Diagnostik der Aviären Influenza im Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt

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1 Diagnostik der Aviären Influenza im Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt

2 Das Virus Familie Orthomyxoviridae Genus Influenzavirus A Subtypeinteilung nach Oberflächenproteinen Hämagglutinin und Neuraminidase bedeutender Krankheitserreger bei Vögeln, Schwein, Pferd, marinen Säugern, Mensch, (Hund) Reservoir: wildlebende Wasservögel, v.a. Enten große Unterschiede in der Virulenz 2

3 Das Virus behüllt, pleomorph, Ø nm segmentiertes RNA- Genom (8 Segmente), einzelsträngig, negative Polarität Größe Genom kbp hohe genetische Variabilität ( Antigenic Drift ), Reassortment möglich ( Antigenic Shift ) Bild: LAV, FB4, Dez. 41 3

4 Relevante Bestandteile für Diagnostik antigenetisch einheitliche Nukleokapsid- und Matrixproteine aber verschiedene Oberflächenglykoproteine 16 Hämagglutinin (HA)-Proteine 9 Neuraminidase (NA)- Proteine aus: The challenges of eliciting neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus Gunilla B. Karlsson Hedestam, Ron A.M. Fouchier, Sanjay Phogat, Dennis R. Burton, Joseph Sodroski & Richard T. Wyatt Nature Reviews Microbiology 6, (February 2008) doi: /nrmicro1819 4

5 Relevante Bestandteile für Diagnostik HA-Protein (H-Subtyp) Aufgaben - Adsorption der Viren auf Oberfläche der Wirtszellen - Agglutination von Erythrozyten Unterschiede der Subtypen in Aminosäuresequenz, Spaltbarkeit durch zelluläre Proteasen, Rezeptorspezifität und in Erkennung durch Antikörper Pathotypen: hochpathogen (HPAIV) und niedrigpathogen (LPAIV) bisher nur bei Subtypen H5 und H7 5

6 Relevante Bestandteile für Diagnostik NA-Protein (N-Subtyp) für Virusfreisetzung aus Zellen relevant neutralisierende Antikörper 6

7 Rechtsgrundlagen EU- Vorschriften Richtlinie 2005/94/EG vom mit Gemeinschaftsmaßnahmen zur Bekämpfung der Geflügelpest und zur Aufhebung der Richtlinie 92/40/EWG Entscheidung 2006/437/EG über die Genehmigung eines Handbuchs zur Diagnose der Aviären Influenza gemäß der Richtlinie 2005/94/EG des Rates Beschluss 2010/367/EU vom 25. Juni 2010 über die Durchführung der Programme zur Überwachung von Geflügel und Wildvögeln auf aviäre Influenza durch die Mitgliedstaaten 7

8 Rechtsgrundlagen Bundesvorschriften Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen in der Fassung der Bekanntmachung vom 19. Juli 2011 (BGBl. I S. 1404), die zuletzt durch Artikel 6 der Verordnung vom 29. Dezember 2014 (BGBl. I S. 2481) geändert worden ist Verordnung zum Schutz gegen die Geflügelpest und die Newcastle-Krankheit (Geflügelpest-Verordnung) vom (BGBl. I S. 2348) 8

9 Untersuchungsschema * IVPI erforderlich, sofern infektionsbegleitende Erkrankungen und Todesfälle auftreten * * Entwicklung von Hoffmann et al., 2007 übernommen und angepasst aus: Amtliche Sammlung von Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Untersuchungsmaterial tierischen Ursprungs im Hinblick auf anzeigepflichtige Tierseuchen, Kap. Geflügelpest (Aviäre Influenza), Stand

10 Dauer der Untersuchungen Methodik PCR generischer Influenzanachweis PCR Subtypisierung (H5, H7) Virusanzucht Dauer 1 Tag 1 Tag Antikörpernachweis (auch Monitoring) 1 Tag Tage angepasst und ergänzt nach: Amtliche Sammlung von Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Untersuchungsmaterial tierischen Ursprungs im Hinblick auf anzeigepflichtige Tierseuchen, Kap. Geflügelpest (Aviäre Influenza), Stand

11 Sektion Material mind. Trachea in Influenzamedium für molekularbiologische Untersuchungen für Anzüchtung zusätzlich: Lunge, Luftsäcke, Darm, Milz, Niere, Hirngewebe, Leber, Herz Befunde kein pathognomonisches Sektionsbild Hämorrhagien auf Serosen (Abb. 1), im Drüsenmagen und anderen Organen Pankreasveränderungen (Abb. 2) bei Legetieren hämorrhagische Eierstockentzündung und Dotterperitonitis aus: Amtliche Sammlung von Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Untersuchungsmaterial tierischen Ursprungs im Hinblick auf anzeigepflichtige Tierseuchen, Kap. Geflügelpest (Aviäre Influenza), Stand

12 Direkter Erregernachweis Probenmaterial Tupfer Trachea 12

13 Direkter Erregernachweis * IVPI erforderlich, sofern infektionsbegleitende Erkrankungen und Todesfälle auftreten * * Entwicklung von Hoffmann et al., 2007 übernommen und angepasst aus: Amtliche Sammlung von Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Untersuchungsmaterial tierischen Ursprungs im Hinblick auf anzeigepflichtige Tierseuchen, Kap. Geflügelpest (Aviäre Influenza), Stand

14 Direkter Erregernachweis RT-qPCR real-time Reverse Transkriptase PCR Stufe 1: Amplifikation eines Fragments des Matrix-, (Nukleokapsid- oder PB1-) Gens Nutzung von zugelassenen Testkits Stufe 2: subtypspezifischer Nachweis von H5 oder H7 im positiven Fall Nutzung von PCR aus OIE-Referenzlabor 14

15 Direkter Erregernachweis * IVPI erforderlich, sofern infektionsbegleitende Erkrankungen und Todesfälle auftreten * * Entwicklung von Hoffmann et al., 2007 übernommen und angepasst aus: Amtliche Sammlung von Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Untersuchungsmaterial tierischen Ursprungs im Hinblick auf anzeigepflichtige Tierseuchen, Kap. Geflügelpest (Aviäre Influenza), Stand

16 Virusisolierung Inkubation 5 7 Tage bei 37 37,8 C aus: Begleittext zu den Lehrveranstaltungen Allgemeine Virologie und Infektionsdiagnostischer Kursus 10. Auflage Herausgegeben vom Zentrum für Infektionsmedizin Institut für Virologie Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, 2011, S

17 Virusisolierung 17

18 Hämagglutinationstest 18

19 Serologische Identifizierung * IVPI erforderlich, sofern infektionsbegleitende Erkrankungen und Todesfälle auftreten * * Entwicklung von Hoffmann et al., 2007 übernommen und angepasst aus: Amtliche Sammlung von Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Untersuchungsmaterial tierischen Ursprungs im Hinblick auf anzeigepflichtige Tierseuchen, Kap. Geflügelpest (Aviäre Influenza), Stand

20 Serologische Identifizierung -HAH 20

21 Serologische Identifizierung -HAH 21

22 Serologische Identifizierung - ELISA 22

23 Exkurs: Pathotypisierung * IVPI erforderlich, sofern infektionsbegleitende Erkrankungen und Todesfälle auftreten * * Entwicklung von Hoffmann et al., 2007 übernommen und angepasst aus: Amtliche Sammlung von Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Untersuchungsmaterial tierischen Ursprungs im Hinblick auf anzeigepflichtige Tierseuchen, Kap. Geflügelpest (Aviäre Influenza), Stand

24 Monitoringprogramme serologisches Hausgeflügel- und virologisches Wildvogelmonitoring kontinuierliche Überwachung um Gefährdung von Hausgeflügelbeständen zu vermeiden zur Risikoabschätzung hinsichtlich des Eintrages von AIV zur Aufklärung der Epidemiologie aviärer Influenzavirusinfektionen seit 2004 seitens EU verpflichtend 24

25 Monitoringprogramme - Hausgeflügel serologisches Screening 700 Serum-Proben in 2015 zu untersuchen Verfügung vom (LVwA, AZ 203.a-42261/AI) Geflügelart Gesamtzahl Betriebe Probenzahl/ Betrieb Methode Huhn ELISA Pute ELISA Ente ELISA Gans 4 20 ELISA Sonstige 2 10 ELISA 25

26 Monitoringprogramme - Hausgeflügel Positive Befunde der letzten 5 Jahre Jahr Geflügelart ELISA HAH (H5/H7) Bemerkung Huhn 1/10 pos. neg. - Huhn 1/20 pos. neg. - Wachtel 7/15 pos. alle 7 H7 pos. Bestätigung durch FLI 2012 Huhn 1/10 pos. neg. - Huhn 1/10 pos. neg. - Ente 5/20 pos. neg. - Ente 5/20 pos. neg. - 26

27 Monitoringprogramme - Hausgeflügel Jahr Geflügelart ELISA HAH (H5/H7) Bemerkung 2013 Pute 10/10 pos. neg. 2/20 Tupfern M-PCRpos., FLI H9 pos. Huhn 1/10 pos. neg. - Laufenten 4/10 pos. 3 H5 pos. 20 Tupfer neg. Ente 12/18 pos. neg. - Ente 13/20 pos. 13 H5 pos. Bestätigung durch FLI, 40 Tupfer neg Ente/Gans 8/10 pos. 1 H5 pos. Bestätigung durch FLI, 1/40 Tupfern verd. Huhn 1/10 pos. neg. - Zoovögel 2/10 pos. H5/ H7 pos. kein Material für FLI, Tupfer neg. 27

28 Monitoringprogramme - Wildvögel passiv seit 2009 ausschließlich passiv in Sachsen-Anhalt werden jährlich moribunde oder bereits verendet aufgefundene Wildvögel eingesendet Virusnachweis mittels RT-qPCR Ziel: 120 Proben aus den 5 Risikoarealen 28

29 Monitoringprogramme - Wildvögel aktiv in Sachsen-Anhalt zwischen und (Erlass /1) erforderlich, da z.b. H5N8 mit inapparentem Verlauf in Wildvogelpopulation Ziel: 400 kombinierte Oropharyngeal-/Kloaken- Tupfer von bejagten Wildvögeln (v.a. Enten, Gänse, Schwäne, Kraniche usw.), vorzugsweise in Risikogebieten (Rast von Wildvögeln, Brutgebiete, Aufenthaltsgebiete) 29

30 Monitoringprogramme - Wildvögel EU-Wildvogelrastgebiete Risikoareale (10 km - Puffer) Risikoareal-tangierte Gemeinden 30

31 Monitoringprogramme - Wildvögel Ergebnisse der letzten 5 Jahre, passiv 2010: 226 Tiere, alle neg. 2011: 126 Tiere, alle neg. 2012: 20 Tiere, alle neg. 2013: 13 Tiere, alle neg. 2014: 34 Tiere, davon im Dez. 1 Wildente (Aken, LK ABI) H5N8 HPAI 2015: bisher 27 Tiere Ergebnisse aktiv 267 untersuchte Wildvögel gesund erlegte Stockenten (Groß Schwechten, LK SDL) H5N8 HPAI Januar 3 Graugänse M-PCR pos., H5/H7 neg. 31

32 Standardprobensatz Entnahme nach Diagnosehandbuch AI (Entscheidung 2006/437/EG) für Erregernachweis mind. 5 kranke/ tote Vögel, falls vorhanden mind. 20 Luftröhren-/Oropharynxabstriche und 20 Kloakenabstriche in TSBH mind. 40 kombinierte Luftröhren-/Kloakenabstriche Kloakenabstriche ausreichend mit Fäzes bedeckt für Antikörpernachweis mind. 20 Blutproben, bei kleineren Beständen von allen Tieren OHNE Gerinnungshemmer, Vollblut 32

33 Probentransport Abstriche auf 4 C gekühlt, nicht gefroren (wenn innerhalb von 24 Std. im Labor) in Transportmedium kommerziell erhältlich (z.b. Virocult- Tupfer) ODER antibiotika- und proteinhaltig ODER mindestens phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) ph 7 7,4 vollständig von Medium bedeckt Fäkalmaterial von anderen Proben getrennt 33

34 Probentransport Probenverpackung nach Kategorie B (UN 3373) gemäß ADR Verantwortung für die sachgerechte Klassifizierung und ordnungsgemäße Kennzeichnung und Verpackung des Probematerials trägt der Einsender Merkblatt auf /transport-und-verpackung 34

35 Probentransport 3 Verpackungsbestandteile 1. Primärverpackung enthält Probe und ist dicht Röhrchen gegen Auslaufen und vor Bruch sichern, ggf. saugfähiges Material dazwischen mehr als 10 Proben sortiert in Ständern/ Kartons (diese gelten nicht als Sekundärverpackung) 35

36 Probentransport 3 Verpackungsbestandteile 2. Sekundärverpackung enthält ein oder mehrere Primärgefäße flüssige Proben auslaufsicher (zweites Kunststoffgefäß oder Plastikbeutel) saugfähiges Material 36

37 Probentransport 3 Verpackungsbestandteile 3. Außenverpackung ausreichend feste Qualität, starr, mind. 10 x 10 cm oder Transportkisten Kennzeichnung (s.bild) 37

38 Probentransport - Begleitscheine erforderliche Angaben Tierhalter mit Adresse Einsender mit Adresse Telefon-/ Faxnummer mit Vorwahl Untersuchungsmaterial Entnahmedatum Untersuchungsanlass/ gewünschte Untersuchungen Vorbericht MUSS dem Probematerial eindeutig zuzuordnen und verschmutzungssicher daran befestigt sein! 38

39 Probentransport - Begleitscheine 39

40 Probentransport - Begleitscheine 40

41 Fragen? 41

42 VIELEN DANK FÜR DIE AUFMERKSAMKEIT! aus: Zugriff am