Markierung von Peptiden. mit Iodoacetamidofluorescein. (Versuch 1B)
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- Charlotte Schäfer
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1 Markierung von Peptiden mit Iodoacetamidofluorescein (Versuch 1B)
2 Motivation Sonde zur Studie von TAP Radioaktive Markierung der Peptide Spin-Sonden Markierung für ESR Photo-crosslinker Fluoreszenz Sonden Markierung während der Festphasensynthese der Peptide (H 3, C 14 markierte Aminosäuren; derivatisierte Aminosäuren) Kovalente Kopplung an spezifische funktionelle Gruppen
3 Nukleophile Substitution RRYCKSTEL CH2 S J - M w = 126,9 Da M w = 515 Da RRYCKSTEL CH2 S
4 Eigenschaften von Fluorescein Exitationsspektrum Emissionsspektrum pk a ~ 6,4 pk a < 5 pk a ~ 2, Q
5 Aufreinigung von markiertem Peptid Aufreinigung mittels RP-HPLC Aufkonzentrierung durch Lyophilisierung Verifizierung durch Massenspektrometrie Konzentrationsbestimmung über optische Dichte
6 High Performance Liquid Chromatography
7 Mischkammer Niederdruck Hochdruck nur eine Pumpe hohe Reproduzierbarkeit der Gradientenformung konstante Flußrate Verzögerung der Gradienten Dosierventile sind anfällig Fließmittelzusammensetzung auf der Säule genau eingestellt scharfe Gradientenprofile schneller Fließmittelwechsel Entgasung überflüssig hohe Kosten geringe Präzision für extreme Zusammensetzung (< 10%)
8 Hochdruck-Injektionsventil Rheodyne Hochdruckventil Rotor Stator
9 Dioden-Array Detektor
10 Zwischenkornvolumen V 0 = 40% Gesamtporenvolumen V P = 40% V Packungsmaterial V S = 20% HPLC Säule
11 Chromatogramm t o : Totzeit t R : Retentionszeit W: Peakbreite W 1/2 : Halbe Peakbreite h: Peakhöhe
12 Chromatographische Auflösung Schlechte Auflösung Optimale Auflösung Zeitverschwendung R < 1 R = 1 R > 1 R n R: Auflösung n: Bodenzahl n ist abhängig von: Säulenpackung, Teilchengröße und Säulenlänge
13 Peakverbreiterung Säule Peakverbreiterung durch: Durchmischung der Substanz in den Kornzwischenräumen (Eddy Diffusion) Längsdiffusion Stofftransport in die porösen Beads (Massentransport)
14 Optimalen Bodenhöhe Van-Deemter-Gleichung B h = A + + C u u A: Eddy Diffusion B: Längsdiffusion C: Massentransport h: Bodenhöhe (L: Säulenlänge; n: Bodenzahl) u: Flußrate h = L n h ~ 1/n
15 Elutionsmethoden Isokratische Elution kurze Equilibrierungszeiten präparative large scale Aufreinigungen erhöhtes Auflösungs- und Trennverhalten Gradienten Elution
16 Reversed-phase Säule Poröse Silica-Kügelchen (SiO 2 x H 2 O) Achtung: Material ist ph sensitiv (niemals über ph 7) Partikeldurchmesser: 3 10 µm Porendurchmesser: 7 30 nm Oberfläche: m 2 /g Monomeres Silan polymeres Silan
17 Eluotrope Reihe Polarität Wasser Methanol Acetonitril Isopropanol Tetrahydrofuran Elutionskraft
18 Eigenschaften der Fließmittel
19 Pufferzusammensetzung gepuffertes System: Verschiebung des ph Wertes hat Einfluß auf die Trennung ph Wert weit ober- oder unterhalb des pi-wertes des Analyten leicht flüchtige Substanzen: ph 2,2: Trifluoressigsäure (TFA 0,1%) ph 6,0: Ammoniumactetat Ionenpaar-Reagenzien: bestehend aus ionischem und ungeladenem/apolarem Molekülteil erhöhen Hydrophobizität des Analyten Bsp.: TFA und Alkylsulfonate (anionisch), Tetraalkylammoniumsalze (kationisch)
20 Lyophilisierung dient der Konzentrierung des Peptides sehr schonende Methode: Peptidlösung gefriert durch Druckerniedrigung (Verdunstungskälte) oder einfrieren; Wasser und leicht flüchtige Substanzen sublimieren im Vakuum Speed Vac Lyophyle
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