Neural Mechanisms of the Eating-Inhibitory Effect of Circulating Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1) in Rats

Transkript

1 DISS. ETH NO Neural Mechanisms of the Eating-Inhibitory Effect of Circulating Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1) in Rats A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH (Dr. sc. ETH Zurich) presented by MUKESH PUNJABI M.B.B.S., University of Bombay M.A.S. Nutrition and Health, ETH Zurich born on 14 th May 1970 from Jonschwil SG accepted on the recommendation of Prof. Dr. Wolfgang Langhans, examiner Prof. Dr. Thomas Lutz, co-examiner Prof. Dr. Stephen C. Woods, co-examiner 2013

2 Summary 1 Summary Peripheral glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) is released by intestinal L-cells in response to intra-luminal nutrient stimuli, and neuronal GLP-1 is produced in the nucleus tractus solitarii (NTS). GLP-1 is implicated in the control of food intake. GLP- 1 receptors (GLP-1R) are expressed in several brain areas as well as in the gastrointestinal tract, pancreatic islets and on vagal afferent fibers. Peripheral and central GLP-1R activation has been shown to inhibit eating, but the exact central neural mechanisms of GLP-1 s eating-inhibitory effect are still largely unknown. In particular, the involvement of the hindbrain GLP-1R in controlling spontaneous meal size and in mediating the eating-inhibitory effect of peripherally administered exogenous GLP-1 are not clear. Moreover, it is unclear whether the area postrema (AP) with its leaky blood brain barrier is involved in mediating the eating-inhibitory effect of circulating GLP-1. Also, it needs to be investigated whether the eating inhibition in response to exogenously administered GLP-1 is due to malaise or satiation. Finally, the hindbrain intraneuronal signaling pathways involved in mediating the eating-inhibitory effect of circulating GLP-1 are not known. These four questions were addressed in this thesis. In the first experiment we investigated the role of the hindbrain GLP-1R in mediating the eating-inhibitory effect of intrameal hepatic portal vein (HPV) GLP-1 infusions and their necessity for the control of spontaneous meals. Because we previously demonstrated that the eating-inhibitory effect of HPV GLP-1 infusion in rats is independent of intact vagal afferents and is accompanied by activation of the NTS and AP, we hypothesized that GLP-1 s eating-inhibitory effect might be mediated by hindbrain GLP-1R. To test this hypothesis, we equipped male rats with chronic fourth ventricular cannulas and HPV catheters and administered the GLP-1R antagonist exendin-9 (Ex-9; 10 µg/rat) into the fourth ventricle (IC4V) and 1 nmol/kg body weight (BW) of GLP-1 into the HPV. The IC4V infusions were given 1 2 h before dark onset, and remotely controlled HPV infusions began 2 min into the first nocturnal meal after 3.5 h of food deprivation. Eating behavior was recorded on-line. Intrameal HPV GLP-1 infusion (1 nmol/kg BW) reduced the size of the ongoing meal. IC4V Ex-9 (10 µg/rat) itself did not affect food intake, but attenuated the satiating effect of HPV GLP-1. These data indicate that the reduction of meal size in response 4

3 Summary to HPV GLP-1 infusions involves activation of hindbrain GLP-1R that are accessible from the fourth ventricle and presumably located in the NTS and AP. Also, this hindbrain GLP-1R activation does not appear to be critical for normal satiation under our conditions. To test whether AP GLP-1R mediate the satiating effect of intrameal HPV GLP-1 infusions we used rats that underwent AP lesion (APX) or sham (APS) surgery and were implanted with chronic HPV catheters, and recorded the meal patterns in both surgical groups after remotely controlled intra-meal HPV GLP-1 infusion (1 nmol/kg BW) during the first spontaneous nocturnal meal after 3.5 h of food deprivation. HPV GLP-1 infusion failed to reduce the first meal size and 2 h cumulative food intake in APX rats, indicating that the eating-inhibitory effect of circulating GLP-1 requires an intact AP. Several lines of evidence suggest the existence of two separate neural pathways that can produce satiation and avoidance, and that GLP-1R in the central area of amygdala (CeA) appear to mediate some of the avoidance response. It is not clear whether the previously observed neuronal activation seen in the CeA in response to HPV GLP-1 infusions is related to an avoidance component of GLP-1's eatinginhibitory effect under our conditions. We therefore used a sensitive two-bottle conditioned flavor avoidance (CFA) paradigm to investigate whether HPV GLP-1 infusion at a dose that reliably inhibited eating (1 nmol/kg BW) produces a CFA under our conditions. The results clearly showed that HPV GLP-1 infusion did not produce CFA. These findings dissociate avoidance and inhibition of eating by HPV GLP-1 infusions and suggest that the inhibition of eating reflects satiation rather than malaise. In the final series of experiments, we investigated whether activation of the extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK 1/2) pathway is involved in the eating inhibition after HPV GLP-1 infusions. The ERK signaling cascade was shown to be involved in mediating the early satiation effects of some gut peptides and proposed to be activated in response to hindbrain GLP-1R activation. The first experiment revealed that HPV GLP-1 (1 nmol/kg BW) infusion increased the phosphorylation of ERK-2, but not ERK-1, in the NTS and CeA, suggesting that phosphorylation of ERK in the NTS and CEA is involved in the responses to exogenous GLP-1 infused into the HPV under our conditions. In subsequent experiments, using acute and semi chronic IC4V infusions of U0126 (3 µg/rat and 3 µg/h respectively), a specific 5

4 Summary noncompetitive inhibitor of mitogen-activated ERK kinase (MEK) 1 h before dark onset blocked the ERK phosphorylation in the NTS induced by HPV GLP-1 infusion (1 nmol/kg BW), but failed to affect the eating-inhibitory effect of GLP-1 or to increase meal size by itself. These findings confirm the role of MEK activation in ERK phosphorylation but indicate that inhibition of ERK phosphorylation in the NTS is not sufficient to antagonize either the eating-inhibitory effect of circulating GLP-1 or normal satiation under our conditions. In summary, we found that the eating-inhibitory effect of HPV GLP-1 infusion (i) involves hindbrain GLP-1R activation, (ii) requires an intact AP, and (iii) can be dissociated from malaise. Furthermore, (iv) HPV GLP-1 infusion leads to a MEKdependent stimulation of the ERK cascade in the NTS, but (v) the eating-inhibitory effect of circulating GLP-1 under our conditions does not depend on the activation of the ERK cascade. The possible role of ERK phosphorylation in the satiating effect of circulating GLP-1 therefore requires further investigation. The findings are scientifically interesting and clinically important because the incidence of obesity and associated diseases, i.e., type-ii-diabetes mellitus (T2DM) and cardiovascular diseases, has increased alarmingly over the last thirty years. Based on the eatinginhibitory and metabolic effects of GLP-1R activation, GLP-1-based pharmacological treatments are currently considered a promising therapeutic approach to fight obesity and T2DM. A better understanding of the underlying physiological mechanisms of GLP-1 s effects is therefore essential for the development of safe and effective treatment strategies. 6

5 Zusammenfassung 2 Zusammenfassung Peripheres Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) wird von enteroendokrinen L-Zellen als Reaktion auf intraluminale Nährstoffreize freigesetzt. Zudem wird GLP-1 noch von Neuronen im Nucleus tractus solitarii (NTS) produziert. GLP-1 wird mit der Steuerung der Nahrungsaufnahme in Zusammenhang gebracht. GLP-1-Rezeptoren (GLP-1R) werden in mehreren Hirnregionen und im Magen-Darm-Trakt, den Langerhans-Inseln im Pankreas und in vagalen Afferenzen exprimiert. Periphere und zentrale GLP-1R-Aktivierung führt zu einer Hemmung der Nahrungsaufnahme, aber die genauen zentralnervösen Mechanismen der sättigenden Wirkung von GLP-1 sind noch weitgehend unbekannt. Insbesondere ist nicht klar, inwieweit im Hinterhirn lokalisierte GLP-1R an der physiologischen Steuerung der Mahlzeitgrösse und an der Vermittlung der verzehrshemmenden Wirkung von peripher verabreichtem exogenen GLP-1 beteiligt sind. Darüber hinaus ist unklar, ob die Area postrema (AP) mit ihrer durchlässigen Blut-Hirn-Schranke an der Vermittlung der verzehrshemmenden Wirkung von im Blut zirkulierenden GLP-1 beteiligt ist. Ferner sollte untersucht werden, ob die Hemmung des Verzehrs als Antwort auf exogenes GLP-1 auf Unwohlsein oder Sättigung beruht. Schließlich sind die intrazellulären Signalwege in den Neuronen des Hinterhirns, die bei der Vermittlung des verzehrshemmenden Effekts von zirkulierenden GLP-1 beteiligt sind, nicht bekannt. Diese vier Fragen wurden in der vorliegenden Dissertation behandelt. Im ersten Experiment untersuchten wir die Rolle der GLP-1R im Hinterhirn bei der Vermittlung der verzehrshemmenden Wirkung von während der Mahlzeit in die Pfortader (HPV) infundiertem GLP-1 und die Notwendigkeit dieser Rezeptoren für die Steuerung der spontanen Mahlzeitgrösse. Da wir zuvor gezeigt hatten, dass die verzehrshemmende Wirkung von HPV GLP-1 Infusionen bei Ratten von intakten vagalen Afferenzen unabhängig und von einer Aktivierung von Neuronen in NTS und AP begleitet ist, vermuteten wir, dass die verzehrshemmende Wirkung von GLP-1 durch GLP-1R in NTS und AP vermittelt werden könnte. Um diese Hypothese zu testen, implantierten wir männlichen Ratten Kanülen in den vierten Hirnventrikel 8

6 Zusammenfassung (IC4V) und HPV Katheter. Dann infundierten wir den GLP-1R Antagonisten Exendin- 9 (Ex-9; 10 ug / Ratte) IC4V und GLP-1 (1 nmol / kg BW) in die HPV. Die IC4V Infusionen erfolgten 1-2 h vor Beginn der Dunkelphase; die ferngesteuerten HPV Infusionen begannen 2 min nach dem Beginn der ersten Mahlzeit in der Dunkelphase nach 3.5 h Futterentzug. Das Essverhalten wurde kontinuierlich aufgezeichnet. Die HPV GLP-1 Infusion (1 nmol / kg BW) reduzierte die Grösse der aktuellen Mahlzeit. IC4V Ex-9 (10 ug / Ratte) selbst hatte keinen Einfluss auf die Nahrungsaufnahme, verminderte jedoch die sättigende Wirkung von HPV GLP-1. Diese Daten zeigen, dass die Verringerung der Mahlzeitgrösse als Antwort auf HPV GLP-1 Infusionen durch die Aktivierung von Hinterhirn GLP-1R vermittelt wird, welche vom vierten Ventrikel zugängig und vermutlich im NTS und der AP lokalisiert sind. Darüber hinaus erscheint die Aktivierung dieser GLP-1R für das Zustandekommen der Sättigung unter unseren Bedingungen nicht notwendig zu sein. Um zu testen, ob AP GLP-1R die sättigende Wirkung von während einer Mahlzeit stattfindenden HPV GLP-1 Infusionen vermitteln, verwendeten wir Ratten nach Läsion der AP (APX) oder nach Scheinoperation (APS) und zeichneten das Mahlzeitmuster beider chirurgischen Gruppen nach ferngesteuerten HPV Infusionen von GLP-1 (1 nmol / kg BW) während der ersten spontanen Mahlzeit in der Dunkelphase nach 3.5 h Futterentzug auf. Die HPV GLP-1 Infusionen reduzierten bei den APX-Ratten weder die Grösse der ersten Mahlzeit noch die kumulative Futteraufnahme über 2 h. Dies deutet darauf hin, dass die verzehrsreduzierende Wirkung von zirkulierendem GLP-1 eine intakte AP erfordert. Mehrere Argumente sprechen für die Existenz von zwei separaten Nervenbahnen, deren Aktivierung Sättigung und Vermeidungsverhalten generieren kann. Ferner scheinen GLP-1R im zentralen Bereich der Amygdala (CeA) an der Vermeidungsreaktion beteiligt zu sein. Unklar ist, ob die in früheren Experimenten nach HPV GLP-1-Infusion beobachtete Zunahme der neuronalen Aktivität in der CeA Ausdruck einer Vermeidungsreaktion oder eines Sättigungseffekts von GLP-1 ist. Wir benützten deshalb einen sensitiven Zwei-Flaschen-Präferenztest um zu untersuchen, ob HPV GLP-1 Infusion in einer zuverlässig sättigend wirksamen Dosis (1 nmol/kg BW) unter unseren Bedingungen eine konditionierte Vermeidungsreaktion (CFA) produziert. Die Ergebnisse zeigten klar, dass HPV GLP- 1-Infusion keine CFA produzierten. Diese Ergebnisse stellen eine klare Dissoziation 9

7 Zusammenfassung der verzehrshemmenden und aversiven Wirkungen von GLP-1 dar und legen nahe, dass die Hemmung des Verzehrs nach HPV GLP-1-Infusion eher Sättigung als Unwohlsein widerspiegelt. In der letzten Serie von Experimenten untersuchten wir, ob eine Aktivierung der extrazellulären signalgeregelten Kinasen 1/2 (ERK 1/2) an der verzehrshemmenden Wirkung von HPV GLP-1-Infusionen beteiligt ist. Früher wurde beschrieben, dass die Aktivierung (Phosphorylierung) von ERK an der Vermittlung des verzehrsreduzierenden Effekts anderer gastrointestinaler Peptide beteiligt ist und vermutlich auch zur Aktivierung von entsprechenden Neuronen beiträgt. Im ersten Experiment induzierte HPV GLP-1 (1 nmol / kg BW) Infusion die Phosphorylierung von ERK-2, aber nicht von ERK-1, im NTS und in der CeA, was darauf hindeutet, dass die Phosphorylierung von ERK in NTS und CeA-Neuronen an der Antwort auf exogenes GLP-1 unter unseren Bedingungen beteiligt ist. In nachfolgenden Experimenten zeigte sich, dass akute und halb chronische IC4V Infusionen von U0126 (3 µg/ratte bzw. 3 µg/h), zwar die durch die HPV-Infusion von GLP-1 (1 nmol/kg KG) induzierte ERK-Phosphorylierung im NTS blockierten, selbst jedoch weder die verzehrshemmende Wirkung von GLP-1 beeinflussten noch die Mahlzeitgrösse erhöhten. Diese Ergebnisse bestätigen die Rolle der Aktivierung von MEK bei der ERK-Phosphorylierung und zeigen, dass die Hemmung der ERK- Phosphorylierung im NTS nicht ausreicht, um der verzehrshemmenden Wirkung von zirkulierendem GLP-1 oder der normalen Sättigung unter unseren Bedingungen entgegenzuwirken. Insgesamt stellten wir fest, dass die verzehrshemmende Wirkung von HPV GLP-1- Infusion (i) auf einer Aktivierung von GLP-1R im Hinterhirn beruht, (ii) eine intakte AP erfordert, und (iii) von Unwohlsein unterschieden werden kann. Darüber hinaus (iv) führten HPV GLP-1-Infusionen zwar zu einer MEK-abhängigen Stimulation der ERK- Kaskade im NTS, (v) die verzehrsreduzierende Wirkung des zirkulierenden GLP-1 unter unseren Bedingungen war jedoch unabhängig von der Aktivierung der ERK- Kaskade. Die mögliche Rolle der Aktivierung der ERK-Signalkaskade bei der sättigenden Wirkung von zirkulierendem GLP-1 erfordert daher weitere Untersuchungen. Die Ergebnisse sind wissenschaftlich interessant und klinisch von Bedeutung, weil die Häufigkeit von Adipositas und der damit einhergehenden Krankheiten, wie Typ-II-Diabetes mellitus (T2DM) und Herz-Kreislauf-Erkrankungen, 10

8 Zusammenfassung in den letzten 30 Jahren erschreckend zugenommen hat. Auf der Grundlage der verzehrshemmenden und metabolischen Wirkung der GLP-1R-Aktivierung, gelten GLP-1-basierte pharmakologische Behandlungen derzeit als vielversprechender therapeutischer Ansatz zur Bekämpfung von Adipositas und T2DM. Ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden physiologischen Mechanismen des GLP-1- Effekts ist daher für die Entwicklung von sicheren und wirksamen Behandlungsstrategien unerlässlich. 11