Expression und Charakterisierung der humanen Fucosyltransferase V

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1 Expression und Charakterisierung der humanen Fucosyltransferase V Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades des Fachbereiches Chemie der Universität Hamburg vorgelegt von Jan Münster aus Elmshorn Hamburg 2005

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3 Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum von November 2001 bis Dezember 2004 am Institut für Biochemie und Lebensmittelchemie, Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, im Arbeitskreis von Prof. Dr. R. Bredehorst der Universität Hamburg durchgeführt. Tag der Disputation: 17. Juni Gutachter: Prof. Dr. R. Bredehorst 2. Gutachter: Prof. Dr. G. Gercken

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5 Abkürzungen ABTS AP BCA BCIP BRS BSA CHO CIAP Cys DHB DHFR DMSO dntp dpm DSA DTT EDTA FCS FITC FKS FucT GNA HEK HPLC IMAC IPTG LB MAA MALDI-TOF MBP MES MOI NBT NEM OD PAGE 2,2 -Azino-di-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonsäure) Alkalische Phosphatase Bicinchoninsäure 5-Brom-4-Chlor-3-indoyphosphat broad range standard Rinderserumalbumin Chinese hamster ovary Alkalische Phosphatase (Calf intestinal alkaline Phosphatase) Cystein Dihydroxy-Benzoesäure Dihydrofolatreduktase Dimethylsulfoxid Didesoxynukleotid disintegrations per minute Datura stramonium Agglutinin Dithiothreitol Ethylendiamintetraessigsäure Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie Fluoreszeinisothiocyanat Fötales Kälberserum Fucosyltransferase Galanthus nivalis Agglutinin Human embryonic kidney High Performance Liquid Chromatography Immobilized metallion affinity chromatography Isopropyl-β-D-Thiogalaktosid Lurea-Bertain Maackia amurensis Agglutinin Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight Maltose Binding Protein N-Morpholinoethansulfonsäure Multiplicity of Infection Nitroblautetrazoliumchlorid N-Ethylmaleimid Optische Dichte Polyacrylamid-Gelelektrophorese V

6 Abkürzungen PBS Phosphatpuffer (Phosphate buffered saline) PCR Polymerase Ketten-Reaktion PEG Polyethylenglycol pfu Plaque forming units PNA Peanut Agglutinin POD Peroxidase PVDF Polyvinyldifluorid SDS Sodium Dodecyl Sulfat Ser Serin Sf Spodoptera frugiperda SNA Sambucus nigra Agglutinin STD Saturation Transfer Difference TAE Tris.Acetat-EDTA-Puffer TBS Tris-gepufferte Salzlösung TBST Tris-gepufferte Salzlösung mit Tween 20 TE Tris-EDTA Tris Tris-(Hydroxymethyl)-Aminoethan TSS Transformation and Storage Solution for chemical transformation U Units wt Wild-Typ xg Mehrfaches der Erdbeschleunigung X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indoyl-β-D-galactosid VI

7 Inhalt 1 Einleitung Biologische Bedeutung von N-Glycanen Glycosyltransferasen α-1,3/4-fucosyltransferasen Die Lewis-Gruppe Das Myeloid-Enzym: Fucosyltransferase IV Das Leukozyten-Enzym: Fucosyltransferase VII Das Neuronale-Enzym: Fucosyltransferase IX Reaktionsmechanismus Biologische Bedeutung der α-1,3/4-fucosyltransferasen Fucosyltransferase-Inhibitoren Struktur/Funktions-Beziehungen Rekombinante Expression humaner α1,3/4- Fucosyltransferasen Zielsetzung der vorliegenden Arbeit Material Chemikalien Enzyme, Proteine und Antikörper Affinitätsmatrices und Partikel Bakterien und Hefestämme Vektoren Zellinien und Kultur Lösungen Medien Oligonukleotide Bibliotheken und Phagen Methoden Molekularbiologische Methoden Mini-Präparation von Plasmid-DNA Isolierung von Plasmid-DNA mit käuflichen Kits Quantifizierung von DNA Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Dephosphorylierung Alkoholpräzipitation der DNA Agarose-Gelelektrophorese DNA-Extraktion aus Agarose-Gelen VII

8 Inhalt Ligation Herstellung kompetenter DH5α-Zellen Transformation Lagerung von E. coli Klonen DNA-Sequenzierung Ortsspezifische Mutagenese Phagentechniken Phagen Display Selektion der Peptidbibliothek Titerbestimmung Amplifikation selektierter Phagen Phagen-DNA-Präparation zur Sequenzierung Polyklonale ELISA-Analyse Monoklonale ELISA-Analyse Selektion Proteinbiochemische Methoden SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese Coomassie-Färbung von Proteinbanden Silberfärbung von Proteinbanden Trocknen von Polyacrylamidgelen Western Blot Proteinbestimmung Zellaufschluß von E. coli BL21(DE3)pLysS Säulenchromatographische Verfahren IMAC (Immobilized metallion affinity chromatography) Rückfaltung unlöslicher Proteinaggregate Isolierung von rekombinanter Fucosyltransferase V FCS Messungen Test zur Bestimmung der Fucosyltransferase V-Aktivität Test zur Bestimmung der DHFR-Aktivität Immunologische Methoden Präparation von Immunisierungsproben Immunisierung Gewinnung von Antiseren Anreicherung von Antikörpern aus Antiseren Immuno-Blot Baculovirus-Expressionssystem Zellkultur Aufbewahrung von Insektenzellen Transfektion von Sf9 Zellen VIII

9 3.5.4 Plaque Isolierung rekombinanter Baculoviren Amplifikation rekombinanter Viren Titerbestimmung Stabile Expression in Insektenzellen Transfektion Expression unter Selektionsdruck Expression von Fucosyltransferase V in Säugetierzellen Kultivierung und Passagieren von CHO- und HEK293-Zellen Kryokonservierung und Auftauen von Zellen Transfektion Expression unter Selektionsdruck Chemische Modifikation von Proteinen und Peptiden FITC-Markierung von Peptiden HPLC-Reinigung MALDI-TOF Biotin-Markierung von Proteinen Ergebnisse Rekombinante Expression der humanen Fucosyltransferase V Amplifikation und Klonierung der Fucosyltransferase V cdna aus HEK 293 Zellen Expression der Fucosyltransferase V in E. coli Versuche zur Rückfaltung unlöslicher Proteinaggregate Klonierung und Expression der Fucosyltransferase V als MBP-Fusionsprotein Erzeugung von anti-fucosyltransferase V Antiseren Expression der Fucosyltransferase V in Säugetierzellen Expression der Fucosyltransferase V mit Hilfe des Baculovirus-Expressionssystem Klonierung unterschiedlicher Transfervektoren und Generierung rekombinanter Baculoviren Expression der Fucosyltransferase V Reinigung der rekombinanten Fucosyltransferase V Stabile Expression der Fucosyltransferase V in Insektenzellen IX

10 Inhalt Klonierung und Expression Strukturelle Untersuchung der rekombinanten humanen Fucosyltransferase V Einfluß der Dimerisierung auf die enzymatische Aktivität Identifizierung der für die Dimerisierung verantwortlichen Aminosäuren Untersuchung der Glycanstrukturen der rekombinanten Fucosyltransferase V Selektion von Peptid-Bibliotheken gegen die Fucosyltransferase V Entwicklung und Charakterisierung linearer Peptid-Inhibitoren gegen die Fucosyltransferase V Entwicklung und Charakterisierung zirkulärer Peptid-Inhibitoren gegen die Fucosyltransferase V Charakterisierung synthetischer Peptide Diskussion Expression der Fucosyltransferase V Untersuchungen zu Struktur-Funktions-Beziehungen Darstellung von peptidischen Liganden gegen die Fucosyltransferase V aus kombinatorischen Bibliotheken Ausblick Zusammenfassung 99 7 Summary 101 Literatur 103 Anhang 117 Danksagung 119 X

11 1 Einleitung Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Strategie zur Expression großer Mengen der humanen Fucosyltransferase V etabliert. Nach Erhalt des gereinigten rekombinanten Proteins wurden verschiedene Fragestellungen hinsichtlich der strukturellen Eigenschaften des Enzyms untersucht. Dabei bildeten die Aufklärung der N-Glycosylierung in Insektenzellen und die Ausbildung von intermolekularen sowie intramolekularen Disulfidbrücken die Schwerpunkte der strukturellen Untersuchungen. Zur Entwicklung spezifischer Inhibitoren der Fucosyltransferase V wurden mit Hilfe der Phage Display-Technologie unterschiedliche Peptid-Bibliotheken gegen das Enzym selektiert. 1.1 Biologische Bedeutung von N-Glycanen Fast alle Proteine des Blutserums und auf Zelloberflächen sind glycosyliert; daher werden große Anstrengungen unternommen, die biologische Bedeutung dieser Kohlenhydrate näher zu untersuchen. Bei Glycoproteinen erfolgt die Verknüpfung des Kohlenhydratanteils entweder O- oder N-glycosidisch an das Protein. O-Glycane sind an die Aminosäureseitenkette von Serin oder Threonin gebunden. N-Glycane sind an die Seitenketten von Asparagin gebunden. Die Erkennungssequenz für N-Glycane lautet Asn-X-Ser/Thr, wobei X jede Aminosäure außer Prolin sein kann (Marshall, 1974). Die Biosynthese von Glycoproteinen erfolgt in zwei Schritten: Die Proteinsequenz wird genetisch determiniert, während die Synthese von Kohlenhydraten enzymatisch erfolgt. Der wichtigste Teil der Biosynthese der N-Glycoproteine findet im Lumen des endoplasmatischen Retikulums (ER) statt. Ein durch das Carrier-Lipid Dolicholpyrophosphat aktiviertes Oligosaccharid aus 14 Zuckereinheiten wird durch eine Oligosaccharyltransferase auf die wachsende ribosomale Peptidkette übertragen. Man nennt diesen Vorgang die kotranslationale Glycosylierung (Kornfeld und Kornfeld, 1976). Im Gegensatz dazu erfolgt die Biosynthese des Kohlenhydratteils von Glycolipiden oder O-Glycanen im Golgi-Apparat (Spiro, 1973). Glycoproteine liegen in einer hohen strukturellen Vielfalt vor und weisen dabei Unterschiede in Anzahl und Sequenz der Seitenketten auf. Durch weitere Modifikationen wie Acetylierung, Phosphatierung und Sulfatierung erhöht sich zusätzlich die Diversität der Glycoproteine. Das Glycosylierungsmuster variiert mit der Struktur des Proteins, dem Zelltyp und dem Organis- 1

12 Einleitung mus. Durch verzweigende N-Acetylglucosaminyltransferasen sowie verlängernde Galactosyl-, Sialyl- und Fucosyltransferasen können zahlreiche unterschiedliche Oligosaccharidstrukturen an einer Glycosylierungsstelle entstehen (Marz und Hatton, 1984 und Schachter, 1991). N-Glycosylierung spielt eine wichtige Rolle bei der Faltung neu gebildeter Glycoproteine im endoplasmatischen Retikulum, indem der Zuckeranteil mit der naszierenden Polypeptidkette verknüpft und so hydrophobe Bereiche abgeschirmt werden. Dadurch wird die Löslichkeit von Faltungsintermediaten erhöht und die Aggregation nicht vollständig gefalteter Proteine verhindert (Chu et al., 1985). Spezifische kohlenhydratbindende Chaperone wie Calnexin und Calreticulin sorgen im ER zusätzlich für eine Qualitätskontrolle der neugebildeten Glycoproteine. Diese Moleküle sind durch die Bindung an die Zuckerstrukturen an einen Glycoprotein-spezifischen Chaperon-Zyklus beteiligt, der dafür sorgt, daß nur korrekt gefaltete Proteine in den Golgi-Apparat weitergeleitet werden (Stronge et al., 2001 und Schrag et al., 2003). Eine weitere wichtige biologische Funktion von N-Glycanen besteht in der Regulierung der Halbwertzeiten von Serumproteinen. So regulieren sulfatierte GalNAc-Strukturen die Lebensdauer von Hormonen wie z.b. Lutropin, Thyrotropin und Pro-Opiomelanocortin, indem Rezeptoren der Leber-Endotelzellen diese Zucker erkennen und so die Hormone rasch aus dem Blutkreislauf entfernt werden können (Baenziger et al., 1992 und Smith und Baenziger, 1992) Die vielseitigste Aufgabe von N-Glycanen besteht jedoch in ihrer Funktion als Liganden für Lektine. Bei Lektinen handelt es sich um Kohlenhydratbindende Proteine, die zur Erkennung spezifischer Glycanstrukturen dienen. Lektine spielen eine Rolle in unterschiedlichsten biologischen Vorgängen wie z.b. Blutgerinnung, Apoptose, Adhäsion an Gewebeoberflächen und das Leiten von Enzymen oder Zellen an ihren Bestimmungsort (Lee, 1992). 1.2 Glycosyltransferasen Glycosyltransferasen spielen eine entscheidende Rolle in der Glycobiosynthese. Diese Enzyme sind in der Lage, einzelne Zucker auf einen Akzeptor zu übertragen. Glycosyltransferasen sind meist im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert, wo neu synthetisierte Glycokonjugate ihre endgültige Zuckerstruktur erhalten und für ihre Sekretion vorbereitet werden (Kleene und Berger, 1993). Obwohl es sich bei den Glycosyltransferasen um eine sehr große heterogene Gruppe von Enzymen handelt, zeigen sie eine Vielzahl von Gemeinsamkeiten. Sie katalysieren eine Transglycosylierungsreaktion, bei der das Monosaccharid von 2

13 Glycosyltransferasen einem energiereichen Nucleotidzucker-Donor (siehe Tabelle 1.1) auf einen Akzeptor übertragen wird. Die Akzeptoren sind in den meisten Fällen selbst Oligosaccharide, obwohl es auch Glycosyltransferasen gibt, die Zucker auf die Hydroxylgruppe von Threonin oder Serin übertragen können (Fukuda et al., 1996). Glycosyldonoren CMP-Sialinsäure GDP-Fucose GDP-Mannose UDP-Galactose UDP-N-Acetylgalactosamin UDP-Glucose UDP-Glucuronsäure UDP-Xylose Dolichol-P-Glucose Dolichol-P-Mannose Dolichol-P-(Glucose 3 - Mannose 9 -N-Acetylglucosamin 2 ) Akzeptoren Oligosaccharide Monosaccharide Proteine Lipide (Ceramide) Tabelle 1.1 Auflistung unterschiedlicher Donor- und Akzeptorsubstrate der Glycosyltransferasen. Glycosyltransferasen zeichnen sich durch ihre hohe Spezifität aus. Sie sind sowohl hochgradig substratspezifisch als auch regio- und stereospezifisch (Paulson und Colley, 1989). So überträgt die menschliche B-Blutgruppen-Galactosyltransferase Galactose auf die 3-OH-Gruppe einer Akzeptorgalactose, wobei am anomeren Zentrum die α-konfiguration gebildet wird. Ausschließlich UDP-Gal wird als Donorsubstrat akzeptiert und eine β-verknüpfung wurde nie beobachtet. Die 3-OH-Gruppe der Akzeptorgalactose ist die einzige Transglycosylierungsstelle, und auch 3-OH-Gruppen anderer Zucker dienen nicht als Substrat. Einige Glycosyltransferasen bilden jedoch Ausnahmen von dieser Regel. So ist die Fucosyltransferase III durchaus in der Lage, zwei unterschiedliche glycosidische Bindungen zu bilden. Glycosyltransferasen einer Familie weisen meist hohe Sequenzhomologien auf und zeigen auch dann noch ein hohes Maß an konservierten Sequenzen, wenn die Enzyme aus wenig verwandten Spezies stammen. Unterschiedliche Familien von Glycosyltransferasen dagegen weisen meist keine Sequenzhomologien auf. Trotz der teilweise sehr unterschiedlichen Primärstruktur haben alle 3

14 Einleitung Golgi-Glycosyltransferasen einen ähnlichen Aufbau. Bei den Glycosyltransferasen handelt es sich um Typ II Transmembranproteine, bestehend aus einem kurzen N-terminalen cytosolischen Bereich, einer Transmembrandomäne und der katalytischen Domäne. Die Transmembrandomäne und die katalytische Domäne werden durch einen Bereich getrennt, der Stem-Region genannt wird (Breton et al., 1998). Viele Glycosyltransferasen können in der Stem-Region proteolytisch gespalten und so sekretiert werden. Verantwortlich für diese Spaltung sind wahrscheinlich Cathepsin-ähnliche Proteasen, die im trans-golgi aktiv sind (Lammers und Jamieson, 1990). Obwohl von einigen Glycosyltransferasen große Aktivitäten in unterschiedlichsten Körperflüssigkeiten detektierbar sind, ist die biologische Funktion dieser sekretierten Formen unklar (Weinstein et al., 1987). Es scheint unwahrscheinlich, daß außerhalb des Golgi-Apparats in den Körperflüssigkeiten die Konzentration an Substraten hoch genug ist, um von Glycosyltransferasen in einer Transglycosylierungsreaktion umgesetzt werden zu können. Eine mögliche biologische Funktion der sekretierten Enzyme kann in der lektinähnlichen Bindung an die Akzeptorsubstrate liegen (Yamamoto et al., 1990). 1.3 α-1,3/4-fucosyltransferasen α1,3/4-fucosyltransferasen katalysieren den Transfer von Fucose von dem Nucleotid-Zucker GDP-Fucose auf ein Akzeptorsubstrat und bilden eine α3- oder α4-bindung zu GlcNAc in Gal-GlcNAc-Zuckerstrukturen (Javaud et al., 2003). Dadurch entstehen wichtige Strukturen wie Lewis a, Sialyl-Lewis a, Lewis x sowie Sialyl-Lewis x, die als Antigene für Selektine dienen und an vielen biologischen Funktionen beteiligt sind (Abbildung 1.1). Die ursprüngliche Nomenklatur der verschiedenen Isoformen von Fucosyltransferasen basiert auf der Benennung der FucT I und FucT II, deren Aktivitäten in lektinresistenten CHO-Zellen gefunden wurden (Howard et al., 1987) und auf später identifizierte Fucosyltransferasen übertragen wurde (Kukowska- Latallo et al., 1990). Danach werden Fucosyltransferasen als FucT bezeichnet und die Isoform mit einer römischen Zahl angegeben. Da diese Art der Bezeichnung sowohl das Protein als auch das Gen beschreibt, wurde sie so abgeändert, daß das Gen mit großen Buchstaben und arabischen Zahlen bezeichnet wird. So ist zum Beispiel die FucT III das Enzym, welches von dem FUT3 Gen kodiert wird (Costache et al., 1997b und Costache et al., 1997a). Beim Menschen sind bisher sechs α1,3/4-fucosyltransferasen identifiziert worden, FucT III bis FucT VII und die FucT IX (Kukowska-Latallo et al., 4

15 α-1,3/4-fucosyltransferasen Antigen Struktur a Le Galβ1 3GlcNAcβ1 3Gal α1,4 Fuc a Sialyl Le SAα2 3 Galβ1 3GlcNAcβ1 3 Gal α1,4 Fuc Lex Galβ1 4GlcNAcβ1 3Gal α1,3 Fuc x Sialyl Le SAα2 3 Galβ1 4GlcNAc β1 3Gal α1,3 Fuc Abbildung 1.1 Zuckermotive mit peripheren Fucosylierungen, wie sie durch α1,3/4-fucosyltransferasen gebildet werden. 1990, Weston et al., 1992b, Weston et al., 1992a, Lowe et al., 1991b, Sasaki et al., 1994, Natsuka et al., 1994 und Nishihara et al., 1999). Die verschiedenen Isoformen werden in unterschiedlichen Geweben exprimiert und haben unterschiedliche Akzeptor-Substrat-Spezifitäten. In vitro wurden die unterschiedlichen Spezifitäten bestätigt (Grabenhorst et al., 1998) (Tabelle 1.2). Name nach Synthetisierte Lowe et al. Verknüpfung Epitope Fuc TIII Lewis-Typ α1,3/4 Le a, sle a, Le x, sle x Fuc TIV Myeloid-Typ α1,3 Le x Fuc TV α1,3 Le x, sle x Fuc TVI Plasma-Typ α1,3 Le x, sle x Fuc TVII α1,3 sle x Fuc TIX α1,3 Le x Tabelle 1.2 Humane α1,3/4-fucosyltransferasen Die Lewis-Gruppe Die Lewis-Gruppe besteht aus drei Enzymen: Der Fucosyltransferase III, dem Lewis Enzym (Kukowska-Latallo et al., 1990), der Fucosyltransferase V 5

16 Einleitung (Weston et al., 1992a) und der Fucosyltransferase VI, dem Plasma-Typ Enzym (Weston et al., 1992b). Im Menschen sind die Gene für diese Enzyme auf dem Chromosom 19p13.3 nahe beieinander lokalisiert und haben mehr als 85 % Sequenzidentität. Etwa 10 % der Weltbevölkerung exprimiert keine Lewis Antigene und weist auch keine Lewis-Enzym-Aktivität auf, was darauf hindeutet, daß diese Gruppe von Enzymen keine essentielle Bedeutung besitzt (de Vries et al., 2001). Fucosyltransferase III-Aktivität wird in der Leber, der Gallen-Blase, der Niere und in der Muttermilch detektiert, jedoch nicht im Plasma. Das Enzym katalysiert die Bildung der Fucα1,4GlcNAc- und der Fucα1,4GlcNAc-Bindung und bildet die Lewis-Antigene Le x, sle a, Le a und sle a (Costa et al., 1997a). Die FucT III ist das einzige Enzym, das in der Lage ist, die Le a Antigene in vivo zu synthetisieren. Die Fucosyltransferase V katalysiert die Bildung der Fucα1,3GlcNAc Bindung und produziert Le x - und sle x -Strukturen (Abbildung 1.2). Das FUT5- Gen wird in Leber, Gehirn und Darm exprimiert. Da die Menge an mrna gering ist, ist es unsicher, ob überhaupt eine signifikante Menge an Enzym gebildet wird, weshalb die biologische Bedeutung des Enzyms unklar ist (Cameron et al., 1995). HO HO HO OHCH 2 OH O HO OH OH CH 2 OH COOH O O NHAc OH O NHAc HO OR O O CH 2 OH LacNAc OH HO O NHAc OR O CH 2 OH OH OH OH OH O FucT V O FucT V OH O GDP OH O GDP HO HO HO OH CH 2 OH NHAc O O OR HO O O OH CH 2 OH Lewis x + GDP OH OH O OH OH CH 2 OH NHAc COOH O O OR O O O OH CH 2 OH O NHAc OH OH OH O OH + GDP sialyl LacNAc sialyl Lewis x Abbildung 1.2 Die von der Fucosyltransferase V katalysierte Reaktion: Das Enzym ist in der Lage, sowohl das ungeladene Akzeptorsubstrat LacNAc als auch das geladene Sialyl-LacNAc umzusetzen. Die Fucosyltransferase VI ist das dritte Mitglied dieser Gruppe von α1,3/4- Fucosyltransferasen und wurde ebenfalls von Weston 1992 erstmals beschrieben (Weston et al., 1992a). Die Nucleotidsequenz des Enzyms ist zu 85 % mit der FucT III-Sequenz und zu 89 % mit der FucT V-Sequenz identisch. Die 6

17 α-1,3/4-fucosyltransferasen FucT VI kann Le x - und sle x -Strukturen synthetisieren und wird als Plasma- Typ Enzym bezeichnet Das Myeloid-Enzym: Fucosyltransferase IV Die Fucosyltransferase IV wurde unabhängig von zwei Gruppen erstmals beschrieben (Goelz et al., 1990 und Lowe et al., 1991b). Da es zuerst im Zusammenhang mit der Bildung des Liganden für das endothele Leukozyten- Adhäsionsmolekül-1 (ELAM-1) entdeckt wurde, war der ursprüngliche Name ELAM-1-Ligand Fucosyltransferase (ELEFT) und wird heute als FucT IV bezeichnet (Kumar et al., 1991). Das Enzym fucosyliert GlcNAc mit einer α3-bindung in neutralen Akzeptormolekülen und produziert Le x -Strukturen, es ist aber nicht in der Lage, sle x Strukturen zu bilden (de Vries et al., 1995 und Niemela et al., 1998). Das FUT4-Gen wird ubiquitär in allen Geweben exprimiert und ist auf dem Chromosom 11q22-q23 lokalisiert (Gersten et al., 1995). Die Hauptmenge an Protein findet man in myeoliden Zellen, Magen, Darm, Uterus und Niere (Gersten et al., 1995) Das Leukozyten-Enzym: Fucosyltransferase VII Die Fucosyltransferase VII wurde unabhängig von zwei Gruppen erstmals beschrieben (Natsuka et al., 1994 und Sasaki et al., 1994). Das Enzym fucosyliert GlcNAc mit einer α3-bindung in sialylierten Akzeptoren und produziert sle x -, aber keine Le x -Strukturen. Das menschliche FUT7 -Gen ist auf dem Chromosom 9q34.3 lokalisiert und wird vorwiegend auf Leukozyten und Endothelzellen exprimiert (Maly et al., 1996) Das Neuronale-Enzym: Fucosyltransferase IX Die jüngst gefundene Fucosyltransferase IX wurde aus einer murinen cdna- Bibliothek kloniert (Kudo et al., 1998). Beim Menschen liegt das Gen auf dem Chromosom 6q16 (Kaneko et al., 1999a). Die FUT9-Gensequenz unterscheidet sich in hohem Maße von den der anderen α1,3/4-fucosyltransferasen, jedoch weisen die FUT9-Gene von Maus und Mensch eine sehr hohe Homologie auf. Das Enzym katalysiert die Synthese von Le x -Strukturen, das Substrat ist ähnlich dem der Fucosyltransferase IV. Die FucT IX wird im Gehirn, Magen, Milz und Blutzellen exprimiert und spielt eine Rolle in der frühen menschlichen Embryogenese (Cailleau-Thomas et al., 2000). 7

18 Einleitung Reaktionsmechanismus Der Reaktionsmechanismus der Fucosyltransferasen wurde am Beispiel der humanen Fucosyltransferase V untersucht (Murray et al., 1997). Es handelt sich dabei um eine geordnete sequentielle bi-bi-reaktion, bei der der Transfer der Fucose mit einer Inversion der Konfiguration am anomeren Zentrum der L-Fucose einhergeht (Weston et al., 1992a). Inhibitorstudien und Untersuchungen bezüglich des primären und sekundären Isotopeneffektes lassen vermuten, daß während der Reaktion ein geladener sp 2 -hybridisierter Übergangszustand entsteht und die glycosidische Bindung des Nucleotidzucker gebrochen wird, bevor die Bindung zum Akzeptor geknüpft wird (Murray et al., 1997). Die vorgeschlagene Struktur des Übergangszustandes ist analog zur Struktur bei Glycosidasereaktionen; der Zucker bildet eine Halbsesselkonformation, bei der am anomeren C-Atom ein Oxacarbeniumion entsteht (Abbildung 1.3) (Norris et al., 2004). Lys oder Arg Lys oder Arg OH OH.. O Akzeptor + N H H H O O OH O P O P.. O H O O ++ Mn.. O GDP Fucose C O Guanosin 1. Bindungs bruch + N H H H OH OH O O OH δ O P O P G O H O O δ + δ + Mn++ δ O 2. neue Bindung H Akzeptor O O C OH OH O OH O Akzeptor + GDP Asp oder Glu Asp oder Glu Abbildung 1.3 Enzymatischer Reaktionsmechanismus der Fucosyltransferase V nach dem von Murray vorgeschlagenen Modell (Murray et al., 1997) Biologische Bedeutung der α-1,3/4-fucosyltransferasen Die von den Fucosyltransferasen synthetisierten Lewis-Strukturen haben unterschiedliche biologische Funktionen und Veränderungen in ihrer Präsentation und werden mit einer Reihe von Erkrankungen assoziiert. Generell dienen 8

19 α-1,3/4-fucosyltransferasen alle synthetisierten Lewis-Strukturen als Liganden für Selektine und sind somit an spezifischen Adhäsionsprozessen beteiligt. Für die immunologische Antwort auf inflammatorische Prozesse ist es für den Organismus essentiell, Leukozyten an den Entzündungsherd zu leiten. Hierbei spielen E-, L- und P-Selektine eine bedeutende Rolle. Diese zuckerbindenden Moleküle werden auf der Oberfläche des Endothelium unter Einfluß von TNF-α, IL-1α und IL-1β exprimiert und sorgen somit für die ortsspezifische Adhäsion von Lymphozyten und der Transmigration an den Ort der Infektion. Als Liganden dieser Selektine dienen sialylierte Lewis x -Strukturen, die auf den Lymphozyten exprimiert werden. Der letzte Schritt der Synthese dieser Zuckerstrukturen wird von den Fucosyltransferasen IV und VII katalysiert (Knibbs et al., 1996). Bei Fucosyltransferase VII-defizienten Mäusen ist die Präsentation von sle x -Strukturen stark vermindert, was zur eingeschränkten Fähigkeit der Leukozyten führt, den intravaskulären Raum zu verlassen und zu dem Ort der Entzündung zu wandern (Maly et al., 1996 und Lowe, 2003). Bei chronischen Hautentzündungen, wie atopischer Dermatitis und Psoriasis, kommt es zu einer Fehlleitung von T-Lymphozyten und damit zu einer ständigen Entzündungsreaktion in der Haut. Neue Ansätze in der Behandlung dieser Erkrankungen können in der Synthese von Fucosyltransferaseinhibitoren liegen, da gezeigt wurde, daß Fucosyltransferase VII-inhibierende Fluorozucker in der Lage waren, die Präsentation von sle x -Strukturen zu verringern und somit die Migration von Leukozyten einzuschränken (Dimitroff et al., 2003 und Zollner und Asadullah, 2003). Seit einigen Jahren sind slewis x - und slewis a -Strukturen als Tumor-assoziierte Antigene bekannt, so daß spezifische Antikörper gegen diese Strukturen in der Diagnostik eingesetzt werden können (Kumamoto et al., 1998). Verantwortlich für die verstärkte Präsentation dieser Zuckerstrukturen ist in vielen Fällen die Überexpression von unterschiedlichen Fucosyltransferasen. So wird z.b. die FucT III in Colon-Carzinoma und Prostatakrebszellen, die FucT V in neoplastischen Geweben und Lungenkrebszellen, die FucT VI in Leberkrebszellen und die FucT VII in Lungenkrebszellen überexprimiert (Yamada et al., 1997, Kannagi et al., 2004, Martin-Satue et al., 1998, Hada et al., 1995 und Inaba et al., 2003). Die Überexpression der sle a/x -Strukturen steht in direktem Zusammenhang mit der Fähigkeit der Krebszelle, Metastasen zu bilden, so daß Patienten mit hoher sle a/x -Aktivität eine deutlich verschlechterte Prognose aufweisen (Holmes et al., 1985, Nakamori et al., 1997 und Jorgensen et al., 1995). Die Fähigkeit zur Metastasierung wird erhöht, da durch die Bindung der sle a/x -Epitope an E-Selektine die im Blutkreislauf zirkulierenden Krebszellen an Endothelzellen adhärieren und so neue Tumoren bilden können (Kannagi, 1997). 9

20 Einleitung Um die nur schwache Expression von E-Selektinen auf normalen Endothelzellen zu verstärken, ist die Krebszelle in der Lage, die Expressionsrate durch Ausschüttung von IL-1α zu erhöhen. In in vivo-versuchen wurde gezeigt, daß Zellkulturüberstände von Krebszellen in der Lage sind, auf kultivierten Endothelzellen die E-Selektinexpression zu erhöhen (Narita et al., 1996 und Khatib et al., 1999). Der direkte Zusammenhang zwischen der Überexpression von Fucosyltransferasen und der Metastasierung konnte belegt werden, indem antisense Oligonukleotide gegen die FucT III und -V in der Lage waren, die Adhäsion von Colon-Carzinoma-Zellen an Endothelzellen zu verringern (Weston et al., 1999 und Klopocki et al., 1998) Fucosyltransferase-Inhibitoren Die Überexpression von Lewis-Strukturen spielt bei einer Vielzahl von Erkrankungen eine Rolle, daher können Fucosyltransferase-Inhibitoren einen hohen therapeutischen Nutzen haben, da mit ihnen der letzte Schritt der Synthese dieser Strukturen verhindert werden kann. Eine wichtige Strategie, um potente Fucosyltransferase-Inhibitoren zu entwickeln, ist das Design und die Synthese von Substratanaloga. Der erste und einfachste Fucosyltransferase-Inhibitor dieser Sorte ist GDP mit einer Inhibitionskonstante von 29 µm (Bella und Kim, 1971). Weitere GDP-Fuc analoge Substanzen wurden synthetisiert und auf ihre Eignung als Inhibitoren getestet. So konnte durch den Austausch des Fucosylmotivs gegen einen 5a- Carbafucopyranosyl- (Pseudofucose-) Rest ein Inhibitor entworfen werden, der doppelt so potent ist wie GDP (Cai et al., 1992). Das bisher beste Donormimetikum GDP-2F-Fucose wurde von Murray entwickelt und bindet an die Fucosyltransferase V mit einem K i = 2,4 µm (Murray et al., 1997). Eine weitere Methode, Fucosyltransferase-Inhibitoren zu entwickeln, ist die Synthese von Substanzen, die sich analog der Akzeptorzucker verhalten. Ein Beispiel hierfür ist das Galβ(1-4)deoxynojirimycin, welches ein schwacher Inhibitor der Fucosyltransferase V ist (IC 50 = 8-40 mm) (Wong et al., 1992). Durch die Synthese eines Azatrisaccharids, welcher dem Lewis-Trisaccharid ähnelt, konnte ein hochspezifischer Fucosyltransferase-Inhibitor entwickelt werden, dessen Bindungskonstante von K i = 2,4 mm jedoch sehr gering ist (Qiao et al., 1996). Die Synthese von Übergangszustandanaloga ist eine weitere Methode zum Design von Inhibitoren. Unter der Annahme des in Abbildung 1.3 gezeigten Modells wurden einige Fucosyltransferase-Inhibitoren entwickelt. Ein Beispiel ist ein GDP-Azazucker, der die Fucosyltransferase V mit einem IC 50 -Wert 10

21 α-1,3/4-fucosyltransferasen von mm inhibiert (Schuster und Blechert, 2001). Obwohl dieser Azazucker die vorgeschlagene Halbsesselkonfiguration einnimmt, ist er allerdings ein schlechterer Inhibitor als GDP. Ein deutlich besserer Inhibitor wurde durch die Erstellung einer Bibliothek aus unterschiedlichen GDP-Triazol-Verbindungen entwickelt. Die 85 Kandidaten dieser Bibliothek wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Fucosyltransferase VI zu inhibieren. Die Substanz 1 erwies sich als Inhibitor mit einer Bindungskonstante von 62 nm und ist somit der erste Inhibitor einer Fucosyltransferase, dessen Bindungskonstante im nanomolaren Bereich liegt. Die Spezifität gegenüber anderen Fucosyltransferasen ist gering, außerdem werden andere Glycosyltransferasen nicht oder nur schwach inhibiert (Tabelle 1.3) (Lee et al., 2003). HN O N N N GDP 1 Abbildung 1.4 Fucosyltransferase-Inhibitor (Lee et al., 2003). Enzym IC 50 (µm) K i (nm) α-1,3-fuct III 1,0 ± 0,2 α-1,3-fuct V 0,9 ± 0,1 270 ± 30 α-1,3-fuct VI 0,15 ± 0,03 62 ± 3 α-1,3-galt k.i β-1,4-galt k.i Guanylatkinase 250 ± 60 Pyruvatkinase k.i Tabelle 1.3 Inhibitionskonstanten der Verbindung 1. k.i.: Keine Inhibition bei 600 µm. Die bis heute entwickelten Fucosyltransferase-Inhibitoren weisen in den meisten Fällen eine geringe Bindungskonstante auf oder zeigen nur geringe Spezifitäten gegenüber ihrem Zielmolekül. Speziell die Inhibierung von nur einer ausgesuchten Fucosyltransferase erscheint aufgrund der geringen Spezifität bis heute nur schwer realisierbar. Aus diesem Grunde ist es notwendig, durch neue 11

22 Einleitung Ansätze hochwirksame und spezifische Fucosyltransferase-Inhibitoren zu entwickeln Struktur/Funktions-Beziehungen Fucosyltransferasen sind Typ-II-Transmembranproteine mit einer kurzen cytoplasmatischen Domäne, einer Transmembrandomäne und einer katalytischen Region, die im Golgi-Apparat lokalisiert ist. In Abbildung 1.5 ist die strukturelle Organisation der Fucosyltransferasen dargestellt. Fucosyltransferasen haben eine Stem-Region, welche sehr anfällig für proteolytische Spaltung sein kann und dafür sorgt, daß ein nicht unerheblicher Teil des aktiven Enzyms sekretiert wird. Lösliche Formen der Fucosyltransferasen wurden in Muttermilch, Serum, Samenflüssigkeit und anderen Körperflüssigkeiten gefunden (Mollicone et al., 1990). Dabei haben die cytoplasmatische, die Transmembran- und die Stem-Domäne einen entscheidenden Einfluß auf das Maß der Sekretion sowie auf die Sublokalisation im Golgi-Apparat (Grabenhorst und Conradt, 1999). Die Tatsache, daß es eine lösliche aktive Form dieser Enzyme gibt, lässt vermuten, daß der N-Terminus für die enzymatische Aktivität nicht notwendig ist. Studien haben ergeben, daß zwischen 50 und 70 Aminosäuren vom N-Terminus entfernt werden können, ohne daß es zu einer Verringerung der Aktivität kommt. Die Deletion nur weniger Aminosäuren am C-Terminus führt jedoch zu einem vollständigen Verlust der Aktivität (Xu et al., 1996). Aufgrund der Untersuchungen an den Fucosyltransferasen III und V, die sich in der katalytischen Domäne um weniger als 25 Aminosäurereste unterscheiden und trotzdem eine signifikant unterschiedliche Substratspezifität besitzen, konnten die Bindungstellen für das Substrat und den Akzeptor identifiziert werden. Aminosäuren, die verantwortlich für die Akzeptorspezifität sind, befinden sich im sogenannten hypervariablen Bereich, der sich bei der FucT III von der Aminosäure 73 bis zur Aminosäure 151 erstreckt (Xu et al., 1996 und Dupuy et al., 1999). Zusätzliche Aminosäurereste, die bei der Erkennung des Akzeptorzuckers eine Rolle spielen, befinden sich nahe des C-Terminus (Vo et al., 1998). Für die Bindung von GDP-Fucose sind mehrere Aminosäuren verantwortlich, die sich in mindestens drei Regionen des Proteins befinden (Martin et al., 1997). Sämtliche humane α1,3/4-fucosyltransferasen besitzen vier konservierte Cystein-Reste, die über Disulfidbrücken den C-terminalen Bereich in die Nähe des Bereiches der katalytischen Domäne bringen, der direkt an die Stem-Region grenzt. Bei der Fucosyltransferase VII existieren sogar sechs Cysteine, die durch drei Disulfidbrücken den N- bzw. C-terminalen Bereich der katalytischen Domäne hinsichtlich ihrer Struktur ihre Stabilität verleihen (de Vries 12

23 α-1,3/4-fucosyltransferasen N Cys16/ Cytoplasma Transmembranregion Golgi Apparat S S S S Cys Cys Asn60 75 Asn105 Asn167 Asn Stem Region Katalytische Domäne Abbildung 1.5 Schematische Darstellung der strukturellen Organisation der Fucosyltransferase V. Der Carboxy-Terminus beinhaltet die Akzeptorbindungsstellen und bildet das katalytische Zentrum. Zwischen der Transmembranregion und der katalytischen Domäne befindet sich eine Stem- Region, welche in vivo proteolytisch gespalten werden kann und so zur Sekretion löslicher Fucosyltransferase V führt. Die Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen Cys94 und Cys351 sowie Cys104 und Cys354 wurde aufgrund von Sequenzähnlichkeiten zur FucT III postuliert (Holmes et al., 2000). Gekennzeichnete Asparaginreste (Asn) sind putative N-Glycosylierungsstellen. et al., 2001). Einige Fucosyltransferasen, so auch die Fucosyltransferase V, werden durch die Behandlung mit alkylierenden Reagenzien inaktiviert, was auf das Vorhandensein freier Cysteine im aktiven Zentrum hindeutet. Dabei ist interessant, daß durch die Anwesenheit von GDP-Fucose diese Inaktivierung ausbleibt und das Cystein im aktiven Zentrum geschützt ist (Holmes et al., 1995). Die sechs humanen α1,3/4-fucosyltransferasen besitzen zwischen zwei und fünf potentielle N-Glycosylierungsstellen. Der Umfang, in dem diese posttranslatorische Modifikation entsteht, ist bedeutend für die Aktivität der Enzyme. Beide Stellen der Fucosyltransferase III sind glycosyliert (Holmes et al., 2000) und diese Modifikation ist essentiell für die Aktivität des Enzyms. Diese beiden Glycosylierungsstellen sind konserviert bei der Fucosyltransferase III, V und VI, jedoch haben die FucT V und VI noch zwei zusätzliche N- Glycosylierungsstellen, wobei die Glycosylierungsstelle Asn60 bei der FucT V nicht glycosyliert wird, wenn sie rekombinant in COS-Zellen exprimiert wird (Nguyen et al., 1998). Bislang konnte noch nicht eindeutig geklärt werden, ob die Aktivität direkt von der Glycosylierung des Enzyms abhängt (Christensen et al., 2000a und Christensen et al., 2000b) oder ob die Zuckerstrukturen ausschließlich für eine korrekte Faltung des Enzyms im endoplasmatischen C 13

24 Einleitung Reticulum verantwortlich sind (Morais et al., 2003). All diese Daten sind in der Lage, den Reaktionsmechanismus zu postulieren und einen Überblick über die Bedeutung einzelner Aminosäuren zu geben. Die Unterschiede in der Spezifität der Enzyme können so jedoch nur ansatzweise geklärt werden, so daß weitere strukturelle Daten, wie man sie aus der Röntgenstrukturanalyse gewinnen könnte, unbedingt notwendig sind Rekombinante Expression humaner α1,3/4-fucosyltransferasen Die Gewinnung humaner α1,3/4-fucosyltransferasen aus natürlichen Quellen ist beschränkt durch die geringe Expressionsrate dieser Enzyme in den unterschiedlichen Geweben (Cameron et al., 1995). Aus den Kulturüberständen einer humanen epidermoider Karcinoma-Zellinie konnte jedoch eine lösliche, sekretierte Form einer α-3/4-fucosyltransferase isoliert werden (Johnson et al., 1993). Diese Fucosyltransferase entspricht in ihrer Spezifität und ihren Eigenschaften der Fucosyltransferase, die in kleinen Mengen für die enzymatische Synthese aus menschlicher Milch gereinigt werden kann (Vandenbroucke et al., 1976 und Stangier et al., 1997). Unterschiedliche rekombinante Expressionssysteme wurden bis heute verwendet, um die humanen α1,3/4-fucosyltransferasen herzustellen. Für funktionelle, kinetische und zellbiologische Untersuchungen, wie z.b. der Sublokalisation von Fucosyltransferasen im Golgi-Apparat, reichen in der Regel geringe Mengen an Protein aus (Grabenhorst und Conradt, 1999, Vo et al., 1998 und Weston et al., 1992a). Dabei kann je nach Fragestellung die Aminosäuresequenz des exprimierten Konstruktes von der ursprünglichen abweichen. So führt die Deletion der Transmembrandomäne und von Teilen der Stemregion zu einer löslichen Form der Fucosyltransferase (de Vries et al., 1995). Diese lösliche Form entspricht weitestgehend der natürlichen löslichen Form von Fucosyltransferasen, die nach proteolytische Spaltung sezerniert werden (Mollicone et al., 1990). Strukturelle Untersuchungen erfordern jedoch Expressionssysteme, die das Zielprotein kostengünstig in großen Ausbeuten produzieren und eine einfache sowie verlustarme Reinigungstrategie ermöglichen. Durch die Verwendung der Hefezellinie Pichia pastoris konnte eine sekretierte Form der humanen Fucosyltransferase III mit einer Ausbeute von 30 mg/l Expressionsansatz produziert werden (Gallet et al., 1998). Hefen unterscheiden sich jedoch hinsichtlich posttranslationalen Modifikation sehr stak von menschlichen Zellen. Speziell die stark ausgeprägte N-Hyper-Glycosylierung kann dafür sorgen, daß das rekombinante Enzym sich stark von der nativen Form unterscheidet. 14

25 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit In den meisten Fällen werden α1,3/4-fucosyltransferasen in Säugetierzellen hergestellt. Dieses Expressionssystem gewährleistet eine weitestgehend originäre posttranslationale Modifikation und stellt so eine hohe Vergleichbarkeit mit dem nativen Enzym sicher. Hinsichtlich der Ausbeuten an rekombinanten Fucosyltransferasen, die in der Regel bei 0,1 0,5 mg/l liegen (Costa et al., 1997a, Weston et al., 1992b, Christensen et al., 2000a und Xu et al., 1996), ist die Verwendung von mammalen Zellen jedoch als ungeeignet zu betrachten, größere Mengen an rekombinantem Enzym zu produzieren. Insektenzellen haben in den letzten Jahren eine bedeutende Rolle bei der Expression von α1,3/4-fucosyltransferasen erlangt. Der Expressionsapparat der Insektenzellen ist vergleichsweise nahe mit den höherer Eukaryoten verwandt, ihre Glycosylierungsmuster unterscheiden sich allerdings in gewissen Maßen (O Reilly et al., 1994). Die Fucosyltransferase VII wurde mit Hilfe des Baculovirus-Expressionssystems als lösliches Protein-A-Fusionsprotein mit einer Ausbeute von 10 mg/l in Spodoptera frugiperda-zellen (Sf9) exprimiert und über eine IgG-Sepharosesäule gereinigt (Shinkai et al., 1997). Auch die Fucosyltransferase III war, jedoch ohne Fusionsanteil, so mit einer Ausbeute von 1 mg/l sowohl in Sf9- als auch in Trichoplusia ni-zellen (T. ni) zugänglich (Morais et al., 2001). Durch die Verwendung stabil transfizierter Sf9-Zellen steigerte sich die Ausbeute an rekombinanter Fucosyltransferase III auf 12 mg/l (Morais und Costa, 2003) und zeigt somit eine Methode auf, die es ermöglicht größere Mengen dieses Enzyms herzustellen. Allgemein ist jedoch zu sagen, daß fast alle α1,3/4-fucosyltransferasen bisher nur mit sehr kleinen Ausbeuten unter Verwendung von Säugetierzellen exprimiert wurden, und daß diese Methoden ungeeignet zur Produktion größerer Mengen von α1,3/4-fucosyltransferasen sind, wie man sie für strukturelle Untersuchungen benötigt. 1.4 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit Die Aufgabenstellung der vorliegenden Arbeit war die Expression großer Mengen humaner Fucosyltransferase V. Hierbei sollte geklärt werden, inwieweit prokaryotische Expressionsysteme in der Lage sind, funktionell aktives Protein zu produzieren, oder ob die Verwendung eukaryotischer Expressionssysteme notwendig ist. In Bezug auf die bisher äußerst geringen Ausbeuten bei der Expression der Fucosyltransferase V in Säugetierzellen, sollte eine auf eukaryotischen Zellen basierende Expression etabliert werden, die hinsichtlich der Expressionrate deutlich über den bisher erzielten Werten liegt. Die auf diese Weise produzierte rekombinante Fucosyltransferase V sollte gereinigt und strukturell untersucht werden. Es war angestrebt, durch unter- 15

26 Einleitung schiedliche biophysikalische Methoden tiefere Erkenntnisse über den strukturellen Aufbau der Fucosyltransferase V zu erlangen. Als drittes Ziel wurde die Entwicklung von Inhibitoren von der Fucosyltransferase V angestrebt. Dabei könnte mit Hilfe der Phage Display-Technologie unterschiedliche vollständig degenerierte Peptid-Bibliotheken gegen die Fucosyltransferase V selektiert werden, um so Liganden zu erhalten, die den enzymatischen Umsatz dieses Proteins inhibieren. Langfristig sollten strukturelle Daten neben diesem kombinatorischen Ansatz ein rationales Design von spezifischen Inhibitoren ermöglichen. 16

27 2 Material 2.1 Chemikalien Allgemeine Chemikalien wurden bei Sigma (Taufkirchen), Merck (Darmstadt), Fluka (Taufkirchen), Invitrogen (Karlsruhe), Biomol Feinchemikalien (Hamburg), Applichem (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Millipore (Eschborn), Calbiochem (Schwalbach) und Peqlab (Erlangen) bezogen. 2.2 Enzyme, Proteine und Antikörper Restriktionsenzyme, Mung Bean Nuclease, T4 Ligase, Alkalische Phosphatase (Calf intestinal alkaline Phosphatase) (CIAP) und dazugehörige Puffer wurden von MBI Fermentas (St. Leon Rot) und von NEB (Frankfurt) bezogen. Thermus aquaticus DNA Polymerase wurde von Eppendorf (Hamburg) oder von Roche (Mannheim) bezogen. Lysozym wurde ebenfalls von Roche gekauft. Fucosyltransferase V wurde in kleinen Mengen von Calbiochem (Schwalbach) bezogen. SDS-PAGE Proteinstandards (broad range standard, BRS) wurde von BioRad (München) bezogen. Antikörper wurden von Sigma (Taufkirchen) bezogen. 2.3 Affinitätsmatrices und Partikel Ni-NTA-Agarose wurde von Qiagen (Hilden) bezogen. Dowex Harz wurde von BioRad (München), Protein A-Agarose wurde von Santa Cruz Biotechnologie (Santa Cruz, Kalifornien, USA) und GDP-Affigel von Jülich Fine Chemicals (Jülich) bezogen. 2.4 Bakterien und Hefestämme Der Bakterienstamm E. coli DH5α (Promega, Mannheim) wurde für die Amplifikation von Plasmiden verwendet. Der Stamm BL21(DE3)pLysS wurde für die rekombinante Expression von Proteinen verwendet. Der Stamm ER2738 war Teil des Ph.D.-C7C Phage Display Library Kit von NEB (Frankfurt) und diente zur Vermehrung von Phagen (Tabelle 2.1). 17

28 Material Stamm Genotyp DH5α supe44 lacu169 (φ801z M15) hsdr17 reca1 enda1 gyra96thi-1 rela1 BL21(DE3)pLysS E. coli B F dcm ompt hsds(r B m B ) galλ(de3) plyss Cam r ER2738 F lacl q (lacz)m15 proa + B + zzf::tn10(tet R )/fhua2 supe thi (lacproab) (hsdms-mcrb)5 (r k m k McrBC ) Tabelle 2.1 Genotypen der verwendeten Bakterienstämme 2.5 Vektoren pmal-c2x Der Vektor pmal-c2x wurde von NEB (Frankfurt) bezogen und diente zur Expression von MBP-Fusionsproteinen in E. coli. pet26dhfr-his Der Vektor pet26dhfr-his stand im Arbeitskreis zur Verfügung und wurde für die Expression der DHFR in E. coli verwendet. puc18/19 pegfp-n1 pvl1392 ptriex4-neo pibv5-his Die Vektoren puc18/19 (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) wurde für die Klonierung verwendet. Der Vektor pegfp-n1 (Clontech, Heidelberg) wurde bei der Transfektion von mammalen Zellinien verwendet, um die Transfektionseffizienz zu bestimmen. Der Vektor pvl1392 (Pharmingen, Karlsruhe) wurde als Baculovirus-Transfervektor für die Expression in Insektenzellen eingesetzt. Der Vektor ptriex4-neo (Novagen, Schwalbach) wurde als Baculovirus-Transfervektor für die Expression in Insektenzellen eingesetzt. Der Vektor pibv5-his (Invitrogen, Karlsruhe) diente zur stabilen Expression in Insektenzellen. 18

29 Zellinien und Kultur 2.6 Zellinien und Kultur Sf900II-, Express Five-, DMEM-Medium, Penicillin G, Streptomycin und Trypsin/EDTA wurden von Gibco BRL (Eggenstein) bezogen. Zellkulturschalen wurden bei Greiner (Frickenhausen), Nunc (Wiesbaden), Sarstedt (Nümbrecht) oder Corning (Wiesbaden) bezogen. Fötales Kälberserum wurde bei Biochrom (Berlin) gekauft. Für die Expression wurden die mammalen Zellinien CHO und HEK293 und die Insektenzellinien Sf9 (Spodoptera frugiperda) und BTI-TN-5B1-4 (HighFive, Trichoplusia ni) verwendet. 2.7 Lösungen BCIP-Stocklösung 0,5 %(W/V) BCIP in DMF Blockierungspuffer 0,1 M NaHCO 3, ph 8,6 5 mg/ml BSA BSATBS 3 % BSA in TBS CAPS-Puffer 20 mm CAPS, ph 11,0 10 %(v/v) Methanol Citratpuffer 50 mm Zitronensäure, ph 4,0 Coomassie-Entfärber 45 %(v/v) Methanol 10 %(v/v) Eisessig Coomassie-Färbelösung 0,25 %(w/v) Coomassie Brilliant Blue R %(v/v) Methanol 10 %(v/v) Eisessig Detektionspuffer (AP) 0,1 M Tris-HCl, ph 9,5 4 mm MgCl 2 Detektionspuffer 3,3 mg ABTS 15 ml Citratpuffer 26,5 µl H 2 O 2 19

30 Material Elutionspuffer 25 mm MES, ph 7,0 3 mm GDP G418-Stocklösung 0,4 %(w/v) G418 in HEPES, 100 mm, ph 7,4 steril filtrieren Lagerung bei 20 C Iodid-Puffer 10 mm Tris-HCl, ph 8,0 1 mm EDTA 4 M NaI Loading Dye (6x) 20 %(w/v) Ficoll mm EDTA 0,025 %(w/v) Bromphenol-Blau 0,025 %(w/v) Xylenxyanol FF Lösung I 50 mm Glucose 25 mm Tris-HCl, ph 8,0 10 mm EDTA autoklavieren Lagerung bei 4 C Lösung II 0,2 M NaOH 1 %(w/v) SDS Lösung III 3 M Kaliumacetat 11,5 %(v/v) Essigsäure autoklavieren Lagerung bei 4 C NBT-Stocklösung 0,1 %(w/v) NBT in 0,1 M Tris- HCl, ph 9,5 PBS 33 mm Na 2 HPO 4 15 mm NaH 2 PO mm NaCl ph 7,2 PEG/NaCl 20 %(w/v) Polyethylenglykol ,5 M NaCl 20

31 Lösungen Phenol/Chloroform 50 %(v/v) Phenol (Tris-gesättigt) 50 %(v/v) Chloroform Probenpuffer (4x) 250 mm Tris-HCl, ph 6,8 8 %(w/v) SDS 40 %(v/v) Glyzerin 0,004 %(w/v) Bromphenolblau Reaktionspuffer 50 %(v/v) DMSO 50 %(v/v) PBS Sammelgelpuffer (4x) 536 mm Tris-HCl, ph 6,8 4 %(w/v) SDS Sonication Puffer 100 mm Na 2 HPO mm NaCl ph 8,0 TAE (50x) 2 M Tris 50 mm EDTA ph 8,5 Tankpuffer (5x) 124 mm Tris, ph 8,3 0,96 M Glycin 0,5 %(w/v) SDS TBS 50 mm Tris-HCl, ph 7,5 150 mm NaCl TBST 50 mm Tris-HCl, ph 7,5 150 mm NaCl 0,5 % (w/v) Tween 20 Trenngelpuffer (4x) 1,5 M Tris-HCl, ph 8,8 0,4 %(w/v) SDS Tris-HCl + MgCl 2 92,5 mm Tris-HCl, ph 9,5 4 mm MgCl 2 Waschpuffer 25 mm MES, ph 7,0 21

32 Material 2.8 Medien LB-Medium 10 g NaCl 5 g Hefe-Extrakt 10 g Bacto-Trypton ad 1 l ddh 2 O autoklavieren LB-Medium 10 g NaCl 5 g Hefe-Extrakt 10 g Bacto-Trypton 15 g Agar ad 1 l ddh 2 O autoklavieren TSS 85 % (v/v) LB-Medium 10 % (w/v) PEG % (v/v) DMSO 50 mm MgCl 2, ph 6,2 2.9 Oligonukleotide Die verwendeten Oligonukleotide wurden von Metabion (Martinsried) synthetisiert (siehe Tabelle 2.2) Bibliotheken und Phagen In dieser Arbeit wurden Phagen aus dem Ph.D.7,- dem Ph.D.C7C- und dem Ph.D.12 Phage Display Peptide Library Kit NEB (Frankfurt) verwendet. 22

33 Bibliotheken und Phagen Name Sequenz 5-3 Schnittstellen/ Mutationen t19a t19a antisense t295a t295a antisense β-tracefuctv pfuctvfwgen pfuctvrevgen pmalfw pmalrev FucTVBamHIfw FucTVPstIrev M13 M13 rev pibseq pibseqrev -96Primer CAA TGG GTC CCG CAG CCA GGA CAG CAT G CAT GCT GTC CTG GCT GCG GGA CCC ATT G CCC CCA GCA ACA GCC GGC ACC TGG CCA GGT GCC GGC TGT TGC TGG GG CGG GAT CCC GCC ATG GCT ACT CAT CAC ACG CTG TGG ATG GGA CTG GCC CTG CTG GGG GTG CTG GGC GAC CTG CAG GCA GCA GCT CCC AAT GGG TCC CGC TGC CCC AAG CTT ATG GAT CCC CTG GGC CCA GCC AAG CCG GAA TTC TCA GGT GAA CCA AGC CGC TAT GCT CGG AAT TCG CTC CCA ATG GGT CCC GCT GCC AG CCA AGC TTT CAG GTG AAC CAA GCC GCT ATG CT CGG GGA TTC CTC CCA ATG GGT CCC GCT GCC AG CCA AGC TCT CAG GTG AAC CAA GTG GCT ATG CT GTA AAA CGA CGG CCA GTG CCA A CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG A CGC AAC GAT CTG GTA AAC AC GAC AAT ACA AAC TAA GAT TTA GTC AG GCC CTC ATA GTT AGC GTA ACG T190A T190A T703A T703A BamHI, NcoI Hind III EcoRI EcoRI HindIII BamHI PstI Sequenzierprimer Sequenzierprimer Sequenzierprimer Sequenzierprimer g3 Sequenzierprimer Tabelle 2.2 Liste der verwendeten Oligonukleotide. 23

34 24

35 3 Methoden 3.1 Molekularbiologische Methoden Mini-Präparation von Plasmid-DNA Die Isolation der Plasmid-DNA wurde nach der Methode der alkalischen Lyse (Birnboim und Doly, 1979) durchgeführt. LB Medium (3 ml) mit Ampicilin (100 µg/ml) wurden mit einer Kolonie angeimpft und über Nacht bei 37 C unter Schütteln (220 rpm) inkubiert. Davon wurden 2 ml in ein Reaktionsgefäß überführt und zentrifugiert (4 min, xg, Raumtemperatur). Der Überstand wurde vorsichtig abgesogen und die sedimentierten Zellen in 100 µl Lösung I resuspendiert. Anschließend wurden 200 µl Lösung II zugegeben, das Reaktionsgefäß mehrfach invertiert und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 150 µl Lösung III wurde wiederum mehrfach invertiert, für 5 min bei 4 C inkubiert und zentrifugiert (5 min, xg, 4 C). Der Überstand wurde in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt, mit 400 µl Phenol/Chloroform extrahiert und die DNA anschließend durch Zugabe von 1 ml kaltem Ethanol für 10 min bei Raumtemperatur gefällt. Nach 10 min Zentrifugation bei 4 C und xg wurde das Pellet mit 500 µl 70 %igem Ethanol gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet. Die DNA wurde in 20 µl TE aufgenommen und mit 0,5 µl RNAse (10 mg/ml) versetzt Isolierung von Plasmid-DNA mit käuflichen Kits Plasmid-DNA für Klonierungen, Transfektionen oder Sequenzierungen wurde mittels des E.Z.N.A. Plasmid Minipräpp II Kits (Peqlab, Erlangen) gereinigt. Die Präparation erfolgte gemäß der Anleitung des Herstellers. Die Lagerung der DNA erfolgte bei 20 C Quantifizierung von DNA In einer Quarzküvette wurden 100 µl DNA-Lösung bei 260/280 nm im Photometer (Ultrospec 3000-Photometer, Amersham Biosciences, Freiburg) vermessen. Dabei entspricht eine optische Dichte von 1 bei 260 nm dem empirischen 25

36 Methoden Wert von 50 µg DNA/ml. Reine DNA sollte ein Verhältnis der OD 260/280 von 1,8 bis 2,0 aufweisen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Zur Amplifikation von DNA-Bereichen, die zwischen bekannten Sequenzen liegen, wurde die Polymerase-Kettenreaktion verwendet (Saiki et al., 1988). Zwei zu den bekannten Sequenzen komplementäre DNA-Fragmente dienen als Primer. Die Synthese der DNA erfolgte durch die Taq-DNA-Polymerase (Eppendorf PCR Readymix), eine thermostabile Polymerase aus Thermus aquaticus. Ein 50 µl PCR-Ansatz setzte sich, wie in Tabelle 3.1 gezeigt, zusammen. 1 5 µl Template 1 10 µl Sense-Oligonukleotid (100 µm) 1 10 µl Antisense-Oligonukleotid (100 µm) 20 µl 2,5x PCR Fertigmix mit dntps, Puffer und Polymerase (Eppendorf) Tabelle 3.1 PCR-Ansatz. Das nachfolgende Programm (siehe Tabelle 3.2) wurde im Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg) durchgeführt. Die Charakterisierung des Amplifikats erfolgte mittels Agarose-Gelelektrophorese. Schritt Dauer Temperatur 1. Primärdenaturierung 30 s 1 min 94 C 2. Denaturierung 30 s 94 C 3. Hybidisierung 1 2 min 45 C 67 C 4. Elongation 1 2 min 72 C Zyklen (Schritt 2 4) 5. Terminale Elongation 5 10 min 72 C Tabelle 3.2 PCR-Programm Dephosphorylierung Zur Dephosphorylierung endständiger Phospatgruppen von DNA-Fragmenten wurde zum Restriktionsansatz 1 µl CIAP (MBI Fermentas, St. Leon Rot) zugegeben und das Reaktionsgemisch bei 37 C inkubiert. Nach 30 min wurde 26

37 Molekularbiologische Methoden erneut 1 µl CIAP zugegeben und für weitere 30 min inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 6x Loading Dye oder durch Hitzedeaktivierung gestoppt Alkoholpräzipitation der DNA Der Restriktionsansatz wurde mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetatlösung (ph 5,2) und mit dem 2,5-fachem Volumen eiskaltem Ethanol versetzt und 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Der Ansatz wurde zentrifugiert (10 min, xg, 4 C), der Überstand abgesogen und das Pellet mit 500 µl eiskaltem 70 %igem Ethanol versetzt. Nach 5 min bei Raumtemperatur wurde erneut zentrifugiert (10 min, xg, 4 C), der Überstand abgesogen und das Pellet an der Luft getrocknet. Die DNA wurde dann in dem gewünschten Volumen ddh 2 O aufgenommen Agarose-Gelelektrophorese Die Agarose-Gelelektrophorese wurde zur Restriktionsanalyse, Analyse von PCR-Ansätzen und zur präparativen Isolation von DNA-Fragmenten genutzt. Es wurden 1 %ige Agarosegele (Qualex Gold Agarose, AGS Heidelberg) zur Auftrennung von Fragmenten von 500 bp bis bp Größe sowie 2 %ige Agarose-Gele zur Auftrennung von Fragmenten unter 500 bp verwendet. Die Agarose wurde in TAE-Puffer aufgekocht und mit 5 µl Ethidiumbromid (1 µg/ml) versetzt. Die Proben wurden mit 6x Loading Dye (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) versetzt. Als Standard wurde λ-dna/eco130i (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) verwendet. Die DNA-Fragmente wurden bei V in einer Elektrophoresekammer in TAE-Puffer aufgetrennt, mittels des Ethidiumbromids auf einem UV-Transilluminator (302 nm) sichtbar gemacht und mit einem Videosystem (Intas, Göttingen) dokumentiert DNA-Extraktion aus Agarose-Gelen Die Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen erfolgte mit dem QiaexII Gel Extraktion Kit (Qiagen, Hilden) nach Anleitung des Herstellers Ligation Der für die Ligation verwendete Vektor wurde im Verhältnis 1:1 bis 1:5 zum Insert eingesetzt, wobei das Verhältnis im Agarose-Gel abgeschätzt wurde. Ein Ligationsansatz setzt sich wie in Tabelle 3.3 gezeigt zusammen. 27

38 Methoden X µl Vektor Y µl Insert 1 µl T4-DNA-Ligase (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) 2 µl 10x Ligationspuffer (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) ad 20 µl mit ddh 2 O Tabelle 3.3 Ligations-Ansatz Die Ligation erfolgte über Nacht bei 16 C, anschließend erfolgte eine Hitzeinaktivierung der Reaktion (65 C, 15 min) Herstellung kompetenter DH5α-Zellen Die Herstellung chemisch kompetenter Zellen erfolgte nach einer Methode von Chung (Chung et al., 1989). LB-Medium (3 ml) wurde mit DH5α-Zellen angeimpft und über Nacht bei 37 C unter Schütteln (220 rpm) inkubiert. Hiervon wurde 1 ml abgenommen und zu 100 ml LB-Medium gegeben. Diese Kultur wurde unter o.g. Bedingungen bis zu einer OD 600 von 0,6 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 20 min auf Eis gekühlt, in 50 ml Reaktionsgefäße überführt und durch Zentrifugation (1 C, xg, 10 min) sedimentiert. Der Überstand wurde dekantiert und die Pellets in je 5 ml eiskalter TSS-Lösung resuspendiert. Die Zellen wurden aliquotiert (300 µl) und mit Hife von flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei 80 C gelagert Transformation Kompetente DH5α-Zellen wurden 30 min auf Eis aufgetaut und 100 µl davon mit 10 µl Ligationsansatz oder 0,5 µl (ca. 1 ng) präpariertem Plasmid vermischt und für 30 min auf Eis inkubiert. Das Reaktionsgefäß wurde anschließend 90 s auf 42 C erhitzt und 2 min auf Eis inkubiert. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 1 ml LB-Medium gegeben und der Ansatz 1 h bei 37 C inkubiert, um danach auf einer LB-Agar-Platte ausgestrichen zu werden Lagerung von E. coli Klonen E. coli Klone waren für einen Monat auf Agarplatten haltbar, wenn diese mit Parafilm verschlossen und invertiert bei 4 C aufbewahrt wurden. Zur Langzeitlagerung wurde 1 ml einer frischen E. coli-kultur in der logarithmischen 28

39 Molekularbiologische Methoden Wachstumsphase mit 200 µl 80 %igem Glycerol versetzt und in einem Kryoröhrchen mit Hilfe von flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei 80 C gelagert DNA-Sequenzierung Die zu sequenzierende Plasmid-DNA wurde über das E.Z.N.A. Plasmid Minipräp II Kit (Peqlab, Erlangen) gereinigt und photometrisch quantifiziert. Etwa ng DNA, ca. 10 pmol des entsprechenden Oligonukleotids, 6 µl Half Term-Puffer und 2 µl Big Dye Terminator Ready Reaktion Mix wurden in ein Reaktionsgefäß gegeben und mit ddh 2 O auf 20 µl Volumen aufgefüllt. Die für die Sequenzierung verwendeten Reagenzien sind Bestandteile des Big Dye Terminator Ready Reaktion Kits (Applied Biosystems, Weiterstadt). Mit dem Ansatz wurde das folgende Programm im Termocycler (Mastercycler Gradient, Eppendorf, Hamburg) durchgeführt (Tabelle 3.4). Schritt Dauer Temperatur 1. Denaturierung 30 s 96 C 2. Hybridisierung 5 s 48 C 50 C 3. Elongation 4 min 60 C 25 Zyklen (Schritte 1 3) 4. Terminale Elongation 5 10 min 72 C Tabelle 3.4 Sequenzierprogramm Anschließend wurde die DNA mit 8 µl 3 M Natriumacetat (ph 5,2) und 300 µl 96 %igem Ethanol gefällt (30 min, 4 C) und zentrifugiert (30 min, xg, 4 C). Nach Zugabe von 500 µl 70 %igem Ethanol wurde zentrifugiert (15 min, xg, 4 C), der Überstand abgesogen und die DNA für 1 h an der Luft getrocknet. Die Auftrennung und Auswertung der sequenzierten DNA erfolgte durch das Institut für Zellbiochemie am Universitätskrankenhaus Eppendorf, Arbeitskreis Richter Ortsspezifische Mutagenese Für eine ortspezifische Mutagenese wurde die QuickChange-Methode (Wang und Malcolm, 1999) angewandt, bei der zwei komplementäre Oligonukleotide verwendet werden, in deren Mitte der gewünschte Basenaustausch kodiert ist. Mit diesen Oligonukleotiden wurde das cdna tragende Plasmid amplifiziert. 29

40 Methoden Die methylierte Template-DNA wurde mit dem Restriktionsenzym Dpn I verdaut. Nicht-methylierte, durch Pfu Polymerase amplifizierte DNA wird nicht verdaut und anschließend gefällt. Es erfolgte die Transformation in kompetente DH5α-Zellen. 3.2 Phagentechniken Phagen Display Das Phagen Display-System ist ein Selektionsprozess zur Identifikation von Bindungs-Partnern. In einem zyklischen Prozeß aus Transkription/Translation und Affinitäts-Selektion werden Bindungs-Partner angereichert. Durch den Bakteriophagen können Peptide auf der Oberfläche als Fusionspartner des Hüllproteins GenIII exprimiert werden und sind direkt mit der genetischen Information verknüpft. Durch eine nachfolgende Infektion von E. coli mit dem filamentösen Bakteriophagen M13 kann die genetische Information gewonnen werden Selektion der Peptidbibliothek Titerbestimmung Zur Bestimmung des Phagentiters wurden 10 ml LB-Medium mit ER2738 E. coli Zellen angeimpft und bis zu einer OD 600 von 0,5 bei 37 C und 220 rpm inkubiert. Es wurden Verdünnungen des Phageneluates in LB-Medium von 10 1 bis 10 4 vorbereitet. Von jeder Verdünnung wurden 10 µl mit je 200 µl der gewachsenen Zellsuspension versetzt und ca. 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zu 3 ml vorgewärmtem Top-Agar gegeben und auf einer LB-IPTG-X-Gal-Platte verteilt. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 37 C. Die blaugefärbten Plaques wurden ausgezählt und der Titer errechnet. Zur Titerbestimmung der amplifizierten Phagen wurde analog verfahren; es wurden jedoch Verdünnungen von 10 5 bis angesetzt Amplifikation selektierter Phagen Nach erfolgreicher Affinitäts-Selektion der Phagen müssen diese in ER2738 E. coli Zellen für weitere Runden der Selektion vermehrt werden. Es wurden 20 ml LB-Medium mit ER2738 E. coli Zellen angeimpft und bei 37 C und 30

41 Phagentechniken 220 rpm inkubiert. Nach Erreichen einer OD 600 von 0,5 wurde das Phagen- Eluat zugesetzt und die Kultur für weitere 4,5 h bei 37 C geschüttelt. Anschließend wurden die Zellen bei 2800 xg und 4 C für 30 min zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und mit 1/6 Volumen PEG/NaCl-Lösung versetzt und über Nacht bei 4 C inkubiert. Die so gefällten Phagen wurden zentrifugiert (4 C, 2800 rpm, 30 min), in 1 ml TBS resuspendiert und 5 min bei 4 C und xg zentrifugiert, um restliche Zellen abzutrennen. Die Phagen wurden in ein steriles 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und mit 1/6 Volumen PEG/NaCl-Lösung für 1 2 h bei 4 C gefällt. Nachfolgend wurde für 10 min bei 4 C und xg zentrifugiert, der Überstand verworfen und die pelletierten Phagen in 200 µl TBS aufgenommen Phagen-DNA-Präparation zur Sequenzierung Zur Analyse der Klone, die in den dritten Selektionsrunden isoliert wurden, wurde die Sequenz ermittelt. Dafür wurden zuerst einzelne Klone amplifiziert, um dann aus den Phagen die DNA zu isolieren. Es wurden Übernachtkulturen von ER2738 E. coli Zellen in LB-Tetracyclin-Medium angesetzt und bei 37 C und 220 rpm inkubiert. Am folgenden Tag wurde die Kultur 1:100 (100 µl auf 10 ml) in LB-Medium verdünnt. Von dieser Verdünnung wurde jeweils 1 ml in mehrere Rundbodenröhrchen überführt. Anschließend wurde eine repräsentative Anzahl der positiven Klonen mit einer Pipettenspitze gepickt, diese in die vorbereiteten Rundbodenröhrchen gegeben und bei 37 C für 4,5 5 h im Schüttler inkubiert. Die Kulturen wurden in sterile Reaktionsgefäße überführt und für 5 min bei 5000 xg zentrifugiert. 500 µl des Phagen enthaltenen Überstandes wurden in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit 200 µl PEG/NaCl-Lösung versetzt. Nach Inversion folgte eine Inkubation von 10 min bei Raumtemperatur. Es wurde 10 min bei xg zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 100 µl Iodid-Puffer resuspendiert, mit 250 µl 96 % Ethanol versetzt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde bei xg für 10 min zentrifugiert und das Pellet mit 250 ml 70 % (v/v) Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde in 30 µl ddh 2 O aufgenommen Polyklonale ELISA-Analyse Um den Verlauf der Selektion auf eine mögliche Anreicherung spezifischer Phagen hin zu verfolgen, wurde die Reaktivität der amplifizierten Phagen charakterisiert. Dazu wurde das Zielmolekül ( µg/ml) über Nacht bei 31

42 Methoden 4 C in den Vertiefungen einer ELISA-Platte inkubiert. Anschließend wurde die Platte dreifach mit TBS gewaschen und mit Blockierungspuffer für 2 h bei Raumtemperatur blockiert. Die Inkubation der Phagen (1:10 verdünnt in Blockierungspuffer) erfolgte bei Raumtemperatur für 2 h; nach dreimaligem Waschen mit TBS wurde mit 100 µl eines anti-m13-pod-konjugates (1:5.000 in Blockierungspuffer) für 1 h inkubiert. Nach drei- bis fünffachem Waschen mit TBST und TBS wurde die Farbentwicklung mit Detektion für POD durchgeführt und bei 405 nm vermessen Monoklonale ELISA-Analyse Zur Charakterisierung der Reaktivität singulärer Phagen-Klone wurde analog zu der polyklonalen Analyse verfahren. Nach der dritten Selektionsrunde wurden ER2738 E. coli-zellen in einem Kulturvolumen von 3 ml bis zu einer OD 600 von 0,5 bei 37 C und 220 rpm inkubiert. Die Bakterienzellen wurden mit einzelnen Phagenkolonien angeimpft und für 4,5 h bei 37 C und 220 rpm inkubiert. Aus dem Überstand dieser Kulturen wurden die Phagen mit 1/6 Volumen PEG/NaCl-Lösung präzipitiert und nach Zentrifugation ( xg, 10 min, 4 C) in 100 µl TBS resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation wurde der Überstand abgenommen und für die ELISA-Analyse eingesetzt Selektion Für die Selektion wurde in den ersten beiden Selektionsrunden auf die Verwendung von Immuno-Röhrchen zurückgegriffen, die zur Belegung mit 1 ml einer Streptavidin-haltigen PBS-Lösung (100 µg/ml) über Nacht bei 4 C auf dem Rollbrett inkubiert wurden. Am folgenden Tag wurde das Immunoröhrchen entleert, dreifach mit TBS gewaschen, komplett mit Blockierungspuffer befüllt und für einen Zeitraum von 2 h bei RT inkubiert. Währenddessen wurden 4 8 µg biotinyliertes Zielprotein mit Phagen der Heptapeptid-Bibliothek (10 µl) in einem Volumen von 200 µl für 2 h bei RT inkubiert. Danach wurde der Ansatz auf 1 ml mit Blockierungspuffer aufgefüllt, in das entleerte Immuno- Röhrchen gegeben und für 1 h bei RT inkubiert. Nicht gebundene Phagen wurden mit dem Überstand verworfen und das Röhrchen auf sauberem Papier ausgeschlagen. Im Anschluß wurde zehnfach mit TBST gewaschen. Die gebundenen Phagen wurden durch Zugabe von 1 ml 0,2 M Glycin-HCl, ph 2,2 für exakt acht Minuten auf dem Rollbrett bei Raumtemperatur eluiert. Anschließend wurde zur Neutralisation 150 µl 1 M Tris-HCl, ph 9,1, in das Polystyrol-Gefäß gegeben, invertiert und das Eluat in ein Reaktionsgefäß überführt. 10 µl des 32

43 Proteinbiochemische Methoden Eluats wurden anschließend zur Bestimmung des Titers eingesetzt, der Rest zur Amplifikation eingesetzt. In der dritten Selektionsrunde wurde das Zielprotein direkt chemisch an eine Epoxy-funktionalisierte Polystyroloberfläche gebunden. Hierzu wurde die Vertiefung einer solche ELISA-Platte mit Proteinlösung einer Konzentration von 50 µg/ml über Nacht bei 4 C geschüttelt. Daraufhin wurde die Proteinlösung entfernt und mit 200 µl Blockierungspuffer für 2 h bei RT inkubiert Phagen der Heptapeptid-Bibliothek (10 µl) in einem Volumen von 200 µl Blockierungspuffer wurde in die Vertiefung pipetiert und bei RT auf einem Schüttelbrett inkubiert. Nicht gebundene Phagen wurden mit dem Überstand verworfen und das Röhrchen auf sauberem Papier ausgeschlagen. Im Anschluß wurde zehnmal mit TBST gewaschen. Die gebundenen Phagen wurden mit 1 ml 0,2 M Glycin-HCl, ph 2,2 für exakt acht Minuten eluiert. Anschließend wurde zur Neutralisation 150 µl 1 M Tris-HCl, ph 9,1, in das Polystyrol-Gefäß gegeben, invertiert und das Eluat in ein Reaktionsgefäß überführt. 10 µl des Eluats wurden anschließend zur Bestimmung des Titers, der Rest zur Amplifikation eingesetzt. 3.3 Proteinbiochemische Methoden SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese Die elektrophoretische Auftrennung von Proteinen wurde in einem diskontinuierlichen System nach (Laemmli, 1970) mit einem Minigel-Gerät (2050 Midget, Amersham Biosiences, Freiburg) durchgeführt Coomassie-Färbung von Proteinbanden Nach der Elektrophorese wurden die Polyacrylamidgele für 30 min in einer filtrierten Lösung von 0,25 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250 in 45 % (v/v) Methanol und 10 % (v/v) Eisessig gefärbt. Als Entfärber diente eine Lösung aus 45 % (v/v) Methanol und 10 % (v/v) Eisessig Silberfärbung von Proteinbanden Die Polyacrylamidgele wurden nach der Elektrophorese für 1 h in 30 % (v/v) Ethanol und 10 % (v/v) Eisessig fixiert und anschließend für 1 12 h in eine Inkubationslösung aus 500 mm Natriumacetat, 14 mm Na 2 S 2 O 4, 25 % (v/v) 33

44 Methoden Ethanol und 0,5 % (v/v) Glutaraldehyd (25 %ig) eingelegt. Nach dreimal 10 min Waschen mit Wasser wurden die Gele 30 min in 6 mm AgNO 3, 0,06 % (v/v) Formaldehyd (37 %ig) gefärbt, kurz mit Wasser gewaschen und anschließend in 263 mm Na 2 CO 3, 0,06 % (v/v) Formaldehyd (37 %ig) entwickelt. Gestoppt wurde die Entwicklung durch Überführen der Gele in 50 mm EDTA- Lösung Trocknen von Polyacrylamidgelen Die Gele wurden zwischen zwei Cellophanfolien in einem SE 1200 Easy Breeze Air Gel Dryer (Hoefer Scientiffic Instuments, USA) getrocknet Western Blot Der elektrophoretische Transfer von Proteinen auf Membranen wurde in einer TE Series Transfer Elektrophoresis Einheit (Hoefer Scientific Instruments, USA) durchgeführt. Als Membran wurde eine Immobilon-P PVDF-Membran (Millipore, Eschborn) verwendet, die kurz in Methanol, für 10 min in Wasser und anschließend für 5 min in Transferpuffer äquilibriert wurde. Filterpapiere, Faserschwämme und SDS-Polyacrylamidgele wurden nach beendeter Elektrophorese für 5 min in Transferpuffer äquilibriert und anschließend zu einem Sandwich aus Faserschwamm, Polyacrylamidgel, Filterpapier und Transfermembran luftblasenfrei in einem Gelhalter gestapelt. Der Transfer erfolgte unter Eiskühlung in Transferpuffer bei 50 V und 180 ma für 1,5 h Proteinbestimmung Proteinbestimmungen wurden nach der BCA-Methode durchgeführt (Smith et al., 1985). Als Standardlösungen dienten Verdünungen von BSA, wobei alle Messungen in Doppelbestimmungen durchgeführt wurden Zellaufschluß von E. coli BL21(DE3)pLysS Zur Aufreinigung der cytoplasmatisch rekombinant exprimierten Proteine wurden die E. coli Zellen mit Ultraschall aufgeschlossen. Dazu wurden die Bakterienkulturen nach Beendigung der Expression zunächst bei 1700 xg für 15 min (4 C) zentrifugiert. Anschließend wurden die Pellets in Abhängigkeit von der nachfolgenden Säulenchromatographie in dem zugehörigen Puffer resuspendiert und vereinigt. Bei microns wurde die Zellsuspension 15-mal für 34

45 Proteinbiochemische Methoden 30 s auf Eis sonifiziert (Soniprep 150, MSE Hamburg). Der Rohextrakt wurde anschließend bei xg für 1 h (4 C) zentrifugiert. Die Überstände wurden vereinigt, durch einen Spritzenfilter (0,22 µm, Typ GS, Millipore, Eschborn) sterilfiltriert und bei 4 C bis zur weiteren säulenchromatographischen Reinigung gelagert Säulenchromatographische Verfahren Alle Säulenchromatographien, die zur Reinigung von rekombinanten Proteinen eingesetzt wurden, sind bei 4 C automatisiert an einer FPLC-Anlage (ÄKTA purifier, Amersham Bioscience, Freiburg) durchgeführt worden. Diese Anlage war mit einem Fraktionssammler (Amersham-Pharmacia, Freiburg) verbunden. Die FPLC-Anlage und die entsprechende Chromatographie-Säule wurden zunächst mit ddh 2 O und anschließend mit dem verwendeten Lauf- Puffer gespült. Alle Puffer und proteinhaltigen Fraktionen wurden vor der Benutzung durch einen 0,22 µm Filter (Typ GS, Millipore, Eschborn) sterilfiltriert. Alle Meßdaten, wie z.b. Absorption bei 280 nm und Leitfähigkeit der Lösung, wurden während des gesamten Laufs mit einem Computer aufgezeichnet. In dieser Arbeit wurden die Methoden der Ionenaustausch- sowie Affinitätschromatographie angewendet IMAC (Immobilized metallion affinity chromatography) Rekombinante His-Tag Fusionsproteine wurden über eine Ni-NTA-Matrix gereinigt. Hierzu wurde das Zellysat auf eine Ni-NTA-Säule (1 ml Säulenvolumen) aufgetragen und die Säule mit 4 ml Sonication Puffer gespült. Unspezifisch gebundene Proteine wurden mit 4 ml Sonication Puffer, dem 20 mm Imidazol zugesetzt wurden, von der Säule gewaschen, um anschließend mit einer Imidazolkonzentration von 250 mm die spezifisch gebundenen His-Tag Fusionsproteine zu eluieren Rückfaltung unlöslicher Proteinaggregate Unlösliche Proteinaggregate können in denaturierenden Puffern in Lösung gebracht werden, und durch schnelle Verdünnung in eine lösliche native Struktur rückgefaltet werden. Hierbei spielt die Zusammensetzung des Puffers, in das die Proteinlösung zum Verdünnen gegeben wird eine entscheidende Rolle. 35

46 Methoden Zum Evaluieren der besten Rückfaltungsbedingungen wurde das FoldIt-Kit (Hamton-Research) verwendet. Denaturierte, aus Einschlußkörperchen gereinigte Fucosyltransferase V (13 mg/ml, in 6 M GuHCl) wurde in 16 unterschiedliche Rückfaltungspuffer verdünnt Tabelle 3.5. Die Ansätze wurden über Nacht bei 4 C inkubiert, gegen 5 l PBS dialysiert, und unlösliche Bestandteile abzentrifugiert ( xg, 60 min, 4 C). Die unterschiedlichen Rückfaltungspuffer hatten eine in Tabelle 3.6 aufgelistete Zusammensetzung. Foldit 0,1 M 30 mm Lauryl 100 mm 10 mm Protein Protein Nr. DTT Maltosid GSH GSSG Konz µl 7,5 µl 0,1 mg/ml 2 10 µl 10 µl 10 µl 7,5 µl 0,1 mg/ml 3 10 µl 10 µl 7,5 µl 0,1 mg/ml 4 10 µl 10 µl 7,5 µl 0,1 mg/ml 5 10 µl 10 µl 50 µl 0,65 mg/ml 6 10 µl 10 µl 50 µl 0,65 mg/ml 7 10 µl 50 µl 0,65 mg/ml 8 10 µl 10 µl 10 µl 50 µl 0,65 mg/ml 9 10 µl 7,5 µl 0,1 mg/ml µl 10 µl 10 µl 7,5 µl 0,1 mg/ml µl 10 µl 7,5 µl 0,1 mg/ml µl 10 µl 7,5 µl 0,1 mg/ml µl 0,65 mg/ml µl 10 µl 50 µl 0,65 mg/ml µl 50 µl 0,65 mg/ml µl 10 µl 10 µl 50 µl 0,65 mg/ml Tabelle 3.5 Pipetierschema zur Evaluierung optimaler Rückfaltungsbedingungen: Zu 950 µl Rückfaltungsreagenz wurden unterschiedliche Additive gegeben und anschließend mit Fucosyltransferase V-Lösung (13 mg/ml) versetzt. Die unterschiedlichen Rückfaltungspuffer hatten eine in Tabelle 3.6 aufgelistete Zusammensetzung Isolierung von rekombinanter Fucosyltransferase V Die Reinigung der Fucosyltransferase V erfolgte in Anlehnung an eine Methode von (Costa et al., 1997a). Bei dieser Arbeit wurde die Reinigung mit einer GDP-Affinitätschromatographie und anschließender Kationentauscherchromatographie durchgeführt. Fucosyltransferase V enthaltender Zellkulturüberstand (250 ml) wurde auf eine GDP-Affinitätssäule ( mm²) aufgetragen. Die Säule wurde mit vierfachem Säulenvolumen Waschpuffer gewa- 36

47 Proteinbiochemische Methoden Nr. Zusammensetzung 1 10,56 mm NaCl, 0,44 mm KCl, 20 mm GuHCl, 1,1 mm EDTA, ph 6,8 2 1,1 mm NaCl, 550 mm GuHCl, 12 mm MgCl 2, 12,2 mm CaCl 2, ph 8,3 3 1,1 mm NaCl, 0,44 mm KCl, 550 mm GuHCl, 12 mm 1,1 mm EDTA, ph 6,8 4 10,56 mm NaCl, 0,44 mm KCl, 550 mm GuHCl, 12 mm MgCl 2, ph 8,3 5 1,1 mm NaCl, 550 mm GuHCl, 12 mm MgCl 2, 11,2 mm CaCl 2, ph 6,8 6 10,56 mm NaCl, 0,44 mm KCl, 20 mm GuHCl, 1,1 mm EDTA, ph 8,3 7 10,56 mm NaCl, 0,44 mm KCl, 550 mm GuHCl, 11,2 mm CaCl 2, ph 8,3 8 10,56 mm NaCl, 0,44 mm KCl, 550 mm GuHCl, 12 mm MgCl 2, 11,2 mm CaCl 2, ph 8,3 9 10,56 mm NaCl, 0,44 mm KCl, 550 mm GuHCl, 12 mm MgCl 2, 11,2 mm CaCl 2, ph 8,3 10 1,1 mm NaCl, 550 mm GuHCl, 12 mm MgCl 2, 11,2 mm CaCl 2, ph 8,3 11 1,1 mm NaCl, 0,44 mm KCl, 550 mm GuHCl, 11,2 mm CaCl 2, ph 8, ,56 mm NaCl, 0,44 mm KCl, 20 mm GuHCl, 12 mm MgCl 2, 11,2 mm CaCl 2, ph 8, ,56 mm NaCl, 550 mm GuHCl, 12 mm MgCl 2, 11,2 mm CaCl 2, ph 8,3 14 1,1 mm NaCl, 0,44 mm KCl, 20 mm GuHCl, 12 mm MgCl 2, ph 6, ,56 mm NaCl, 550 mm GuHCl, 12 mm MgCl 2, 11,2 mm CaCl 2, ph 8,3 16 1,1 mm NaCl, 0,44 mm KCl, 20 mm GuHCl, 1,1 mm EDTA, ph 6,8 Tabelle 3.6 Zusammensetzung der unterschiedlichen Rückfaltungspuffer schen. Die Elution der gebundenen Proteine erfolgte mit vierfachem Säulenvolumen Elutionspuffer. Die Elutionsfraktionen wurden mittels SDS-PAGE und Westernblot auf Proteingehalt überprüft. Fucosyltransferase V enthaltene Fraktionen wurden vereinigt, ultrafiltriert und mit Salzsäure auf ph 6,0 eingestellt. Die vereinigten Fraktionen wurden auf eine MonoS Kationentauschersäule gegeben. Nach Elution ungebundener Proteine wurde ein linearer Gradient von 0 1 M NaCl angelegt. Der Proteingehalt der Elutionsfraktionen 37

48 Methoden wurde photometrisch bei 280 nm bestimmt und die proteinhaltigen Proben mittels SDS-PAGE und Aktivitätstest auf ihren Fucosyltransferase-Gehalt überprüft FCS Messungen Mit Hilfe der Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS) können kinetische Daten von Protein-Ligand-Wechselwirkungen bestimmt werden. Die Bestimmung dieser Daten beruht auf der Tatsache, daß schwere Moleküle (in diesem Falle Protein-Ligand-Komplex) in Lösungen langsamer diffundieren (Brownsche Bewegung) als kleine Moleküle (der Ligand alleine). Die Änderung der Diffusionsgeschwindigkeit kann zur Berechnung von Bindungskonstanten benutzt werden. Durch die Markierung des Liganden mit einem Fluoreszenzfarbstoff kann dieser mit Hilfe von Laseroptiken beobachtet werden. Dabei wird ein sogenanntes confokales Volumen (1 fl) fokussiert und im Nanosekundentakt die Anwesenheit oder Abwesenheit des Fluoreszenzmarkers bestimmt. Je häufiger dieser Farbstoff detektiert werden kann, desto größer ist die Diffusionsgeschwindigkeit. Durch Zugabe des Bindungspartners, der in der Regel mindestens die 8-fache Masse haben sollte, ändert sich durch die Bindung an den Liganden die Diffusionsgeschwindigkeit. Konzentrationsabhängige Messungen erlauben dann die Bestimmung von der Bindungskonstante. FCS-Messungen wurden bei der Firma Carl-Zeiss im Rahmen einer Geräte- Vorstellung in Jena durchgeführt. Verwendet wurde das Gerät LSM 510 ME- TA. Das FITC-markierte Peptid wurde bei einer Konzentration von 22,5 nm im Gerät vermessen und die Änderung der Diffusion durch Zugabe von 220 nm FucT V beobachtet Test zur Bestimmung der Fucosyltransferase V-Aktivität Die Fucosyltransferase V katalysiert die Transglycosylierung der Fucose vom Donornukleotidzucker GDP-Fucose auf den Akzeptorzucker N-Acetyl-Lactosamin. Die Reaktion kann durch Verwendung 14 C-markierter GDP-Fucose und durch Trennung der Produkte von dem Edukt GDP-Fucose durch Messung der Radioaktivität beobachtet werden. Dabei wird ausgenutzt, daß durch die Übertragung der 14 C-markierten Fucose von dem doppelt negativ geladenen Edukt GDP-Fucose auf den Akzeptorzucker ein ungeladenes 14 C-markiertes Produkt (Le x ) ensteht, daß sich über eine Anionentauscher-Chromatographie 38

49 Proteinbiochemische Methoden abtrennen und in einem Flüssigscintilationszähler vermessen läßt (Weston et al., 1992a). Die Zusammensetzung der Kontroll- und Reaktionsansätze ist in Tabelle 3.7 dargestellt. Ansatz Reagenz Kontrolle 10 mm MgCl 2 25 mm Cacodylat ph 6,2 10 mm LacNAc 1,25 mm GDP-Fucose 0,925 kbq 14 C-GDP-Fucose (11,1 GBq/mmol)) ad 50 µl ddh 2 O Probe 10 mm MgCl 2 25 mm Cacodylat ph 6,2 10 mm LacNAc 1,25 mm GDP-Fucose 0,925 kbq 14 C-GDP-Fucose (11,1 GBq/mmol) 5 µl Probe ad 50 µl ddh 2 O Tabelle 3.7 Zusammensetzung der Kontroll- und Reaktionsansätze des FucT V-Aktivitätstests. Alle Komponenten der Kontroll- und Reaktionsansätze wurden in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß gegeben und üblicherweise 1 h bei 37 C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 400 µl eiskaltem ddh 2 O gestoppt. Zur Abtrennung des 14 C-markiertem Produktes wurde der Reaktionsansatz über eine Anionentauschersäule gereinigt. Zur Aktivierung der Ionentauschermatrix wurde pro Ansatz 1 g Anionentauscherharz (Dowex-Harz, Bio-Rad) mit je 4 ml 0,1 M HCl und dann mit 4 ml 1 M NaCl gewaschen. Die so vorbereitete Matrix wurde in eine 12 ml Polyethylensäule (Varian, Darmstadt) gefüllt und drei mal mit 4 ml ddh 2 O gewaschen. Anschließend wurde der Reaktionsansatz (450 µl) auf die Säule gegeben, das Produkt zwei mal mit 750 µl ddh 2 O eluiert, in einem 5 ml Scintillationsröhrchen aufgefangen und mit 2,5 ml Szintilationsflüssigkeit versetzt. Die Probe wurde in einem Tri-Carb 2500 TR Flüssigscintilationszähler (Packard, USA) vermessen und die Zerfälle pro Minute (dpm) bestimmt. Quantitativer Umsatz resultiert in einer Aktivität von 0,925 kbq ( dpm). Eine Unit ist definiert als die Menge Enzym, die in 1 min bei 37 C 1 µmol Fucose von GDP-Fucose auf N-Acetylactosamin transferiert. 39

50 Methoden Test zur Bestimmung der DHFR-Aktivität Die DHFR katalysiert die Reduktion von FH 2 durch NADPH zu FH 4 und NADP +. Diese Aktivität kann photometrisch über den NADPH-Verbrauch im Testansatz durch Messung der spezifischen Absorption bei 340 nm untersucht werden, die bei DHFR-Aktivität stetig abnimmt (Hillcoat et al., 1967). Die Zusammensetzung der Kontroll- und Reaktionsansätze ist in Tabelle 3.8 angegeben. Ansatz Reagenz Kontrolle 330 µl Test-Puffer (100 mm Tris-HCl, ph 7,5) 500 µl ddh 2 O 70 µl NADPH (100 µm) in Test-Puffer 100 µl FH 2 (75 µm) in Test-Puffer Probe 330 µl Test-Puffer (100 mm Tris-HCl, ph 7,5) 400 µl ddh 2 O 100 µl Probe 70 µl NADPH (100 µm) in Test-Puffer 100 µl FH 2 (75 µm) in Test-Puffer Tabelle 3.8 Zusammensetzung der Kontroll- und Reaktionsansätze des DHFR-Aktivitätstests. Alle Komponenten der Kontroll- und Reaktionsansätze, mit Ausnahme von FH 2, wurden in eine Einmalküvette gegeben. Anschließend wurde der Ansatz 5 min bei RT inkubiert, um den unspezifischen NADPH-Verbrauch zu minimieren. Dann wurde die Reaktion durch Zugabe von FH 2 gestartet und die spezifische Absorption bei 340 nm vermessen (E t=0 ). Als Nullwert diente Test- Puffer, der mit ddh 2 O im Verhältnis 1:1 verdünnt wurde. Nach 30 minütiger Inkubation bei 37 C im Wasserbad wurde erneut die Absorption gemessen (E t=30 ). Zur Berechnung der Probenaktivität wurde zunächst die Differenz ( E) der Absorption zum Zeitpunkt t = 0 min (E t=0 ) und t = 30 min (E t=30 ) gebildet. Von diesen Werten wurde der entsprechende Wert der Kontrolle abgezogen. Die so korrigierten Absorptionsdifferenzen (E korr ) wurden mit Hilfe der Standarddefinition in Einheiten (Units) umgerechnet. Es ist definiert, daß eine Units DHFR-Aktivität der Enzymmenge entspricht, die unter Standardbedingungen 1 mmol FH 2 pro Minute in FH 4 umwandelt. 40

51 Immunologische Methoden 3.4 Immunologische Methoden Präparation von Immunisierungsproben Zur Immunisierung wurde die Fucosyltransferase nach der IMAC Aufreinigung über ein präparatives SDS-Polyacrylamidgel weiter gereinigt. Dazu wurden 500 µl proteinhaltige Lösung mit 4x reduzierendem Probenpuffer für 5 min im siedenden Wasserbad erhitzt und über ein 12 %iges SDS-Polyacrylamidgel (1,5 mm Dicke) bei 90 V unter Wasserkühlung aufgetrennt. Nach der Anfärbung mit Coomassie wurde die Proteinbande, in der sich die rekombinante Fucosyltransferase V befand, aus dem Gel ausgeschnitten, getrocknet und mit einem Mörser zu feinem Pulver zerstoßen Immunisierung Die Fucosyltransferase (ca. 1 mg) enthaltende Pulver wurde mit 2 ml komplettem Freudschen Adjuvants emulgiert. Die Emulsion wurde aufgeteilt und zwei 3 Monate alten Kaninchen Subcutan injiziert. Vier Wochen nach der Primärinjektion wurde die erste Boostinjektion durchgeführt. Hierbei wurde wie oben vorgegangen, mit dem Unterschied, daß inkomplettes Freudsches Adjuvants verwendet wurde. Nach jeweils 6 Wochen wurde eine zweite und eine dritte Boostinjektion analog der ersten durchgeführt Gewinnung von Antiseren Antiseren wurden Tage nach jeder Boostinjektion gewonnen. Hierbei wurden je einige ml Blut aus der äußeren Ohrvene mit einer Kanüle gesammelt. Nach der letzten Boostinjektion wurde das gesamte Blut der Kaninchen durch Herzpunktion gewonnen. Das Blut wurde für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert und das Serum von den geronnenen Bestandteilen durch Zentrifugation (10 min, xg, 4 C) abgetrennt Anreicherung von Antikörpern aus Antiseren Protein A ist ein bakterielles Protein, das sich durch hohe Affinität zu Domänen von Immunglobulinen auszeichnet. Gekoppelt an Agarose ist es zur Reinigung von Antikörpern einsetzbar. Zur Reinigung der Immunglobuline aus Kaninchenantiseren wurden 5 10 ml Antiserum auf eine Protein-A-Agarose 41

52 Methoden Säule gegeben. Nicht gebundene Proteine wurden mit 0,02 M Phosphatpuffer ph 7,0 herausgewaschen. Die Elution erfolgte mit 0,1 M Zitronensäurepuffer ph 3,0. Der ph-wert der Elutionsfraktionen wurde sofort durch Zugabe von 1 M Tris ph 9,0 neutralisiert Immuno-Blot Der Immuno-Blot diente zum spezifischen Nachweis von Antigenen nach elektrophoretischem Transfer auf Membranen. Die Membran wurde 15 min in TBS gewaschen, anschließend für 2 h in Blockierlösung inkubiert und wiederum zweimal für 5 min in TBS gewaschen. Anschließend wurde die Membran mit dem primären Antiserum (1:500 1:1.000 verdünnt) in BSATBS für 3 12 h inkubiert. Nach erneutem zweimaligen Waschen für 5 min in TBS wurde mit einem an alkalische Phosphatase konjugierten sekundären Antikörper (1: verdünnt) in BSATBS für 2 4 h inkubiert. Anschließend wurde die Membran zweimal für 5 min in TBS, 5 min in 0,1 M Tris/HCl, ph 9,5 gewaschen und in 25 ml NBT/BCIP Färbelösung unter Lichtausschluß gefärbt. Nach Waschen in Wasser wurde die Membran schließlich an der Luft getrocknet. 3.5 Baculovirus-Expressionssystem Sämtliche Arbeiten mit dem Baculovirus-Expressionssystem wurden in Anlehnung an O Reilly (O Reilly et al., 1994) durchgeführt Zellkultur Spodoptera frugiperda (Sf9) Zellen (Invitrogen, Karlsruhe) wurden in Sf-900 II SFM als Monolayer in Zellkulturflaschen bei 27 C kultiviert. BTI-TN-5B1-4 Zellen (Invitrogen, Karlsruhe) wurden in Express Five SFM mit 10 µg/ml Gentamycin und 9 % 200 mm L-Glutamin ebenfalls als Monolayer bei 27 C kultiviert. Die Zellen wurden in einem Rhythmus von 3 bis 4 Tagen bei einer Dichte von Zellen/185 cm² Wachstumsfläche in 25 ml Medium umgesetzt. Die Vitalität wurde regelmäßig durch Färbung mit Trypanblau in einer Neubauer-Zählkammer unter dem Mikroskop untersucht. Das Ablösen der Zellen von der Wachstumsoberfläche erfolgte mit Hilfe eines Zellschabers Aufbewahrung von Insektenzellen Die Zellen wurden in der logarithmischen Wachtumsphase mit einer Lebensrate größer 95 % und einer Dichte von Zellen/ml eingefroren. Dabei 42

53 Baculovirus-Expressionssystem wurden die Zellen von der Oberfläche gelöst und bei 1200 xg für 10 min zentrifugiert und in einem entsprechenden Volumen aus 42,5 % (v/v) konditioniertem Medium, 42,5 % (v/v) frischem Medium 10 % DMSO und 5 % FKS aufgenommen und in Kryoröhrchen (Nunc, Roskilde, Dänemark) aliquotiert. Die Zellen wurden zuerst 2 h bei 20 C dann über Nacht bei 80 C und schließlich in flüssigen Stickstoff gelagert Transfektion von Sf9 Zellen Die Transfektion von Sf9-Zellen erfolgte nach der Methode der Calciumphosphat-DNA-Kopräzipitation. Sf9 Zellen ( ) wurden in einem Volumen von 4 ml in einer 24 cm² Zellkulturschale angesetzt und für 1 h bei 27 C inkubiert. Zur Herstellung eines DNA Mixes wurden 0,5 µg Baculo Gold DNA mit 2 5 µg Transfervektor für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 1 ml Transfektionspuffer zugegeben. Das Medium wurde von den Zellen abgesogen und 1 ml frisches Medium zugegeben. Anschließend wurde tropfenweise und unter leichtem Schütteln der DNA-Mix zugegeben, für 4 h bei 27 C inkubiert, die Zellen zweimal mit je 4 ml Medium gewaschen und anschließend für 5 Tage bei 27 C inkubiert. Der Zellkulturüberstand, der die rekombinanten Viren enthielt, wurde abgenommen und nach Sedimentation für 5 min (1000 xg) bei 4 C gelagert Plaque Isolierung rekombinanter Baculoviren Um aus dem polyklonalen Zellkulturüberstand der Transfektion monoklonale rekombinante Baculoviren zu erhalten, wurde ein Plaquetest durchgeführt. dazu wurden zwölf Zellkulturschalen (25 cm²) mit jeweils Zellen in 4 ml Medium angesetzt, für 1 h bei 27 C inkubiert und anschließend das Medium abgenommen. Der Überstand der Transfektion wurde seriell verdünnt und in einem Doppelansatz je 0,5 ml der entsprechenden Verdünnung ( ) zu den Zellen gegeben und für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Das Medium wurde abermals abgenommen und durch 4 ml einer auf 37 C temperierten Agarlösung in Medium überschichtet. Nach dem Erkalten der Agarose wurde die Schale für 5 Tage bei 27 C inkubiert. Die eine Hälfte des Ansatzes wurde anschließend zur Titerbestimmung einer Neutralrotfärbung unterzogen, die andere Hälfte diente zur Virusisolierung. Die Plaques wurden mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze isoliert, in 1 ml Medium über Nacht bei 4 C resuspendiert und anschließend amplifiziert. 43

54 Methoden Amplifikation rekombinanter Viren Rekombinante virale Plaques wurden über zwei Runden amplifiziert. Für die erste Amplifikation wurden Sf9 Zellen in einer 25 cm² Flasche in 4 ml Medium angesetzt, für 1 h bei 27 C inkubiert, das Medium abgenommen und die Zellen mit 0,5 ml des resuspendierten Plaques infiziert. Nach 1 h leichtem Schütteln bei Raumtemperatur wurden 1,5 ml Medium zugegeben und die Zellen für 4 Tage bei 27 C inkubiert. Nach Überprüfung der Infektion unter dem Mikroskop wurde bei positiven Ansätzen der Überstand abgenommen, zentrifugiert (5 min, 1000 xg, 4 C) und als Passage 1 Stock bei 4 C gelagert. Für die zweite Amplifikation wurden zwei 175 cm² Zellkulturflaschen mit jeweils Sf9 Zellen in 20 ml Medium angesetzt, für 1 h bei 27 C inkubiert, das Medium abgenommen und mit 1 ml des Passage 1 Stock (1:4 in Medium verdünnt) infiziert. Nach 1 h leichtem Schütteln wurden 19 ml Medium zugegeben, die Zellen für 4 Tage bei 27 C inkubiert, der Überstand abgenommen, zentrifugiert (5 min, 1000 xg, 4 C) und als Passage 2 Stock bei 4 C gelagert. Weitere Amplifikationen erfolgten mit einer MOI von 0,1 nach obigem Schema Titerbestimmung Zur Bestimmung des Virustiters wurden Zellkulturschalen (25 cm²) mit jeweils Zellen in 4 ml Medium angesetzt, für 1 h bei 27 C inkubiert und anschließend das Medium abgenommen. Der Überstand der Transfektion wurde seriell verdünnt und in einem Doppelansatz je 0,5 ml der entsprechenden Verdünnung ( ) zu den Zellen gegeben und für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Das Medium wurde abermals abgenommen und durch 4 ml einer auf 37 C temperierten Agarlösung in Medium überschichtet. Nach dem Erkalten der Agarose wurde die Schale für 5 Tage bei 27 C inkubiert. Zum Anfärben der gebildeten Plaques wurden die Zellkulturschalen mit 3 ml einer auf 37 C temperierten 0,5 %igen Agaroselösung in Medium mit Neutralrot (5 µg/ml) überschichtet und erneut über Nacht bei 27 C inkubiert. Die Plaques wurden anschließend ausgezählt und der Virustiter bestimmt. 3.6 Stabile Expression in Insektenzellen Neben der transienten virusvermittelten Expression wurde die Fucosyltransferase V außerdem stabil in Insektenzellen exprimiert. Hierzu wurde das InsectSelect-System von Invitrogen (Karlsruhe) verwendet. 44

55 Expression von Fucosyltransferase V in Säugetierzellen Transfektion Zur Expression in Insektenzellen wurde der Expressionsvektor durch das Cellfectin Reagenz (Invitrogen, Karlsruhe) in die Zelle gebracht. Dabei wurde nach der Anleitung des Herstellers vorgegangen Expression unter Selektionsdruck Zur Erhöhung der Ausbeute wurde die Generierung stabil exprimierender Linien angestrebt, wobei die Transfektionsansätze nach zwei Tagen durch Zugabe von Blasticidin in Kultur gehalten und subkultiviert wurden. Zur Stabilisierung wurde eine Konzentration von 50 µg/ml des Antibiotikums gewählt. Nach zwei Wochen konnte die Konzentration auf 10 µg/ml verringert werden. 3.7 Expression von Fucosyltransferase V in Säugetierzellen Für die Expression der rekombinanten Fucosyltransferase V standen verschiedene Zellinien zur Verfügung. CHO-Zellen aus den Ovarien eines chinesischen Hamsters enthalten ein RNA-Polymerasegen, welches mit einem Kernlokalisationssignal versehen wurde. HEK 293-Zellen sind humane embryonale Nierenzellen, sie sind für eine transiente oder stabile Expression verwendbar Kultivierung und Passagieren von CHO- und HEK293-Zellen Die CHO-Zellen oder HEK293-Zellen wurden im Inkubator (Heraeus Instruments Begasungsbrutschrank 6060) in wassergesättigter Atmosphäre mit 5 % CO 2 bei 37 C kultiviert. Bei den CHO-Zellen und HEK293-Zellen erfolgte das Wachstum in DMEM-Medium (Gibco/BRL, Eggenstein). Allen Medien wurde 10 % FKS (Biochrom, Berlin) und 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung (Endkonzentration 100 µg/ml) zugesetzt. Sobald die Zellen konfluent in den Gewebekulturflaschen (75 cm², Cellstaar, Greiner Labortechnik, Frickenhausen) gewachsen waren, wurden sie in eine neue Kulturflasche passagiert. Der Zellüberstand wurde hierfür abgesogen und die Zellen mit PBS gewaschen. Auf die Zellen wurden 4 ml Trypsin/EDTA (Gibco/BRL, Eggenstein) gegeben und für 5 min im Inkubator inkubiert. Das Ablösen der Zellen vom Boden wurde dann durch leichtes Klopfen unterstützt und unter dem Mikroskop kontrolliert. 45

56 Methoden Bei nahezu vollständiger Ablösung wurde der Vorgang durch Zugabe von 10 ml Serum-haltigem Medium gestoppt, die Suspension in ein 15 ml-reaktionsgefäß überführt und die Zellen durch Zentrifugation (5 min, 1000 xg) pelletiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet in 10 ml Serum-haltigem Medium resuspendiert und 1 bis 3 ml der Zellsuspension in eine neue Gewebekulturflasche gegeben und mit Serum-haltigem Medium bis zu einem Endvolumen von 12 ml aufgefüllt Kryokonservierung und Auftauen von Zellen Zur längerfristigen Aufbewahrung der Zellen wurden diese kryokonserviert. Dazu wurden die Zellen trypsiniert und nach der Zentrifugation (5 min, 1000 xg) in FKS mit 10 % DMSO resuspendiert. Von dieser Zellsuspension wurde 1 ml in ein Kryoröhrchen (Cryo Tube Vials, Nunc, Wiesbaden) überführt. Zunächst wurde der Ansatz für 2 h bei 20 C, dann über Nacht bei 80 C inkubiert. Die endgültige Lagerung erfolgte in flüssigem Stickstoff. Nach dem Auftauen der Zellen wurde die Zellsuspension mit 10 ml Medium aufgenommen und zentrifugiert (5 min, 1000 xg). Der Überstand wurde verworfen und das Zellsediment in 12 ml Medium resuspendiert, um dann in eine 75 cm² Kulturflasche überführt zu werden Transfektion Zur Expression in mammalen Zellen wurde der Expressionsvektor durch das Lipofektions-Reagenz GenePorter in die Zelle gebracht. Dabei wurde nach der Anleitung des Herstellers vorgegangen Expression unter Selektionsdruck Zur Erhöhung der Ausbeute wurde die Generierung stabil exprimierender Linien angestrebt, wobei die Ansätze der transienten Expression durch Zugabe von 10 µl/ml Kulturmedium einer Stammlösung des Antibiotikums G418 in Kultur gehalten und subkultiviert wurden. 46

57 Chemische Modifikation von Proteinen und Peptiden 3.8 Chemische Modifikation von Proteinen und Peptiden FITC-Markierung von Peptiden Zur Bestimmung kinetischer Parameter wurde die Einführung des Fluoreszenzfarbstoffes Fluorescin angestrebt. Für die Kopplung an eine freie Aminogruppe wurde das reaktive Fluorescin-Iso-thiocyanat (FITC) in 3-fachem molarem Überschuß für 1 h bei RT in Reaktionspuffer (PBS) mit dem Peptid inkubiert. Die Edukte wurden mittels HPLC abgetrennt HPLC-Reinigung Die Reinigung modifizierter Peptide mittels HPLC-Verfahren erfolgte zunächst im analytischen Maßstab, nach der Etablierung geeigneter Gradienten dann in präparativem Maßstab. Im allgemeinen wurden die Produkte unter Verwendung von Wasser und Acetonitril als Laufmittel (Puffer A und B, jeweils mit einer Konzentration von 0,1 % TFA) mit den in Tabelle 3.9 dargestellten Gradienten getrennt. Dauer Puffer A Puffer B Analytischer Lauf: 20 min % % 5 min 30 % 70 % Präparativer Lauf: 25 min % % 5 min 30 % 70 % Tabelle 3.9 Gradienten zur Reinigung von FITC-markiertem Peptid mittels HPLC MALDI-TOF Zur Überprüfung des markierten Peptides bietet sich die Untersuchung der HPLC-Fraktionen mit Hilfe von MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight) an. Dazu werden Substanzmengen im fmol- Bereich mit einer niedermolekularen Matrix (Zimtsäure- oder Benzoesäurederivate) cokristallisiert. Durch Laserbeschuß im Hochvakuum verdampft die 47

58 Methoden Matrix und reißt die Makromoleküle mit in die Gasphase. Ein Teil der Moleküle wird dabei ionisiert, im elektrischen Feld beschleunigt und in einem Flugzeitdetektor nach Masse getrennt. Für die Analyse der Peptide wurde je 1 µl der zu analysierenden Substanz einer Dihydroxy-Benzoesäure-Matrix (DHB) auf dem Probenteller cokristallisiert und im Spektrometer (Biflex III, Bruker) vermessen Biotin-Markierung von Proteinen Die Biotinylierung rekombinanter Proteine wurde mit dem EZ-Link NHS-LC- Biotin-Reagenz (Pierce, Bonn) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Nach der Kopplung, bei der das Biotinylierungsreagenz in einem zwei- bis dreifachem molarem Überschuß eingesetzt wurde, wurde zwei mal gegen 2 l PBS dialysiert. Anschließend wurde die Funktionalität der markierten Proteine mit Hilfe eines Aktivitätstest überprüft. 48

59 4 Ergebnisse 4.1 Rekombinante Expression der humanen Fucosyltransferase V Die strukturelle Untersuchung der humanen Fucosyltransferase V erfordert die rekombinante Darstellung des Proteins in hoher Quantität. Für die Etablierung eines geeigneten Expressionssystems sollte im Rahmen dieser Arbeit die Expression der Fucosyltransferase V sowohl in prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen evaluiert werden Amplifikation und Klonierung der Fucosyltransferase V cdna aus HEK 293 Zellen Die für die rekombinante Expression notwendige cdna der humanen Fucosyltransferase V wurde aus humanen embryonalen Nierenzellen (HEK 293) amplifiziert. Da bei der Fucosyltransferase V, wie auch bei den meisten Fucosyltransferasen, die kodierende Sequenz auf einem einzigen Exon lokalisiert ist (Cameron et al., 1995), konnte diese direkt aus genomischer DNA amplifiziert werden. Genomische DNA wurde aus HEK 293 Zellen isoliert und mit den Oligonukleotiden pfuct5fwgen und pfuct5revgen die kodierende Sequenz des FucT V-Gens amplifiziert. Das gereinigte Amplifikat wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI geschnitten, in den gleichermaßen behandelten Vektor puc18 insertiert und, nach der Überprüfung der korrekten Sequenz, im folgenden puc18fuct V genannt. Da in dieser Arbeit das Enzym als verkürzte, lösliche Form dargestellt werden sollte, mußte ein Teil der Stem-Region, die Transmembrandomäne und die cytoplasmatische Domäne deletiert werden. Studien über die Expression der FucT V als Fusionsprotein mit N-terminalem Protein A, ergaben, daß die ersten 75 Aminosäuren der FucT V nicht für die enzymatische Aktivität essentiell sind und gegen eine Protein A Fusions-Domäne ausgetauscht werden können (Xu et al., 1996). Um bei der strukturellen Untersuchung der Fucosyltransferase V störende Einflüsse von Fusionsanteilen auszuschliessen, sollte das Enzym ohne Protein-A-Domäne exprimiert werden. Aus diesem Grunde wurde erwogen, einen Teil der Stem-Region bestehen zu lassen, um so eventuell stabilisierende Effekte eines N-terminalen Überhanges auszunutzen. Es gibt keine Berichte über eine erfolgreiche Expression humaner α1,3/4-fucosyltransferasen, 49

60 Ergebnisse deren Stem-Region vollständig deletiert und gegen keine Fusionsdomäne ersetzt wurde. Welcher Teil der Stem-Region in dem zu exprimierenden Konstrukt erhalten bleiben sollte, wurde in erster Linie über Sequenzvergleiche mit der FucT III bestimmt, die in Insektenzellen bereits erfolgreich als lösliches Protein exprimiert wurde (Morais et al., 2001). Ein analoges Konstrukt der Fucosyltransferase V kodiert die Aminosäuren A58 T374 und beinhaltet damit auch alle vier putativen N-Glycosylierungstellen im Protein. Für die sekretorische Expression in eukaryotischen Zellen wurde das Konstrukt analog zur Veröffentlichung von Morais mit der Signalsequenz des humanen β-trace Proteins versehen. Mit den Oligonukleotiden β-tracefuctv und pfuctvrevgen wurde ein Konstrukt amplifiziert, welches die Signalsequenz und die Aminosäuren A58 T374 der humanen Fucosyltransferase V kodiert (Abbildung 4.1). Das Amplifikat wurde mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und EcoRI geschnitten und in den analog behandelten puc18-vektor insertiert. Der resultierende Vektor puc18β-tracefuct V wurde durch eine Sequenzierung überprüft (Daten nicht gezeigt). BamHI NcoI β Trace Signalesequenz EcoRI β Trace Signalsequenz Katalytische Domäne NcoI BamHI FucT V EcoRI Abbildung 4.1 Schematische Darstellung der Amplifikation der deletierten Fucosyltransferase V: Mit den Oligonukleotiden β-tracefuctv und pfuctvrevgen wurde das 951 bp große Fragment der FucT V amplifiziert und am 5 -Ende mit der β-trace-signalsequenz versehen. Zusätzlich wurde das Konstrukt an den 5 - und 3 -Enden mit Restriktionsschnittstellen versehen Expression der Fucosyltransferase V in E. coli Die Expression rekombinanter Proteine in E. coli zeigt gegenüber der Expression in eukaryotischen Zellen große Vorteile auf. Das Expressionsystem ist leicht zu handhaben und das Protein kann oft in großen Mengen produziert werden. Da es sich dabei um ein prokaryotisches Expressionsystem handelt, 50

61 Rekombinante Expression der humanen Fucosyltransferase V finden allerdings keine postranslationalen Modifikationen statt und die Proteine erhalten oft nicht ihre native Faltung (Marston, 1986). Die verkürzte lösliche Form (A59 T375) der Fucosyltransferase V sollte mit dem Vektor prsetb als N-terminales Fusionsprotein mit einem Histidin- Hexamer ( His-Tag ) in E. coli exprimiert werden. Zu diesem Zweck wurde zunächst das Plasmid prsetb mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und PstI geschnitten. Die cdna der verkürzten löslichen Form der Fucosyltransferase V wurde mit den Oligonukleotiden FucT5BamHIfw und FucT5PstIrev amplifiziert, analog geschnitten und in den Vektor prsetb inseriert. Für die Expression der FucT V wurden mit dem Vektor prsetbfuctv transformierte BL21(DE3) E. coli-zellen bei einer optischen Dichte von OD 600 = 1 mit einer Konzentration von 1 mm IPTG induziert und für 4 h bei 37 C inkubiert. Zur Analyse der Expression wurden stündlich Proben des Expressionsansatzes durch Sonifikation aufgeschlossen und die löslichen Zellbestandteilen von den unlöslichen getrennt. In den unlöslichen Fraktionen war nach einer Stunde eine schwache Bande mit dem Molekulargewicht von 41 kda zu erkennen, deren Intensität nach drei bis vier Stunden ein Maximum erreichte. Die Analyse im Immunoprint zeigte, daß ausschließlich in den unlöslichen Fraktionen rekombinante Fucosyltransferase V vorhanden war (Abbildung 4.2). Das Molekulargewicht der verkürzten Form der Fucosyltransferase V beträgt 38 kda. Unter Berücksichtigung des Fusionsanteils des His-Tags, ergibt sich für das rekombinante Protein ein Molekulargewicht von 41 kda. Die Tatsache, daß in den löslichen Proteinfraktionen keine rekombinante FucT V zu detektieren war, indiziert, daß das Protein in E. coli als unlösliches Proteinaggregat (Inclusion Bodies) (Marston, 1986) exprimiert wurde Versuche zur Rückfaltung unlöslicher Proteinaggregate Da die humane Fucosyltransferase V in E. coli als unlösliche Proteinaggregate exprimiert wurde, sollten verschiedene Versuche unternommen werden, um die Proteine in eine lösliche Form zu überführen. Für die Evaluierung der geeigneten Rückfaltungsbedingungen wurde das FoldIt-Kit (Hamton-Research) verwendet. Mit Hilfe dieses Systems ist es möglich, 16 unterschiedliche Rückfaltungsbedingungen hinsichtlich der individuellen Anforderungen in relativ kurzer Zeit zu testen. Die Rückfaltung unlöslicher Proteine sollte derart erfolgen, daß durch Verdünnung der Proteinlösung die Konzentration der chaotropen Reagenzien so verringert wird, daß das Protein nicht mehr als unlösliches Proteinaggregat in Lösung gehalten werden kann. Durch Zusätze in den Puffersystemen kann das Ausfallen der Proteine zugunsten einer Rückfaltung verzögert werden. Hierbei spielen Additive wie Sucrose und L-Arginin eine 51

62 Ergebnisse löslich unlöslich {}}{{}}{ BRS 1h 2h 3h 4h 1h 2h 3h 4h {}}{ A {}}{ B 97 kda 66 kda 45 kda 31 kda FucT V FucT V Abbildung 4.2 Expression der rekombinanten Fucosyltransferase V in E. coli: Zur Analyse der Proteinexpression wurde nach der Induktion mit IPTG stündlich (1h 4h) ein Aliquot des Expressionsansatzes entnommen. Das Zellsediment wurde aufgeschlossen und die löslichen von den unlöslichen Bestandteilen getrennt. Proben von löslichen und unlöslichen Bestandteilen wurden auf ein 12 %iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen und mit Coomassie gefärbt (A). Die Proteine eines identischen Gels wurden auf eine PVDF-Membran übertragen. Bei dem anschließenden Immunoblot wurde mit dem Anti-Xpress Antikörper (1:5.000) für 2h inkubiert. Als sekundärer Antikörper wurde ein anti-maus-ap-konjugat (1:10.000) eingesetzt. Die Entwicklung erfolgte unter Verwendung von NBT/BCIP (B). Rolle bei der Stabilisierung von Faltungsintermediaten. Die Präsenz von reduzierenden und oxidierenden Reagenzien, wie z.b. oxidiertem und reduziertem Glutathion, unterstützt die richtige Ausbildung von Disulfidbrücken. Weitere Parameter die einen Einfluß auf die Bildung löslicher Proteine haben, können ph-wert, Salzkonzentration und das Vorhandensein von Detergentien sein. Für die Rückfaltung der Fucosyltransferase V wurde das vollständig denaturierte Protein 1:20 in den 16 unterschiedlichen Rückfaltungspuffern verdünnt und bei 4 C für 14 h inkubiert. Ausgefallene Proteinaggregate wurden abgetrennt und alle 16 Ansätze gegen PBS dialysiert. Die Verdünnung und die darauffolgende Dialyse gegen PBS führte in allen Ansätzen zu einer fast vollständigen Präzipitation der rekombinanten Fucosyltransferase V. Die Analyse in der SDS-PAGE zeigte, daß sich die unlösliche rekombinante FucT V in 5 von 16 Rückfaltungsansätzen in eine lösliche Form überführen ließ, wobei die Menge an rückgefaltetem Protein in allen Fällen sehr gering war (Abbildung 4.3). Die besten Ergebnisse wurden mit den Puffern 6 und 7 erzielt, die in ihrer Zusammensetzung sehr ähnlich waren und sich ausschließlich in der Präsenz von zweiwertigen Kationen und EDTA un- 52

63 Rekombinante Expression der humanen Fucosyltransferase V terschieden kda 66 kda 45 kda 31 kda Abbildung 4.3 Rückfaltung unlöslicher Proteinaggregate: Je 50 µl denaturierte FucT V Lösung (13 mg/ml) wurden in 16 verschiedenen Rückfaltungs-Puffern verdünnt (950 µl) (1 16) und über Nacht bei 4 C inkubiert. Unlösliche Bestandteile wurden abzentrifugiert und der Überstand gegen PBS dialysiert. Nach erneuter Zentrifugation wurden Proben jedes Rückfaltungsversuches auf ein 12 %iges SDS-Polyacrylamidgel geladen und einer Silberfärbung unterzogen. Die nun löslich vorliegende Fucosyltransferase V wurde hinsichtlich ihrer enzymatischen Aktivität untersucht. Der in dieser Arbeit verwendete Aktiviätstest beruht auf der enzymatisch katalysierten Übertragung von Fucose von dem Nukleotid-Zucker GDP-Fucose auf den Akzeptorzucker N-Acetyllactosamin (LacNAc). Die Trennung von dem Produkt Le x (ungeladen) und dem Donorzucker (negativ geladen) mittels Anionentauschern, ermöglicht unter Verwendung 14 C-markierten GDP-Fucose die Quantifizierung des Produktes durch Messung der radioaktiven Strahlung. Die im Flüssigscintillationszähler bestimmte Radioaktivität ist damit direkt proportional zum gebildeten Produkt und läßt Aussagen über die enzymatische Aktivität des getesteten Proteins zu. Bei der rückgefalteten Fucosyltransferase V konnte mit Hilfe dieses Aktivitätstests auch nach dreistündiger Inkubation kein enzymatischer Umsatz festgestellt werden Klonierung und Expression der Fucosyltransferase V als MBP-Fusionsprotein Da die Fucosyltransferase V in E. coli ausschließlich als unlösliches Proteinaggregat gebildet wurde, wurde in Erwägung gezogen, das Enzym N-terminal mit dem periplasmatischen Maltose-Binding-Protein (MBP) (Maina et al., 1988) aus E. coli zu fusionieren. Das MBP ermöglicht die Reinigung des rekombinanten Proteins über eine Amylose-Affinitätsmatrix und führt bei der Expression als Fusionsprotein zu einer erhöhten Bildung von löslichem Protein. Für die Expression des MBP-FucT V-Fusionsproteins wurde der Vektor pmalp2x verwendet. Dieser Vektor beinhaltet das male-gen unter der Kon- 53

64 Ergebnisse trolle des lac-promotors und ermöglicht die Klonierung von Zielgenen am 3 -Ende dieses Gens. Die verkürzte Form der FucT V cdna wurde mit den Oligonukleotiden pmalfrw und pmalrev aus puc18fuct V amplifiziert und über die eingeführten Schnittstellen der Restriktionsenzyme EcoRI und HindIII in den Vektor insertiert. Um Mutationen, die durch die PCR entstanden sein könnten auszuschließen, wurden einige erhaltene Klone sequenziert. Die Expression erfolgte in BL21(DE3)-Zellen über 4 h bei 37 C und einer Induktorkonzentration von 1 mm IPTG. Die Zellen wurden aufgeschlossen und der Zellextrakt über eine Amylose-Affinitätsmatrix säulenchromatographisch gereinigt (Abbildung 4.4). Die Analyse der Reinigung zeigte im SDS- Polyacrylamidgel eine dominierende Bande bei 83 kda, sowohl im Zellextrakt als auch in den Elutionsfraktionen. Die verkürzte Fucosyltransferase V hat ein Molekulargewicht von 38 kda. Unter Berücksichtigung des Fusionsanteils des MBPs, ergibt sich für das rekombinante Protein ein Molekulargewicht von 83 kda. Zusätzlich zum MBP-FucT V-Fusionsprotein erschienen auch andere Proteine in den Elutionsfraktionen der Reinigung, welche ein minimales apparentes Molekulargewicht von 45 kda aufzeigten. Da diese Proteine ebenfalls spezifisch mit Maltose von der Amylosematrix eluiert werden konnten, handelte es sich möglicherweise um Translationsabbrüche. BRS A D E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 97 kda 66 kda MBP-FucT V 45 kda 31 kda Abbildung 4.4 Reinigung des Fusionsproteins MBP-FucT V: Die Zellen eines 250 ml MBP- FucT V Expressionsansatzes wurden aufgeschlossen und über eine Amylose-Säule (0,6x10 cm) gereinigt. Von dem Zellaufschluß (A), dem Durchlauf (D) und den Elutionsfraktionen (E1 E7) wurden Proben entnommen, auf ein 9 %iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen und einer Coomassiefärbung unterzogen. Deutlich ist zu erkennen, daß trotz der affinitätchromatographischen Reinigung ein Großteil des Fusionsproteins im Zellextrakt verblieb und nur ein geringer Teil an die Amylosematrix gebunden hat. Dies indiziert entweder eine geringe Kapazität oder einen sehr großen Anteil MBP-Fusionsanteil, der nicht in der Lage ist an die Matrix zu binden. 54

65 Rekombinante Expression der humanen Fucosyltransferase V Um zu evaluieren inwieweit das erhaltene Fusionsprotein enzymatisch aktiv ist, wurden Elutionsfraktionen einem Aktivitätstest unterzogen. Trotz einer Konzentration von 100 µg/ml an gereinigtem Fusionsprotein, konnte kein enzymatischer Umsatz festgestellt werden. Die Möglichkeit, lösliche Fucosyltransferase V sowohl durch Rückfaltung unlöslicher Proteinaggregate als auch durch die Expression als MBP-Fusionsprotein in E. coli herzustellen, weist ein hohes Potential bei der Produktion diese Enzym auf. Die Löslichkeit indiziert an sich schon zumindest eine partiell richtige Faltung des Enzyms. Weitere Untersuchungen in diesem Zusammenhang sind daher unbedingt notwendig. So könnte durch Versuche mit oxidiertem und reduziertem Gluthation Redoxschuffling Experimente durchgeführt werden, die eventuell die Ausbildung korrekter Disulfidbrücken unterstützen und so zu einem enzymatisch aktivem Enzym führen Erzeugung von anti-fucosyltransferase V Antiseren Da zur Detektion rekombinanter Fucosyltransferase V kein polyklonales Serum vorlag, wurde das in E. coli exprimierte Protein zur Immunisierung genutzt. Hierzu wurde das über die Nickel-Chelatsäule vorgereinigte Protein auf einer präperativen SDS-PAGE angereichert und aus dem Gel ausgeschnitten. Die proteinhaltigen Gelstücke wurden getrocknet und fein zermahlen zur Immunisierung von zwei Kaninchen eingesetzt. Zur Steigerung der Immunantwort wurden nach der Primärimmunisierung im Abstand von zwei bis drei Wochen zwei Folgeimmunisierungen durchgeführt. Die Seren wurden von den zellulären Bestandteilen des Blutes getrennt und die Reaktivität gegen FucT V im ELISA getestet (Abbildung 4.5). Der Anstieg der Reaktivität der Immunseren gegenüber dem Präimmunserum indiziert eine erfolgreiche Bildung spezifischer Antikörper gegen die FucT V. Deutlich ist zu erkennen, daß bei einer Serumverdünnung von 1:100 die Steigerung des Signals gegenüber dem Präimmunserum optimal ist und eine höhere Konzentration zu schlechteren Ergebnissen führte. Um den Antikörper im Immunoprint zu verwenden und eine Verringerung des Hintergrundes zu erreichen wurden die Serum-IgG mittels einer Protein-A Affinitätssäule gereinigt. Das gereinigte polyklonale Serum wurde für die Detektion der Fucosyltransferase V im Immunoprint in einer Verdünnung von 1:100 eingesetzt Expression der Fucosyltransferase V in Säugetierzellen Da die Expression der Fucosyltransferase V in E. coli ausschließlich zur Bil- 55

66 Ergebnisse Extinktion [405 nm] 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 1:10 1:100 1:1000 1: Präimmunserum 1. Serum 2. Serum 3. Serum Abbildung 4.5 Reaktivität der gewonnenen Antiseren im ELISA: Die gewonnenen Antiseren vor (Präimmunserum) und nach den jeweiligen Immunisierungen wurden im ELISA auf ihre Reaktivität getestet. Die Vertiefungen einer 96-Mikrotiterplatte wurden über Nacht bei 4 C mit rekombinanter FucT V (50 µl, 50 µg/ml) inkubiert. Danach wurde 2 h bei Raumtemperatur mit Blockierpuffer blockiert. Die Detektion der FucT V erfolgte mit dem anti-fuct V Serum unterschiedlicher Verdünnungen (1:10 1:10.000) über Nacht und einem anti-kaninchen-pod-konjugat (1:5.000) für 2 h. Die Farbentwicklung mit ABTS wurde bei 405 nm vermessen. dung von unlöslichem Protein führte und auch eine Rückfaltung dieser Proteinaggregate nicht zu einer enzymatisch aktiven Form dieses Enzyms führte, sollte nun evaluiert werden, in welchem eukaryotischen Expressionsystem die Fucosyltransferase V aktiv und in hoher Ausbeute exprimiert werden kann. Durch die hohe Authentizität hinsichtlich der posttranslatorischen Modifikation, sollten als erstes unterschiedliche Säugetierzellinien hinsichtlich der rekombinanten Expression der Fucosyltransferase V untersucht werden. Zur Expression der rekombinanten Fucosyltransferase V standen verschiedene Säugetierzellinien zur Verfügung. Um einen Vergleich der Ausbeuten führen und Aussagen über unterschiedliche postranslatorische Modifikationen machen zu können, wurde die Fucosyltransferase V in CHO- sowie in HEK 293-Zellen exprimiert. Die Verwendung der humanen Zellinie HEK 293 versprach eine möglichst authentische Glycosylierung der rekombinanten Fucosyltransferase V, die für eine Untersuchung der Bedeutung der Zuckerstrukturen wünschenswert erschien. CHO-Zellen weisen jedoch häufig deutlich höhere Expressionsraten auf und waren für die Herstellung größerer Mengen des rekombinanten Proteins geeignet. Für die Expression in Säugetierzellen wurde der Expressionsvektor ptriex-4-neo verwendet, welcher den viralen CMV ie - Promotor enthält. Als Selektionsmarker enthielt der Vektor neben der Ampicilinresistenz zur Vermehrung in E. coli auch das Neomycinresistenzgen für die Generierung stabiler Säugetierzellinien. Zur Klonierung des Expressionsvektors wurde das Konstrukt β-trace- FucT V( ) mit den Restriktionsendonukleasen NcoI und EcoRI aus 56

67 Rekombinante Expression der humanen Fucosyltransferase V dem Vektor puc18β-tracefuct V herausgeschnitten und in den Vektor ptriex4-neo insertiert. Die Analyse im Immunoblot zeigte deutliche Expression sowohl in CHOals auch in HEK-Zellen. Das apparente Laufverhalten entsprach in den CHO- Zellen einem Molekulargewicht von 90 und in den HEK-Zellen von 88 kda. Dabei handelte es sich um FucT V Dimere, die unter reduzierenden Bedingungen im Immunoprint ein Molekulargewicht von 43 kda aufwiesen. Durch die Reduktion der Dimere ist erkennbar, daß das Protein in CHO-Zellen homogen exprimiert wird und das Dimer aus zwei gleich schweren Untereinheiten besteht. Das in HEK 293-Zellen exprimierte Dimer scheint jedoch aus unterschiedlichen FucT V Spezies zu bestehen, da es unter reduzierenden Bedingungen als Doppelbande im Immunoprint erscheint (Abbildung 4.6). Bei einer Transfektionseffizienz von 40 % für beide Zellinien ergab die densitometrische Auswertung für die Expression in CHO-Zellen die doppelte Ausbeute an rekombinanter Fucosyltransferase V gegenüber der Expression in HEK 293- Zellen. 96 kda CHO HEK CHO HEK 66 kda 45 kda FucT V A Abbildung 4.6 Expression von rekombinanter Fucosyltransferase V in unterschiedlichen Säugerzellinien: Nach der Transfektion von CHO- und HEK 293-Zellen mit ptriexβ-tracefuct V wurden die Zellen drei Tage bei 37 C inkubiert. Expressionsüberstände wurden durch ein 12 %iges SDS- Polyacrylamidgel aufgetrennt und anschließend auf eine PVDF-Membran übertragen und einem Immunoprint unterzogen. Als Antikörper wurde gereinigtes polyklonales Serum gegen rfuct V (1:100) verwendet. Als sekundärer Antikörper wurde ein anti-kaninchen-ap-konjugat (1:10.000) eingesetzt. Die Entwicklung erfolgte unter Verwendung von NBT/BCIP. A: Nicht reduzierend; B: Reduzierend. Ein ähnliches Ergebnis wurde bei der Vermessung der transienten Expressionsüberstände im Aktivitätstest erzielt (Abbildung 4.7). Hierbei zeigte sich sowohl in den Expressionsüberständen der CHO-Zellen als auch der HEK 293- Zellen eine Fucosyltransferase-Aktivität, die allerdings bei den CHO-Zellüberständen doppelt so groß war. Die Expressionsraten wurde densitometisch im Vergleich mit kommerziell erworbener Fucosyltransferase V bekannter Konzentration bestimmt und lagen bei 0,5 1,0 mg/l für CHO-Zellen und 0,2 0.8 mg/l für HEK-Zellen. B 57

68 Ergebnisse Übertragung von 14 C-Fucose [dpm] Hintergrund CHO- Überstand HEK 293- Überstand Abbildung 4.7 Expression der Fucosyltransferase V in Säugetierzellen: Es wurde analog der Abbildung 4.6 FucT V in CHO- und HEK 293-Zellen exprimiert. Die Kulturüberstände wurden mittels Aktivitätstest auf Fucosyltransferase-Aktivität überprüft Expression der Fucosyltransferase V mit Hilfe des Baculovirus-Expressionssystem Die Expression in Säugetierzellen ermöglicht die Herstellung kleiner Mengen enzymatisch aktiver Fucosyltransferase V. CHO-Zellen sowie HEK 293-Zellen produzieren maximal 1 mg dieses Proteins pro Liter Expressionsansatzes. Diese Ausbeuten sind hinsichtlich der strukturellen Untersuchung des Enzyms als zu gering zu betrachten. Um größere Mengen an rekombinanter Fucosyltransferase V zu erhalten und die Reinigung des Proteins zu erleichtern, wurde das Baculovirus-Expressionssystem verwendet. Dieses System ermöglicht die virusinduzierte Proteinexpression in unterschiedlichen Insektenzellinien und verspricht durch die Verwendung sehr starker viraler Promotoren hohe Ausbeuten an rekombinantem Protein. Da Insektenzellen relativ einfach in serumfreiem Medium zu kultivieren sind, erlaubt dieser Ansatz zudem eine einfache Reinigung des Proteins. Durch Verwendung unterschiedlicher Transfervektoren konnte das Fucosyltransferase V Gen unter die Kontrolle unterschiedlich starker viraler Promotoren gestellt werden. Der Polyhedrinpromotor als auch der p10 Promotor werden in der sehr späten Phase der viralen Replikation aktiv, wobei der p10-promotor als etwas schwächer beschrieben ist (Roelvink et al., 1992). Um die Fucosyltransferase V in den Überstand zu sekretieren, wurde die lösliche Fucosyltransferase V als Fusionsprotein mit der Signalsequenz des β-trace-proteins exprimiert. 58

69 Rekombinante Expression der humanen Fucosyltransferase V Klonierung unterschiedlicher Transfervektoren und Generierung rekombinanter Baculoviren Für die Generierung von rekombinanten Baculoviren wurden unterschiedliche Transfervektoren verwendet. Im Vektor pvl1393 steht das Zielgen unter der Transkriptionskontrolle des Polyhedrinpromotors; beim Vektor ptriex4-neo steht das Zielgen unter der Kontrolle des p10-promotors. Für die Klonierung der verkürzten Form der FucT V wurde das Konstrukt β-tracefuct V aus dem Vektor puc18β-tracefuct V mit Hilfe der Restriktionsenzyme BamHI und EcoRI in den Baculotransfervektor pvl1393 insertiert. Der Transfervektor ptriexβ-tracefuct V entsprach dem Expressionsvektor der Säugetierexpression. Sf9-Zellen wurden entweder mit dem Transfervektor ptriexβ-tracefuct V oder dem Transfervektor pvl1393β-tracefuct V und mit linearisierter BaculoGold-DNA kotransfiziert. Infizierte Insektenzellen konnten nach 3 4 Tagen morphologisch mit einem geschwollenen Zellkörper, der Durchmesser nahm um etwa % zu, sowie einem größeren Zellkern, der fast das gesamte Zellvolumen einnahm, unter dem Mikroskop lokalisiert werden. In der späteren Phase der Infektion lösten sich die Zellen von der Wachstumsoberfläche und lysierten. Nach fünf Tagen wurden die gebildeten Viren entnommen und für eine spätere Amplifikation aufbewahrt (siehe Tabelle 4.1). Transfervektor Promotor Rekombinanter Virus ptriexβ-tracefuct V p10 p10fuct V pvl1393β-tracefuct V Polyhedrin polfuct V Tabelle 4.1 Übersicht der eingesetzten Transfervektoren und der rekombinanten Baculoviren Die erhaltenen Virenpäparate polfuct V und p10fuct V wurden einem Plaquetest unterzogen, der sowohl der Titerbestimmung der Viruslösungen diente als auch zur Vereinzelung der rekombinanten Viren verwendet wurde. Nach dreifacher Amplifikation der rekombinanten Viren betrug der Titer zwischen 10 7 und 10 8 pfu/ml, was für die Infektion von Insektenzellen und die Expression in kleinem Maßstab ausreichte Expression der Fucosyltransferase V Zur Expression der rekombinanten Fucosyltransferase V in Insektenzellen mit Hilfe des Baculovirus-Expressionssystems, wurden unterschiedliche Parameter getestet. Die Menge an zugeführtem Virus (Multiplicity of Infection MOI), der 59

70 Ergebnisse eingesetzte Promotor und die Inkubationszeit sind Faktoren, die Einfluß auf die Expression haben können. Daher wurden BTI-TN-5B1-4-Zellen mit unterschiedlichen MOIs der rekombinanten Baculoviren polfuct V und p10fuct V infiziert, für 120 h bei 27 C inkubiert und täglich sowohl die gebildete Proteinmenge anhand der enzymatischen Aktivität als auch zellbiologische Parameter wie Zellzahl und Zellvitalität bestimmt. Zur Evaluierung ab welchem Zeitpunkt nach der Infektion die Insektenzellen ihre Proliferation einstellen und sterben wurden in Abbildung 4.8 sowohl die Gesamtzellzahl als auch die Zellvitalität nach der Infektion von BTI-TN-5B1-4-Zellen mit polfuct V-Virus in unterschiedlichen MOIs gegeneinander aufgetragen Gesamtzellzahl [10 6 ml -1 ] MOI MOI 1 MOI 2 MOI Inkubationszeit [h] Abbildung 4.8 Zellbiologische Parameter bei der Expression der rekombinanten Fucosyltransferase V in BTI-TN-5B1-4-Zellen: BTI-TN-5B1-4-Zellen (20 ml Suspensionskultur) wurden bei einer Zelldichte von Zellen/ml mit dem rekombinanten Baculovirus polfuct V infiziert. Hierbei wurden verschiedene Virusmengen (MOI 0,1 MOI 5) eingesetzt. Die Zellen wurden für 5 Tage bei 27 C und 80 rpm inkubiert. Täglich wurde ein Aliquot entnommen, um die Gesamtzellzahl (gestrichelte Linie) und die Vitalität der Zellen (durchgezogene Linie) zu bestimmen. Bei allen Expressionsansätzen stieg die Gesamtzellzahl bis zum dritten Tag stark an und bleibt ab dem vierten Tag auf einem konstanten Niveau. Ausschließlich der Expressionsansatz, der mit einer MOI von 0,1 infiziert wurde, zeigte nach dem dritten Tag eine leichte Steigerung der Zellzahl. Deutlich zu erkennen ist auch, daß die maximal erreichte Zelldichte umso größer ist, desto weniger Virus bei der Infektion eingesetzt wurde. Die Vitalität der Zellen verhielt sich entgegengesetzt. In den ersten zwei Tagen der Expression waren unter dem Mikroskop kaum tote Zellen zu erkennen, wobei jedoch die Vitalität der Zellen, die mit einer MOI von 5 infiziert wurden, signifikant geringer war, als in den übrigen Ansätzen. Nach 96 h waren in allen Ansätzen kaum noch lebende Zellen zu finden. Der größte Einfluß der eingesetzten Virusmenge auf Vitalität [%] 60

71 Rekombinante Expression der humanen Fucosyltransferase V die Zellvitalität macht sich nach 72 h bemerkbar. Zu diesem Zeitpunkt waren deutlich mehr tote Zellen zu erkennen als in den Ansätzen, die mit einer hohen MOI infiziert wurden. Das Verhalten der mit dem p10fuct V-Virus infizierten BTI-TN-5B1-4- Zellen ist in Abbildung 4.9 dargestellt und zeigt keinen signifikanten Unterschied, sowohl in der Zellzahl als auch in der Zellvitalität gegenüber den mit dem polfuct V-Virus infizierten BTI-TN-5B1-4-Zellen Gesamtzellzahl [10 6 ml -1 ] MOI MOI 1 MOI 2 MOI Inkubationszeit [h] Abbildung 4.9 Zellbiologische Parameter bei der Expression der rekombinanten Fucosyltransferase V in BTI-TN-5B1-4-Zellen: BTI-TN-5B1-4-Zellen (20 ml Suspensionskultur) wurden bei einer Zelldichte von Zellen/ml mit dem rekombinanten Baculovirus p10fuct V infiziert. Hierbei wurden verschiedene Virusmengen (MOI 0,1 MOI 5) eingesetzt. Die Zellen wurden für 5 Tage bei 27 C und 80 rpm inkubiert. Täglich wurde ein Aliquot entnommen, um die Gesamtzellzahl (gestrichelte Linie) und die Vitalität der Zellen (durchgezogene Linie) zu bestimmen. Um Aussagen über die gebildete Proteinmenge treffen zu können, wurde von allen Expressionsansätzen täglich die Fucosyltransferase-Aktivität im Überstand bestimmt und relativ zueinander aufgetragen (Abbildung 4.10 auf Seite 62). Am zweiten Tag war in den Überständen aller Expressionansätze eine signifikante Aktivität zu detektieren, die bis zum dritten Tag anstieg und dann konstant blieb. Die gebildete Aktivität nach 120 h war in fast allen Ansätzen ähnlich und zeigte die erwartete Tendenz, daß eine höhere MOI in einer gesteigerten Expression an rekombinantem Protein resultierte. Des Weiteren konnte beobachtet werden, daß in fast allen Fällen der p10-promotor bei gleicher MOI zu höheren Aktivitäten im Überstand führte, wobei die Unterschiede jedoch gering waren. Abweichend war der Verhalten wenn BTI-TN-5B1-4-Zellen mit dem polfuct V-Virus und einer MOI von 5 infiziert werden. Unter diesen Vitalität [%] 61

72 Ergebnisse Relative Aktivität [%] p10fuct V MOI 0,1 p10fuct V MOI 1 p10fuct V MOI 2 p10fuct V MOI 5 polfuct V MOI 0,1 polfuct V MOI 1 polfuct V MOI 2 polfuct V MOI Inkubationszeit [h] Abbildung 4.10 Expression der Fucosyltransferase V in BTI-TN-5B1-4-Zellen: BTI-TN-5B1-4- Zellen (20 ml Suspensionskultur) wurden bei einer Zelldichte von Zellen/ml mit den rekombinanten Baculoviren polfuct V bzw. p10fuct V infiziert. Hierbei wurden verschiedene Virusmengen (MOI 0,1 MOI 5) eingesetzt. Die Zellen wurden für 5 Tage bei 27 C und 80 rpm inkubiert. Täglich wurde ein Aliquot entnommen, die Fucosyltransferase V-Aktivität im Überstand bestimmt und relativ zueinander aufgetragen. Bedingungen war zu allen Zeitpunkten die gebildete Menge rekombinanter FucT V signifikant höher als in allen Vergleichsansätzen. Allgemein ist zu beobachten, daß in allen Expressionsansätzen die Proliferation an rekombinanter Fucosyltransferase V zu dem Zeitpunkt stagniert, an dem die Zellen am Ende der sehr späten Phase der Virusreplikation lysieren. Diese Ergebnisse indizieren, daß die virusinduzierte Expression der rekombinanten Fucosyltransferase V durch den virusbedingten Tod der Zellen zustande kommt und nicht bedingt ist im Zusammenbruch des sekretorischen Weges und der Proteinfaltungsmaschinerie. Um Aussagen über die Proteinexpression hinsichtlich Dimerisierung und eventueller Degradierung zu treffen, wurde der Expressionsverlauf im Immunoblot verfolgt. Nach der Infektion von BTI-TN-5B1-4-Zellen mit dem pol- FucT V-Virus und einer MOI von 5 konnte nach 48 h eine Bande mit einem apparenten Molekulargewicht von 86 kda detektiert werden, dessen Intensität im Laufe der Zeit zunahm und nach 96 h ein Maximum erreichte. Zusätzlich war nach 96 h eine weitere Bande mit einem Molekulargewicht von 43 kda zu erkennen (Abbildung 4.11). Wie auch in Säugetierzellen wurde die FucT V in Insektenzellen vorwiegend als dimeres Protein exprimiert, wobei in diesem Fall zusätzlich eine monomere Form zu detektieren war. Die densitometrische 62

73 Rekombinante Expression der humanen Fucosyltransferase V Auswertung im Vergleich zu Fucosyltransferase V bekannter Konzentration ergab eine Expressionsrate von 1 2 mg/l. 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 97 kda 66 kda 45 kda Dimer Monomer Abbildung 4.11 Analyse der FucT V-Expression in BTI-TN-5B1-4-Zellen: BTI-TN-5B1-4-Zellen (20 ml Suspensionskultur) wurden bei einer Zelldichte von Zellen/ml mit den rekombinanten Baculoviren polfuct V und einer MOI von 5 infiziert und für 120 h bei 27 C und 80 rpm inkubiert. Täglich wurden Proben entnommen und auf ein 12 % iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Die Proteine wurden auf eine PVDF-Membran übertragen und einem Immunoprint unterzogen. Als Antikörper wurde gereinigtes polyklonales Serum gegen rfuct V (1:100) verwendet. Als sekundärer Antikörper wurde ein anti-kaninchen-ap-konjugat (1:10.000) eingesetzt. Die Entwicklung erfolgte unter Verwendung von NBT/BCIP Reinigung der rekombinanten Fucosyltransferase V Für strukturellen Analysen müssen die zu untersuchenden Substanzen einen hohen Reinheitsgrad aufweisen. Die Reinigung der Fucosyltransferase V erfolgte in Anlehnung an eine Methode von Costa (Costa et al., 1997a). Der Überstand eines 500 ml Expressionsansatzes wurde über eine GDP- Affinitätsmatrix gegeben, gewaschen und die spezifisch gebundene FucT V mit 3 mm freiem GDP eluiert. Trotz einer theoretischen Kapazität von mindestens 10 µmol/ml und einem Säulenvolumen von 10 ml reichte die Kapazität der Matrix nicht aus, um die gesamte FucT V zu binden, so daß dieser Reinigungsschritt mehrfach wiederholt wurde, bis keine Fucosyltransferase- Aktivität mehr im Durchlauf detektierbar war. Um die restlichen Verunreinigungen und das GDP abzutrennen wurde der ph-wert der vereinten Elutionsfraktionen auf 6,0 eingestellt und in einem abschließenden Arbeitsschritt über eine MonoS-Kationentauschersäule gereinigt. Die gebundene FucT V wurde mit einem linearen NaCl-Gradienten eluiert (Abbildung 4.12). Die Analyse in der SDS-PAGE zeigte das Vorhandensein von FucT V in allen proteinhaltigen Elutionsfraktionen, wobei keine Trennung der monomeren und der dimeren Form erfolgte. Zusätzlich konnte festgestellt werden, daß die monomere Form der FucT V eine deutliche Heterogenität aufweist und als Tripelbande erscheint (Abbildung 4.13). Trotz des uneinheitlichen Elutionsprofils wurde mit dieser Reinigungsstrategie FucT V mit 63

74 Ergebnisse Adsorption bei 280 nm [mau] Volumen [ml] Abbildung 4.12 Reinigung der rekombinanten Fucosyltransferase V mittels Kationentauscherchromatographie: Von der GDP-Affinitätssäule eluierte proteinhaltige Fraktionen wurden vereint und bei ph 6,0 über eine Kationentauscherchromatographie (MonoS-Säule) gereinigt. Gebundene Proteine wurden mit einem linearen NaCl Gradienten eluiert. Proteinhaltigen Fraktionen wurden auf Gehalt und Reinheit der Fucosyltransferase V überprüft (Abbildung 4.13). BRS A D E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 97 kda E1 E2E3 E4 E5E6 E Konduktivität [ms/cm] 66 kda 45 kda 31 kda Dimer Monomer Abbildung 4.13 Reinigung der rekombinanten Fucosyltransferase V: Elutionsfraktionen der GDP-affinitätschromatographischen Reinigung wurden vereint (A) und bei ph 6,0 über eine Kationentauscherchromatographie (MonoS-Säule) gereinigt. Gebundene Proteine wurden mit einem linearen NaCl Gradienten eluiert (E1 E7). Die Elutionsfraktionen wurden über ein 12 %iges SDS- Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt und einer Coomassiefärbung unterzogen. D = Durchlauf, BRS = broad range standard einem Reinheitsgrad von über 90 % und einer Ausbeute von 0,5 mg/l bei einer Expressionsrate von 1 2 mg/l erhalten. Die spezifische Aktivität betrug 0,3 mmol/(mg Enzym min) Stabile Expression der Fucosyltransferase V in Insektenzellen Da die viral induzierte Expression in Insektenzellen gezeigt hat, daß BTI-TN- 5B1-4-Zellen für die Produktion rekombinanter Fucosyltransferase V geeignet 64

75 Rekombinante Expression der humanen Fucosyltransferase V sind, wurde die Etablierung einer stabilen Insektenzellinie angestrebt. Untersuchungen, bei denen die FucT III stabil in Sf9-Zellen exprimiert wurde, zeigen, daß die kontinuierliche Expression in einer stabilisierten Zellinie zu deutlich höheren Ausbeuten an rekombinantem Protein führt (Morais und Costa, 2003) Klonierung und Expression Für die stabile Expression der Fucosyltransferase V in Insektenzellen wurde der Vektor pib-v5-his verwendet. Der Vektor wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI geschnitten. Aus dem Vektor puc18β-tracefuct V wurde das Insert mit BamHI und EcoRI ausgeschnitten und in den pib-v5-his Vektor insertiert. BTI-TN-5B1-4-Zellen wurden mit dem erhaltenen Plasmid pibβ-tracefuct V mit einer Effizienz von 70 % transfiziert und zur Stabilisierung mit 50 µg/ml Blasticidin kultiviert. Der zeitliche Verlauf der Expression zeigte schon nach 24 h im Immunoprint eine gut erkennbare Bande bei 86 kda, deren Intensität im Laufe der Zeit zunahm und nach 120 h ein Maximum erreichte. Nach 72 h war die Konzentration an Protein im Kulturüberstand so hoch, daß auch das FucT V Monomer detektierbar war. Es zeigte sich auch hier, daß das Monomer im Immunoblot als Tripelbande erscheint (Abbildung 4.14). Die densitometrische Analyse ergab im Vergleich mit Fucosyltransferase V bekannter Konzentration eine Expressionsrate von mg/l. Die spezifische Aktivität betrug 0,37 mmol/(mg Enzym min). 97 kda 66 kda 45 kda 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h Dimer Monomer Abbildung 4.14 Analyse der Expression der Fucosyltransferase V in stabil transfizierten Insektenzellen: In 25 cm²-zellkulturschalen wurden je stabilisierte BTI-TN-5B1-4-Zellen ausgesät und bei 27 C inkubiert. Alle 24 h wurde eine Probe (24 h 120 h) entnommen und nach der gelelektrophoretischen Auftrennung auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Detektion erfolgte mit anti-fuct V Serum (1:100) und einem anti-kaninchen-ap-konjugat (1:10.000) unter Verwendung von NBT/BCIP. 65

76 Ergebnisse 4.2 Strukturelle Untersuchung der rekombinanten humanen Fucosyltransferase V Einfluß der Dimerisierung auf die enzymatische Aktivität Da das exprimierte Fucosyltransferase V Konstrukt in allen Zellinien zu einem überwiegendem Maße als Dimer exprimiert wurde, wurde der Einfluß dieser Dimerisierung auf die enzymatische Aktivität untersucht werden. Zur Spaltung der Dimere wurde die gereinigte rekombinante Fucosyltransferase V aus Insektenzellen mit unterschiedlichen Konzentrationen DTT behandelt. Schon bei geringen DTT-Konzentrationen (1 mm) führte dies zur vollständigen Bildung von FucT V Monomeren, welche eine hohe Heterogenität aufweisen und in der SDS-PAGE als Tripelbande erscheinen (Abbildung 4.15). BRS kda 66 kda 45 kda Dimer Monomer 31 kda Abbildung 4.15 Reduktion der rekombinanten Fucosyltransferase V mit DTT: Gereinigte rekombinante Fucosyltransferase V (300 µg/ml) wurde mit verschiedenen Konzentrationen DTT behandelt. Dabei wurde mit 0 mm (1), 1 mm (2), 5 mm (3), 10 mm (4), 20 mm (5) und 50 mm (6) DTT für 1 h bei 37 C inkubiert. Die Proben wurden auf ein 12 %iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen und einer Coomassiefärbung unterzogen (BRS = broad range standard). Die Analyse der enzymatischen Aktivitäten zeigte bei geringen Konzentrationen an DTT (1 10 mm) eine signifikante Steigerung. Bei höheren Konzentrationen (20 50 mm) nahm die Aktivität stark ab und bei 50 mm DTT war nur noch die Hälfte des ursprünglichen Umsatzes zu detektieren (Abbildung 4.16). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Dimerisierung des in dieser Arbeit gewählten Konstruktes weder auf eine falsche Faltung zurückzuführen ist, noch dafür sorgt, daß die dimere Form der Fucosyltransferase V enzymatisch inaktiv ist. 66

77 Strukturelle Untersuchung der rekombinanten humanen... relative Aktivität [%] DTT Konzentration [mm] Abbildung 4.16 Reduktion der rekombinanten Fucosyltransferase V mit DTT: Die wie in Abbildung 4.15 behandelten Proteinproben wurden einem Aktivitätstest unterzogen und die gemessenen Werte relativ zur Aktivität der nicht reduzierten FucT V aufgetragen Identifizierung der für die Dimerisierung verantwortlichen Aminosäuren Die Reduktion der Fucosyltransferase-Dimere in eine monomere Form durch DTT ohne Verlust der Aktivität indizierte, daß intermolekulare Disulfidbrükken spezifischer Cysteine für diese Dimerisierung verantwortlich sind. Das in dieser Arbeit exprimierte Konstrukt enthält sechs Cysteinreste (Cys64, Cys94, Cys104, Cys156, Cys351, Cys354). Bei den meisten Glycosyltransferasen werden der C-Terminus und die Proteindomäne, die direkt hinter der Stem-Region liegt, durch mehrere Disulfidbrücken zusammengehalten und formen so das katalytische Zentrum (de Vries et al., 2001). Bei der Fucosyltransferase V wurde postuliert, daß Cys94 mit Cys354 sowie Cys104 mit Cys351 diese Brücken ausbilden (Holmes et al., 2000) und damit nicht für die Dimerisierung verantwortlich sein können (siehe Abbildung 1.5). Um das für die Dimerisierung verantwortliche Cystein zu identifizieren, wurden Mutanten der Fucosyltransferase V kloniert, bei denen entweder das Cys64 (C64S) oder das Cys156 (C156S) gegen Serin getauscht ist. Zusätzlich wurde eine Doppelmutante (C64S/C156S) kloniert und alle Konstrukte in BTI-TN-5B1-4-Zellen exprimiert. Zur Generierung der unterschiedlichen Mutanten, wurden über Orts-spezifische Mutagenese die jeweiligen Nukleotide ausgetauscht (Abbildung 4.17). 67

78 Ergebnisse wt:... TCC CGC TGC CAG GAC...//... AGC AAC TGC CGG CAC... Ser Arg Cys Gln Asp Ser Asn Cys Arg His C64S:... TCC CGC agc CAG GAC...//... AGC AAC TGC CGG CAC... Ser Arg Ser Gln Asp Ser Asn Cys Arg His C156S:... TCC CGC TGC CAG GAC...//... AGC AAC agc CGG CAC... Ser Arg Cys Gln Asp Ser Asn Ser Arg His C64S/C156S:... TCC CGC agc CAG GAC...//... AGC AAC agc CGG CAC... Ser Arg Ser Gln Asp Ser Asn Ser Arg His Abbildung 4.17 Schematische Darstellung der eingefügten Mutationen. Zu diesem Zweck wurde die QuikChange Methode (Wang und Malcolm, 1999) angewandt und ausgehend vom Vektor puc18β-tracefuct V die Mutante C64S mit den Oligonukleotiden a19t und a19tantisense eingeführt. Die Mutante C156S wurde mit den Oligonukleotiden t295a und t295a antisense generiert. Die entsprechenden Mutationen in den Plasmide puc18β-tracefuct VC64S und puc18β-tracefuct VC156S wurden durch Sequenzierung bestätigt. Die mutierten Konstrukte wurden analog zum Wild-Typ in den Vektor pibv5his umgesetzt. Die Doppelmutante C64S/C156S wurde mit den Primern t295a und t295a antisense aus der Mutante C64S generiert und ebenfalls nach Bestätigung der korrekten Sequenz in den Vektor pib-v5-his insertiert. BTI-TN-5B1-4-Zellen wurden mit den erhaltenen Plasmiden pibβ-trace- FucT VC64S, pibβ-tracefuct VC156S und pibβ-tracefuct VC64S/C156S mit einer Effizienz von 70 % transfiziert und über einen Zeitraum von ca. 2 Wochen unter Selektionsdruck durch Blasticidin stabilisiert. Zur Analyse der Expression wurden sowohl von den stabilisierten BTI-TN- 5B1-4-Zellen, die das Wild-Typ-Konstrukt exprimierten, als auch von den drei Mutanten, 20 ml-suspensionskulturen mit einer Zelldichte von Zellen angesetzt und für 120 h bei 27 C inkubiert. Täglich wurden Proben entnommen und auf Fucosyltransferase-Aktivität untersucht. Der zeitliche Verlauf der Aktivitäten im Überstand zeigte sich für alle Konstrukte gleich (Abbildung 4.18). Dieses Ergebnis belegt, daß der Austausch der Cysteine gegen Serin in den entsprechenden Konstrukten nicht zu einer inaktiven Form der Fucosyltransferase V führt und zeigt, daß die veränderte Primärstruktur des Enzyms keinen signifikanten Einfluß auf die Expressionsrate in Insektenzellen hat. Die Analyse im Immunoprint zeigte, daß das apparente Laufverhalten der Mutante C156S dem des Wild-Typ-Enzyms entsprach. Die Expression der Konstrukte, bei denen das Cys64 gegen Ser ausgetauscht wurde, führte ausschließlich zur Bildung der monomeren Form der FucT V (Abbildung 4.19). Diese Unterschiede im Laufverhalten indizieren, daß ausschließlich das Cys64 für die Dimerisierung verantwortlich war. 68

79 Strukturelle Untersuchung der rekombinanten humanen... relative Aktivität [%] C64S C156S C64S/C156S wt Inkubationszeit [h] Abbildung 4.18 Expressionsanalyse der wt FucT V sowie der Mutanten C64S, C156S und C64S/C156S: Suspensionskulturen mit je stabilisierten BTI-TN-5B1-4-Zellen wurden bei 27 C für 120 h inkubiert. Täglich wurden Proben entnommen und die Fucosyltransferase-Aktivität bestimmt. 97 kda 66 kda 45 kda wt C64S C156S C64S/C156S Dimer Monomer Abbildung 4.19 Expressionsanalyse der Witdtyp FucT V sowie der Mutanten C64S, C156S und C64S/C156S: Suspensionskulturen mit je stabilisierten BTI-TN-5B1-4-Zellen wurden bei 27 C inkubiert. Nach 120 h wurden Proben der Expressionsüberstände auf ein 12 %iges SDS- Polyacrylamidgel aufgetragen. Die auf eine PVDF-Membran übertragenen Proteine wurden einem Immunoprint unterzogen. Die Detektion der FucT V erfolgte mit dem anti-fuct V Serum (1:100) und einem anti-kaninchen-ap-konjugat (1:10.000). Die Entwicklung erfolgte unter Verwendung von NBT/BCIP. Zur Analyse der spezifischen Aktivität des Wild-Typs als auch der unterschiedlichen Mutanten wurden die vier Proteine aus ihren Expressionsansätzen gereinigt. Nach der Reinigung wiesen die Proteine eine Reinheit von 90 % auf. Unter reduzierenden Bedingungen hatten alle Mutanten ein identisches Laufverhalten in der SDS-PAGE (Abbildung 4.20). 69

80 Ergebnisse nicht reduzierend reduzierend {}}{{}}{ kda 66 kda 45 kda Dimer Monomer Abbildung 4.20 Analyse der Reinigung der FucT V Mutanten C64S (Bahn 2+6), C156S (Bahn 3+7), C64S/C156S(Bahn 4+8) und des wt (Bahn 1+5): Je 100 ml Kulturüberstand der unterschiedlichen FucT V Mutanten wurden über GDP-Agarose Affinitätschromatographie und anschließender Kationentauscherchromatographie gereinigt. Proben der gereinigten Proteine wurden unter nicht reduzierenden und reduzierenden Bedingungen auf ein 12 %iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen und einer Coomassiefärbung unterzogen. Die Bestimmung der spezifischen Aktivität der jeweiligen Mutanten sowie des Wild-Typ-Enzyms Zeigte für alle Konstrukte keine signifikanten Unterschiede (Tabelle 4.2 siehe unten). Mutante Spezifische Aktivität [mmol/(mg Enzym min)] wt-fuct V 0,37 ± 0,1 C64S-FucT V 0,32 ± 0,1 C156S-FucT V 0,35 ± 0,1 C64S/C156S-FucT V 0,40 ± 0,1 Tabelle 4.2 Ermittelte spezifische Aktivitäten der einzelnen Konstrukte: Je 250 ng (5, mol) rekombinantes Protein wurde für 20, 30, 40 und 50 min einem Reaktionsassay unterzogen. Der Umsatz pro Zeiteinheit konnte direkt aus der vermessenen Strahlungsmenge abgeleitet und gemittelt werden Untersuchung der Glycanstrukturen der rekombinanten Fucosyltransferase V Die große Heterogenität der rekombinanten in Insektenzellen exprimierten Fucosyltransferase V verhindert eine strukturellen Untersuchung mit biophysikalischen Methoden. Besonders die Kristallisation von Proteinen ist stark abhängig von der Homogenität des eingesetzten Enzyms. Verantwortlich für die Heterogenität könnten unterschiedliche Glycosylierungsformen des rekombinanten Proteins sein. Aus diesem Grund wurde die 70

81 Strukturelle Untersuchung der rekombinanten humanen... Glycosylierung der in Insektenzellen exprimierten Fucosyltransferase V näher untersucht. Zu diesem Zweck wurde die spezifische Bindung von Lektinen an Kohlenhydratstrukturen zur Identifizierung der endständigen Oligosaccharide ausgenutzt. Die hier verwendeten Lektine waren mit dem Steroidhapten Digoxigenin konjugiert, wodurch eine immunologische Detektion der gebundenen Lektine möglich ist. Die Fucosyltransferase V wurde neben einem entsprechenden Kontrollprotein (Tabelle 4.3) auf ein SDS-Polyacrylamidgel geladen und einem Lektinprint unterzogen. In Abbildung 4.21 ist erkennbar, daß das einzige gegen die FucT V reaktive Lektin das Galanthus nivalis Agglutinin (GNA) war, welches endständige Mannose erkennt, die α(1-3), α(1-6) oder α(1-2) an Mannose gebunden ist. Diese Reaktivität indiziert das Vorhandensein von high-mannose N-Glycanen, wie sie in Insektenzellen vorwiegend vorkommen. Inwieweit die Zuckerstukturen der rekombinant in Insektenzellen exprimierten Fucosyltransferase V tatsächlich verantwortlich für die beobachtete Heterogenität sind, kann durch die vollständige Deglycosylierung mit Hilfe von N- Glycosidasen aufgeklärt werden. Das vollständig deglycosylierte Protein sollte in diesem Fall als singuläre Bande in der SDS-PAGE-Analyse erscheinen. Kontrollprotein Masse GNA SNA MAA PNA DSA Carboxypeptidase Y (1) 63 kda + Transferrin (2) 80 kda + Fetuin (3) 68 kda Asialofetuin (4) 61 kda + + Tabelle 4.3 Liste der verwendeten Kontrollproteine und ihre Reaktivität gegenüber unterschiedlichen Lektinen: + starke Reaktion; schwache Reaktion. GNA = Galanthus nivalis Agglutinin, SNA = Sambucus nigra Agglutinin, MAA = Maackia amurensis Agglutinin, PNA = Peanut Agglutinin, DSA = Datura stramonium Agglutinin In Insektenzellen exprimierte, reduzierte und denaturierte FucT V wurde mit N-Glycosidase F deglycosyliert und das Laufverhalten analysiert. Im Immunoblot ist erkennbar, daß durch die Behandlung mit N-Glycosidase F die FucT V als singuläre Bande erscheint und ein niedrigeres apparentes Molekulargewicht aufweist als die unbehandelte FucT V (Abbildung 4.22). Diese Veränderung im Laufverhalten indiziert, daß die Aufspaltung in eine Tripelbande bei der rekombinanten FucT V auf das Vorhandensein unterschiedlich glycosylierter Spezies zurückzuführen ist. 71

82 Ergebnisse GNA SNA MAA PNA DSA {}}{{}}{{}}{{}}{{}}{ 1 FucTV 2 3 FucTV 3 FucTV 4 FucTV 3 4 FucTV Abbildung 4.21 Untersuchung der Glycanstrukturen an in Insektenzellen exprimierter Fucosyltransferase V: Mit Hilfe des Baculovirus-Expressionssystems exprimierte rekombinante FucT V (100 ng) wurde neben den entsprechenden Kontrollproteinen (Tabelle 4.3) auf ein 12 %iges SDS- Polyacrylamidgel aufgetragen. Die Proteine wurden auf eine PVDF-Membran übertragen und einem Lektin-Immunoprint unterzogen. Für die Detektion wurden die entsprechenden Lektine und ein Anti-Digoxigenin-AP-Konjugat (1:1000) verwendet. Die Färbung erfolgte unter Verwendung von NBT/BCIP. 66 kda + 45 kda Abbildung 4.22 Deglycosylierung mit N-Glycosidase F: 100 ng in Insektenzellen mit Hilfe des Baculovirus-Expressionssystems exprimierte rekombinante FucT V wurden mit 1 % SDS und 50 mm β-mercaptoethanol für 5 min bei 100 C denaturiert. Nach Zugabe von 1,25 % Tween 20 und 5 U N- Glycosidase F (+) bzw. dem entsprechendem Volumen H 2 O ( ) wurde für 14 h bei 37 C inkubiert. Die Proben wurden mit Probenpuffer versetzt und über eine SDS-PAGE aufgetrennt. Die auf eine PVDF-Membran übertragenen Proteine wurden einem Immunoprint unterzogen. Die Detektion der FucT V erfolgte mit dem anti-fuct V Serum (1:100) und einem anti-kaninchen-ap-konjugat (1:10.000). Die Entwicklung erfolgte unter Verwendung von NBT/BCIP. 4.3 Selektion von Peptid-Bibliotheken gegen die Fucosyltransferase V Die bisherige Entwicklung von spezifischen Fucosyltransferase-Inhibitoren basiert auf dem rationalen Design von Substrat- bzw. Übergangszustands-Analoga (Murray et al., 1997, Qiao et al., 1996 und Lee et al., 2003). Diese Substanzen weisen jedoch nur eine geringe inhibitorische Wirkung oder Spezifi- 72