Glukose, Glukoseoxidase/Peroxidase-Methode, Photometrie, Diabetes mellitus.

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1 Quantitative Bestimmung TEAS Themen Glukose, Glukoseoxidase/Peroxidase-Methode, Photometrie, Diabetes mellitus. Prinzip Der Blutzucker ist der wichtigste Energieträger für unsere Zellen. Das wichtigste Hormon der Blutzuckerregulation ist Insulin. Die hier vorgestellten Glukoseoxidase/Peroxidase-Methode zur Bestimmung des Blutzuckers wird auch in Vielfachteststreifen zur Glukosebestimmung im Urin verwendet. Bei dieser Methode wird Glukose mit Hilfe der Glukoseoxidase (GOD) durch Luftsauerstoff zur Glukonsäure oxidiert. Das dabei entstehende H 2 O 2 reagiert mit einem Farbindikator unter Einwirkung der Peroxidase (POD) zu einem Farbstoff, der photometrisch detektiert wird. Material Studenten-Basis-Set 1 Mikroliterpipette µl Mikroliterpipette µl Digitale Stoppuhr Laborbecher, 100 ml, PP Laborschreiber, wasserfest Halbmikro-Küvetten Küvettenständer Pipettenspitzen μl im Halter, Stk. 1 Pipettenspitzen μl im Halter, Stk. 1 Einweghandschuhe, M, Latex, 100 Stk Einweg-Rührspatel, 500 Stk Laborausstattungs-Set 1 Photometer Chemikalien 1 Wasser, destilliert, 5 l Zusätzlich werden folgende Reagenzien benötigt Glukosereagenz ink. Standard Kontrolle TruLab Pund N Hinweis: Die für diesen Versuch verwendeten Reagenzien und Kontrollproben sind im Anhang aufgelistet. Achtung! Beachten Sie stets die Vorbemerkungen, wenn Sie diesen Versuch durchführen. Abb.1: P P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 1

2 TEAS Quantitative Bestimmung Aufgaben 1. Ermitteln Sie die Glukose-Konzentration im Blut eines Patienten und einer Kontrollprobe. 2. Berechnen Sie die Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes. Durchführung Reagenzvorbereitung - Reagenz ist gebrauchsfertig - Reagenz auf Raumtemperatur bringen, Beipackzettel beachten. Untersuchungsmaterial Siehe Kapitel Präanalytik - Serum, NaF-Plasma, Sammelurin, Liquor - Standard (aus Reagenzpackung) ist gebrauchsfertig = 100 [mg/dl] (lt Packungsbeilage) - TruLab P oder N dienen als Kontrollproben. Sie sind lyophylisiert, entsprechend des Beipackzettels in destilliertem Wasser lösen (siehe Kapitel Vorbemerkung). Hinweis: Bei der Präanalytik müssen einige Aspekte berücksichtigt werden. Es besteht ein Konzentrationsgefälle zwischen der Glukose im arteriellen, im venösen Blut sowie zwischen Plasma und Erythrozyten. Diese arterio-venöse Differenz beträgt beim Gesunden ca mg/dl und kann postprandial auf bis zu 30 mg/dl ansteigen. Unmittelbar nach der Blutentnahme beginnt ein Glukoseverlust durch die glykolytische Wirkung erythrozytärer Enzyme, was durch die Zugabe von Glykolysehemmern, wie z.b. Natriumfluorid vermindert werden kann. Steht NaF-Röhrchen zur Blutabnahme nicht zur Verfügung, muss das Serum innerhalb von 60 Minuten von den glukoseverbrauchenden Zellen getrennt und die Glukosebestimmung umgehend durchgeführt werden. Aufgabe 1: Ermitteln Sie die Glukose-Konzentration einer Patientenprobe und der Kontrolle Gemäß dem Pipettierschema werden jeweils 10 µl der zu bestimmenden Probe (Standard, Kontrolle oder Patientenprobe) mit 1000 µl des Reagenzes gemischt, 10 min inkubiert und dann die Extinktion gemessen. Für den Reagenzleerwert wird das Reagenz statt mit einer Probe mit 10 µl destilliertem Wasser pipettiert. Pippetierschema 1. Küvette Reagenzleerwert (LW) 2-4. Küvette Probe (Std, Kontrolle, Patient) Probe (Std, Kontrolle, Patient) - 10 µl Aqua dest. 10 µl - Reagenz 1000 µl 1000 µl 2 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P

3 Quantitative Bestimmung TEAS Messung Die Temperatur sollte C betragen. Zunächst muss der Reagenzleerwert eingestellt werden: - Gerät einschalten: on/off - Wellenlänge einstellen: 550 nm - Leerwertküvette (LW) in die Messstelle stellen Taste R drücken Die restlichen Proben (Standard, Kontrolle und Patientenprobe) werden wie folgt bestimmt: - Küvette in die Messstelle stellen Taste T drücken - Extinktion ablesen Abb. 2: Messung einer Probe Am Schluss: Gerät abschalten: on/off Grundlagen Der Blutzucker ist der wichtigste Energielieferant für unsere Zellen. Wir nehmen Zucker aus der Nahrung auf und "verbrennen" ihn, meist zu CO 2 und Wasser. Dabei entsteht Energie, die für viele Vorgänge in den Zellen notwendig ist. Überschüssige Zuckermoleküle werden in Form von Glykogen in der Leber und Muskulatur gespeichert. Nehmen wir über längere Zeit zuwenig Kohlenhydrate zu uns, dann wird zur Energiegewinnung auch Fett und Eiweiß abgebaut (Glukoneogenese). Das wichtigste Hormon der Blutzuckerregulation ist Insulin. Insulin wirkt blutzuckersenkend. Eine Blutzuckerbestimmung dient vor allem der Diabetes-Diagnose. Erhöhte Nüchternblutzuckerwerte sprechen für Diabetes. Die weiterführende Diagnostik hat dann zum Ziel, zwischen Typ I und Typ II Diabetes zu differenzieren. Während der Typ I Diabetes auf einem Insulin Mangel beruht, werden beim Typ II Diabetes normale, häufig sogar erhöhte Insulinspiegel beobachtet. Als Ursache liegt beim Typ II eine Störung der Insulinrezeptoren vor. Der Typ I erfordert als Therapie grundsächlich die Insulinsubstitution, während der Typ II je nach Schweregrad mit Diät oder Medikamenten therapiert werden kann. Testpinzip (siehe Beipackzettel des Reagenzes) Bei der hier vorgestellten Glukoseoxidase/Peroxidase-Methode (GOD/POD) wird Glukose mit Hilfe der Glukoseoxidase (GOD) durch Luftsauerstoff zu Glukonolakton oxidiert. GOD Glukose + O 2 Glukonsäure + H 2 O 2 Das dabei entstehende H 2 O 2 reagiert mit einem Farbindikator F-H 2 (4-Aminoantipyrin und Phenol) unter Einwirkung der Peroxidase (POD) zu einem Farbstoff F (Chinonimin) und Wasser. POD 2H 2 O 2 + F-H 2 F (Chinonimin) + 4 H 2 O Die messbare Farbintensität ist proportional der Glukosekonzentration. Diese Methode wird ebenfalls am Vielfachteststreifen für die halbquantitative Glukosebestimmung im Urin verwendet. P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 3

4 TEAS Quantitative Bestimmung Auswertung Aufgabe 1: Berechnung der Konzentration Der Glukosekonzentration kann direkt aus der Extinktion der Proben im Vergleich mit dem Standard ermittelt werden. Glucose[mg/dl] = E Probe [Standard] E Standard Der Standard in mg/dl angegeben ist. Im Anschluss ist die Umrechnung der Konzentration in die SI- Einheit (mmol/l) möglich. Der Umrechnungsfaktor enthält unter anderem die molare Masse der Glukose. Glukose [mg/dl] x 0,05551 = Glukose [mmol/l] Berechnungsbeispiel Extinktion Standard (Std): 0.26 Extinktion Kontrolle (Ko): 0.24 Glucose[mg/dl] = E Probe [Standard] E Standard Die Kontrollprobe hat also einen Glukosegehalt (c Kontrolle ) von 92.3 mg/dl, was einer Konzentration von 5.12 mmol/l entspricht. Extinktion Patient (P 1 ): 0.66 c P1 mg dl = E Probe c E Standard Standard = mg dl = 275 mg dl Die Patientenprobe hat also einen Glukosegehalt (c P1 ) von 275 mg/dl, was einer Konzentration von 15.3 mmol/l entspricht. Referenzwerte mg/dl Aufgabe 2: Berechnung der Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes (KoPEM) Mit der Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes überprüft man, ob das Experiment mit Fehler behaftet ist. Siehe Kapitel Vorbemerkung. Der im Experiment ermittelte Wert der Kontrollprobe ist der sogenannte Ist-Wert. Von der Kontrolle kennen wir aber auch den eigentlichen Wert, den Soll-Wert. Er ist auf der Packungsbeilage des Kontrollserums (Trulab P oder N) angegeben. Aus dem ermittelten Ist-Wert und dem bekannten Soll-Wert ergibt sich die Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes nach folgender Formel: KoPEM[%] = Soll Ist Soll PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P

5 Quantitative Bestimmung TEAS Beispielrechnung: Ist-Wert der Kontrolle: 92,3 mg/dl Soll-Wert der Kontrolle: 87,6 mg/dl KoPEM[%] = Soll Ist 100 = Soll = 3.1% 95.5 Im Anschluss wird die Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes vom Sollwert mit den landesüblich erlaubten Grenzen verglichen. In der Bundesrepublik Deutschland wird diese Grenze für Glukose in der Tabelle B 1a RiliBÄK auf +/-11 % angegeben. In unserem Beispiel erfüllt der Kontrollprobeneinzelmesswert diese Vorgabe. Folglich kann der Patient beurteilt werden. Achtung: Bitte die gesetzlichen Vorgaben des jeweiligen Landes beachten! Siehe Kapitel Vorbemerkung. Fragen - Warum wird ein Reagenzleerwert mitgeführt? Um den Einfluss der Eigenfarbe des Reagenzes auf das Ergebnis zu eliminieren. - In welchem Abnahmesystem kann die Glykolyse wirkungsvoll gehemmt bzw. verhindert werden? Natriumfluorid (NaF-Röhrchen) - Wie werden die Glukosewerte eines Patienten ausfallen, wenn die Blutprobe zu spät zentrifugiert wurde und warum ist das so? Zucker wird zu niedrig gemessen, weil unmittelbar nach der Blutentnahme beginnt ein Glukoseverlust durch die glykolytische Wirkung erythrozytärer Enzyme. - Welches Oxidationsprodukt entsteht beim enzymatischen Glukosenachweis mit GOD? - H 2 O 2 Wasserstoffperoxid P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 5

7 Quantitative Bestimmung TEAS Protokoll Aufgabe 1 Sie können Ihre Werte in die folgende Tabelle eintragen. Probe Extinktion Konzentration (mg/dl) Standard (Std) 0, Kontrolle (Ko) 0,24 Probe 1 Aufgabe 2 Notieren Sie die Abweichung des KoPEM und diskutieren Sie das Ergebnis. Fragen - Warum wird ein Reagenzleerwert mitgeführt? - In welchem Abnahmesystem kann die Glykolyse wirkungsvoll gehemmt bzw. verhindert werden? - Wie werden die Glukosewerte eines Patienten ausfallen, wenn die Blutprobe zu spät zentrifugiert wurde und warum ist das so? - Welches Oxidationsprodukt entsteht beim enzymatischen Glukosenachweis mit GOD? P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 7