Bioverfahrensentwicklung

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1 Winfried Storhas Bioverfahrensentwicklung Zweite, vollständig überarbeitete und aktualisierte Auflage Unter Mitarbeit von Ulrich Behrendt, Hendrik Rubbeling und Philipp WILEY YCH WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA

2 Inhaltsverzeichnis Dank für besondere Unterstützung bei der Neuauflage und bei der ersten Auflage V Vorwort zur ersten Auflage XIX Vorwort zur zweiten Auflage XXII Formelzeichenerklärung XXIII Indexerklärung XXIX Abkürzungsverzeichnis XXXIII Leistungsfähigkeit der Bioverfahrenstechnik Allgemeine Betrachtungen 1 Einsatzfelder und Produktgruppen 2 Leistungsdarstellung der Bioverfahrensentwicklung 3 Bioverfahrensentwicklung in der Nahrungsmittelindustrie 5 Vorrangige Vorteile der Bioverfahrensentwicklung 5 Zunehmende Bedeutung der Bioverfahrensentwicklung 6 Einsatzgebiete 6 Einsatz von genetisch veränderten Mikroorganismen in der Nahrungsmittelindustrie 8 Gentechnologie 18 Voraussetzungen für den Einsatz der Bioverfahrenstechnik 18 Aufgaben der Forschung und Entwicklung 18 Optimierung der Verfahrensoperationen 19 Harmonisierung der Arbeitsgruppen 21 Integrierter Umweltschutz - agierender Umweltschutz 22 Märkte und Marktanteile biotechnologischer Produkte 22 2 Arbeitsgebiete der Bioverfahrenstechnik Einführende Betrachtungen 25

3 VIIII Inhaltsverzeichnis Stellung und Aufgaben der Mikrobiologie 26 Beschaffung und Auswahl eines potenziellen Produktionsstammes 27 Anreicherung und Isolierung 29 Screening 32 Stammentwicklung bzw. Stammverbesserung 34 Überproduktion von Metaboliten -Stammentwicklung durch Metabolic Engineering 38 Haltung und Führung von Produktionsstämmen 43 Gefriertrocknung (Lyophilisation) 43 TiefkühIlagerung und Gefrierkonservierung 44 Stellung und Aufgaben der Molekularbiologie 46 Gentechnischer Zugriffauf Stoffwechselwege 46 Gentechnische Übertragung von Synthesepotenzialen 49 Expressionssysteme 51 Transkriptionsbestimmende Elemente 54 Produktionssysteme für rekombinante Proteine 56 Vor- und Nachteile gängiger Expressionssysteme 66 Stellung und Aufgaben der Zellkulturtechnik 69 Grundlagen der Zellbiologie 71 Cytologie 71 Zellorganellen 74 Extrazelluläre Matrix 78 Zellkulturen und Zelllinien 79 Primärkultur und primäre (adhärente) Zelllinien 79 Kontinuierliche Zelllinien 80 Organkulturen 82 Adhärente Zellkulturen: Microcarrier 82 Adhärente Zellkulturen: Roller Bottles 84 Suspensionskulturen 84 Rekombinante Proteinexpression in Säugerzellen 85 Expressionsvektoren 86 Episomale Vektoren 91 Stabile Transfektion und Amplifikation 92 Klonierung 94 Kryokonservierung und Zellbänke 98 Transiente Transfektion 98 Grundlegende Labortechnik 99 Subkultivierung von Zellen 99 Kontamination 102 Monitoring von Zellkulturen 104 Zellzahl und Vitalität 106 Medien für die Zellkulturtechnik 108 Entwicklung der Säugerzellmedien 109 Serumhaltige Medien 111 Seren 111

4 Inhaltsverzeichnis IIX Serumfreie Medien 112 Puffersysteme: Natriumhydrogencarbonat 114 Puffersysteme: 4-(2-Hydroxyethyl)-I-piperazinethansulfonsäure (HEPES) 115 Monitoring von Mediumsbestandteilen und Metaboliten 115 Stellung und Aufgaben der Biochemie 117 Merkmale von Stoffklassen und deren Eigenschaften 117 Aminosäuren 117 Proteine 119 Lipide 125 Kohlenhydrate 128 Nucleinsäuren 132 Vitamine/Coenzyme 134 Katabolische und anabolische Stoffwechselvorgänge 136 Enzymatische Katalyse 136 Regulation der StoffWechselvorgänge 136 Untersuchung von StoffWechselvorgängen 139 Stoffwechsel von Lipiden 140 StoffWechsel von Proteinen und Aminosäuren 141 Stoffwechsel von Kohlenhydraten 144 Grundmechanismen der Energiegewinnung 148 Zentrale Rolle des Acetyl-CoA im StoffWechsel 148 Tricarbonsäurecyclus und Oxidative Phosphorylierung 149 Stoffanalytik - Hilfe für das Downstream-Processing 151 Analytische Methoden der Biochemie 151 Informatik - Messen, Regeln und Steuern von Prozessen 153 Messgrößen - Einflussgrößen - Zielgrößen - Monitoring 155 Primärparameter 156 Sekundärparameter 158 Zuordnung der wichtigsten Prozessgrößen 166 Monitoring 167 Offline-Monitoring 174 Berechenbare Größen 176 Regelalgorithmen und Automatisierung 181 Regelkonzepte - Fuzzy-Logik, Prädikation, Neuronale Netze 181 Automatisierung und Automatisierungsgrad 184 Das Prozessleitsystem (PLS) 187 Anforderungen an das Prozessleitsystem 187 Beschreibung eines Prozessleitsystems 190 Aufbau von Steuerprogrammen 191 Menüanwahl/Programmablauf 192 Einführung in die Bioinformatik 195 Zum Begriff der Bioinformatik 195 Entwicklung der Bioinformatik 196 Stellung und Aufgaben der Verfahrenstechnik 197

5 X I Inhaltsverzeichnis Bedarf und Abbau von Mediumsbestandteilen 200 Bestandteile von Fermentationsmedien 200 Allgemeine Substratansprüche der Mikroorganismen 201 Substrate zur technischen Mikroorganismenzucht 203 Kohlenstoffquellen 203 Stickstoffquellen 204 Abbau und Verwertung der Substrate 205 Abbau von Proteinen und Nucleinsäuren 205 Abbau von Kohlenhydraten 207 Antibiotika und Induktoren 207 Versuchsplanung 208 Faktorielle Versuchsplanung 209 Statistische Versuchsplanung 211 Genetischer Algorithmus 216 Maßstabsübertragungsregeln 219 Grundsätzliches zur Ahnlichkeitstheorie 223 Modellgesetze 225 Verfahrenstechnische Primäraufgaben 227 Leistungsberechnung 230 Maßstabsvergrößerung von Rührwerkbioreaktoren 236 Synchronisierte Parallelfermentation 239 Bilanzierung und Transportmechanismen 243 Bilanzgleichungen 243 Transportvorgänge 245 Wärmeleitung 251 Stoff-, Wärme- und Impulstransport an Phasengrenzen 253 Wandlungsgeschwindigkeiten 255 Design von verfahrenstechnischen Apparaten 256 Umsatz, Ausbeute, Selektivität 266 Zufall und Statistik in der Verfahrenstechnik 267 Dimensionsanalyse 269 Mosaik der Bioverfahrensentwicklung 287 Verknüpfung aller Aufgabengebiete 289 Logistik 293 Einfluss auf die Ökologie 294 Bakterieller Aspekt 294 Stoffaspekte 298 Ringschlüssel 300 Behördenengineering: GM p.richtlinien, Genehmigungsgrundlagen, Gesetze und Verordnungen 301 Allgemeine Informationen zu GMP 301 Planung, Ausrüstung und Layouten eines Wirkstoffbetriebes unter Maßgabe der Anforderungskataloge 302 Empfehlungen und Hilfestellungen zur Validierung 304

6 Inhaltsverzeichnis IXI Begriffsdefinition und Zielsetzung 304 Qualifizierung 304 Durchführung 304 Gesetze zur Regelung der Planung und des Betriebs von bioverfahrenstechnischen Anlagen 306 Das Gentechnik-Gesetz und die Verwaltungsvorschriften (GentG, GenTSV) 307 Bau und Ausrüstung gern. Anh. III-V GenTSV zu den Sicherheitsstufen Anhang IV und V 325 Wichtige Internetadressen 325 Bioreaktionstechnik in Laborgefäßen 327 Allgemeine Betrachtungen 327 Beschreibung des kleinsten Bioreaktors 330 Geometrische Zusammenhänge 330 Unterscheidung von Kolbenreaktoren hinsichtlich des Energieeintrags 333 Leistungseintrag in Kolbenreaktoren 334 Untersuchungen zum Schüttelkolben (SK) 334 Korrelationsgleichungen zur Berechnung der Leistungsdichte 338 Leistungseintrag in ein Becherglas 343 Sauerstofftransferraten (OTR) in Kolbenreaktoren 346 Sauerstoffeintrag in den Schüttelkolben 347 Korrelationsgleichungen zur Berechnung des Sauerstoffeintrages 347 Untersuchungen zum Sauerstoffeintrag in Schüttelkolben 349 Ähnlichkeitstheorie beim Schüttelkolben 351 Sauerstofftransfer im Magnetfischkolben (Glasflasche) 353 Ähnlichkeitstbeorie beim gerührten System (Glasflasche) 355 Upstream-Processing 357 Lagerung und Logistik 357 Anmaischprozesse 362 Konditionierungsprozesse 363 Reinigungsprozesse (CIP, cleaning in place) 368 Sterilisationsprozesse (SIP, sterilization in place) 376 Allgemeines 376 Sterilfiltration 377 Chemische und enzymatische Sterilisation 377 Inaktivierung durch Strahleneinwirkung 379 Hitzesterilisation 379 Ermittlung der Inaktivierungskinetik 380 Modell für eine Mischkulturkinetik 383 Mediumskriterium 388 Sterilisationsarbeitsdiagramm und Scale-up 392

7 XIII Inhaltsverzeichnis Kontinuierliche Sterilisation (Durchlaufsterilisation) 395 Virusinaktivierung bei Pharmazeutika 401 5toffumwandlung 405 Bildung der Biokatalysatoren (Zellwachstum) 405 Vermehrungsmechanismen 405 Phasen der Biokatalysatorbildung (Zellwachstum) 409 Modelle zur Beschreibung des Wachstums 412 Nicht strukturierte, verteilte Modelle 413 Beschreibung der Produktbildung 420 Allgemeines 420 Produktbildungsraten 424 Enzymkatalysierte biotechnologische Reaktionen 425 Inhibierung von Enzymen (Enzymhemmung) 427 Kompetitive Inhibierung 427 Unkompetitive Inhibierung 427 Nichtkompetitive Hemmung 428 Substratinhibierung 428 Allosterische Inhibierung (Hemmung) 428 Homogene Enzymkatalyse 428 Auslegung einer Enzymreaktion: Bestimmung der Enzymanfangsmenge 429 Heterogene Enzymkatalyse 431 Zylindrische Einzelpore 432 Sauerstoffversorgung eines Mycel-Pellets 437 Modellierung und Simulation 439 Voraussetzungen 439 Experimentalmethoden und Simulation auf einem PCjMAC 441 Batch-Fermentation 441 Fed-Batch-Fermentation 442 Stabilitätsprüfung von Gleichgewichtspunkten 444 Berechnung der Eigenwerte 446 Dynamisches Modell 449 Downstream-Processing 453 Mechanische Trennung 453 Filtration - Mikrofiltration 454 Aufgaben- und Funktionsprinzipien 454 Verfahrens- und Betriebsweisen 455 Berechnungs- und Auslegungsdaten 458 Bauarten der einzelnen Typen 477 Auswahlkriterien, Einsatzbeispiele, Auslegungsbeispiele 480 Sedimentation 480 Aufgaben- und Funktionsprinzipien 480 Verfahrens- und Betriebsweisen 480

8 Inhaltsverzeichnis IXIII Berechnungs- und Auslegungsdaten 480 Bauarten von Sedimentationsanlagen 482 Flotationsprinzip 483 Zentrifugation 486 Aufgaben und Funktionsprinzipien 486 Verfahrens- und Betriebsweisen 486 Berechnungs- und Auslegungsdaten 487 Bauarten der einzelnen Typen 488 Ultraschallseparation 489 Zerteilung von Stoffen 493 Aufgaben und Funktionsbeschreibung 493 Aufgabe der Desintegration 495 an den Zellaufschluss 496 Verfahren und Betriebsweisen 496 Aufschlussmethoden 497 Desintegration mittels Druckentspannung im Hochdruckhomogenisator (HDH) 497 Desintegration durch Prall-Druck-Zerkleinerung in einer Rührwerkskugelmühle (RKM) 498 Prinzip der Prall-Druck-Zerkleinerung 498 Einflussgrößen auf die Desintegration in der Rührwerkskugelmühle 499 Berechnungs- und Auslegungsdaten 500 Allgemeine Betrachtungen 500 Aufschlussgrad bei der Desintegration 501 Homogenisationsdruckdifferenz IIp 501 Zulaufkonzentration 502 Temperatur 503 Auslegung des Hochdruckhomogenisators 503 Rührelementeumfangsgeschwindigkeit 504 Größe der Mahlkörper 506 Dichte der Mahlkörper PMK 507 Mahlkörperfüllgrad 507 Design von Rührwerk und Mahlraum 508 Volumenstrom 508 Zulaufkonzentration und Temperatur 509 Auslegung der Rührwerkskugelmühle 509 Bauarten von Zerkleinerern 510 Hochdruckhomogenisatoren 510 Bauprinzip 512 Auswahlkriterien, Beispiele 512 Allgemeiner Überblick über Zerkleinerungstechniken 512 Praktische Beispiele zum Zellaufschluss 513 Vereinigung von Stoffen 513 Aufgaben und Funktionsbeschreibung 513

9 XIV I Inhaltsverzeichnis Verfahren und Betriebsweisen 518 Berechnungs- und Auslegungsdaten 518 Bauarten von Mischsystemen 523 Auswahlkriterien, Beispiele 524 Wärmeübertragung 526 Aufgaben und Funktionsbeschreibung 526 Verfahren und Betriebsweisen 528 Berechnungs- und Auslegungsdaten 528 Bauarten von Wärmeaustauschern 535 Auswahlkriterien, Beispiele 537 Thermische Trennung - Destillation, Rektifikation 538 Aufgaben und Funktionsbeschreibung 538 Verfahren und Betriebsweisen 539 Berechnungs- und Auslegungsdaten 543 Bauarten von Destillations- und Rektifikationsapparaten 548 Auswahlkriterien, Beispiele 550 Absorption 552 Aufgaben und Funktionsbeschreibung 552 Verfahren und Betriebsweisen 553 Berechnungs- und Auslegungsdaten 555 Bauarten von Absorbern 561 Auswahlkriterien, Beispiele 562 Adsorption 563 Aufgaben und Funktionsbeschreibung 563 Verfahren und Betriebsweisen 565 Berechnungs- und Auslegungsdaten 567 Bauarten von Adsorbern 569 Auswahlkriterien, Beispiele 570 Extraktion 571 Aufgaben und Funktionsbeschreibung 571 Verfahren und Betriebsweisen 572 Wässriges Zweiphasensystem 576 Hochdruck-Mehrphasengleichgewichte 577 Berechnungs- und Auslegungsdaten 578 Bauarten von Extraktoren 582 Auswahlkriterien, Beispiele 583 Kristallisation 584 Aufgaben und Funktionsbeschreibung 584 Verfahren und Betriebsweisen 585 Berechnungs- und Auslegungsdaten 588 Bauarten von Kristallisatoren 591 Auswahlkriterien 593 Trocknung 593 Aufgaben- und Funktionsprinzipien 593 Einführung 593

10 Inhaltsverzeichnis IXV Funktionsprinzipien 594 Allgemeine Literaturhinweise zur Trocknungstechnik 596 Verfahrens- und Betriebsweisen 596 Konvektionstrocknung 596 Kontakttrocknung 597 Gefriertrocknung 597 Berechnungs- und Auslegungsdaten 597 Grundlagen 597 Vakuumkontakttrocknung 598 Konvektive Trocknung 599 Scale-up-Methoden und Produkteigenschaften 600 Bauarten von Trocknern 601 Einleitende Bemerkungen 601 Konvektive Trockner 601 Kontakttrockner 605 Auswahlkriterien, Vorgehen und Auslegung 607 Auswahlkriterien 607 Vorgehen bei der Verfahrensentwicklung 607 Scale-up über charakteristische Größen 608 In-vitro-Refolding 609 Aufgaben und Funktionsbeschreibung 609 Grunde für Refolding 612 Verfahren und Betriebsweisen 614 Der Verlauf einer In-vitro-Renaturierung 614 Berechnungs- und Auslegungsdaten 616 Kinetische Konkurrenz zwischen Faltung und Aggregation 616 Molekulare Chaperone 616 Synthetische Faltungshilfsmittel 618 Konformationsspezifische Liganden 619 Lösungsmittelzusätze (Cosolvents) 620 In-vitro-Protein-(Rück-)faltung 621 Bauarten von Refolding-Operationen 623 Einige Aspekte aus kommerziellen Verfahren 624 Proteinaufreinigung und Chromatographie 625 Aufgaben und Funktionsbeschreibung 626 Verfahren und Betriebsweisen 627 Adsorptionschromatographie 629 Ionenaustauschchromatographie 630 Gelchromatographie (Gelfiltration) 632 Affinitätschromatographie 634 Verteilungschromatographie 635 Reverse-Phase-Chromatographie (RPC) 636 Elutionsvolumen 639 Betrieb von Chromatographieanlagen 639 Berechnungs- und Auslegungsdaten 640

11 Inhaltsverzeichnis Bauarten von Chromatographieanlagen 643 Auswahlkriterien, Beispiele 650 Integrierte Prozesse und Verfahrensentwicklung 653 Aufbau und Darstellung eines Prozesses 653 Vorgehensweise bei der Verfahrensentwicklung 660 Phasen der Bioverfahrensentwicklung 660 Miniplant-Technologie 662 Auswahl der Prozessführung 667 Sicherheitsaspekte bei der Verfahrensentwicklung 673 Nutzen und Gefahren der Gentechnologie 673 Sicherheitsbetrachtung 675 Konzept einer Sicherheitsbetrachtung 676 Sicherheitsbetrachtung in Form von Störfallszenarien 681 Prozessintegrierter Umweltschutz 684 Definition des Prozessintegrierten Umweltschutzes 684 Wärmeverbund als Integrationselement 685 Prozesstechnische Integrationselemente 689 Recycling als Umweltschutzmaßnahme 689 Abwasserentsorgung 690 Abgasbehandlung 691 Wirtschaftlichkeitsbetrachtungen 695 Methoden zur Kostenanalyse eines Verfahrens 695 Strukturen von Kostenschätzungsmethoden 695 Produktionskostenschätzung 699 Wirtschaftlichkeitsbetrachtung mittels Short-cut-Methoden 707 Möglicher Aufbau einer Short-cut-Methode 707 Ermittlung der Ausgangssubstanzmengen 710 EntsorgungsbiIanz 711 Abschätzung des Energiebedarfes 711 Abschätzung des Dampfbedarfes 711 Abschätzung des Strombedarfes 712 Abschätzung des Kühlwasserbedarfes 713 Personalplanung 714 Short-cut-Apparateauslegung zur Apparatekostenschätzung 715 Verfahrensbeispiele 721 Einleitung 721 Allgemeine Prozessschemata 724 Upstream- und Reaktionsmodule 724 produktion eines gelösten, extrazellulär exprimierten Produktes 728 Produktion eines gelösten, intrazellulär exprimierten Produktes 731 Produktion eines ungelösten, intrazellulär exprimierten Produktes 732 Produktion eines ungelösten, extrazellulär exprimierten Produktes 736

12 Inhaltsverzeichnis IXVII Auslegungsbeispiel: ß-Galactosidase 737 Fermentative Herstellung von ß-Galactosidase 738 Prozessbegleitendes Monitoring 744 Sauerstoffaufnahmerate (OUR), COz-Bildungsrate (CPR) und Respirationskoeffizient (RQ) über Fermentationszeit 750 Bestimmung der maximalen spezifischen Wachstumsrate fl-max 752 Berechnung der Ertragskoeffizienten 752 Berechnung des k L a-wertes 753 Diskussion der Ergebnisse und Fehlerdiskussion 754 Aufarbeitung der fermentativ gewonnenen ß-Galactosidase 755 Ernte und Abtrennung der Biomasse 756 Zellaufschluss 757 Extraktion 759 Aufkonzentrierung 761 Gelchromatographie 762 Ermittlung der Gesamtausbeute 763 Wirtschaftlichkeit 763 Apparate- und Maschinenauslegung 765 Energiebetrachtungen 785 Strom 786 Ermittlung des Kühlwasserbedarfs 789 Ermittlung der Stoffsträme 791 Ermittlung der Abwasserstoffsträme 791 Apparateliste mit Ermittlung der Investitionen 791 Ergebnisdarstellung 795 Diskussion 795 Stichwortverzeichnis 809

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