Blut DNA Mini Kit. Datenblatt. (Nur für Forschung und in vitro-anwendungen) Chargen-Nr.: Mindestens haltbar bis: Aussehen: Farbe: Bio&SELL

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1 Datenblatt Artikel-Nr. BS Artikel-Nr. BS Artikel-Nr. BS Präparationen 50 Präparationen 250 Präparationen (Nur für Forschung und in vitro-anwendungen) Chargen-Nr.: Mindestens haltbar bis: Aussehen: Farbe: 1

2 Beschreibung Säulchen basierte Extraktion von DNA aus Vollblut mit hohem Wirkungsgrad. Enthalten sind, neben allen benötigten Puffern, auch genaue Protokolle zur Verarbeitung unterschiedlicher Gesamtblut-Ausgangsmengen. Wichtige Hinweise zur Lagerung Alle Komponenten, bis auf die Proteinase K, sollten bei Raumtemperatur gelagert werden Lagerung der lyophylisierten Proteinase K bei -20 C Lagerung der gelösten Proteinase K bei -20 C; die Lagerung in Aliquots wird empfohlen, da wiederholtes Einfrieren und Auftauen die Aktivität des Enzyms drastisch reduziert 2

3 Kit-Komponenten 10 Präparationen 50 Präparationen 250 Präparationen Lysepuffer TMT Bindepuffer CM Proteinase K Waschpuffer D Waschpuffer CT Elutionspuffer 5 ml 25 ml 120 ml 8 ml 40 ml 200 ml für 0,3 ml Arbeitslösung 5ml (ready-to-use) 2 ml (Endvolumen 20 ml) für 2 x 1,25 ml Arbeitslösung 25 ml (ready-to-use) 8 ml (Endvolumen 80 ml) für 6 x 1,5 ml Arbeitslösung 120 ml (ready-to-use) 2 x 18 ml (Endvolumen 2x 180 ml) 2 x 2ml 6 x 2ml 3 x 25 ml Zentrifugationssäulen (orange) x 50 Sammeltubes 2,0 ml Elutionstubes 1,5 ml 50 5 x x x 50 3

4 Wichtige Schritte vor Beginn Zugabe von 96 99,8% Ethanol zu Waschpuffer CT. Die entsprechenden Volumina je nach Kit Größe entnehmen Sie der nachfolgenden Tabelle. Gründlich mischen und Flasche stets dicht verschlossen halten. Lösen Sie die Proteinase K durch Zugabe von ddh 2 O. Die entsprechenden Volumina je nach Kit Größe entnehmen Sie der nachfolgenden Tabelle. Gründlich mischen. Waschpuffer CT Proteinase K 10 Präparationen 18 ml 96 99,8% Ethanol zugeben 0,3 ml ddh 2 O 50 Präparationen 72 ml 96 99,8% Ethanol zugeben 1,5 ml ddh 2 O 250 Präparationen 162 ml 96 99,8% Ethanol zugeben 1,5 ml ddh 2 O Heizen Sie einen Thermomixer oder ein Wasserbad auf 60 C vor Stellen Sie sicher, dass Waschpuffer CT und die Proteinase K gemäß der obigen Instruktionen vorbereitet sind Elutionspuffer auf 60 C vorheizen Alle Zentrifugationsschritte sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen des Ausgangsmaterials 4

5 Nicht im Kit enthaltene Komponenten Optional: RNase A (100 mg/ml) Optional: 2,0 ml Reaktionsgefäße 1,5 ml Reaktionsgefäße ddh 2 O 96 99,8% Ethanol Qualitätskontrolle und technische Unterstützung Alle Produkte von werden umfassenden Qualitätskontrollen unterzogen. Dadurch wird gewährleistet, dass sie bei vorschriftsmäßiger Anwendung einwandfrei funktionieren. Die Komponenten jedes Blut DNA Mini Kit wurden in der Isolierung von genomischer DNA aus Vollblut getestet, die extrahierte DNA wurde amplifiziert sowie durch Gelelektrophorese und Spektrophotometrie analysiert. Sollten Fragen oder Probleme auftreten, kontaktieren Sie uns bitte telefonisch unter: Wir behalten uns das Recht vor, Änderungen zur Verbesserung der Durchführung und am Design vorzunehmen. 5

6 Funktionsweise Lyse des Ausgangsmaterials Binden der DNA an der Säule Waschen der gebundenen DNA Elution der DNA 6

7 Protokoll 1: Isolierung von DNA aus 300 µl Vollblut Hinweis: Füllen Sie die benötigte Menge Elutionspuffer in ein 2,0 ml Reaktionsgefäß und inkubieren Sie den Puffer bei 70 C während der Probenaufarbeitung. 1. Bis zu 300 µl Vollblut in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß pipettieren µl Lysepuffer TMT und 20 µl Proteinase K zugeben. Durch mehrmaliges Vortexen für insgesamt 5 Sekunden gründlich mischen. Bei 70 C für 15 Minuten inkubieren, möglichst unter Schütteln (z.b. in einem Thermomixer). Falls ein kontinuierliches Schütteln nicht möglich ist, die Probe während der Inkubation 3 4mal vortexen. Ohne Schütteln wird die Effizienz der Lyse deutlich herabgesetzt. Hinweis: Falls erforderlich, kann an dieser Stelle ein RNA-Verdau stattfinden. 4 µl RNase A (100 mg/ml) zugeben, kurz vortexen und die Probe 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. 3. Falls Flüssigkeit am Deckel des 1,5 ml Reaktionsgefäßes kondensiert ist, dieses für 10 sek zentrifugieren. Anschließend 450 µl Bindepuffer CM zu der lysierten Probe geben und durch Vortexen oder mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gründlich mischen, bis eine homogene Lösung entsteht. 4. Eine Zentrifugationssäule in ein 2,0 ml Sammeltube stellen. Die Probe auf die Säule geben. Den Deckel verschließen und bei x g ( rpm) für 2 min zentrifugieren. Hinweis: Falls der Überstand nicht komplett durch die Membran zentrifugiert wurde, nochmals bei höherer Geschwindigkeit zentrifugieren oder die Zentrifugationszeit verlängern. Das Sammeltube mit dem Durchfluß verwerfen. Zentrifugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube stellen. 7

8 5. Zentrifugationssäule öffnen und 500 µl Waschpuffer D zugeben. Den Deckel verschließen und bei x g ( rpm) für 1 min zentrifugieren. Das Sammeltube mit dem Durchfluß verwerfen. Zentrifugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube stellen. 6. Zentrifugationssäule öffnen und 650 µl Waschpuffer CT zugeben. Den Deckel verschließen und bei x g ( rpm) für 1 min zentrifugieren. Den Durchfluß verwerfen und die Zentrifugationssäule nochmals in das gleiche Sammeltube stellen. Nochmals 650 µl Waschpuffer CT zugeben. Bei maximaler Geschwindigkeit für 2 min zentrifugieren, um alle Reste von Ethanol vollständig zu entfernen. Das Sammeltube mit dem Durchfluß verwerfen. Zentrifugationssäule in ein 1,5 ml Elutionstube stellen. 7. Zentrifugationssäule öffnen und 200 µl vorgewärmten Elutionspuffer zugeben. Bei Raumtemperatur für 2 min inkubieren, dann bei x g ( rpm) für 1 min zentrifugieren. Für eine maximale Ausbeute an DNA können zwei Elutionsschritte mit gleichen Volumina Elutionspuffer durchgeführt werden. Hinweis: Die DNA kann auch mit geringeren oder mit höheren Volumina an Elutionspuffer eluiert werden als oben angegeben. Bei geringeren Volumina an Elutionspuffer erhöht sich die Endkonzentration der DNA. Die extrahierte DNA sollte bei 4 C aufbewahrt werden. Für Langzeitlagerung wird eine Temperatur von - 20 C empfohlen. 8

9 Protokoll 1: Isolierung von DNA aus Vollblut unter 300 µl Hinweis: Füllen Sie die benötigte Menge Elutionspuffer in ein 2,0 ml Reaktionsgefäß und inkubieren Sie den Puffer bei 70 C während der Probenaufarbeitung. 1. Gesamte Blutprobe in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß pipettieren. Mit ddh 2 O auf 300 µl Gesamtvolumen auffüllen (also z.b. 50 µl Blutprobe und 250 µl ddh 2 O) µl Lysepuffer TMT und 20 µl Proteinase K zugeben. Durch mehrmaliges Vortexen für insgesamt 5 Sekunden gründlich mischen. Bei 70 C für 15 Minuten inkubieren, möglichst unter Schütteln (z.b. in einem Thermomixer). Falls ein kontinuierliches Schütteln nicht möglich ist, die Probe während der Inkubation 3 4mal vortexen. Ohne Schütteln wird die Effizienz der Lyse deutlich herabgesetzt. Hinweis: Falls erforderlich, kann an dieser Stelle ein RNA-Verdau stattfinden. 4 µl RNase A (100 mg/ml) zugeben, kurz vortexen und die Probe 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. 3. Falls Flüssigkeit am Deckel des 1,5 ml Reaktionsgefäßes kondensiert ist, dieses für 10 sek zentrifugieren. Anschließend 200 µl Bindepuffer CM zu der lysierten Probe geben und durch Vortexen oder mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gründlich mischen, bis eine homogene Lösung entsteht. 4. Eine Zentrifugationssäule in ein 2,0 ml Sammeltube stellen. Die Probe auf die Säule geben. Den Deckel verschließen und bei x g ( rpm) für 2 min zentrifugieren. Hinweis: Falls der Überstand nicht komplett durch die Membran zentrifugiert wurde, nochmals bei höherer Geschwindigkeit zentrifugieren oder die Zentrifugationszeit verlängern. Das Sammeltube mit dem Durchfluß verwerfen. Zentrifugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube stellen. 5. Zentrifugationssäule öffnen und 500 µl Waschpuffer D zugeben. Den Deckel verschließen und bei x g ( rpm) für 1 min zentrifugieren. Das Sammeltube mit dem Durchfluß verwerfen. Zentrifugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube stellen. 9

10 6. Zentrifugationssäule öffnen und 650 µl Waschpuffer CT zugeben. Den Deckel verschließen und bei x g ( rpm) für 1 min zentrifugieren. Den Durchfluß verwerfen und die Zentrifugationssäule nochmals in das gleiche Sammeltube stellen. Nochmals 650 µl Waschpuffer CT zugeben. Bei maximaler Geschwindigkeit für 2 min zentrifugieren, um alle Reste von Ethanol vollständig zu entfernen. Das Sammeltube mit dem Durchfluß verwerfen. Zentrifugationssäule in ein 1,5 ml Elutionstube stellen. 7. Zentrifugationssäule öffnen und 200 µl vorgewärmten Elutionspuffer zugeben. Bei Raumtemperatur für 2 min inkubieren, dann bei x g ( rpm) für 1 min zentrifugieren. Für eine maximale Ausbeute an DNA können zwei Elutionsschritte mit gleichen Volumina Elutionspuffer durchgeführt werden. Hinweis: Die DNA kann auch mit geringeren oder mit höheren Volumina an Elutionspuffer eluiert werden als oben angegeben. Bei geringeren Volumina an Elutionspuffer erhöht sich die Endkonzentration der DNA. Die extrahierte DNA sollte bei 4 C aufbewahrt werden. Für Langzeitlagerung wird eine Temperatur von - 20 C empfohlen. Kalkulation der Zentrifugalkraft (relative centrifugal force, rcf) in [g], ausgehend von Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute, rpm) RCF (g) = 1, x (rpm)² x R R = Radius des Rotors in cm (Achtung: Radius, nicht Durchmesser!) Beispiel: Berechnung der Zentrifugalkraft bei rpm in einer Zentrifuge mit Rotor-Radius 9 cm RCF = 1, x (10.000)² x 9 RCF = x g 10

11 Troubleshooting Problem / mögliche Ursache Bemerkungen und Vorschläge Verstopfte Zentrifugationssäule Ungenügende Lyse und/oder zu viel Ausgangsmaterial Lysezeit verlängern. Zentrifugationsgeschwindigkeit erhöhen. Geringeres Volumen an Blut einsetzen Niedrige Ausbeute Ungenügende Lyse Lysezeit verlängern. Geringeres Volumen an Blut einsetzen. Unvollständige Elution Inkubationszeit mit Elutionspuffer auf 5 Minuten verlängern oder Elutionsschritt wiederholen. Elution mit höherem Volumen Elutionspuffer durchführen. Unzureichendes Mischen mit Bindepuffer SBS Auf gründliches Mischen der Probe mit Bindepuffer SBS achten, evtl vortexen. 11

12 Niedrige Konzentration der DNA Zu viel Elutionspuffer Elution mit niedrigerem Volumen Elutionspuffer durchführen. Degradierte oder gescherte DNA Falsche Lagerung des Ausgangsmaterials Altes Ausgangsmaterial Sicherstellen, dass die Blutprobe vor der Präparation richtig aufbewahrt wird. (Sofort nach der Entnahme in flüssigem Stickstoff oder bei mindestens -20 C einfrieren; Langzeitlagerung bei -80 C). Mehrmaliges Auftauen und Einfrieren vermeiden. Alte Blutproben beinhalten stets degradierte DNA oder apoptotische DNA. RNA-Kontamination der DNA RNase A-Verdau durchführen wie im Protokoll beschrieben 12

13 Technische Daten Sicherheitsanweisungen Bitte gehen Sie mit allen Materialien und Reagenzien, die im Kit enthalten sind, vorsichtig um. Es sollten immer Handschuhe getragen und Hautkontakt vermieden werden! Bei Kontakt mit Augen oder Haut sofort mit viel Wasser abspülen! Versand: bei Raumtemperatur Lagerung: Das Blut DNA Mini Kit sollte trocken und bei Raumtemperatur (14 25 C) gelagert werden. Unter diesen Bedingungen ist es mindestens 6 Monate stabil. Vor jeder Nutzung sollten alle Komponenten Raumtemperatur haben. Kristalle, die sich eventuell während der Lieferung bzw. Lagerung gebildet haben, können durch vorsichtiges Erwärmen gelöst werden. Lagerung der lyophylisierten Proteinase K: bei -20 C Lagerung der gelösten Proteinase K: bei -20 C; die Lagerung in Aliquots wird empfohlen, da wiederholtes Einfrieren und Auftauen die Aktivität des Enzyms drastisch reduziert. Sicherheitshinweis: Dieses Produkt sollte nur von Personen verwendet werden, die Routine in Laboranwendungen haben. Es sollte laborübliche Schutzkleidung wie Kittel, Handschuhe und Schutzbrillen getragen werden. Bei Kontakt mit Haut und Augen sollten die betroffenen Stellen umgehend mit Wasser gewaschen bzw. ausgespült werden. Anwendungshinweis: In bestimmten Ländern sind einige Anwendungen, für die dieses Produkt eingesetzt werden kann, patentrechtlich geschützt. Da durch den Kauf keine Lizenzen erworben werden, kann abhängig vom Anwendungsland und der Anwendung der Erwerb entsprechender Lizenzrechte erforderlich sein. 13

14 Notizen 14

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