit TG2/TG2-AK Charakterisierung der mrna-expression fibrose-assoziierter Gene in hepatischen Sternzellen nach Inkubation mit KM der Hepatomzelllinien mrna-expression von TGFb1 in hepatischen Sternzellen nach Inkubation mit KM der Hepatomzelllinien mrna-expression von CTGF in hepatischen Sternzellen nach Inkubation mit KM der Hepatomzelllinien mrna-expression von a-sma in hepatischen Sternzellen nach Inkubation mit KM der Hepatomzelllinien mrna-expression von COL1 in hepatischen Sternzellen nach Inkubation mit KM der Hepatomzelllinien mrna-expression von COL3 in hepatischen Sternzellen nach Inkubation mit KM der Hepatomzelllinien mrna-expression von MMP-2 in hepatischen Sternzellen nach Inkubation mit KM der Hepatomzelllinien mrna-expression von MMP-13 in hepatischen Sternzellen nach Inkubation mit KM der Hepatomzelllinien mrna-expression von TIMP-1 in hepatischen Sternzellen nach Inkubation mit KM der Hepatomzelllinien Charakterisierung der mrna-expression fibrose-assoziierter Gene in hepatischen Sternzellen nach Inkubation mit TG mrna-expression von TGFb1 in hepatischen Sternzellen nach Inkubation mit TG

6 III mrna-expression von CTGF in hepatischen Sternzellen nach Inkubation mit TG mrna-expression von a-sma in hepatischen Sternzellen nach Inkubation mit TG mrna-expression von Bcl-2 in hepatischen Sternzellen nach Inkubation mit TG mrna-expression von Bax in hepatischen Sternzellen nach Inkubation mit TG mrna-expression von COL1 in hepatischen Sternzellen nach Inkubation mit TG mrna-expression von COL3 in hepatischen Sternzellen nach Inkubation mit TG mrna-expression von MMP-2 in hepatischen Sternzellen nach Inkubation mit TG mrna-expression von MMP-13 in hepatischen Sternzellen nach Inkubation mit TG mrna-expression von TIMP-1 in hepatischen Sternzellen nach Inkubation mit TG Tabellarische Darstellung der Ergebnisse für die mrna- Transkriptionsraten Diskussion Einfluss der TG2 auf die eigene Proteinsynthese in viral infizierten Hepatomzellen Einfluss der TG2 auf die Proliferations- und Apoptoserate von viral infizierten Hepatomzellen Einfluss der TG2 auf die Expression fibroserelevanter Gene in viral infizierten Hepatomzellen Einfluss der TG2 auf die Expression fibroserelevanter Gene in hepatischen Sternzellen Indirekter Einfluss der TG2 auf die hepatischen Sternzellen über konditioniertes Medium von viral infizierten Hepatomzellen Direkter Einfluss der TG2 auf die hepatischen Sternzellen Zusammenfassung der Ergebnisse Literaturverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Tabellen- und Abbildungsverzeichnis Abbildungen Tabellen Danksagung Lebenslauf

7 IV I Zusammenfassung I.I Hintergrund und Ziele Weltweit sind etwa 200 Millionen Menschen an HCV erkrankt. Dabei kommt es häufig zu einem chronischen Prozess, der zu einer progredienten Fibrosierung der Leber bis hin zur Entwicklung eines Hepatozellulären Karzinoms führen kann. Bereits seit vielen Jahren untersucht man bei derartigen fibrotischen Vorgängen die Funktion der Transglutaminase 2 (TG2). Bisher gibt es keinen wissenschaftlichen Konsens, doch scheint es wahrscheinlich, dass diesem Enzym durch seine transamidierende Funktion bei der Fibrogenese eine tragende Rolle zukommt. Dies wird unter anderem auf seine Interaktion mit dem Zytokin TGFb1 zurückgeführt, das als einer der stärksten profibrogenen Mediatoren gilt. Vorarbeiten in unserem Labor haben bereits gezeigt, dass viral infizierte Hepatomzellen vermehrt TG2 exprimieren. Unklar ist bislang, ob die Induktion der TG2-Transkription profibrogenen Charakter hat oder vielmehr als Abwehrmechanismus des Körpers dient. I.II Methoden Ziel der Arbeit war es, die Rolle der TG2 im Rahmen einer HCV-induzierten Leberfibrose genauer zu beleuchten. Hierfür wurden stabil transfizierte humane Replikon-Hepatomzellen, die die viralen Nicht-Strukturproteine NS3-NS5 exprimieren (Huh7 5-15) und moderat aktivierte Sternzellen der Ratte (HSZ) der Linie CFSC-2G mit extern zugegebener rekombinanter TG2 inkubiert und in Hinblick auf die Transkriptionsraten fibroserelevanter Gene (TGFb1, CTGF, TG2, COL1, COL3, a-sma, MMP-2, MMP-13 und TIMP-1) untersucht. Des weiteren wurde auch das Proliferations- und Apoptoseverhalten und die Proteinbiosynthese der TG2 in den Hepatomzellen unter dem Einfluss der TG2 analysiert. Als Vektorkontrolle diente die scheintransfizierte Hepatomzelllinie Huh7 pcdna3. I.III Ergebnisse und Beobachtungen Die Auswertung der Ergebnisse zeigt einen eher fibroseprotektiv zu bewertenden Einfluss der TG2. Dabei kommt es in HCV-infizierten Hepatomzellen zu einem Anstieg der profibrotischen Faktoren TGFb1 und CTGF und des immunmodulatorischen TNFa. Gleichzeitig wird auch vermehrt TG2 synthetisiert, welche vermutlich am Anfang der Fibrose als Gegenspieler der fibrotischen

8 V Veränderungen auftritt, in dem sie antiproliferativ vor allem auf die HSZ wirkt. Diese transkribieren daraufhin eine reduzierte Menge an TGFb1, CTGF, a-sma, COL1, COL3 und MMP-2. Da bei fortschreitender Fibrose allerdings auch vermehrt TG2 im EZR zu finden ist [100], muss man davon ausgehen, dass das Enzym dort durch exzessive Proteinquervernetzung ebenfalls zu einer Progression der fibrotischen Prozesse beitragen könnte und der anfangs protektive Effekt aufgehoben wird. I.IV Praktische Schlussfolgerungen Gerade in Hinblick auf Proliferation und Apoptose der viral infizierten Replikonzellen zeigt die TG2 in den Versuchen keinen entscheidenden Einfluss, was dem Umstand zuzuschreiben sein könnte, dass die Replikonzellen das in diesen Prozess involvierte Core-Protein nicht exprimieren. Weitere Experimente könnten deshalb den selektiven Einfluss der TG2 auf einzelne Virusproteine zum Inhalt haben. Des weiteren scheint extern zugegebene TG2 - unabhängig von einer HCV- Infektion der Hepatomzellen - einen antifibrotischen Effekt auf die HSZ zu haben. Ob eine abweichende Wirkung der TG2 auf die HSZ vorliegt, wenn sie selbst mit HCV infiziert sind, ist durch die vorliegenden Versuche nicht geklärt. Auch legen die Ergebnisse die Vermutung nahe, dass die Wirkung der TG2 bei zunehmender Fibrosierung in ihrer protektiven Wirkung nachlässt. Bevor die TG2 im Rahmen einer HCV-Infektion als pharmakotherpeutischer Ansatzpunkt dienen kann, gilt es deshalb zuerst, die Wirkungszusammenhänge dieses Enzyms im Organismus und auf das Virus genauer zu kennen.

9 VI II. Abstract Worldwide 200 million people are infected with HCV. In many cases it causes a chronic process leading to progressiv liver fibrosis up to hepatocellular carcinoma. For many years the function of Transglutaminase 2 (TG2) has been center of investigation in fibrotic activities. So far there is no scientific consensus, but it is likely, that this enzyme has a major role in fibrogenesis via its transamidation ability. This is particulary because of its interaction with cytokine TGFb1, which is one of the most potent profibrotic mediators. Our preliminary works have shown hepatoma cells transfected with HCV expressing more TG2. But it is still unclear, if induction of TG2 transcription is favoring liver fibrosis or becoming part of defence mechanism inside the infected organism. We tried to prove the role TG2 plays in HCV induced liver fibrosis. For this reason we incubated stabil transfected human replicon hepatoma cells, which express the viral non-structural proteins NS3 - NS5 (Huh7 5-15), and rapid Hepatic Stellate Cells (HSC) line FSCS-2G with recombinant TG2 in order to analyse transcription rate of profibrotic acting proteins (TGFb1, CTGF, COL1, COL3, a-sma, MMP-2, MMP- 13 and TIMP-1). Further we investigated the proliferation and apoptotic activity and the amount of TG2 synthesis of HCV infected hepatoma cells influenced by recombinant TG2. The mock-transfected hepatoma cell clone Huh 7 pcdna3 was used as negative control. The evaluation of our results shows a more protective influence of TG2 against fibrosis. Thereby in HCV infected hepatoma cells is occuring an induction of profibrotic factors e.g. TGFb1 and CTGF and of TNF-a, which is involved in immun system regulation. At the same time you can find an induction of TG2 production acting as an antagonist of fibrotic progress by having antiproliferativ effects on HSC. Thereupon these cells are transcribating less copies of TGFb1-, CTGF-, a-sma-, COL1-,COL3- and MMP-2-RNA. However, having detected an increase of TG2 in extracellular space while proceeding fibrosis [100] you have to assume that TG2 is taking part in progression of liver fibrosis through excessive protein cross-linking. This activity is deregulating the initial protective effect. With regard to proliferative and apoptotic properties of the HCV infected hepatoma cells TG2 shows no crucial influence in our experiments. This could be conditional upon the replicon cells we used containing no core protein, which is mainly involved

10 VII in those processes. Maybe other studies can imply selective effects of TG2 compared with particular virus proteins. So long there are also no results aviable of HCV infected HSC (instead of infected hepatoma cells) and their gene expression after incubation with TG2, that could be different to our findings. Finally the protective impact of TG2 on liver fibrosis in later states seems to slow down. So further investigations are necessary to characterise the connections of TG2 inside the organism and to HCV before etablishing therapeutic strategies for HCV infection with TG2 as target.

11 1 1 Einleitung 1.1 Das Hepatitis C Virus Das Hepatitis C Virus (HCV) gehört zu einer Gruppe von Viren, die sich vor allem durch eine pathologische Manifestation innerhalb der Leber äußern. Obwohl in ihrem klinischen Erscheinungsbild verwandt, stammen sie doch aus teils unterschiedlichen Virusfamilien. HCV selbst ist ein Mitglied der Flaviviridae. Neben diesen sind die Picornaviridae (Hepatitis A Virus), Hepadnaviridae (Hepatitis B Virus und Hepatitis D Virus), Calciviridae (Hepatitis E Virus) und die Circinoviridae (Transfusion Transmissible Virus) [103] als weitere Virusfamilien zu nennen, die in erster Linie eine Hepatitis verursachen können.[55] Zur weiteren Klassifizierung und Unterscheidung existiert innnerhalb der Familien eine Unterteilung in Gattungen; für HCV ist dies die Gattung Hepacivirus.[55] Epidemiologie, Ätiologie, Aufbau und Replikationszyklus Die Entdeckung von HCV gelang 1989 [77] und der Mensch ist der einzige natürliche Wirt für dieses Virus.[112] Die Durchseuchung liegt weltweit bei etwa 200 Millionen Menschen [5],[147] und variiert stark in den verschiedenen Erdregionen. Von dem im Durchmesser nm großen Virus konnten bisher 6 Genotypen (Typ1-6) ausgemacht werden, die in weitere Subgruppen (1a, 1b, 1c,..., 6) unterteilt werden.[112] In (West-)Europa dominieren Typ 1a/1b, 2 und 3, während in Afrika und Asien vor allem Typ 4-6 vorzufinden sind.[77] Bis zum heutigen Tag war es trotz intensiver Forschungen nicht möglich, eine wirksame Schutzimpfung gegen eine Infektion mit HCV zu entwickeln.[32] Die Übertragung des Virus erfolgt in erster Linie über Blutkontamination, d.h. über die Transfusion von Blutprodukten, als Folge chirurgischer Eingriffe, von Nadelstichverletzungen oder intravenösen Drogenkonsums. Durch die standardisierte, routinemäßige Kontrolle von Blutprodukten konnte das Risiko der Transfusionsübertragung zumindest in den Industrienationen stark eingedämmt werden, so dass in diesen Gebieten etwa 60-70% der Neuinfektionen auf den gemeinsamen Gebrauch von Spritzen beim Applizieren von Drogen zurückzuführen sind.[102] Doch sind auch Fälle einer Infektion beschrieben, in denen keine vorherige

12 2 Exposition mit Fremdblut ausgemacht werden konnte. Eine Übertragung auf sexuellem Weg wird deshalb ebenfalls diskutiert. Eine Studie aus den USA suggeriert hier einen Risikofaktor, wobei eine Assoziation zur Herpes-simplex Typ 2-Infektion bestehen könnte.[4] Ebenso lässt sich bei einigen der HCV-Patienten das Virus im Speichel nachweisen, die Übertragung auf diesem Weg ist allerdings wissenschaftlich nicht gesichert.[26] Hauptreplikationsort des Virus ist die Leber, vor allem innerhalb der Hepatozyten, doch wird vermutet, dass auch in den Zellen des mononukleären Systems, möglicherweise den B-Lymphozyten, eine Virusreplikation stattfindet.[77],[8] Das virale Genom besteht aus einer einzelsträngigen RNA in Plusstrangrichtung, die annähernd 9600 Nukleotide enthält. Die RNA kodiert für ein Polyprotein, das kound posttranslational proteolysiert und dabei in 10 Einzelproteine gespalten wird.[8] Die RNA unterteilt sich in eine Translationsvorlage für Struktur- und Nicht- Strukturproteine. Die 3 Strukturproteine Core, E1 und E2 benötigt das Virus für den Schutz der replizierten RNA. Das Core-Protein fungiert dabei als Kapsid zum direkten Schutz der RNA, doch werden ihm noch weitere Funktionen in der Pathogenese der Hepatitis zugeschrieben. Durch Interaktionen des Proteins mit der Wirtszelle kommt es zur Modulation der Transkription, einem induzierten Zelltod, einer gewebsschädigenden Immunantwort und Störungen im Fettstoffwechsel.[113] Die beiden Proteine E1 und E2 bilden die Hülle, die das Nukleokapsid umgeben. Da sie direkt an der Oberfläche des Viruspartikels lokalisiert sind, erfolgt durch sie wahrscheinlich auch die rezeptorvermittelte Endozytose in die Wirtszelle. Ein mögliches Ziel von E2 ist dabei die Bindung an CD81, das auf der Oberfläche von Hepatozyten und B-Lymphozyten exprimiert wird.[117] Die Nicht-Strukturproteine (NS) werden der Reihe nach mit NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B bezeichnet.[113] Sie bilden die viruseigenen Enzyme, die das ursprüngliche Polyprotein spalten und die RNA replizieren (Proteinasen, Helicase, RNA- Polymerase).[112] Die Polymerase verfügt bei der Replikation über keine Funktion des Korrekturlesens, wodurch sich innerhalb eines infizierten Organismus eine breite Vielzahl an Genotyp-Abweichungen findet, die es dem Virus u.a. ermöglichen, einer gerichteten Immunantwort zu entgehen.[77] Zwischen den Sequenzen für Strukturproteine und Nicht-Strukturproteine befindet sich schließlich ein Abschnitt, der für einen Ionenkanal kodiert. Dieses Protein P7 ist wahrscheinlich an der

13 3 Ausschleusung der Viruspartikel aus der Wirtszelle und der endgültigen Reifung der Virusproteine beteiligt.[51] Klinisches Erscheinungsbild Die ersten klinischen Anzeichen nach einer Infektion treten innerhalb 7 8 Wochen auf.[55] Zu den unspezifischen Symptomen zählen Abgeschlagenheit, subfebrile Temperaturen, gastrointestinale Beschwerden wie Übelkeit und Durchfall, Druckschmerz im rechten Oberbauch als Zeichen einer Lebervergrößerung und Appetitlosigkeit, Arthralgien oder auch ein flüchtiges Exanthem. Ikterische Verläufe, die sich mit Pruritus, Ikterus an Skleren und Haut und einer Dunkelfärbung des Urins äußern und in eine fulminante Hepatitis münden können, sind möglich, jedoch sehr selten. Definitionsgemäß kommt es dabei als laborchemisches Zeichen einer Hepatitis zu einem Anstieg der Transaminasen auf etwa U/I mit einem de Ritis-Quotienten < 1.[54] Die große Mehrheit der Infizierten durchläuft im akuten Infektionsstadium eine milde Hepatitis oder ist symptomfrei.[55] Charakteristisch für eine HCV-Infektion ist daher ein prolongiertes, klinisch unspezifisches Intervall, häufig mit einer persistierenden Virämie, die Schätzungen nach in % der Fälle vorzufinden ist.[4],[24] In % kommt es nach einer akuten Hepatitis zu einer spontanen Eliminierung des Erregers und einer damit verbundenen Ausheilung, woraus sich allerdings keine verlässliche Immunität ergibt.[112] Die asymptomatischen Infektionen nehmen jedoch oft einen chronischen Verlauf.[54] Ist die Krankheit erst einmal bis zu diesem Stadium fortgeschritten, ist die Wahrscheinlichkeit der spontanen Erregereliminierung sehr gering.[77] Chronische Infektionen können immer wieder intermittierende Schübe mit hoher entzündlicher Aktivität verursachen, die dem Bild einer aktiven Hepatitis gleichen und einen erneuten drastischen Anstieg der Transaminasen bewirken.[55] Als Folge einer lang anhaltenden Leberschädigung kommt es dann in vielen Verläufen zu einer Leberfibrose. Diese ist von relativ unspezifischen Symptomen, wie etwa Erschöpfung, begleitet.[77] % der Patienten entwickeln auf dem Boden einer solchen Fibrose innerhalb von 20 Jahren eine Leberzirrhose [77], die sich histologisch als irreversible Degeneration der Läppchen- und Gefäßstruktur mit entzündlicher Fibrose und Ausbildung von Regeneratknoten darstellt und eine Insuffizienz des Organs bedeutet. Dekompensiert die Zirrhose, treten als Folge eine portale Hypertension mit Varizenblutung, Aszites und Ödemen oder eine hepatische

14 4 Enzephalopathie auf.[54] Daraus entwickelt sich mit einer Inzidenz von 1-4% pro Jahr ein hepatozelluläres Karzinom (HCC) [102] (s.abb. 1). Zu den Faktoren, die die Progression der Erkrankung beschleunigen, zählen Alkoholkonsum, männliches Geschlecht, fortgeschrittenes Alter und Koinfektion mit HIV oder HBV.[77] Doch neben der hepatischen Manifestation einer HCV-Infektion klagen Abb. 1: Mögliche Verläufe der CHV-Infektion Infizierte in 40-74% der Fälle auch über extrahepatische Beschwerden, welche wesentlich massiver die Lebensqualität eines Betroffenen einschränken können als die Virusinfektion.[122] Sehr häufig ist die kryoglobulinämische Vaskulitis, die sich klinisch mit Arthralgien, Glomerulonephritis und Neuropathie darstellt.[54] Doch auch lymphoproliferative Erkrankungen wie z.b. die Non-Hodgkin Lymphome sind mit HCV assoziiert. Porphyria cutanea tarda, Lichen planus oder andere dermatologische Krankheiten treten ebenfalls gehäuft auf. Die Prävalenz für endokrinologische Störungen bei HCV-Infizierten ist erhöht, wobei die antivirale Therapie möglicherweise selbst Hypothyreoidismus oder Diabetes mellitus induzieren kann. Sicca-Symptomatik im Zuge eines idiopathischen Sjörgen- Syndroms und Arthritis sind bei Infektionen ebenfalls öfter als im Bevölkerungsdurchschnitt beobachtet worden.[44] Diagnostische Nachweisverfahren Nachweisen lässt sich das Virus zum einen durch einen serologischen Test auf Antikörper mit Hilfe eines Enzyme-Immunoassay (EIA) oder in molekularen Tests auf Viruspartikel mit der Polymerase-Kettenreaktion. Vor allem der Screeningtest auf Antikörper hat zu einer Reduktion der Transfusions-assoziierten Übertragung geführt. Jedoch muss eine diagnostische Lücke beachtet werden, da die Serokonversion in der Regel erst 4 10 Wochen nach Infektion erfolgt. Immunsupprimierte Patienten weisen zudem oft falsch negative Ergebnisse auf, da die Immunantwort des Körpers ausbleibt. Der spezifischte Test bleibt demnach der

15 5 direkte Nachweis von viraler RNA. Er gibt Aufschluss über die aktuelle Viruslast, was für die Verlaufskontrolle bei einer antiviralen Therapie ein entscheidender Parameter ist. Bei chronischen Infektionen wird eine Leberbiopsie empfohlen, da durch sie ein Staging des Leberschadens ermittelt werden kann, was wiederum Auswirkung auf die Behandlung hat.[77],[122] Allerdings sind der Zuverlässigkeit einer solchen Biopsie Grenzen gesetzt, da die Ergebnisse oft eine starke Varianz zeigen, wenn die Proben an verschiedenen Stellen entnommen wurden.[11] Therapie Die Therapie von HCV beschränkt sich auf den Einsatz weniger Medikamente. Vor allem Interferon alpha nimmt dabei einen wichtigen Stellenwert ein. Bereits 1989 wurden die ersten Fälle einer HCV-Infektion erfolgreich mit diesem Immunmodulator behandelt.[77] Es besteht die Möglichkeit, pegyliertes Interferon (PEG- Interferon alpha) zu verabreichen, das durch eine längere Halbwertszeit eine seltenere Applizierung ermöglicht. Den Monotherapien überlegen ist eine Kombinationstherapie aus Interferon und Ribavirin, einem klassischen Virostatikum.[122] Die Höhe der Dosis und die Dauer der Therapie richten sich nach einer Vielzahl von Faktoren, wie z.b. dem Genotyp, der Viruslast, dem Stadium der Erkrankung und den möglichen Medikamentennebenwirkungen, die beträchtlich sein können.[77] Über den Erfolg der Behandlung gibt es verschiedene Studien mit unterschiedlichen Ergebnissen.[77],[122] Fest steht allerdings, dass es immer wieder Fälle gibt, bei denen ein Therapieerfolg ausbleibt. Bei dekompensierter Leberzirrhose bleibt eine Organtransplantation die einzige Behandlungsmöglichkeit, wobei in einer Vielzahl der Fälle eine Reinfektion mit HCV und erneuter Organschädigung die Folge ist.[35] 1.2 Die Rolle der Transglutaminase 2 im Organismus Allgemeines zur Enzymfamilie Transglutaminasen (Tgasen, sing. TG) wurden das erste Mal 1959 von Clarke beschrieben [24] und definieren eine Gruppe von Enzymen, die der Superfamilie der Cystein-Proteasen angehören [85] und innerhalb der Klasse der Transferasen eine transamidierende Funktion einnehmen. Alle Mitglieder dieser Familie verfügen über eine katalytische Triade, bestehend aus Cys-His-Asp oder Cys-His-Asn.[50] Die quervernetzende Transamidierung von

16 6 Proteinen durch Tgasen wird via Acyltransfer zwischen der g- Carboxyamidgruppe eines peptidgebundenen Glutamins und der e-aminogruppe eines peptidgebundenen Lysinrestes erreicht und ergibt eine kovalente e-g-glutamin-lysin Isopeptidbindung.[120] Das Glutamin ist dabei unter Abspaltung eines Ammoniaks über eine Thioesterbindung mit dem Cystein des katalytischen Zentrums verbunden. So können Polypeptide eine inter- bzw. intramolekulare Isopeptidbindung mit peptidgebundenen primären Aminen bilden. Alternativ können die Polypeptide in Polyamine wie Putrescin oder Histamin inkorperiert und diese gegebenenfalls weiter polymerisiert werden.[39] Eine Vielzahl von Proteinen dient als Substrate für diese posttranslationalen Quervernetzungen, die hochmolekulare Proteinaggregate ergeben können, die sich als sehr stabil und resistent gegenüber Proteinasen erwiesen.[50] Allerdings können einige Tgasen möglicherweise selbst in der Funktion von Isopeptidasen auftreten und diese Bindungen hydrolysieren.[110] Des weiteren können Tgasen gebundenes Glutamin durch die Reaktion mit H 2 O zu Glutamat deamidieren.[36] Tgasen können in vielen Lebewesen nachgewiesen werden. Bisher sind acht verschiedene Isoenzyme (Typ1 8) in Säugetieren entdeckt worden, die eine hohe strukturelle Homogenität aufweisen. Neuere Forschungen berichten von einem homologen Protein, das als Komponente in der Membran von Erythrozyten zu finden ist (EPB 4.2), jedoch aufgrund eines Aminosäureaustauschs katalytisch nicht aktiv ist. Die aktiven Tgasen sind an der Blutgerinnung (Faktor XIII a ) sowie an der Differenzierung von Keratinozyten (Typ 1 und Typ 3) und der Epidermis (Typ 5) beteiligt. TG Typ 4 ist im Prostatasekret enthalten und trägt vor allem bei Nagetieren essentiell zur Fertilität bei.[50] Im Gehirn konnte TG Typ 6 identifiziert werden, das an der Reifung des Nervensystems beteiligt zu sein scheint.[140] Während die Funktion von Typ 7 bislang nicht genauer bestimmt werden konnte, sind viele Versuche in der genaueren Charakterisierung von Typ 2 unternommen worden Aufbau und Funktion der Transglutaminase 2 Diese Transgutaminase 2 (TG Typ 2, nachfolgend TG2 genannt) ist ein Protein, das beim Menschen eine Größe von 76 kda besitzt und aus 686 Aminosäuren besteht.[36] Die molekulare Struktur der TG2 lässt sich in vier Domänen unterteilen: ein N-terminales b-sandwich mit Bindungsstellen für Fibronektin und Integrin, ein katalytisches Mittelstück, das eine Bindungsstelle und die zugehörige hydrolytische

17 7 Abb. 2: Darstellung der funktionellen und strukturellen Domänen der TG2 Aktivität für ATP/GTP, eine Bindungsstelle für Ca 2+ und die katalytische Triade zur Transamidierung (Cys 277, His 335, Asp 358 ) enthält, und zwei antiparallel angeordnete C-terminale b-zylinder (barrels), von denen der zweite eine Bindungsstelle für die Phospholipase C-d1 (PLC-d1) besitzt (s. Abb. 2).[36] Der katalytische Kern alleine ist für eine Transamidierung nicht ausreichend, was die Vermutung nahelegt, dass auch die restlichen Domänen in diese Aktivität involviert sind.[58] Ebenso wird die Nukleotidhydrosylierung nicht nur durch das katalytische Mittelstück reguliert.[75] Das Enzym hat eine geschätzte Halbwertszeit von 11 Stunden [145] und kann durch Caspase, Calpain oder pankreatisches Trypsin und Chymotrypsin proteolysiert werden. Dabei wird es vornehmlich zwischen Domäne 2 und 3 gespalten. Gegenüber Proteinasen, die Säurereste angreifen, ist es jedoch nicht sensitiv.[50] Neben seiner Fähigkeit zur Transamidierung verfügt die TG2 als bifunktionales Enzym über die Möglichkeit, als G-Protein in die Signaltransduktion einzugreifen wurde dieses G-Protein G h in Leberzellen von Ratten entdeckt und konnte als Funktionseinheit der TG2 identifiziert werden.[98] Durch die Bindung von GTP an TG2 vermittelt das Enzym über die a1 B - und a1 D -adrenergen Rezeptoren die Aktivierung von PLC-d1.[57] Diese im transmembranösen Bereich startende Signalkaskade führt zu einer Hydrolyse von PIP 2 in DAG und IP 3 und erfüllt vielseitige wichtige intrazelluläre Funktionen wie z.b. den Einstrom von Ca 2+ - Ionen.[36] Die Interaktion mit GTP setzt allerdings voraus, dass die TG2 in einer Form vorliegt, in der sie keine transamidierende Aktivität aufweist.[50] Sowohl die Nukleotidbindungsstelle als auch die hydrolysierende Enzymeinheit der TG2 sind grundlegend verschieden zu anderen signaltransduzierenden heterotrimeren G- Proteinen.[60]

18 Die Regulierung der Transglutaminase 2 Die Regulierung der TG2 erfolgt sowohl auf der Transkriptions- als auch auf der Proteinebene. Die Expression der TG2 variiert unter den verschiedenen Spezies und ist darüber hinaus auch sehr zellspezifisch.[79] Transkriptionsfaktoren besetzen dabei die Promotorregion des TG2-Gens an bestimmten Stellen und führen entweder zu einer Aktivierung oder Inhibierung der für die Durchführung der Transkription zuständigen RNA-Polymerase II.[50] So findet sich eine Hochregulierung der Expression durch Vitamin D3, in menschlichen Hepatoblastomzellen durch IL-6, in Astrozyten von Ratten durch IL-1b und durch Dexamethason in Fibrosarkomzellen des Hamsters.[79] Transforming growth factor-b1 (TGFb1) führt in epidermalen Keratinozyten zu einem Anstieg der Transkriptionsrate [46], während in Prä-Osteoblastenzellen der Maus ein TG2-inhibierender Effekt dieses Zytokins festgestellt wurde. Als stärkste Induktoren für die Expression werden allerdings die Retinoide angesehen. Das wurde in verschiedenen Geweben verschiedener Spezies gleichermaßen nachgewiesen.[79] Für einige dieser Transkriptionsfaktoren konnten bereits spezielle Bindungsstellen in der Promoterregion lokalisiert werden.[83] Aktiviert wird die transamidierende Funktion der TG2 durch Ca 2+, das eine Konformationsänderung des Enzyms bewirkt und damit das katalytische Zentrum dem jeweiligen Substrat zugänglich macht. Dieses in Domäne 2 gelegene Zentrum wird im nicht aktiven Zustand durch Domäne 3 und 4 überlagert. Nachdem Ca 2+ gebunden hat, entfalten sich diese Domänen und die katalytische Triade gelangt an die Oberfläche.[50] Auch zwei Nicht-Prolin-cis-Peptidbindungen könnten bei diesem Vorgang eine entscheidene Rolle spielen.[149] Zusätzlich öffnet sich möglicherweise, vergleichbar zu TG Typ 3, ein Kanal, der zwei Tryptophanreste offenlegt, die nahe der Subtratbindungsstelle gelegen sind und den Zugang zu ihr stabilisieren bzw. kontrollieren.[2] Die Bindung von Ca 2+ bewirkt ferner eine erhöhte Sensitivität der TG2 gegenüber einer Proteolyse durch Proteinasen.[50] In-vitro-Versuche demonstrierten, dass die für eine Enzymaktivierung nötige Ca 2+ -Konzentration die physiologischen Werte, die in Zellen vorzufinden sind, übersteigt. Diese Tatsache hat zu der Überlegung geführt, dass es entweder nur bei Störungen der Zellhomöostase (z.b. Apoptose) zu einer enzymatischen Aktivität kommt oder die Sensitivität des

19 9 Enzyms für Ca 2+ und dessen Wirkung durch verschiedene Moleküle moduliert werden kann.[79] Ein Beispiel hierfür wäre Sphingosylphosphocholin, das zu einem Anstieg der Ca 2+ -Sensitivität führt.[73] Die Nitrosylierung von Cystein-Resten der TG2 durch NO-Donatoren führt auf der anderen Seite vor allem in der Anwesenheit von Ca 2+ zu einer merklichen Inhibierung der enzymatischen Aktivität und zu einer erhöhten Sensitivität gegenüber GTP.[73] GTP/GDP kann als allosterischer Gegenspieler des Ca 2+ angesehen werden. In der Tertiärstruktur der TG2 befindet sich die Bindungsstelle für GTP in enger Nachbarschaft zum Cystein des katalytischen Zentrums und wirkt wahrscheinlich direkt auf dieses ein.[59] Die Effekte, die sich daraus ergeben, resultieren in einer geringeren Affinität der TG2 zu Ca 2+, geringeren Konformationsänderungen, einer festeren Bindung zwischen den Domänen und damit zu einer abnehmenden Substratbindungsfähigkeit für die Transamidierung.[14] Gleichermaßen effektiv vermag GDP das Enzym zu hemmen, GMP hingegen hat nur eine schwach inhibierende Wirkung.[76] Zusätzlich hat GTP einen protektiven Charakter gegenüber der Proteolyse durch Proteasen, da die Bindung von GTP eine Änderung der Konformation von TG2 induziert und ihr mehr Stabilität verleiht.[154] Auch für ATP gibt es eine Bindungsstelle, die jedoch nicht mit der für GTP identisch ist. Die Nukleotide werden an die TG2 gebunden und in einer Magnesium-abhängigen Reaktion hydrolysiert. Das Enzym verfügt demnach über eine GTPase-/ATPase- Aktivität, wobei die Bindung von ATP mit höherer Affinität geschieht und zu einer Inhibierung der GTPase führt. Im Unterschied zu GTP übt ATP aber keinen direkten Einfluss auf die transamidierende Tätigkeit aus.[76] Da der physiologische Gehalt an GTP in den Zellen über der Konzentration liegt, die nötig ist, um die Transamidierung durch die TG2 zu unterbinden, ist diese enzymatische Aktivität im Normalfall gering, wird aber nicht komplett durch GTP geblockt.[79] Die Signalübertragung kann durch eine verminderte Affinität der TG2 gegenüber GTP reduziert werden. Wie bereits oben erwähnt, geschieht dies einmal durch die Bindung von ATP, zum anderen kann es auch durch Ca 2+ -gebundenes Calreticulin erreicht werden. Dieses Protein entfaltet seine inhibierende Wirkung allerdings nur auf die TG2, die bereits GDP-gebunden hat. Darüber hinaus inhibiert Calreticulin auch die transamidierende Aktivität.[34]

20 Funktionen der Transglutaminase 2 im Organismus Die TG2 ist ein Multifunktionsenzym, ihre Aufgaben sind sehr vielseitig und sie ist in verschiedenen Kompartimenten an wichtigen Prozessen beteiligt. Die Anzahl der Substrate für dieses Enzym ist beträchtlich [50] und es wurde gezeigt, dass auch Virusproteine von HIV und HCV enzymatisch modifiziert werden. Im Fall des HCV führt dies zu Proteindimeren des Core-Proteins, die sich als sehr stabil erwiesen und dadurch eine verringerte RNA-Bindungsfähigkeit aufwiesen, was als Teil eines Abwehrmechanismus der Wirtszelle verstanden werden könnte. In jedem Fall scheint TG2 in den Replikationszyklus des HCV regulierend einzugreifen.[84] Intrazellulär, wo die TG2 hauptsächlich lokalisiert ist, kann sie mit Mikrotubuli und anderen Komponenten des Cytoskeletts interagieren und an der Plasmamembran dienen ihr unter anderen PLC-d1 und Integrin als enzymatische Partner. Eine Translokation des Enzyms in den Nukleolus mit Hilfe von Importin-a3 konnte nachgewiesen werden. Hier ist gezeigt worden, dass das Enzym als G-Protein tätig ist oder auch durch Quervernetzung von bestimmten Histonen und Proteinen eine regulierende Funktion bei der Genexpression übernimmt.[36] Induziert wird das Enzym von Zellen, die Apoptose begehen.[38] Es bewirkt eine Hyperpolarisation der Mitochondrienmembranen, wodurch es zu einen Anstieg von oxidativen Zwischenprodukten kommt.[116] Dies führt in einer positiven Rückkopplung wiederum zu einer erhöhten TG2-Enzymaktivität, wodurch es zu einer ausgedehnten Proteinpolymerisation in allen subzellulären Kompartimenten kommt.[132] Der für apoptotische Zellen typische massive Ca 2+ -Einstrom verursacht eine weitere Steigerung der TG2-Enzymaktivität.[50] Während der Apoptose werden so Proteine zu unlöslichen Aggregaten quervernetzt, bevor die Zelle phagozytiert wird.[36] Eine entscheidende Bedeutung liegt dabei in einem Verhindern der Freisetzung von schädlichen oder toxischen Stoffen aus der durchlässig gewordenen Zellmembran. Eine mögliche inflammatorische Reaktion, wie sie in nekrotischem Gewebe entsteht, wird damit unterbunden.[119] In Makrophagen exprimierte TG2 unterstützt dabei einen raschen Ablauf des Phagozytosevorgang der betroffenen Zellen.[137] In GTP-gebundener Form kann die TG2 auf der anderen Seite aber auch präventiv einer Apoptose entgegenwirken.[50] Die Bindungsstelle für Fibronektin ist entscheidend für die Externalisation der TG2 in den Extrazellularraum (EZR), wo sie sich an der Zelloberfläche an Integrin anlagert.[45] In dieser Form fungiert sie als Integrin-assoziierter Co-Rezeptor für

21 11 Fibronektin [3], das mit hoher Affinität gebunden werden kann. Diese Interaktion wiederum ermöglicht so die Adhäsion, Migration und Motilität von Zellen.[36] Gewebe, das oxidativem Stress ausgesetzt ist oder in einem Infarktgebiet liegt, exprimiert und sezeniert vermehrt TG2. Das Enzym hat durch die Quervernetzung von Fibronektin, Proteoglykanen, vwf und anderen Matrixproteinen einen direkten Einfluss auf die Stabilisierung und Integrität des EZR [1] und aktiviert zudem Wachstumsfaktoren wie TGFb1, die eine wichtige Rolle im Auf- und Umbau extrazellularer Matrix spielen.[104] So übernimmt die TG2 eine schadensbegrenzende Wirkung in verletztem Gewebe und ist an dem Wundheilungsprozess und der Angiogenese beteiligt.[53] Auftreten der Transglutaminase 2 bei verschiedenen Krankheitsbildern Bei verschiedenen Krankheiten spielt die TG2 eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie. Bei der Zöliakie / Sprue konnte das Enzym als Autoantigen identifiziert werden.[29] Die TG2 ist bei dieser Krankheit überexprimiert und in der Lage, ganz spezifische Glutaminreste des ätiologischen Agenz Gliadin zu deamidieren. Diese deamidierten Gliadinpeptide führen zu einer gesteigerten T-Zell-vermittelten inflammatorischen Immunantwort [91], die letztlich in einer Mikrovilliatrophie und Kryptenhyperplasie des Dünndarms resultiert und eine Malabsorption zur Folge hat. IgA-Antikörper, welche gegen die TG2 gerichtet sind, stellen den wichtigsten serologischen Marker dieser Krankheit dar. Hier konnte gezeigt werden, dass diese Antikörper die Enzymaktivität der TG2 zum Teil inhibieren und es in vitro zu einer Störung in der Differenzierung von intestinalen Epithelzellen kommt.[30],[52] Assoziiert ist die Zöliakie mit dem Auftreten von anderen Autoimmunkrankheiten wie Diabetes mellitus [40], Störungen der Schilddrüse [23], dem Sjörgen-Syndrom und dem systemischen Lupus Erythematodes.[50] In der Tumorforschung belegten Untersuchungen, dass eine vermehrte Expression der TG2 im Stroma nahe des Tumors eine Metastasierung inhibieren kann. Die Quervernetzung von Matrixproteinen führt zu einer erhöhten Stabilität der extrazellulären Matrix (EZM) und erschwert die Migration und Invasion der Tumorzellen.[86] Dennoch scheint ein erhöhter Gehalt des Organismus an TG2 nicht immer ein guter Prognosefaktor im Tumorgeschehen zu sein.[69]

22 12 In neurodegenerativen Erkrankungen wird spekuliert, dass die TG2 Proteinpolymerisationen katalyisiert, die zu Ablagerungen führen könnten, wie man sie beim Morbus Alzheimer findet. Die verstärkte Bindung und enzymatischen Modifikation von Polyglutaminen, wie sie bei Chorea Huntington auftreten, könnte im Zusammenhang mit der Ablagerung von Proteinaggregaten in Neuronen und dem Verlust von Nervenzellen bei dieser Erkrankung stehen. [36],[50],[79] Aufgrund der Wirkung der TG2 auf Matrixproteine im EZR und in ihrer Funktion als Aktivator von TGFb1 ist das Enzym maßgeblich an dem Gewebeumbau beteiligt. Transamidierte, unlösliche Proteinaggregatablagerungen inner- und außerhalb von Zellen und die proinflammatorische Wirkung von TGFb1 führen nicht selten zu einer chronischen Entzündung, Organfibrose oder Narbenbildung. Oft triggert oxidativer Stress im beschädigten Gewebe die gesteigerte Aktivität der TG2. Die dadurch induzierte Zytokinausschüttung (z.b. IL-6, TNFa oder TGFb1) wirkt in einer positiven Rückkopplung wiederum auf die Expression des Enzyms. So treten manifeste Krankheitsbilder wie die proliferative Retinopathie, Lungen- und Leberfibrose oder Arthritis auf, in denen TGFb1 nachweislich erhöht ist.[50],[132] Ein Fehlen der TG2 im Organismus führte bei transgenen Mäusen, die keine TG2 exprimierten, auf den ersten Blick weder zu phänotypischen Veränderungen noch zu funktionellen Einschränkungen. Man erklärt sich diesen Umstand dadurch, dass andere Isoformen dieser Enzymgruppe kompensatorisch wirken. Dennoch zeigten die Tiere unter induziertem Stress sowohl eine eingeschränkte Zelladhärenz und Wundheilung als auch defekte Apoptoseprozesse mit nachfolgenden inflammatorischen Reaktionen.[36] Eine gestörte Glukosetoleranz durch eine reduzierte Insulinsekretion wurde ebenfalls beobachtet.[15] Eine im Tierversuch provozierte Überexpression des Enzyms führte hingegen durch die Proteinquervernetzung zu Organhypertrophie und fibrose.[134]

23 Mechanismen der Leberfibrose Ätiologie und Pathogenese der Organfibrose Eine Fibrose kann in den verschiedensten Organen im Verlauf einer chronischen Entzündung entstehen. Durch immer wieder schädlich einwirkende oder entzündlichpersistierende Reize kommt es zu einer Immunantwort, die in einem dynamischem Prozess Gewebsumbauten provoziert, mit dem ursprünglichen Ziel, das beschädigte Gewebe zu reparieren. Die Liste der Ursachen und Noxen, die eine Fibrogenese generieren können, ist lang: Fibrosen findet man nicht nur in der Leber, sondern auch bei Systemischer Sklerose und Sklerodermie in der Haut, bei chronischen Nierenerkrankungen, als Lungenfibrose aufgrund von Sarkoidose, Silikose oder rheumatoider Arthritis, ebenso nach Herzinfarkt und bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen. Nicht zuletzt ist eine Fibrose aufgrund von Chemotherapeutika, Strahlenbelastung, Infektionen oder iatrogen nach chirurgischen Eingriffen und mechanischer Belastung möglich.[152] Sobald ein Gewebe (z.b. mechanisch) beschädigt wurde, läuft eine profibrotische Kaskade ab, in der die Fibroblastenaktivierung eine entscheidene Rolle spielt.[70] Fibroblasten durchlaufen dabei eine Transformation in sogenannte Myofibroblasten (MF), die in der Lage sind, u.a. a-smooth-muscle-actin (a-sma) und Kollagene zu exprimieren. Zudem produzieren sie gemeinsam mit Epithel und Endothelzellen Matrix-Metalloproteinasen (MMPs). Diese werden als Proenzyme in den EZR sezeniert und dort gespeichert.[107] Ihre Aktivierung erfolgt durch limitierte Proteolyse an der Zelloberfläche.[6] Durch die Proteolyse der Basalmembran ermöglichen sie inflammatorischen Zellen wie Makrophagen und neutrophilen Granulozyten, zum Gewebeschaden vorzudringen und Zellmaterial zu phagozytieren.[152] Gleichzeitig werden von verschiedenen Zellen TGFb1, Plateletderived-growth factor (PDGF) und andere Mediatoren sezerniert, die wiederum aktivierend auf die beteiligten Zelltypen wirken. Leukozyten sezenieren Chemokine und Zytokine, die mitogen und chemotaktisch auf Endothelzellen wirken, welche am Aufbau neuer Blutgefäße beteiligt sind.[152] Die für den Regenerationsprozess nötige Kontraktion des beschädigten Gewebes wird durch die MFs erreicht. Sie erleichtern den Epithel und Endothelzellen die Migration an die Wundränder und zerstörtes Gewebe zu ersetzen.[152] In der Phase eines akuten Organschadens sind

24 14 Fibrogenese und Fibrolyse ausbalanciert.[111] Proteolytische Enzyme wie die MMPs sowie die Inhibitoren der MMPs (TIMPs für tissue inhibitors of MMPs) regulieren diesen Prozess und verhindern die übermäßige Ablagerung von EZM.[152] Während die MMPs überwiegend für den Abbau der EZM verantwortlich sind, führen die TIMPs zu einer Inhibierung der MMPs und somit zu einer Reduzierung des Gewebeabbaus.[6] Die Gewebsreparatur verläuft dabei in einer regenerativen und einer fibrogenetischen Phase. Wenn die Regeneration unkontrolliert verläuft und der Selbstlimitierungsprozess gestört ist, führt das zu Ablagerungen von EZM. Das normale Organparenchym wird verdrängt und es resultiert eine zunehmende Gewebsvernarbung und Septenbildung.[131] Ganz entscheidend ist nun der Umstand, dass es bei wiederholter oder dauerhafter Schadenseinwirkung auf ein Gewebe durch eine chronische Entzündung zu einer Störung dieses Gleichgewichts und zu einem Überwiegen von EZM-Bildung kommt. Der Aufbau von Kollagen, v.a. durch MFs als Hauptproduzenten von EZM [42], dominiert in diesem Stadium.[152] Erwähnenswert ist außerdem noch die Bedeutung des Renin-Angiotensin- Aldosteron-Systems, wobei vornehmlich Angiotensin II einen fibrotischen Effekt zu haben scheint.[89],[148] Produziert in Fibroblasten und Makrophagen wirkt es seinerseits in einer positiven autokrinen Rückkopplung auf die Fibroblastendifferenzierung und -proliferation, triggert die Expression von TGFb1 und steuert dessen Signalkaskade.[125] Auch an seinem eigenen Produktionsanstieg und der Entstehung von Radikalen durch NADPH-Oxidase ist das Angiotensin II bei der Fibrogenese mitbeteiligt.[9],[10] Das Immunsystem ist bei chronischen Entzündungen maßgeblich involviert. Es findet sich eine breite Infiltration von mononukleären Zellen wie Makrophagen, Eosinophilen und Lymphozyten. Versuche mit transgenen Mäusen haben gezeigt, dass T H 2-Zellen, die an einer humoralen Immunantwort mitwirken, durch die Ausschüttung verschiedener Zytokine (IL-4, IL-5, IL-13 und IL-21) eher profibrotisch wirken, wohingegen Produkte der T H 1-Zellen wie IL-12 und IFNg, die eine zelluläre Immunantwort stimulieren, als eher antifibrotisch zu betrachten sind.[152] Bei einem Überwiegen von T H 2-Zellen und deren Produkten kommt es also zu einem progressiveren Verlauf der Fibrose. Unterstützt werden diese Thesen von Studien mit Patientengruppen, die eine Koinfektion von HCV entweder mit HIV oder Schistosoma mansoni aufwiesen. Beide, sowohl HIV als auch Schistosoma mansoni, bewirken ein Überwiegen der T H 2-Immunantwort. Tatsächlich stellte sich

25 15 ein beschleunigter Fibrosestatus der Leber ein als in der Vergleichsgruppe, deren Mitglieder nur mit HCV infiziert waren.[28],[63] Leberfibrose und ihre wichtigsten Mediatoren Die Ursachen, die eine Leberfibrose bedingen, sind breit gefächert. Hierzu zählen Alkohol und andere Toxine, chronische Hepatitiden verschiedener Genese z.b. Viren oder NASH, Gallenwegserkrankungen, Speicherkrankheiten oder Herzinsuffizienz. [54] Eine Kombination dieser Faktoren kann dabei das Risiko für einen chronischen Organschaden signifikant steigern.[9] Eine klinische Einteilung über die Schwere der Fibrose wie z.b. der Ishak -oder Metavir-Score erfolgt durch eine Leberbiopsie. Doch auch nicht-invasive Verfahren wurden entwickelt, um eine Beurteilung durchzuführen. Die Thrombozyten und Transaminasenkonzentration, der Gehalt an C-reaktivem Protein oder die Prothrombinzeit sind wichtige Laborparameter, die dafür bestimmt werden.[9] Bei der Leberfibrose werden vermehrt Laminin, Fibronektin und Proteoglykane sezeniert.[112] Die Hauptbestandteile der Matrix bilden jedoch Kollagene. Sie spielen eine wichtige Rolle, da sie ein stabiles Gerüst bilden, für dessen Proteolyse es bestimmter Proteasen bedarf. Im Interstitium herrscht das Fibrillen-bildende Kollagen des Typ I und III vor, an der Basalmembran ist es Kollagen Typ IV. Sie sind die hauptsächlich in der Leber produzierten Kollagene. Bei einem narbigem Umbau des Gewebes ist ihr Gehalt bis zu 10-fach erhöht [131], der des Gesamt-EZM in fortgeschrittenem Erkrankungsstadium liegt etwa 6-fach über dem Normwert.[9] Die Synthese von Kollagenen unterliegt einer Regulierung sowohl auf Transkriptions als auch auf Posttranskriptionsebene.[80] Sie werden zusammen mit a-sma, MMPs und TIMPs von aktivierten hepatischen Sternzellen (HSZ) oder aktivierten Fibroblasten gebildet und sezeniert. [130] Die HSZ durchlaufen bei anhaltendem Gewebeschaden der Leber die oben erwähnte Transdifferenzierung in MFs. HSZ (auch Ito-Zellen genannt) sind im ruhenden Zustand Vitamin A-speichernde Fettzellen im perisinusoidalen Gebiet (Disse-Raum). Sie verlieren bei ihrer phänotypischen Verwandlung ihre Fettspeicherkapazität zugunsten einer erhöhten Kontraktiliät und einer gesteigerten Produktion von Zytokinen, chemotaktischen Substanzen oder EZM-Komponenten.[92] Stimuliert wird dieser Prozess durch bestimmte Zytokine oder Wachstumsfaktoren, welche von

26 16 Kupfferschen Sternzellen und anderen mononukleären Zellen, Hepatozyten, Thrombozyten, vom Gallengangsepithel, Endothelzellen oder MFs selbst sezerniert werden.[92],[130] PDGF ist dabei der dominierende mitogene Faktor für die Aktivierung und Proliferation von MFs.[9] Durch Gewebekontraktion reduzieren die MFs den Blutfluss in den hepatischen Sinusoiden und es kommt zu einem Verlust der Fenestrierung durch EZM-Ablagerungen. Die Folge ist eine Störung des Stoffaustauschs und ein fortschreitender Funktionsverlust der Leber. Begleitend kommt es zu einer zunehmenden Infiltrierung des Leberparenchyms mit Lymphozyten und einer gesteigerten Apoptoserate von Hepatozyten. [9] Die MMPs schneiden die relativ Protease-unempfindlichen Kollagen-Tripelhelixmoleküle an ihrer a-kette.[6] In der menschlichen Leber kennt man die MMP-1, -2, -3, -8, -9, -12, -13, -14, welche einen fibrolytischen Effekt haben.[13] Neben ihrer proteolytische Funktion können sie auch als gegenseitige Aktivatoren wirken (z.b. MMP-3 gegenüber MMP-1 [13] und MMP-13 [90]). Progelatinase A (MMP-2) hingegen wirkt profibrotisch, da sie Kollagen Typ IV als Substrat hat und in die Bildung einer geordneten Basalmembran eingreift.[130] MMP-2 wird von aktivierten MFs sezeniert und bewirkt eine Aktivitätssteigerung von sich selbst, MFs und Kollagen Typ I.[6] Bei einem unkontrolliertem Regenerationsprozess von Lebergewebe findet sich ein reduzierter Gehalt an MMPs im Parenchym. Dafür werden vermehrt TIMPs, die Inhibitoren der MMPs, sezeniert, wobei vor allem TIMP-1 eine starke fibrosesteigernde Wirkung entfaltet.[61] Neben diesem Enzymungleichgewicht findet sich bei der Fibroseprogression vermehrt TGFb1 als zentraler Wachstumsfaktor.[92] Dieses Zytokin wird von zahlreichen Zelltypen exprimiert und sezerniert und bleibt im EZR an ein Protein gebunden vorerst inaktiv.[16] Bei einer Entzündung kommt es zu einer Aktivierung durch zahlreiche Faktoren wie MMPs oder Plasmin.[49] TGFb1 reguliert die Proliferation und Zytokinausschüttung von T-Lymphozyten, stimuliert die Transkription von Kollagen Typ I, inhibiert die der meisten MMPs und induziert PDGF.[16] Dadurch wirkt es aktivierend und chemotaktisch auf HSZ.[118] Der von den HSZ und anderen Zellen produzierte, fibrogen wirkende Connective tissue growth factor (CTGF) wird ebenfalls von TGFb1 induziert.[93],[123] Zudem ist TGFb1 durch Aktivierung der Caspase-Kaskade an der Apoptose von Hepatozyten beteiligt [16] (s. Abb. 3).