Research Collection. Ein Beitrag zur papierchromatographischen Aminosäurebestimmung in Holzzuckerhefe. Doctoral Thesis.

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1 Research Collection Doctoral Thesis Ein Beitrag zur papierchromatographischen Aminosäurebestimmung in Holzzuckerhefe Author(s): Vögeli, Hansjakob Publication Date: 1957 Permanent Link: https://doi.org/ /ethza Rights / License: In Copyright NonCommercial Use Permitted This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information please consult the Terms of use. ETH Library

2 Prom. Nr Ein Beitrag zur papierchromatographischen Aminosäurebestimmung in Holzzuckerhefe Von der Eidgenössischen Technischen Hochschule in Zürich zur Erlangung der Würde eines Doktors der technischen Wissenschaften genehmigte PROMOTIONSARBEIT vorgelegt von HANSJAKOB VÖGELI dipl. Ing.Agr. von Grafenried (Kt. Bern) Referent: Herr Prof. Dr. E. Crasemann Korreferent: Herr Prof. Dr. H. Deuel JurisVerlag Zürich 1957

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4 Meiner Frau und dem Gedenken meiner Mutter

5 Meinem hochverehrten Lehrer, Herrn Prof. Dr. E. dessen Leitung ich die vorliegende Arbeit ausführte, Crasemann, unter möchte ich an dieser Stelle für seine vielseitige Unterstützung meinen herzlichen Dank aussprechen. Ebenfalls dan ke ich Herrn Dr. P. von Tavel, dem Leiter des TheodorKocherInstitutes in Bern, wo ich während eines längeren Aufenthaltes einen Teil der papierchromatographischen Untersuchungen durchführen konnte. Ferner bin ich den Herren Dr. A. Schürch und Dr. H. Jucker für die tatkräftige Förderung meiner Untersu chungen zu Dank verpflichtet. Mein Dank gehört auch den Herren H. Strübi und J. Bischofberger, die mir wertvolle Hilfe leisteten.

6 5 INHALTSVER ZEICHNIS Seite A. Einleitung und Zielsetzung 7 B. Beschreibung und grobchemische Charakterisierung der untersuchten Hefe 8 C. Die Methodik der Aminosäurebestimmung Die Vorbereitung der Hefe 12 a) Die Entfettung der Hefe 15 b) Die Extraktion der freien Aminosäuren 15 c) Die Hydrolyse des Hefeproteins 16 d) Die Reinigung der Hydrolysate mit Hilfe von Ionenaustauschern 17 e) Die Verteilung des Stickstoffes auf die einzelnen, bei der Vor behandlung gewonnenen Fraktionen Die papierchromatographische Trennung der Aminosäuren 20 a) Allgemeines 20 b) Die Technik der chromatographischen Trennung 22 aa) Das Papier 22 bb) Die Entwicklungskammern 22 cc) Die Wahl der Lösungsmittel 22 dd) Die Zubereitung der Lösungsmittel 24 ee) Der Arbeitsgang Die Identifizierung und die quantitative Bestimmung der Aminosäuren 27 a) Allgemeines 27 b) Die qualitative Auswertung der Chromatogramme 27 c) Die quantitative Bestimmung der im Papierchromatogramm getrennt vorliegenden Aminosäuren 28 aa) Die Ausführung der quantitativen Ninhydrinreaktion auf dem Papier 30 bb) Die Ausführung der Ninhydrinreaktion im Reagenzglas 33 cc) Die Adsorptionsverluste im Papier 37 dd) Die Verluste bei der Entfernung der Lösungsmittel 42 ee) Der Einfluss der Lokalisationsmethode auf das Ergebnis der papierchromatographischen Aminosäurebestimmung Zusammenfassende Beschreibung der verwendeten quantitativen, 45 zweidimensionalen PapierChromatographie D. Die Ergebnisse Der qualitative Aminosäurenachweis in der Hefe 47

7 6 Seite a) Die Aminosäuren im Alkoholextrakt 47 b) Die Aminosäuren in der alkoholunlöslichen Fraktion Das Ergebnis der quantitativen Aminosäurebestimmung 52 a) Die quantitative Aminosäurebestimmung im Alkoholextrakt 53 b) Die quantitative Aminosäurebestimmung in der alkoholunlös lichen Fraktion 57 Die Besprechung der Ergebnisse 58 Zusammenfassung 67 Literaturverzeichnis 72

8 7 A. EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG Die Vielgestaltigkeit der Funktionen mit denen die stickstoffhaltige Fraktion der Futtermittel am Stoff und Energiewechsel des Tieres beteiligt ist, stellt die Bemühung um bestimmte Aussagen über die von ihr im gegebenen Fall zu erwarten de physiologische Wirkung vor Probleme besonderer Art. Bis in die jüngste Zeit stützen sich diese Aussagen nahezu ausschliesslich auf den Tierversuch. Der andere, unmittelbar vom Chemismus der genannten Fraktion ausgehende Weg erwies sich noch vor kurzem als kaum gangbar. Dies war zu einem guten Teil dadurch bedingt, dass die chemischanalytische Bestimmung der Aminosäuren, die normalerweise im stickstoffhaltigen Anteil der Futtermittel vorherrschen und für dessen physiologische Wirkung ausschlaggebend sind, auf erhebliche, teilweise unüberwindlich erscheinen de Schwierigkeiten stiess. Erst mit der Einführung der Papierchromatographie durch R. Consden, A.H. Gordon und A.I.P. Martin (21) sind Möglichkeiten eröffnet worden, die es gestatten, die chemische Bestimmung der in Naturstoffen vor kommenden Aminosäuren verhältnismässig einfach und praktisch brauchbar zu ge stalten, womit sich die Aussichten, die physiologische Wirkung der stickstoffhaltigen Nahrungsfraktion auf Grund chemischer Gegebenheiten zu beurteilen, wesentlich ver bessert haben. Mit der vorliegenden Arbeit stellten wir uns die Aufgabe, den stickstoffhaltigen Anteil und von diesem vor allem das Eiweiss einer als Futtermittel vielfach verwen deten Wuchshefe (Torula utilis) einer eingehenden chemischen Analyse zu unterzie hen. Im Zusammenhang damit nahmen wir uns vor, einen Beitrag zur papierchromatographischen Bestimmung der Aminosäuren zu leisten und zu prüfen, ob und wie weit diese Bestimmung Aussagen über die biologische Wertigkeit stickstoffhaltiger Futterfraktionen erlaubt, wobei wir auf entsprechende Vorschläge und vergleichba re Angaben der Literatur Bezug nahmen.

9 8 B. BESCHREIBUNG UND GROBCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER UNTERSUCHTEN HEFE Für unsere Untersuchungen wurde eine von der Holzverzuckerungs A. G. in Ems (Graubünden) zur Verfügung gestellte, getrocknete Futterhefe (Torula utilis) verwendet. Sie wurde nach einem Verfahren gewonnen, das sich wie folgt um schreiben lässt: Holzzuckerwürze, die bei der hydrolytischen Spaltung von Holzzel lulose nach dem SchollerVerfahren anfällt, macht vorerst eine alkoholische Gä rung durch, wobei die Hexosen in Aethanol übergeführt werden. Nach der Destilla tion des Alkohols versetzt man die zurückbleibende Schlempe, in der noch die Pen tosen des Holzes enthalten sind, mit kalium, phosphor und stickstoffhaltigen Salzen. Auf diesem Nährboden wird bei intensiver Belüftung die Wuchshefe gezüch tet. Diese wird anschliessend durch Zentrifugieren von der Närlösung getrennt, ge waschen und auf dampfbeheizten Trommeln getrocknet. Der grobchemische Aufbau der untersuchten Trockenhefe geht aus Tabelle 1 hervor: Tabelle 1 Die Ergebnisse der Gesamtnährstoffanalyse der Hefe Wasser 9,85% In % der Trockensubstanz: Rohasche 10,11 Rohfett 4,68 Roheiweiss 50,25 Reineiweiss 45,90 Rohfaser 2,93 Stickstoffreie Extraktstoffe 32,03 Der Reineiweisstickstoff, der nach Barnstein durch Fällung mit Kupferhydroxyd bestimmt wurde, macht91,3 % des nach Kjeldahl ermittelten Gesamtstickstoffes aus. Bei Anwendung weiterer Eiweissfällungsmittel ' wurden folgende Anteile des Reineiweisstickstoffes am Gesamtstickstoff ermittelt: Mit Tannin 87,2% Mit Trichloressigsäure 76,2 % *) Handbuch der landwirtschaftlichen Versuchs und Untersuchungsmethodik (Me thodenbuch Bd. III) Neumann Verlag, Radebeul und Berlin 1951.

10 Aminostickstoff 9 Diese niedrigeren Werte lassen vermuten, dass nach der Barnsteinmethode auch Nichteiweisstickstoff ausgefällt wird, eine Tatsache, auf die H. Schjerning (84) schon vor langer Zeit aufmerksam gemacht hat. Die Trennung des Eiweisstickstoffes vom Nichteiweisstickstoff lässt sich auch durch Extraktion des Nichteiweisstickstoffes durchführen. Folgende Extraktionsmit tel wurden geprüft: a) Alkohol: 2 g nach R. Reichert (80) entfettete Trockenhefe wurden unter Um rühren mit der zehnfachen Menge 75 %igem Alkohol dreimal je lv2 Stunden extrahiert. b) Trichloressigsaure: 2 g Trockenhefe wurden nach P. Roine (81) während 4 Stunden mit der zehnfachen Menge kalter, 8 %iger Trichloressigsäure behandelt. Zur Vermeidung einer Hydrolyse erfolgte die Extraktion im Kühlraum. c) Wasser: Die Extraktion erfolgte in der Weise, dass 2 g Hefe nach H. T. Mac pher son (57) dreimal während je 5 Minuten mit 30 cm kochendem Wasser aus gezogen wurden. Die so gewonnenen Extrakte wurden mittels Zentrifugieren und anschliessender Fil tration durch einen JenaBakterienfilter G 5 auf 3 von den Hefezellen befreit. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Extraktionsversuche. Der mit angegebene «*Aminostickstoff wurde gasometrisch nach D.D. van Slyke (95) bestimmt. Tabelle 2 Bestimmung des Nichteiweisstickstoff s auf Grund verschiedener Extraktionsverfahren In % des In % des lös Extraktionsmittel Gesamtstick liehen Stick stoffs Stoffs Alkohol löslicher Gesamtstickstoff 12,5 c<aminostickstoff 8,2 65,6 Trichloressigsäure löslicher Gesamtstickstoff 16,4 <* Aminostickstoff 9,8 59,8 Wasser löslicher Gesamtstickstoff 26,1 <X 9,6 36,8 Auf Grund der verschiedenen, von uns geprüften Fällungs und Extraktionsverfahren nahm der Anteil des Nichteiweisstickstoffes am Gesamtstickstoff der Hefe Werte an, wie sie in Tabelle 3 zusammengestellt sind.

11 10 Ta belle 3 Der Anteil des nach verschiedenen Fällungs und Extraktionsverfahren bestimmten Nichteiweisstickstoffes am Gesamtstickstoff der Hefe Fällung mit: Nichteiweissstickstoff in % des Gesamt stickstoffs Extraktion mit: Nichteiweissstickstoff in % des Gesamt stickstoffs Kupferhydroxyd 8,7 Trichloressigsäure 16,4 Trichloressigsäure 23,8 Wasser 26,1 Tannin 12,8 Alkohol 12,5 Die Tanninfällung und die Alkoholextraktion lieferten nahezu übereinstimmende Werte. Einander nahekommende, jedoch bedeutend höhere Werte ergaben die Fäl lung mit Trichloressigsäure und die Extraktion mit Wasser. Dabei zeigte es sich, dass aus dem Heisswasserextrakt mit Trichloressigsäure noch eine, wenn auch nur geringe Stickstoffmenge (0,7 % des Gesamtstickstoffes) ausfällbar war. In Uebereinstimmung damit steht eine Beobachtung von F.A. Cosonka (22), der erwähnt, dass in der Hefe nach Hitzekoagulation wasserlösliches Eiweiss nachgewiesen werden könne. Um einen Anhaltspunkt über die Menge des mit Kupferhydroxyd nach Barn stein ausfallenden Nichteiweisstickstoffes zu erhalten, wurde die Hefe vor der Reineiweissbestimmung mit heissem Wasser extrahiert. Nach dieser Behandlung konnten im Rückstand nur noch 78,9 % des Gesamtstickstoffes gefällt werden gegen über 91,3 % bei nicht vorbehandelter Hefe. Mit der Barnsteinmethode wurden somit 12,4 % oder nach Abzug des im Wasserextrakt koagulierbaren Anteils (0,7 %) 11,7% des Gesamtstickstoffes ausgefällt, die vermutlich nicht als Proteinstickstoff gelten können. Untersuchungen von K. Dirr und P. Decker (27) über den Nichteiweisstickstoff in Holzzuckerhefe führten zu folgenden Ergebnissen: Nichteiweisstickstoff in % des Gesamtstickstoffs 1. Trichloressigsäureextrakt 16,9 2. NucleinsäurePurinStickstoff im Rückstand 5,7 3. NucleinsäurePyrimidinStickstoff im Rückstand 2,9 4. LipoidStickstoff 0,9 Nichteiweisstickstoff 26,4

12 11 Mit dem mittels Trichloressigsäure extrahierten Nichteiweisstickstoff (16,9 %) stimmt der von uns im Trichloressigsäureextrakt gefundene Stickstoffanteil (16,4 %) sehr gut überein. Sehr gut ist auch die Uebereinstimmung zwischen dem von K. Dirr und P. Decker bestimmten Gesamtanteil an Nichteiweisstickstoff (26,4 %) mit dem von uns durch Wasserextraktion erhaltenen Wert (26,1 %). Hieraus darf man den Schluss ziehen, dass die Heiswasserextraktion eine Methode darstellt, die den in Hefe enthaltenen Nichteiweisstickstoff in guter Annäherung bestimmen lässt. Im weitern darf gefolgert werden, dass für den Anteil des Reineiweisstickstoffes am Gesamtstickstoff der von uns geprüften Hefe der nach Barnstein ermittelte Wert von 91,3 % nicht verwendbar ist; diesem Anteil dürfte ein Wert von 74 bis 75 %, basierend auf einem Anteil an Nichteiweisstickstoff von 25 bis 26 %, weit besser entsprechen. Zu einem ähnlichen Schluss gelangen O. v. Soden und K. Dirr (87), die feststellen, dass der Eiweisstickstoff der Hefe kaum 80 % ihres Gesamtsrickstoffes betrage.

13 12 C. DIE METHODIK DER AMINOSAEUREBESTIMMUNG 1. Die Vorbereitung der Hefe In Nahrungs und Futtermitteln sind neben der zu untersuchenden, stickstoff haltigen Fraktion meist in grösseren Mengen andere Stoffgruppen zugegen, die den Gang der Analyse stören. Besonders in Gegenwart von Kohlenhydraten und Fetten besteht die Gefahr, dass einzelne Aminosäuren bei der für ihre Bestimmung erfor derlichen Hydrolyse der im Untersuchungsmaterial vorhandenen Proteine beträchtli che Verluste erleiden. Im Bestreben, dieser Gefahr zu begegnen, werden zwei grundsätzlich verschiedene Verfahren zur Anwendung gebracht. Nach dem ersten Verfahren werden die Eiweisskörper so weitgehend als mög lich von allen andern Stoffen befreit, um die Verluste bei der nachfolgenden Hydro lyse auf ein Minimum zu beschränken. Diese Isolierung ist jedoch ihrerseits mit oft beträchtlichen Verlusten verbunden, denen dadurch Rechnung getragen wird, dass das mit der isolierten Proteinfraktion erhaltenen Analysenergebnis auf das Gesamteiweiss übertragen wird. Dieses Vorgehen kann jedoch grosse Fehler in sich schliessen, da die Zusammensetzung des isolierten Proteins derjenigen des Gesamteiweisses in vielen Fällen nur schlecht entspricht. Beim zweiten Verfahren, das in neuerer Zeit vermehrt Anwendung findet, wird das ganze Nahrungs oder Futtermittel ohne vorgängige Isolierung der Proteine hydrolysiert. Diese Methode ist insbesondere Von E. I. Bigwood (3) ausgearbeitet worden. Der die Hydrolyse störende Einfluss der Kohlenhydrate kann durch starke Verdünnung der Proben mit 6 n Salzsäure im Verhältnis von 1 : 100 oder 1 : 200 be deutend verringert werden. In Standardlösungen bekannter Zusammensetzung gelang es Bigwood, nach einer in Gegenwart eines grossen Kohlenhydratüberschusses vorgenommenen Hydrolyse, alle Aminosäuren mit Ausnahme von Trytophan, Cystin und Methionin innerhalb einer Fehlergrenze von ± 5 % zu erfassen. Auch bei der Untersuchung von Heu und Getreide erzielten E.I. Bigwood und Mitarbeiter (4) mit diesem Verfahren gute Ergebnisse. Der in den 18 erfassten Aminosäuren vor handene Stickstoff machte 80 bis 90 % des Gesamtstickstoffes aus. Der restliche Stickstoff stammte zum grössten Teil aus nicht aminosäureartigen Stickstoffverbin dungen und nur zum kleineren Teil aus Aminosäuren, die der Bestimmung entgangen waren. J. Brüggemann und K.Drepper (17) stellen die Forderung auf, dass in Futtermitteln die Aminosäureanalyse ohne vorherige Isolierung des Eiweisses durch zuführen sei.

14 13 Wir selber beabsichtigten anfänglich, vor der Hydrolyse der Hefe eine Abtren nung der Kohlenhydrate vorzunehmen. Die Schwierigkeiten, die sich hierbei ergaben, waren derartig, dass wir den Versuch, das Eiweiss zu isolieren, als aussichtslos aufgaben. Bei der Trockenhefe liegen insofern besondere Verhältnisse vor, als ihr Eiweiss von einer sehr widerstandsfähigen Zellwand eingeschlossen wird. Um bes sere Voraussetzungen für die Abtrennung des Eiweisses zu schaffen, versuchten wir, allerdings vergeblich, die Hefezellen mit flüssiger Luft zu sprengen. Aehnlichen Schwierigkeiten begegneten D. D i r r und O. v. Soden (26) bei ihren Untersu chungen über die Lipoide der Hefe. Anderseits gelang esr.j. Block und D. Bolling (6), Die von E. die Hefezellen mit Kohlensäureschnee zu zerstören. Kofranyi (48) entwickelte Methode zur Trennung von Eiweiss und Kohlenhydraten ist uns leider zu spät zur Kenntnis gekommen, weshalb sie in unsern Versuchen nicht geprüft wurde. Nach diesem Verfahren werden die Kohlen hydrate ohne die Rohfaser mittels einer das Eiweiss schonenden Hydrolyse mit Ameisensäure in Lösung gebracht. Nach Abtrennung der Rohfaser durch Filtration werden das Eiweiss und die freien Aminosäuren nach C. Neuberg und J. Kerb (72) mit Quecksilberacetat gefällt und anschliessend mit Salzsäure hydrolysiert. Das Quecksilber wird sodann als Sulfid aus dem Hydrolysat ausgefällt. Obschon sowohl bei der Fällung nach Neuberg und Kerb als auch bei der nachfolgenden Ausfäl lung des Quecksilbers gewisse Verluste, zum Teil selektiver Natur, entstehen, scheint die Methode vielversprechend zu sein. Um Hydrolysenverluste zu vermindern, versuchten wir wenigstens einen Teil der störenden Nichteiweisstoffe aus der Hefe zu entfernen. Zu diesem Zweck extra hierten wir vorerst die Fettstoffe mit Aether; dann wurden die freien Aminosäuren durch Extraktion mit wasserhaltigem Alkohol vom Eiweiss getrennt, wobei sich auch ein Teil der störenden Kohlenhydrate entfernen liess. Anschliessend wurde die Hefe nach H.T. Macpherson (57) mit heissem Wasser behandelt (vgl. Seite 9), wobei 18,2 % der Hefetrockensubstanz, vermutlich zum grössten Teil in Form von Glykogen, in Lösung gingen. Im nicht hydrolysierten Wasserextrakt waren ausser einer Spur von Glutathion weder freie Aminosäuren noch Oligopeptide festzustellen. Das Glutathion hat sich demnach im Alkohol nicht vollständig gelöst, eine Beobachtung, die auch von O. Lindan und E. Work (56) gemacht wurde. Der Heisswasserauszug enthielt eine geringe Menge mit Trichloressigsaure ausfällbaren Stickstoffs, der sich auf Grund einer Hydrolyse und papierchromatographischen Prüfung als Eiweissstickstoff erwies. Folgende Aminosäuren konnten ermittelt werden: Alanin, Arginin, Asparaginsäure, Cystin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Serin, Threonin, Tyrosin und Valin. Damit Hessen sich mit Ausnahme von Prolin und Isoleucin alle Aminosäuren nachweisen, die auch im sauren Hydroly sat des mit Heiswasser nicht extrahierbaren Hefeproteins gefunden wurden.

15 14 Die Feststellung, wonach Protein in Lösung ging, liess den von der Heisswasserbehandlung erhofften Vorteil als hinfällig erscheinen. Sie hätte zwei statt nur eine Hydrolyse erfordert, was vermutlich mit zusätzlichen Verlusten verbunden ge wesen wäre; dies veranlasste uns, auf die Heisswasserbehandlung zu verzichten. Da die Kohlenhydrate nur teilweise entfernt wurden, musste mit einer Bildung stickstoffhaltiger Huninstoffe gerechnet werden, die, wie die Proteinisolierung, ebenfalls zu Verlusten führt. So wird Tryptophan bei der in Gegenwart von Kohlen hydraten stattfindenden sauren Hydrolyse vollständig zerstört, während es nach T. Kotake (50) in reiner Form gegenüber einer Säurebehandlung unempfindlich ist. Bei der alkalischen Hydrolyse schädigen Kohlenhydrate das Tryptophan nur wenig. Besonders empfindlich ist in Gegenwart von Kohlenhydraten sowohl bei saurer als auch bei alkalischer Hydrolyse das Cystin. Deshalb ist nach J. Brüggemann und K. Drepper(17) seine quantitative Bestimmung in Futtermitteln noch sehr fragwürdig. Wie die gleichen Autoren mitteilen, erlitt Methionin bei der sauren Hydrolyse in einem kohlenhydratfreien Medium keine Verluste, während in Gegen wart von Kohlenhydraten Einbussen von 10 % festgestellt wurden. Dagegen sollen die basischen Aminosäuren bei der sauren Hydrolyse, auch wenn Kohlenhydrate zu gegen sind, nur wenig geschädigt werden. Im Widerspruch hiezu steht der Befund von G.R. Tristram (94), wonach Arginin und Histidin bei der in Anwesenheit von Kohlenhydraten durchgeführten sauren Hydrolyse bis zu 20 % zerstört wurden. Dass bei der in Gegenwart von Kohlenhydraten stattfindenden sauren Hydrolyse Ver luste an Tryptophan, Cystin und Methionin auftraten, wird auch von J.P. Dustin und Mitarbeitern (30) erwähnt. J. Brüggemann und K. Drepper konnten bei der sauren Hydrolyse folgende, zu kohlenhydrathaltigen Futtermitteln zugesetzte Aminosäuren quantitativ wiederfinden: Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Leucin, Isoleucin, Valin und Prolin. Im weiteren sei eine Feststellung von R. J. Evans und Mitarbeiter (31) erwähnt, wonach Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin und Threonin bei der sauren Hydro lyse in Anwesenheit von Kohlenhydraten keine oder nur geringe Verluste erleiden. Nach M. S. Dünn (29) soll die Gegenwart von Kohlenhydraten und Fetten bei der sauren Hydrolyse auf folgende Aminosäuren keinen schädlichen Einfluss ausüben: Arginin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Leucin, Isoleucin, Lysin, Phenylalanin, Threonin und Valin. Auf Grund ihrer Untersuchungen gelangten J. P. Dustin und Mitarbeiter (30) zum Schluss, dass sich die Hydrolysenverluste bei Zu satz von Kohlenhydraten gegenüber der Hydrolyse von reinem Eiweiss bei keiner von 15 geprüften Aminosäuren (Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Prolin, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, Histidin, Lysin, Arginin) um mehr als 3 % erhöhten, sofern in starker Verdünnung gearbeitet wurde.

16 15 Die zitierten Beobachtungen anderer Autoren, wonach die Hydrolyse von Pro teinen in Gegenwart von Kohlenhydraten die Mehrzahl der Aminosäuren nur wenig schädigt und wonach störende Einflüsse begleitender Kohlenhydrate auf die empfind licheren Aminosäuren bei entsprechender Verdünnung wesentlich herabgesetzt wer den können, Hessen es uns als angezeigt erscheinen, die Hydrolyse der Hefe ohne vorherige Isolierung des in ihr enthaltenen Proteins durchzuführen. Das Vorgehen gestaltete sich wie folgt: a) Die Entfettung der Hefe In der Hefe liegt ein beträchtlicher Teil des Fettes in Form von Lipoproteiden vor, die sich mit Aether nicht extrahieren lassen. R. Reichert (80) empfiehlt vor der Extraktion die Lipoproteide nach folgendem Verfahren zu spalten: 1 g Trok 3 kenhefe wird mit 20 cm 95 %igem Methanol 1 Stunde am Rückflusskühler gekocht. Nach dem Abdampfen des Methanols trocknet man die Hefe während einer Stunde bei 95 C und extrahiert anschliessend im Soxhletapparat während 12 Stunden mit Aether. Methanolaufschluss und Aetherextraktion werden einmal wiederholt. Beide Aetherextrakte werden vereinigt und nach Abdampfen des Aethers im Vakuum getrocknet. Ausser den Phosphatiden sollen nach diesem Verfahren keine stickstoffhaltigen Ver bindungen in den Extrakt gelangen. Wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist, ergaben unsere Untersuchungen je nach der verwendeten Methode für den Fettgehalt der Hefe stark voneinander abweichende Werte. Tabelle 4 Der Fettgehalt der Hefe, bestimmt nach verschiedenen Extraktionsmethoden Fettgehalt in % der Tr. Subst. Extraktion mit Aether während 24 Stunden 4,18 Extraktion mit Aether während 48 Stunden 4,68 Extraktion nach R. Reichert 9,85 Wir entschlossen uns die Hefe nach der Methode von R. Reichert zu entfetten. b) Die Extraktion der freien Aminosäuren Aus analytischen und physiologischen Gründen ist es angezeigt, die freien und die im Eiweiss gebundenen Aminosäuren getrennt zu bestimmen. Obschon die Daten

17 16 der Tabelle 2, Seite 9 zeigen, dass mit Trichloressigsaure am meisten 0<Aminostickstoff extrahiert werden kann, wählten wir zur Extraktion der freien Aminosäuren 75 %igen Alkohol, da sich der so gewonnene Auszug einfacher verarbeiten liess. Wie die in Tabelle 5 angeführten Ergebnisse erkennen lassen, ist die Entfettung der Hefe vor der Alkoholextraktion unerlässlich. Tabelle 5 Der aus nicht entfetteter und entfetteter Hefe mit Alkohol extrahierbare Stickstoff Extrahierter Stick Extrahierter e* Aminostoff in % des Ge Stickstoff in % des Ge samtstickstoffs samtstickstoffs Nicht entfettete Hefe 7,0 5,2 Nach Reichert entfettete Hefe 12,5 8,2 Die bessere Stickstoffausbeute nach Entfettung der Hefe lässt vermuten, dass die Vorbehandlung die Durchlässigkeit der Hefezelle für den Alkohol verbessert. Die Extraktion der freien Aminosäuren wurde wie folgt ausgeführt: 1 g ent fettete Trockenhefe wurde dreimal je 1V2 Stunden und jedesmal mit der zehnfachen Menge 75 %igem Alkohol unter Umrühren ausgezogen. Die drei Auszüge wurden alsdann vereinigt, zentrifugiert und zur Abtrennung der restlichen Zellen durch ein Bakterienfilter G 5 auf 3 filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingedickt und in 3 2 cm 10 %igem Isopropanol aufgenommen. Um zu prüfen, ob der Alkoholextrakt neben freien Aminosäuren auch Peptide enthalte, wurden einige Proben nach dem Eindicken 12 Stunden mit 30 cm 6 n HCl bei 100 C hydrolysiert. Darauf wurde zur Entfernung der Salzsäure eingedampft, zweimal mit Wasser versetzt und wieder 3 eingedampft; schliesslich wurde der Rückstand in 2 cm 10 %igem Isopropanol auf genommen. Die Prüfung des hydrolysierten Extraktes nach van Sly ke zeigte im Ver gleich zum nicht hydrolysierten Auszug eine kaum merkbare Zunahme des OCAminostickstoffes, was beweist, dass Mengen an Peptiden in Lösung gingen. infolge der Alkoholbehandlung nur unbedeutende Sowohl die hydrolysierte als auch die nichthydrolysierte Lösung konnte ohne weitere Reinigung papierchromatographiert werden. c) Die Hydrolyse des Hefeproteins Die zur vollständigen Hydrolyse des Hefeeiweisses benötigte Zeit wird in der Literatur sehr verschieden angegeben. Was die saure Hydrolyse mit 6 n HCl be trifft, so liegen folgende Angaben vor:

18 17 H. Fink und F. Just (33) dehnten die Hydrolysedauer bei Torulahefen auf 120 bis 140 Stunden aus. H. Kraut und F. Schlottmann (52) hydrolysierten Nährhefe 3 bis 4 Tage. K. Dirr undo.v. Soden (25) erachten diese Zei ten als viel zu lang und geben als optimale Dauer 10 Stunden an. In unsern Versuchen überprüften wir die Vollständigkeit der Hydrolyse durch Berechnung des Quotienten o( Aminostickstoff Gesamtstickstoff 100 Wir fanden, dass eine Hydrolyse von 24 Stunden genügt, um eine vollständige Auf spaltung des Hefeeiweisses zu erreichen. Zur Gewinnung des sauren Hydrolysates, in dem mit Ausnahme des Trypto phans alle Aminosäuren bestimmt werden konnten, wurde folgendes Vorgehen ge wählt: 0,2 g Trockenhefe, die entfettet und in der auf Seite 9 beschriebenen Weise 3 mit Alkohol extrahiert worden waren, wurden in 40 cm 6 n HCl aufgenommen und 24 Stunden auf dem Oelbad bei schwachem Sieden hydrolysiert. Nach Entfernung der Huminstoffe durch Filtration wurde das Hydrolysat, um die Salzsäure zu vertreiben, nach jeweiliger Wasserzugabe dreimal im Vakuum zur Tockne eingedampft. Damit das Tryptophan bestimmt werden konnte, musste die Hefe einer alkali schen Hydrolyse unterworfen werden. 0,2 g Trockenhefe wurden nach erfolgter Ent 3 fettung und Alkoholextraktion in 1 cm 5 n NaOH aufgenommen und in einem zuge schmolzenen Glasrohr 18 Stunden bei 100 C hydrolysiert. Anschliessend wurde mit 5 n HgSO. neutralisiert. d) Die Reinigung der Hydrolysate mit Hilfe von Ionenaustau schern Eine direkte Verwendung der Hefehydrolysate für die papierchromatographische Analyse erwies sich nicht als vorteilhaft, infolge der in grösseren Mengen vorhandenen, da die Qualität der Chromatogramme störenden Begleitstoffe sehr zu wün schen übrig liess. Es musste deshalb eine Reinigung der Hydrolysate mit Hilfe von Ionenaustauschern vorgenommen werden. Wir stützten uns in unsern Versuchen vor allem auf die Erfahrungen von P. Boulanger und Mitarbeiter (15), von P. Boulanger und von G. Biserte und R. Scriban (5). und G. Biserte (16) In Anlehnung an diese Arbeiten verwendeten wir als Kationenaustauscher Zerolit 225, ein Polystyrolharz mit aktiven SO HGruppen. Durchfliessteinaus biologischem Ma terial hergestelltes Hydrolysat einen Kationenaustauscher, so werden nicht nur die mineralischen Kationen, sondern auch die Aminosäuren, die in schwach saurer Lö sung ebenfalls als Kationen vorliegen, gegen diehionendes Harzes eingetauscht,

19 18 während die Anionen und die elektrisch neutralen Substanzen die Kolonne passieren. Die nur leicht festgehaltenen Aminosäuren können mit 1 n Ammoniak wieder eluiert werden, während die stärker gebundenen mineralischen Kationen zurückbleiben. Die Aminosäuren werden in einer schmalen Zone vor der Ammoniakfront hergetrieben und erscheinen fast gleichzeitig mit dem Ammoniak im Eluat. Zur quantitativen Gewinnung der eluierten Aminosäuren genügt es, vor und nach dem Durchbruch der Ammoniakfront, deren Lage in einem Blindversuch bestimmt wird, 3 je 30 bis 50 cm Eluat aufzufangen. Nach P. Boulanger und G. Biserte (16) soll es möglich sein, mit Ammoniak alle Aminosäuren quantitativ zu eluieren. Ein zig die quantitative Erfassung des Arginins soll oft auf Schwierigkeiten stossen. Zur Kontrolle dieser Angaben Hessen wir eine aus den 18 bekanntesten Aminosäuren be stehende Mischung durch eine Zerolitkolonne laufen. Nach der Elution mit Ammo niak konnten wir in einer Doppelbestimmung 99,0 und 98,3 % des in der ursprüngli chen Lösung festgestellten OCAminostickstoffs wiederfinden. Demnach darf mit einer quantitativen Elution der Aminosäure gerechnet werden. Im einzelnen gestaltet sich das Vorgehen, wie folgt: Das im Vakuum eingedampfte Hydrolysat, das nach Entfernung der Huminstof 3 fe insgesamt 12,05 mg Stickstoff enthielt, wurde in 15 cm destilliertem Wasser aufgenommen und mit einer Geschwindigkeit von 15 bis 20 Tropfen pro Minute durch eine Zerolitsäule von 20 mm Durchmesser und 5 cm Höhe fliessen gelassen. Da 3 rauf wurde mit 100 cm destilliertem Wasser nachgewaschen und anschliessend mit 1 n Ammoniak eluiert. Die letzten, vor dem Erscheinen der Ammoniakfront ausflies 3 3 senden 30 cm und die nachfolgenden 30 cm wurden gemeinsam aufgefangen und im 3 Vakuum eingedampft. Schliesslich wurde der Rückstand in 3 cm 10 %igem Isopropanol aufgelöst. Die so erhaltene Lösung wurde zur Herstellung der Papierchromatogramme verwendet. Das alkalische Hydrolysat wurde in analoger Weise gereinigt. e) Die Verteilung des Stickstoffes auf die einzelnen, bei der Vorbehandlung gewonnenen Fraktionen Der in der Fettfraktion bestimmte Stickstoff machte 0,90 % des Gesamtstick stoffes der Hefe aus. Er stellt nach R. Reichert (80) ausschliesslich Phosphatidstickstoff dar.

20 19 Die alkohollösliche Fraktion wies folgende Verteilung des Stickstoffes auf: In % des Gesamt In % des löslistickstoffs chen Stickstoffs der Hefe Löslicher Gesamtstickstoff 12,48 Löslicher o< Aminostickstoff 8,19 65,63 Ammoniakstickstoff 0,32 2,54 Der grösste Teil des löslichen Stickstoffs lag offenbar in Form von Aminosäu ren vor. Da die gasometrische Bestimmung des Stickstoffs nach D.D. van Slyke (95) nur den <Aminostickstoff erfasst, lässt sich mit dieser Methode bei verschie denen Aminosäuren nur ein Teil ihres Stickstoffgehaltes bestimmen (z.b. Trypto phan 1/2, HistidinV3, Argininl/4); der Prolinstickstoff entgeht ihr vollständig. Der gesamte Anteil des in den freien Aminosäuren enthaltenen Stickstoffes wird somit wesentlich mehr betragen haben als die bestimmten 65,63 %. Nach P. Roine (81) ist es sehr fraglich, ob in der Hefe freies Ammoniak vorkommt. Da Roine als Lösungsmittel Trichloressigsäure verwendete, hält er da für, dass möglicherweise das von ihm im Extrakt gefundene Ammoniak während der Extraktion abgespalten worden sei. Bei Verwendung von Alkohol als Extraktionsmit tel dürfte eine solche Abspaltung kaum eintreten. Eher scheint in unserem Falle die andere, von Roine erwähnte Möglichkeit zuzutreffen, wonach in der Hefe nachweis bares, freies Ammoniak aus Ueberresten der an den Hefezellen haftenden Nährlö sung stamme. In der alkoholunlöslichen Fraktion wurde folgende Verteilung des Stickstoffs festgestellt: In % des Gesamt In % des alkoholunstickstoffs löslichen Stickstoffs der Hefe Alkoholunlöslicher Stickstoff «XAminostickstoff 58,98 68,36 Huminstickstoff *^ 3,22 3,72 Ammoniakstickstoff 6,42 7,41 *) Stickstoff im Hydrolysenrückstand.

21 20 Bezogen auf den Gesamtstickstoffgehalt der Hefe, muss mit einem Anteil an Nichteiweisstickstoff von 25 bis 26 % gerechnet werden (vgl. Seite 11). Hievon finden sich in der extrahierten Fettfraktion und im alkohollöslichen Anteil 13,38 %, so dass in der alkoholunlöslichen Fraktion noch ungefähr 12 % Nichteiweisstickstoff vorliegen müssen. Dieser Anteil tritt hauptsächlich in den oben stehenden Daten für den Ammoniakstickstoff und wahrscheinlich bis zu einem gewissen Grade auch in den Daten für den Huminstickstoff in Erscheinung. Ferner ergab sich aus Tabelle 2, Sei te 9, dass die freien Aminosäuren durch die von uns vorgesehene Alkoholextraktion nicht vollständig aus der Hefe herausgelöst werden. Der 12 % betragende Anteil an Nichteiweisstickstoff muss demnach ausser aus Ammoniak und Huminstickstoff auch aus Stickstoff freier Aminosäuren bestanden haben. Immerhin erweist sich dieser Anteil an freien Aminosäuren im Vergleich zu dem im Hefeprotein gebundenen Stick stoff als sehr bescheiden. 2. Die papierchromatographische Trennung der Aminosäuren a) Allgemeines Das von R. Consden, A.M. Gordon und A. J. P. Martin (21) ausgearbeitete Verfahren der Papierchromatographie, das von uns für die weitere Auftrennung der Eiweisshydrolysate angewandt wurde, beruht wahrscheinlich vor wiegend auf der unterschiedlichen Verteilung der Komponenten eines Gemisches zwi schen zwei flüssigen Phasen. Das Papier dient zur Fixierung der einen, d. h. der stärker polaren Phase (meist Wasser), an der eine zweite weniger polare Phase (organische Phase) vorbeiströmt. Je grösser die Löslichkeit einer Komponente in der organischen Phase ist, desto rascher wandert sie. Umgekehrt ist aber auch eine gewisse Löslichkeit in der stärker polaren Phase (Wasserlöslichkeit) erforderlich, um die Bildung abgegrenzter Flecke zu gewährleisten. Als Ausdruck für die Wanderungsgeschwindigkeit eines Stoffes dient der R_Wert, der wie folgt definiert ist: Wanderungsstrecke der Substanz Wanderungsstrecke der Lösungsmittelfront Sofern die Papiersorte und die Lösungsmittel definiert sind, lassen sich die Chromatogramme reproduzieren, so dass die R_Werte zur Charakterisierung ei ner Substanz dienen können.

22 21 Je mehr Komponenten ein Gemisch enthält, desto schwieriger ist dessen voll ständige Auftrennung in einzelne, sauber begrenzte Flecke. Besondsrs dem eindi mensionalen Verfahren, bei dem das Chromatogramm nur in einer Richtung ent wickelt*) wird, sind bezüglich Trennschärfe enge Grenzen gesetzt. Da die eindimensionale PapierChromatographie, verglichen mit dem zweidi mensionalen Verfahren, weniger Zeit bedarf und als weiteren Vorteil die parallele Entwicklung verschiedener Proben auf dem gleichen Papierbogen ermöglicht, durch die Identifizierung der getrennten Stoffe erleichtert wird, ist versucht worden, dieses Verfahren zu verbessern, um so eine befriedigende Trennung aller Amino säuren zu erzielen. J.K. Miettinen und A.I. Virtanen (61) konnten eine wesentliche Verbesserung der Trennschärfe dadurch erzielen, wo dass sie kontinuier lich chromatographierten, d. h. die Entwicklung fortsetzten, nachdem das Lösungs mittel den unteren Blattrand erreicht hatte. Bei dieser Methode muss das Chromato gramm jedoch 58 Tage oder länger in der Entwicklungskammer verbleiben, wo durch das Arbeitstempo stark verlangsamt wird. Ein anderes Verfahren zur Ver besserung der Trennschärfe bei der eindimensionalen Chromatographie ist von E. F. McFarren(58) vorgeschlagen worden. Gestützt auf die phabhängigkeit der RpWerte polarer Substanzen, gelang es ihm, durch Pufferung der Aminosäurelö sung, des Papiers und des Lösungsmittels auf verschiedene phwerte, eine saube re Trennung von 19 Aminosäuren zu erhalten. Die Trennschärfe dieser Methode be stätigte sich auch in unsern Versuchen, doch zeigte es sich, tiven Auswertung mit Hilfe der Ninhydrinreaktion Trübungen auftraten, dass bei der quantita die das Photometrieren verunmöglichten. Leider genügte auch dieses Verfahren nicht, um die in der Hefe, d.h. vor allem in der alkohollöslichen Fraktion besonders zahlreich vorhandenen Aminosäuren vollkommen zu isolieren. Eine befriedigende Auftrennung von kompliziert zusammengesetzten Eiweisshydrolysaten zum Zweck einer nachfolgenden quantitativen Auswertung scheint vor läufig nur nach dem zweidimensionalen Verfahren möglich zu sein, bei dem das Chromatogramm in zwei senkrecht zueinander stehenden Richtungen entwickelt wird. Dieses Verfahren, für das wir uns entschlossen, schrieben. wird nachfolgend ausführlich be *) Die Bezeichnung "entwickeln" wird nachfolgend ausschliesslich für den Lauf des Chromatogramms verwendet; es sei jedoch vermerkt, dass von andern Autoren in Anlehnung an die Photographie oft auch die Sichtbarmachung der Flecke mit Hilfe einer Farbreaktion als "entwickeln" bezeichnet wurde.

23 22 b) Die Technik der chromatographischen Trennung aa) Das Papier In unseren Untersuchungen wurde ausschliesslich WhatmanPapier verwendet, wobei für qualitative Zwecke entweder Nr. 4 oder Nr. 1, für quantitative Bestim mungen nur das Papier Nr. 1 mit mittlerer Laufzeit gewählt wurde, da letzteres kleine, scharf begrenzte Flecke gibt. Für die Trennung mit ButanolPhenol be nützten wir stets ganze Bogen (181/4 x 221/2 inch). bb) Die Entwicklungskammern Zur Verhinderung der Verdunstung des Lösungsmittels müssen die Chromatogramme in geschlossenen Behältern oder Kammern in einer mit dem Lösungsmittel gesättigten Atmosphäre entwickelt werden. Grundsätzlich sollte für jedes verwendete Lösungsmittel eine separate Entwicklungskammer zur Verfügung stehen, damit nicht nach jedem Lauf das Lösungsmittel gewechselt werden muss. Wird in grossen Kam mern mit ganzen WhatmanPapierbogen gearbeitet, so gelingt es meist nicht, vor der Verwendung eines neuen Lösungsmittels die letzten Spuren des vohergehenden zu entfernen. Wird wie bei unseren Untersuchungen ein Butanollauf von einem Phenol lauf gefolgt, so tritt bei Vorhandensein von Butanolrückständen eine ausgeprägte brau ne Front auf, deren Zacken sich oft weit ins Blatt hineinziehen, so dass diejenigen Aminosäuren mit den grössten Rp,Werten (Leucin, Methionin, Valin, Phenylalanin, Prolin und Arginin) in ihrem Lauf gestört werden. Wir verwendeten deshalb für je des der beiden Lösungsmittel eine getrennte Kammer, von denen eine aus paraffiniertem Holz mit zwei Glasfenstern, die andere aus Glasscheiben in einem Metallrahmen gebaut war. Das Sättigungsmittel (wässerige Phase) wurde in eine Porzellanschale auf dem Boden der Kammer gebracht. Die gläsernen Küvetten für die Aufnahme des Lösungs mittels wurden im Verlauf der weiteren Untersuchungen durch solche aus Polyaethylen ersetzt. Diese Küvetten bewährten sich ausgezeichnet. cc) Die Wahl der Lösungsmittel Bei der Auswahl der Lösungsmittel für quantitative, chromatographische Eiweissuntersuchungen sind folgende Gesichtspunkte zu beachten: 1. Die R_Werte der zu untersuchenden Stoffe sollten sich im gewählten Lösungs mittelsystem um mindestens 0,05 unterscheiden und nicht über 0,9 liegen (H. Hellmann (41).

24 23 Wasser 2. Die Lösungsmittel dürfen keine chemischen Veränderungen der Aminosäuren, die zu fehlerhaften Ergebnissen führen, verursachen. 3. Bei aufeinanderfolgender Verwendung zweier verschiedener Lösungsmittel, wie sie bei der zweidimensionalen Chromatographie meist vorkommt, besteht die Ge fahr, dass Rückstände des ersten Lösungsmittels den Lauf des zweiten beein trächtigen. Aus diesem Grunde muss das erste Lösungsmittel so beschaffen sein, dass es aus dem Papier entfernt werden kann, ohne dass Verlust«an Aminosäu ren entstehen. 4. Das zweite Lösungsmittel darf den Nachweis und die quantitative Bestimmung der Aminosäuren nicht stören. In den meisten Fällen ist es notwendig, dieses voll ständig aus dem Papier zu entfernen, was wiederum ohne Verluste an Aminosäuren zu geschehen hat. Nach J. K. Miettinen und A.I. Virtanen (61) erfüllen Pyridin, Lutidin (2, 4Dimethylpyridin) und Collidin (2, 4, 6Trimethylpyridin), die früher oft als Lösungsmittel zur Trennung der Aminosäuren verwendet wurden, die genannten An forderungen nur teilweise, was u.u. zu fehlerhaften Ergebnissen führt. Bei nicht sachgemässer Anwendung kann auch Phenol Verluste an Aminosäuren verursachen. Aliphatische Alkohole, wie vor allem Propanol und Butanol, die den zuvor genannten Lösungsmitteln überlegen sind, haben die Pyridinabkömmlinge in der Papierehramatographie der Aminosäuren weitgehend verdrängt. Einzig das Phenol liess sich bisher durch kein leichter flüchtiges Lösungsmittel mit gleich grossem Auflösungsvermögen ersetzen. Nach Prüfung verschiedener Lösungsmittel entschieden wir uns für das folgende von S.M. Partridge (74) empfohlene Paar: 1. Lauf: nbutanol Eisessig Wasser (4:1:5) 2. Lauf: Mit Wasser gesättigtes Phenol Mit diesen zwei Lösungsmitteln konnten im absteigenden Lauf alle in der Hefe nachgewiesenen Aminosäuren, ausser Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Methionin und Valin, vollständig getrennt werden. Die Trennung der letzteren erfolgte aufstei gend nach R.A. Boissonas (12) mit Hilfe der nachfolgend aufgeführten Lösungs mittel: 1. Lauf: Tertiäres Butanol Methyläthylketon (4:4:2) 2. Lauf: Tertiäres Butanol Methanol Wasser (4:5:1) Im Gegensatz zu unserem Vorgehen wird in den meisten Fällen bei Verwendung des erstgenannten Lösungsmittelpaares das Phenol im ersten und das Butanol im

25 24 zweiten Lauf eingesetzt. Diese Reihenfolge erfordert jedoch eine restlose Entfernung des Phenols nach dem ersten Lauf. Bei qualitativem Arbeiten, bei dem Verluste an Aminosäuren keine Rolle spielen, kann dies leicht durch Erhitzung auf höhere Tem peraturen erreicht werden. Folgt der Trennung jedoch eine quantitative Auswertung der Chromatogramme, so müssen die Papierbogen, um das Phenol ohne Verluste an Aminosäuren vollständig entfernen zu können, bei 45 C vorgetrocknet, anschliessend mit Aether ausgewaschen und schliesslich 24 Stunden bei Zimmertemperatur nachge trocknet werden. Wird in abgekürztem Verfahren das Phenol nach dem ersten Lauf nicht restlos entfernt, so tritt im zweiten Lauf mit Butanol hinter der Lösungsmittel front eine zweite gelbe Front auf, welche die Entwicklung der Aminosäuren stark hemmt und deren Trennung beeinträchtigt (auch von R. J. Block (10) beobachtet). Das eben erwähnte Vorgehen erweist sich meist als zu umständlich. Es hat sich deshalb als vorteilhafter erwiesen, das Butanol im ersten Lauf zu verwenden, besonders deshalb, weil dieses die günstige Eigenschaft besitzt, die den Phenollauf stören, Verunreinigungen, aus dem Papier herauszulösen und sie an seiner Front vor sich herzutreiben. Dieser einer Waschung der Blätter gleichkommende Prozess schafft somit günstige Voraussetzungen für den nachfolgenden Phenollauf und bewirkt, dass die als Folge von Verunreinigungen an der Phenolfront auftretende braune Zone *) nur noch schwach in Erscheinung tritt '. dd) Die Zubereitung der Lösungsmittel Die Reinheit der Lösungsmittel bildet eine wichtige Voraussetzung für das Ge lingen der chromatographischen Trennung. Besondere Sorgfalt erfordert die Zube reitung des Phenols. Dieses wurde nach G. Stampa (90) über Aluminiumspänen bei Normaldruck destilliert und durch Zusatz von 10 % doppelt destilliertem *) Beim Phenollauf wird oft an der Lösungsmittelfront eine braunschwarze Zone beobachtet. Diese tritt im basischen Milieu verstärkt auf und kann u.u. die Bestimmung der am weitesten wandernden Aminosäuren beeinträchtigen. Die Bildung dieser aus Verunreinigungen bestehenden Zone wird durch das im Papier in Spuren vorhandene Kupfer katalysiert. Durch Zusatz einiger Kristalle von Kaliumcyanid zur Sättigungslösung lässt sich die katalytische Wirkung des Kup fers jedoch weitgehend unterbinden (R.Consden (21) ). Nach A. M. Smith (85) kann die Bildung der dunkelbraunen Phenolfront auch durch Zusatz von Ameisensäure zum Lösungsmittel und von Ammoniak zum Sättigungsmittel ver hütet werden, da anscheinend das entstehende Ammoniumformiat mit Kupfer ei ne Komplexverbindung eingeht. In unseren Untersuchungen zeigte es sich, dass durch dieses Vorgehen die dunkle Front fast gänzlich zum Verschwinden gebracht werden kann. Dagegen hat es den Nachteil, dass das Ammoniumformiat nach dem Lauf im Trockenschrank bei 80 C verdampft werden muss, wobei gewisse Ami werden können. In unseren wei nosäuren bei Anwesenheit von Phenol geschädigt teren Untersuchungen wurde deshalb auf den Zusatz von Ameisensäure verzich tet.

26 25 *) Wasser ' verflüssigt. Das auf diese Weise gewonnene Produkt erwies sich als sehr rein und liess sich während längerer Zeit als Stammlösung aufbewahren. Bei Bedarf wurde diese Stammlösung in einem Schütteltrichter mit doppelt destilliertem Wasser im Verhältnis 1 : 1 gesättigt, worauf die spezifisch schwerere Phase, das wasserge sättigte Phenol, als Lösungsmittel zur Entwicklung des Chromatogrammes, die leichtere Phase, das phenolgesättigte Wasser, zur Sättigung der Kammerluft ver wendet wurde. Beim nbutanol erübrigte sich eine Destillation. Nach dem Vorschlag von S. M. Partridge (74) wurden jeweils vier Teile Butanol und ein Teil Eisessig mit fünf Teilen Wasser im Schütteltrichter gesättigt. In diesem Falle diente die leichte re Phase, das mit Wasser gesättigte Butanol, als Lösungsmittel, während die schwe rere Phase, das mit Butanol gesättigte Wasser, zur Sättigung des Kastens Verwen dung fand. Beide Lösungsmittel wurden jeweils am Vorabend ihrer Verwendung hergestellt und über Nacht stehen gelassen. Es empfiehlt sich, die Lösungen bei der Mischung im Schütteltrichter nicht zu stark zu schütteln, um Trübungen zu vermeiden, da die se auch bei längerem Stehenlassen nicht mehr verschwinden und nur noch durch wei tere Zusätze von etwas Phenol bzw. ButanolEisessig geklärt werden können. Um einer nachträglichen Entmischung in der Küvette vorzubeugen, soll die Sättigung der Lösungsmittel nicht im Chromatographierraum, was kühleren Lokal erfolgen. sondern in einem et Sie soll für alle Untersuchungen bei annähernd gleicher Temperatur stattfinden, damit die RFWerte, die wie H. B. Bull (18), G. N. Kowkabany undh.g. Cassidy (51) gezeigt haben, Lösungsmittels abhängen, nicht allzu grosse Schwankungen aufweisen. von der Konzentration des Da die R_Werte der polaren Aminosäuren eine starke phabhängigkeit zeigen, wurde zur besseren Trennung der basischen Aminosäuren dem Sättigungsmittel je 3 weils 1 cm Ammoniak zugesetzt. Bei der Zubereitung des zweiten Lösungsmittelpaares wurde nach den Vor schriften von R.A. Boissonnas (12) verfahren. ee) Der Arbeitsgang Die zu analysierenden Aminosäurelösungen wurden mit einer Mikropipette auf das Papier aufgetragen. Um möglichst kleine Flecke zu erhalten, wurden für quan 3 titative Bestimmungen 2 bis 3 mm nicht überschritten, während für qualitative *) Bei Verwendung von doppelt destilliertem Wasser tritt die braune Phenolfront schwächer auf als bei einfach destilliertem. O.J. Draper und A.L.Pollar d (28) verwenden sogar dreifach destilliertes Wasser.

27 26 Untersuchungen, bei denen die Fleckengrösse keine Rolle spielt, Mengen von bis 3 zu 5 mm aufgetragen wurden. Zeigte es sich, dass die aufgetragenen Lösungsmen gen nicht genügend Aminosäuren enthielten, so wurde die Auftragung nach einer je weiligen Zwischentrocknung wiederholt, bis der für die Bestimmung notwendige Ge halt an Aminosäuren erreicht war. Saure Lösungen wurden nach dem Auftragen neu tralisiert, indem nach R. C onsden(21) der noch nasse Fleck während kurzer Zeit Ammoniakdämpfen ausgesetzt wurde. Die Papierbogen wurden alsdann in der Kammer in der Weise entwickelt, dass das Butanol parallel zur breiten Seite, das Phenol parallel zur schmalen Seite lief. Zwischen dem Butanol und dem Phenollauf wurden die Papierbogen in einem Trokkenschrank mit Abzug bei 45 C getrocknet und hernach die Ansammlung von Ver unreinigungen an der Butanolfront dadurch entfernt, dass das Blatt 2 bis 3 cm hinter der Front abgeschnitten wurde. Die phenolhaltigen Papierbogen, die nicht für eine quantitative Auswertung vorgesehen waren, wurden bei 100 C getrocknet, wäh rend die für die quantitative Auswertung bestimmten Bogen eine schonendere Behand lung erfuhren (vgl. S.43 ). Zur besseren Trennung der basischen Aminosäuren bei quantitativer Bestimmung war es erforderlich, das Butanol nicht nur bis zum Er reichen des unteren, ausgezackten Blattrandes laufen zu lassen, sondern den Lauf um das Doppelte zu verlängern. Die gleiche Massnahme erwies sich im Phenollauf zur Trennung von Glycin und Serin als notwendig. Die Trennung von Leucln und Isoleucin, Phenylalanin und Methionin mit dem zweiten Lösungsmittelpaar wurde, wie erwähnt, gemäss den Vorschriften von R. A. Boissonnas(12) durchgeführt. Isoleucin wurde jedoch nicht erreicht, Eine zufriedenstellende Trennung von Leucin und auchnicht, wenn wir die Lösungsmittelpaare doppelt so weit laufen Hessen, als vom Autor angegeben wird. Oft wird empfohlen, die Bogen vor der Zugabe des Lösungsmittels einige Stun den in der gesättigten Atmosphäre hängen zu lassen. Weder J. F. Thompson (92) noch wir konnten jedoch einen ins Gewicht fallenden Vorteil dieses Vorge hens feststellen, weshalb wir davon absahen. Zur Erkennung der Butanolfront muss diese entweder vor dem Eintrocknen mar kiert oder nach dem Trocknen mit ultravioletten Strahlen zum Fluoreszieren ge bracht werden. Statt die Front abzuschneiden, kann sie auch dadurch entfernt werden, dass man das Butanol nach Erreichen des ausgezackten Randes während kurzer Zeit abtropfen lässt. Hierdurch wird jedoch die exakte Bestimmung der R Werte erschwert.

28 27 3. Die Identifizierung und die quantitative Bestimmung der Aminosäuren a) Allgemeines Sowohl zur qualitativen als auch zur quantitativen Auswertung der AminosäurenChromatogramme diente die NinhydrinReaktion. Das Ninhydrin (Triketohydrinden) dehydriert die Aminosäuren zu Iminosäuren und geht dabei selbst in den entsprechenden sekundären Alkohol, Hydrindantin, über. Die Iminosäuren zerfallen hierauf spontan in die nächstniedrigeren Aldehyde, in C02 und NH3. Letzterer bildet durch Kondensation mit dem noch vorhandenen Ninhydrin und dem Hydrindantin den bekannten blauen Farbstoff. Unterhalb ph 2,5 unterbleibt diese Kondensation, so dass keine Farbstoffbildung stattfindet. Bei diesen Bedingun gen tritt die abgespaltene Aminogruppe als Ammoniak auf, der nach Entfernung des überschüssigen Ninhydrins gemessen werden kann. Eine weitere Auswertungsmög lichkeit der Ninhydrinreaktion besteht in der Messung der abgespaltenen Kohlensäu re. b) Die qualitative Auswertung der Chromatogramme Zur qualitativen Auswertung der Chromatogramme diente uns die mit Nin hydrin auftretende Farbreaktion. Nach Verdampfung des grössten Teils des Phenols bei 100 C wurden die Chromatogramme unter Zuhilfenahme eines Zerstäubers mit einer 0,1 %igen Lösung von Ninhydrin in wassergesättigtem nbutanol bespritzt und 5 bis 10 Minuten bei 80 bis 100 C erhitzt womit die, Blaufärbung eintrat. Es ist vorteilhaft, die Blätter nach dem Erhitzen noch 12 bis 24 Stunden bei Zimmertem peratur hängen zu lassen, da hierdurch die Farbflecken an Intensität gewinnen, so dass auch in geringen Mengen vorkommende Aminosäuren noch festgestellt werden können. Das wichtigste Hilfsmittel zur Identifizierung der von den verschiedenen Amino säuren gebildeten Farbflecke ist die Unterschiedlichkeit der R_Werte (vgl. Seite 20). Es hat sich aber gezeigt, dass der ein und derselben Aminosäure nur be R^Wert dingt als charakteristische Konstante betrachtet werden darf, indem er in Abhängig keit vom Chemismus und der Konzentration des Lösungsmittels, vom ph und von andern Faktoren eine gewisse, wenn auch meist nur geringfügige Variabilität auf weist, eine Tatsache, die bei der Identifizierung der Aminosäuren einige Unsicher *) A.R. Patton(75) führt die Farbreaktion bei Zimmertemperatur durch, 18 bis 28 Stunden benötigt werden. Dieses Vorgehen ist vor allem bei Lösungen un wozu aber bekannter Zusammensetzung zu empfehlen, um zu verhindern, dass Aminosäuren, die ev. nur in Spuren vorhanden sind, bei der Erhitzung in Anwesenheit von Phenol zerstört werden.

29 28 heit schafft (G. N. Kowkabany (51), A. J. Landua (55) und ihre Mitarbeiter). Man darf immerhin erwarten, dass die Mehrzahl der Ursachen, die zu Schwankun gen der einzelnen R_,Werte führen, weitgehend ausgeschaltet werden, wenn man stets unter möglichst gleich bleibenden Bedingungen arbeitet. Da ausserdem diese Ursachen die verschiedenen R,Werte meist in gleicher Weise verändern, wird durch sie die relative Lage der einzelnen Aminosäureflecke kaum beeinflusst. Ein schränkend ist zu bemerken, dass eine durch Veränderung des ph bedingte Variabili tät der R_Werte nur bei den sauren und basischen Aminosäuren zur Geltung kommt, woraus sich, entgegen dem zuvor Gesagten, Verschiebungen in der relativen Lage der Flecke ergeben können, die nicht zu vernachlässigen sind. Im allgemeinen darf jedoch festgestellt werden, dass die meisten Aminosäuren auf Grund ihrer RFWerte bzw. auf Grund der gegenseitigen Lage ihre Flecke recht gut identifiziert werden können. Schwierigkeiten treten allerdings auf, wenn Eiweisskörper vorliegen, die 20 und mehr verschiedene Aminosäuren enthalten. c) Die quantitative Bestimmung der im Papier ehr omatogramm getrennt vorliegenden Aminosäuren Nicht lange nach der Veröffentlichung der grundlegenden Arbeit von R. Consden und Mitarbeitern (21) wurden Versuche zur quantitativen Auswertung des papierchromatographischen Trennungsverfahrens in Angriff genommen. Ein wichti ger Beitrag hierzu haben S. Moore und H.W. Stein(67) geleistet, indem sie die Reaktionsbedingungen, die zur Ninhydrinfärbung führen, untersuchten. Sie konn ten feststellen, dass bereits geringe Mengen Sauerstoff genügen, um das im Laufe der Reaktion entstehende Hydrindantin wieder zu Ninhydrin zu oxydieren, womit eine quantitative Farbstoffbildung verhindert wird. Durch Zusatz von Hydrindantin gelang es ihnen, diesen Oxydationseffekt zu kompensieren, so dass die zuvor beschriebene Kondensation mit dem abgespaltenen Ammoniak ungestört zustande kam. Statt Hy drindantin kann auch ein anderes Reduktionsmittel z.b. ZinnÜChlorid, zugesetzt werden. Nach den genannten Autoren erreicht die Farbreaktion zwischen ph 4,5 und 5,5 ein Maximum. Auf Grund ihrer Untersuchungen teilen S. Moore und H.W. Stein (67) folgende Arbeitsvorschrift für die Durchführung der Farbreaktion mit: Citratpuffer ph 5: 21,008 g 3 3 Citronensäure in 200 cm n NaOH lösen und auf 500 cm ergänzen. 3 Ninhydrinlösung: 0, 80 g SnCl, 2 H 0 in 500 cm Citratpuffer lösen und zu einer Lösung von 20 g Ninhydrin in 500 cm Methylcellosolve zugeben. Diese Lösung kann unter Stickstoff längere Zeit aufbewahrt werden.

30 29 Von der gepufferten Ninhydrinlösung werden 1 bis 2 cm zu der zu bestimmenden Aminosäurelösung in ein Reagenzglas gegeben und 20 Minuten im siedenden Wasser bad erhitzt. Nach dem Erkalten wird mit einem Gemisch von gleichen Teilen Propanol und Wasser verdünnt und bei 570 myu photometriert. S. Moore und H.W. Stein (67) bestimmten die Aminosäuren, die sie mit Hilfe einer Stärkesäule in Verbindung mit einem Fraktionensammler trennten, mit einer Genauigkeit von ± 1 %. A. J. Landua und J. Awapara (54) versuchten die Erfahrung von Moore und Stein in dem Sinne zu verwerten, dass sie das Reagens dieser zur quantitati ven Auswertung von Papierchromatogrammen verwendeten. Dabei zeigte es sich, dass bei direkter Anwendung der Ninhydrinlösung auf Papier ein hoher Blindwert auftritt, der eine befriedigende Auswertung verunmöglichte. R.A. Boissonnas (14) wies nach, dass der Papierblindwert ausschliesslich auf Adsorption von Am moniumionen der Luft zurückzuführen ist. Durch Behandlung des Papiers mit einer 1 %igen Lösung von KOH in Methanol werden diese Ammoniumionen entfernt, so dass kein Blindwert des Papiers mehr auftritt. Auch für den stets in Erscheinung tretenden Blindwert der Ninhydrinlösung sind in ihr enthaltene Ammoniumionen ver antwortlich. Die durch diese verursachte Farbstoffbildung erreicht nach Boisson nas bei ph 4, 7 ein Minimum. Er verwendet deshalb einen Acetatpuffer von ph 4,7 (1 Teil n NaOH + 1 Teil 2n Essigsäure). Boissonnas empfiehlt auch, die Reagenzien von Moore und Stein in geringerer Konzentration zu verwenden (0,5 % Ninhydrin und 0, 5 g SnCl, 2 H,0 pro Liter). Die Genauigkeit der von Boissonnas abgeänder ten Methode soll bei der Untersuchung von Eiweisshydrolysaten + 5 % betragen. Ein weiterer Versuch, das Reagens von Moore und Stein zur quantitativen Auswertung von Papierchromatogrammen einzusetzen, stammt von L. Fowden (39). Er ver wendet eine 4 %ige, mit Hydrindantin gesättigte Lösung von Ninhydrin in Methylcellosolve und eine Citratpufferlösung mit 0,16 % SnCL, 2 HgO im Verhältnis 1 : 1. Die Entfernung der Ammoniumionen aus dem Papier nimmt Fowden im Reagens glas vor, in welchem die ausgeschnittenen Aminosäureflecke über Nacht einer Alka libehandlung mit nachfolgender Neutralisation ausgesetzt werden. Die Genauigkeit die ser Methode wird mit i 5 % angegeben. A.M. Smith unda.h. Agiza (86) stellen schliesslich folgende drei verschie dene Lösungen her, die erst unmittelbar vor der Reaktion zu gleichen Teilen im Reagensglas gemischt werden: Citratpuffer nach Moore und Stein, Ninhydrinlösung: 550 mg Ninhydrin in 100 cm Citratpuffer Zinnchlorid: 0,5 g SnCl, in 250 cm3 Citratpuffer Auch dieses Reagens lässt sich für die quantitative Auswertung von Papierchromato grammen verwenden. In reiner Form ins Reagensglas gebrachte Aminosäuren sollen mit ihm mit einer Genauigkeit von t 1 bis 2 % bestimmbar sein. Nach unserem Dafürhalten erschien die Methode von R.A. Boissonnas

31 30 (14) für die quantitative Bestimmung von Aminosäuren im Anschluss an ihre papierchromatographische Trennung am besten geeignet zu sein. Sie besitzt den Vorteil, eine geringe Konzentration, d. h. verhältnismässig kleine Mengen des sehr teuren Ninhydrins zu benötigen; gleichzeitig ermöglicht sie, den Blindwert des Papiers auf einfachem Wege zu eliminieren. Wir konnten zudem beobachten, dass sich die mit dem Acetatpuffer versehene Lösung von Boissonnas bei Aufbewahrung weniger leicht blau färbt als die Ninhydrinlösung von Moore und Stein; unter Stickstoff ist sie monatelang haltbar. Indem wir uns grundsätzlich für die Methode von Boissonnas entschlossen, versuchten wir, die von ihm angegebene Farbreaktion direkt auf dem Papier durchzuführen; anderseits arbeiteten wir nach seiner Vorschrift im Reagens glas. aa) Die Ausführung der quantitativen Ninhydrinreaktion auf dem Papier Die direkte Ausführung der quantitativen Ninhydrinreaktion auf dem Papier ist mit grossen Messchwierigkeiten verbunden. Folgende Methoden sind hierfür vorgeschlagen worden: A. Polson und Mitarbeiter (77) chromatographierten neben der zu untersu chenden Aminosäuremischung eine Standardmischung bekannter Zusammensetzung in verschiedenen Verdünnungen ( spotdilution method). Ein Vergleich der Fleckengrösse und der Farbintensität des Versuchschromatogrammes mit dem Standardchromatogramm erlaubte es, den Aminosäuregehalt im Untersuchungsmaterial ab zuschätzen. Wie R.B. Fisher und Mitarbeiter (37) gezeigt haben, ist es auch möglich, eine quantitative Bestimmung auf Grund der Fleckengrösse allein auszu führen, da die Fläche der Flecke sich zum Logarithmus der Konzentrationen pro portional verhält. Verschiedentlich versuchte man eine direkte quantitative Auswertung der Chromatogramme in der Weise, dass die Aminosäureflecke auf dem Papier mit Hilfe ei nes Densitometers photometriert wurden ( R. J. Block (9), H.B. Bull und Mitarbeiter (18), R.R. Redfield undg.e.s. Bar r on (78), E. F. Mc Farren und J.A. Mills (59). Wie J. F. Thompson und Mitarbeiter (92) gezeigt haben, ist jedoch der Anwendungsbereich dieser Methode sehr beschränkt. Unsere Versuche, die Aminosäuren auf dem Papier quantitativ direkt zu be stimmen, haben zu keinen brauchbaren Ergebnissen geführt. Beispielsweise fan den wir mit Alanin sehr verschiedene Werte, je nachdem die Farbreaktion auf dem Papier oder im Reagenzglas erfolgte:

32 31 Extinktion (relative Werte) Farbreaktion auf dem Papier 100 Farbreaktion im Reagenzglas 65 In beiden Fällen wurde nach den Vorschriften von Boissonnas gearbeitet, wobei wir jedoch den Papierblindwert nicht mit Hilfe der von ihm empfohlenen KOHBehandlung, sondern in nachfolgend angegebener Weise eliminierten. Die Papierbogen wurden mit der Ninhydrinlösung von Boissonnas bespritzt und 15 Minuten im Trokkenschrank auf 90 C erhitzt. Die Farbflecke und zwei gleich grosse ungefärbte, zur Bestimmung des Papierblindwertes vorgesehene Zonen wurden dann ausgeschnitten, mit einem PyridinWasserGemisch extrahiert und photometriert. Da das Lösungs mittel beim Erhitzen ziemlich rasch eintrocknet, weshalb die Farbreaktion nur wäh rend einer kurzen Zeit vor sich gehen kann, wäre zu erwarten gewesen, dass die direkte Bestimmung auf dem Papier einen eher niedrigeren Wert ergeben würde als die Bestimmung im Reagenzglas. Eine einleuchtende Erklärung, warum unser Be fund im Gegensatz zu dieser Erwartung steht, vermögen wir nicht anzuführen. Die Vermutung, es könnte der höhere Wert bei der direkten Bestimmung dadurch zu standegekommen sein, dass bei dieser vermehrt, die Blaufärbung verstärkendes Ammoniak aus der Luft aufgenommen worden sei, fällt dahin, da dieser Einfluss durch die zuvor erwähnte Bestimmung des Blindwertes ebenfalls eliminiert wurde. Im Zusammenhang mit unserem Befund seien einige Ergebnisse von J. F. Thompson und Mitarbeiter (92) angeführt, die zeigen, dass sich Modifikationen im Erhitzen der Papierchromatogramme auf die quantitative Bestimmung verschie dener Aminosäuren unterschiedlich auswirken. Tabelle 6 Die Ninhydrinreaktion verschiedener Aminosäuren in Abhängigkeit Temperaturbehandlung des Papierchromatogrammes ( nach J.F. Thompson und Mitarbeiter) von der Relative Farbintensitäten Temperatur der trockenen Atmosphäre Temperatur der alkoholge sättigten Atmosphäre 40 C 60 C 80 C 60 C Alanin 1,000 0,942 0,737 0,696 Serin 1,000 8,811 0,508 1,061 Threonin 1,000 1,000 0,695 Glycin 1,000 1,046

33 32 Bemerkenswert ist das Ergebnis, wonach Alanin beim Erhitzen des Papier chromatogrammes in trockener Luft höhere, Serin dagegen niedrigere Werte ergab als beim Erhitzen in alkoholgesättigter Atmosphäre. J. F. Thompson und Mit arbeiter erklären diese Erscheinung damit, dass Alanin mit Ninhydrin wesentlich rascher reagiert als Serin, so dass die Beschränkung der Reaktionsdauer durch das Eintrocknen des Lösungsmittels beim Alanin weniger zur Geltung kommt als beim Serin. Im übrigen geht aus den von Thompson gewonnenen Daten hervor, dass beim Erhitzen des Papierchromatogrammes in trockener Atmosphäre die Farbbildung der geprüften Aminosäuren im allgemeinen umso schwächer ausfiel, je höher die ge wählte Temperatur war. Da das von Thompson und Mitarbeitern verwendete Sprüh mittel (0,5 %ige Ninhydrinlösung in Butanol) kein Reduktionsmittel enthielt, dürfte dieser Temperatureinfluss nicht nur infolge eines rascheren Eintrocknens der Lösung, sondern auch dadurch zustande gekommen sein, dass entstandenes Hydrindantin in Gegenwart von Luftsauerstoff bei höherer Temperatur vermehrt in das farblose Nin hydrin zurückoxydiert wurde. In unsern Versuchen mit der Lösung nach Boissonnas (14) scheinen höhere Temperaturen, d.h. Temperaturen zwischen 100 und 110 C die Farbbildung eher begünstigt als beeinträchtigt zu haben (Tabelle 7). Dass selbst Temperaturen um 110 C keine geringere Farbintensität zeitigten als Tempe raturen von 90 C, hing offenbar nicht nur damit zusammen, dass die Lösung von Boissonnas weniger rasch eintrocknet als die von Thompson verwendete, sondern auch damit, dass jene Lösung als Reduktionsmittel Zinnchlorid enthält (vgl. Seite 29). Tabelle 7 Die Ninhydrinreaktion in Abhängigkeit von der Erhitzungstemperatur des Papierchromatogrammes Relative Farbintensitäten (4 Wiederholungen) Temperatur Alanin Asparagii C ire Phenylalanin Lysin Um einem u. U. nachteilig wirkenden, vorzeitigen Eintrocknen des Lösungs mittels vorzubeugen, versuchten wir, die Papiere in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre zu erhitzen. Die Streifen wurden zu diesem Zweck in den Hals eines

34 33 grossen Erlenmeyerkolbens gehängt, in dem während der Erhitzung ständig Dampf entwickelt wurde. Um störendes Ammoniak zu binden, wurde in einer besondern Versuchsreihe dem Kolben etwas Schwefelsäure zugesetzt. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle 8. Tabelle 8 Die Ninhydrinreaktion in Abhängigkeit trockenen bzw. feuchtenerhitzens der Blätter Relative Werte (5 Wiederholungen) Art des Erhitzens Alanin Asparaginsäure Phenylalanin Lysin Trocken (ca. 100 C) Dampf Dampf+ H2S Mit Ausnahme des Lysins liegen die Relativwerte aller Aminosäuren beim Er hitzen im Dampf höher als bei trockener Behandlung. Der Zusatz von HgSO. lässt durchwegs eine Reduktion der nach Danjpfbehandlung erhaltenen Daten erkennen. Allgemein war festzustellen, dass unsere auf die direkte Bestimmung Bezug nehmenden Ergebnisse eine sehr grosse Streuung aufwiesen und nur schlecht repro duzierbar waren. Oft traten unerklärliche Werte auf, so dass wir uns schliesslich veranlasst sahen, die Voruntersuchungen über die quantitative Auswertung der Nin hydrinreaktion auf dem Papier aufzugeben. Wie J.F. Thompson und Mitarbei ter (92) später zeigen konnten, kann die Ninhydrinreaktion auf dem Papier nur dann quantitativ gestaltet werden, wenn das Erhitzen unter völligem Ausschluss von Sauer stoff in einer mit Alkohol gesättigten Kohlensäureatmosphäre erfolgt. Sie haben zu diesem Zweck eine entsprechende Apparatur entwickelt und damit gute Resultate er zielt. bb) Die Ausführung der Ninhydrinreaktion im Reagenzglas Bei der Ausführung der Ninhydrinreaktion im Reagenzglas folgten wir mit weni gen Abweichungen den zu Beginn dieses Abschnittes (vgl. Seite 29) diskutierten Vor schriften von R.A. Boissonnas (13, 14). In Abweichung von diesen wurden je doch die Blätter nach der zweidimensionalen Trennung der Aminosäuren nicht mit einem Stempel bedruckt (vgl. S. 44), sondern mit einer 0,1 %igen Ninhydrinlösung in Butanol besprüht und so lange im Trockenschrank erhitzt, bis die Aminosäure flecke ganz schwach sichtbar waren und umrandet werden konnten. Zwecks Eliminie

35 34 rung des Blindwertes wurden die Blätter, der Vorschrift von Boissonnas folgend, mit einer 1 %igen KOHLösung in wasserfreiem Methanol bespritzt und 15 Minuten bei 45 C getrocknet. Hierdurch lässt sich der auf die Anwesenheit von Ammonium ionen im Papier zurückzuführende Blindwert vollständig eliminieren, was aus den in Tabelle 9 angeführten, auf reinem Papier gewonnenen Ergebnissen erkannt werden kann. Tabelle 9 Die Eliminierung des Blindwertes nach der Methode von Boissonnas in reinem Papier Erhitzungstemperatur Dauer der Erhitzung Extinktionskoeffizient 0 C Minuten (Mittelwert aus 5 Bestimmungen) , , (erst nach 4 Stun 0,111 den gemessen) Blindwert der Ninhydrinlösung 0,109 Wie Tabelle 9 zeigt, war die Eliminierung des Papierblindwertes auch dann noch wirksam, wenn die Blätter nach der Behandlung noch längere Zeit der Luft ausge setzt wurden. Auch in diesem Fall war kein Anstieg des Blindwertes zu beobachten. Im Gegensatz zu dem Ergebnis der Tabelle 9 gelang es bei der zweidimensio nalen Trennung der Aminosäuren aus Hefehydrolysaten nur ausnahmsweise, den Papierblindwert durch KOHBehandlung dem Lösungsmittelblindwert anzugleichen, weshalb es sich als notwendig erwies, aus jedem Chromatogramm drei Papierstükke zur Bestimmung einer Blindwertkorrektur auszuschneiden. Leider zeigte es sich, dass zwischen den Blindwerten dieser 3 Stücke oft ziemlich grosse Abweichungen auftraten, wodurch die Genauigkeit der photometrischen Bestimmung beeinträchtigt wurde. Bei der Ninhydrinreaktion im Reagenzglas gingen wir, wie folgt, vor: Die Reagenzgläser mit den ausgeschnittenen Aminosäureflecken und zwei leere Glä 3 ser zur Bestimmung des Blindwertes des Reagens werden mit je 5 cm Ninhydrinlö sung versehen. Nachdem man sich vergewissert hat, dass die Papierstücke voll ständig in die Reagenslösung eintauchen, werden die Gläser mit Glashütchen zu gedeckt und 20 Minuten im siedenden Wasserbad erhitzt. Nach sofortigem Abkühlen 3 werden 5 cm einer WasserPropanolmischung im Verhältnis 1 : 1 zugegeben. Es folgt gutes Schütteln oder besser mehrmaliges Kippen, worauf in einem Spektrophotometer (wir verwendeten ein BeckmannInstrument) bei 570 m u. (Prolin 440 mu. ) die Extinktion der Lösung gegen Wasser gemessen wird.

36 35 Da bei der Reaktion mit Ninhydrin die verschiedenen Aminosäuren je Mol nicht die gleiche Farbintensität geben, musste für jede einzelne ein Eichwert bestimmt werden. Die zu diesem Zwecke hergestellten Standardlösungen enthielten 0,1 Mikromo 3 le in 5 mm. Als Lösungsmittel diente nach R. J. Block (10) 10 %iger Isopropylalkohol. Schwerlösliche Aminosäuren, wie Cystin, Tyrosin und Glutaminsäure, wur den durch Ansäuern mit Salzsäure oder durch stärkere Verdünnung in Lösung ge bracht. Zur Beseitigung des Blindwertes wurden die in Mengen von 0,1 bis 0,3 Mikromolen auf das Papier aufgetragenen Aminosäureflecke mit 1 %iger Kalilauge in Methanol behandelt (vergl. Seite 34). Anschliessend wurden die Flecke ausgeschnitten und im Reagenzglas nach der oben beschriebenen Methode verarbeitet. Auf diese Weise erhielten wir die in Tabelle 10 wiedergegebenen Extinktions koeffizienten. Nach einem Vorschlag von S. Moore und W.K. Stein (67) wur den die Extinktionskoeffizienten der Aminosäuren auf denjenigen von 0,1 Mikromole Leucin gleich 1 bezogen (Tabelle 10, 2. Kolonne). Tabelle 10 Die absoluten und relativen Extinktionskoeffizienten der Aminosäuren Extinktions Relative Werte (Extinktionskoeffizient von koeffizient Leucin 1) = für 0,1 Mi eigene Moore Boissonnas Smith kromole Arbeit und Stein und Agiza Alanin 0,205 1,00 1,01 1,01 0,85 <* Aminobuttersäure 0,202 0,99 jf Aminobuttersäure 0,192 0,94 1,00 Arginin 0,182 0,89 1,00 1,08 0,88 Asparaginsäure 0,184 0,90 0,88 0,93 0,86 Citrullin 0,220 1,08 1,03 Cystin 0,200 0,98 1,04 0,79 Glutaminsäure 0,190 0,93 1,05 0,93 0,89 Glycin 0,204 1,00 1,01 1,00 1,00 Histidin 0,184 0,90 1,04 0,95 0,88 Isoleucin 0,204 1,00 1,00 1,00 1,00 Leucin 0,204 1,00 1,00 1,00 1,00 Lysin 0,228 1,12 1,12 1,09 0,90 Methionin 0,206 1,01 1,00 1,00 0,88 Ornithin 0,273 1,34 Phenylalanin 0,194 0,95 0,88 0,94 0,93 Prolin 0,051 0,25 0,26 Serin 0,200 0,98 0,94 0,95 0,96 Threonin 0,192 0,94 0,92 0,94 0,81 Trytophan 0,143 0,70 0,72 0,73 0,89 Tyrosin 0,186 0,91 0,88 0,90 0,89 Valin 0,208 1,02 1,02 1,00 0,81 Asparagin 0,184 0,90 0,94 Glutamin 0,210 1,03 0,99

37 36 1 Ein Vergleich unserer in Tabelle 10 angeführten Relativwerte mit den Werten von Moore und Stein sowie mit denen von Boissannas lässt für alle Amino säuren ausser für Arginin eine recht gute Uebereinstimmung erkennen. Grösser ist die Anzahl der ins Gewicht fallenden Differenzen, die sich zwischen unsern Relativ werten und denjenigen von A.M. Smith und H.H. Agiza (86) ergaben. Diese sind auf Grund einer Methode ermittelt, die von den ursprünglichen, auf S. Moore und W. H. Stein (67) zurückgehenden Vorschriften ziemlich abweicht. Wie der Zusammenstellung in Tabelle 11 entnommen werden kann, liegt die Ge nauigkeit der kolorimetrischen Ninhydrinmethode, wenn einzelne Aminosäuren in rei ner Form vorliegen und wenn nach der zuvor angeführten Vorschrift im Bereich von 0,2 Mikromolen gearbeitet wird, zwischen und ± 2 %. Tabelle 11 Die Versuchsfehler bei der kolorimetrischen Bestimmung einzelner Aminosäuren nach der Ninhydrinmethode Extinktion (Mittel aus 10 Bestimmungen) Standardabweichung in % des Mittelwertes Alanin 0,410 1,97 Glutaminsäure 0,380 1,76 Leucin 0,408 1,53 Lysin 0,456 2,09 R.A. Boissonnas (14) gibt für seine im Bereich von 0,1 bis 0, 5 Mikro molen durchgeführten Versuche eine Genauigkeit der kolorimetrischen Ninhydrinme thode von + 1 % an. Wie bereits erwähnt (Seite 33), können auch mit der direkten Bestimmung auf dem Papier gut reproduzierbare Werte gefunden werden, sofern, wie dies J. F. Thompson und Mitarbeiter (92) taten, die Farbreaktion in anaerober CO,Atmos phäre durchgeführt wird. Die genannten Autoren fanden die in Tabelle 12 zusammen gestellten Versuchsfehler.

38 37 Tabelle 12 Die Versuchsfehler bei der Ausführung der Ninhydrinreaktion auf dem Papier nach J.F. Thompson und Mitarbeiter Standardabweichung in % des Mittelwertes Glutaminsäure 2,34 Serin 0,97 Glycin 2,20 Threonin 1,75 Alanin 1,68 Leucin 2,40 A.M. Smith und H.H. Agiza (86) bestimmten die Aminosäuren auf dem Pa pier mit einer Genauigkeit von 1 bis 3 %. Wie im folgenden Abschnitt dargelegt werden soll, können die bei zweidimen sionaler Chromatographie aufgetragenen Aminosäuren nie vollständig wiedergefun den werden; es bleiben von Aminosäure zu Aminosäure wechselnde Anteile im Pa pier zurück. Dies hat zur Folge, dass die in Tabelle 10 angeführten Extinktions koeffizienten (Spalte 1) nicht direkt als Eichwerte benützt werden können. Sie mussten gemäss den in Tabelle 13, Seite 38, Spalte 2, gemachten Angaben korrigiert werden. cc) Die AdsorptionsVerluste im Papier. Bei einer ein oder gar zweidimensionalen Entwicklung der Aminosäuren tre ten im Papier regelmässig Adsorptionsverluste auf. Die Grösse dieser Verluste variiert von einem Chromatogramm zum andern. Dies hat besonders bei der zwei dimensionalen Chromatographie grosse Streuungen zur Folge, da bei dieser Metho de die für einen Mittelwert notwendigen Einzelbestimmungen nicht auf dem gleichen Blatt durchgeführt werden können. Exaktere quantitative Bestimmungen sind in der Papierchromatographie dann möglich, wenn, was nur bei der eindimensionalen Chro matographie möglich ist, neben der Analysenlösung gleichzeitig eine Standardlösung mit entwickelt werden kann. Die von uns mit verschiedenen reinen Aminosäuren nach zweidimensionaler Entwicklung mit Butanol und Phenol erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 13 zusam mengestellt (Seite 38). Wie aus Tabelle 13 hervorgeht, wurden nach zweidimensionaler Entwicklung 85 bis 97 % der aufgetragenen reinen Aminosäuren wiedergefunden. Weniger als 90 % fanden wir bei folgenden Aminosäuren: Aminobuttersäure, Arginin, Histidin, Lysin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Glutamin.

39 38 Tabelle 13 Die Genauigkeit der kolorimetrischen Ninhydrinmethode nach zweidimensionaler Entwicklung reiner Aminosäuren enge: 0,2 Mikromole. Mittel aus 5 Bestimmungen) Extinktions Wiedergefundene Standardabweichung koeffizient Menge in % in % des Mittelwerts Alanin <X Aminobuttersäure % Aminobuttersäure Arginin Asparagins äure Citrullin Cystin Glutaminsäure Glycin Histidin Isoleucin Leucin Lysin Methionin Ornithin Phenylalanin Prolin Serin Threonin Tryptophan Tyrosin Valin Glutamin Asparagin 0,399 97,2 3,77 0,380 94,0 3,84 0,340 88,6 5,27 0,321 88,3 5,37 0,335 91,1 2,88 0,408 92,8 3,38 0,362 90,4 4,67 0,349 91,9 3,44 0,383 93,8 6,25 0,320 87,0 4,93 0,383 93,9 4,17 0,390 95,6 5,53 0,393 86,2 8,09 0,387 93,9 4,12 0,524 95,9 3,98 0,362 93,4 4,53 0,093 91,0 5,14 0,356 89,0 3,37 0,329 85,7 6,06 0,255 89,3 4,21 0,315 84,6 7,31 0,386 92,8 4,88 0,374 89,1 5,47 0,333 90,5 8,23 Die verhältnismässighohen Verlust an basischen Aminosäuren werden durch die bei diesen Aminosäuren häufig vorkommende unscharfe Fleckenbildung bedingt. Auch J.F. Thompson und F.C. Steward (93) haben grosse Verluste an Threonin und Serin beobachtet; sie führen sie darauf zurück, dass diese Hydroxysäuren stark hydrophile Eigenschaften besitzen und deshalb stärker als die andern Aminosäuren in der WasserZellulosePhase haften bleiben. Wie aus Tabelle 13 weiterhin ersichtlich ist, liegt die Standardabweichung zwi schen 2,88 % und 8, 23 %. Eine Abweichung von über 5 % weisen Y Aminobuttersäu re, Arginin, Glycin, Leucin, Lysin, Prolin, Threonin, Tyrosin, Glutamin und Asparagin auf. Ausführliche Untersuchungen über die Genauigkeit der Aminosäurebestimmung und die Verluste an Aminosäuren bei ein und zweidimensionaler Chromatographie sind von L. Fowden (38) ausgeführt worden. Nach eindimensionaler Entwicklung

40 39 mit Phenol hat dieser Autor 98 % der aufgetragenen Menge wiedergefunden, nach zweidimensionaler mit Phenol und ButanolEisessig 92 %. In einer weiteren Arbeit berichtet L. Fowden (39), dass bei sachgemässer Behandlung der eindimensio nalen Phenolchromatogramme 89 bis 101 % der aufgetragenen Mengen (8 mg < Aminostickstoff) wiedergefunden werden konnten, wobei die Standardabweichung zwischen 0,8 % und 4,2 % lag. Einzig Glutamin, Histidin und Lysin fielen durch be sonders schlechte Ausbeute auf. Bei Verwendung von nur 2 mg OCAminostickstoff fand L. Fowden 92 bis 102 % der aufgetragenen Mengen verschiedener Aminosäuren wieder, wobei die Standardabweichung innerhalb 1 und 5,9 % lag. Bei zweidimensionaler Chromatographie ergaben sich aus L. Fowdens Unter suchungen die in Tabelle 14 wiedergegebenen Verhältnisse. Tabelle 14 Die Versuchsfehler bei der zweidimensionalen Chromatographie (Nach L. Fowden) Wiedergefundene Menge (Mittel aus 8 Bestimmungen) Standardabweichung in % des Mittelwertes Arginin 100 5,6 Leucin 96 3,8 Valin 96 3,4 Phenylalanin 93 4,5 Alanin 99 2,0 Threonin 100 2,4 Glycin 102 7,6 Serin 102 6,6 Glutaminsäure 92 2,2 Asparaginsäure 95 3,8 Was die wiedergefundenen Mengen betrifft, so zeigen unsere in Tabelle 13 an geführten Werte im Vergleich zu den von L. Fowden gefundenen beträchtlich nach un ten gehende Abweichungen für die Aminosäuren Arginin, Glycin, Serin und Threonin. Besser ist ganz allgemein die Uebereinstimmung der Standardabweichungen. Die in unseren Versuchen nach zweidimensionaler Entwicklung festgestellten Verluste von bis zu 15 % können entweder durch Adsorption der betreffenden Amino säuren im Papier oder durch deren Kontakt mit den Lösungsmitteln zu stände gekom men sein. Nach den Angaben von L. Fowden (39) sowie von J. F. Thompson und F.C. Steward (93) sind allerdings bei Verwendung von Phenol keine oder nur ganz geringe Kontaktverluste nachweisbar. L. Fowden gelangt ausserdem zum Schluss, dass die Menge der wiedergefundenen Aminosäuren unabhängig von der zurückgelegten Strecke sei, d.h., dass während des Laufes von denwandernden Aminosäuren keine Reste

41 40 im Papier zurückbleiben. Im Gegensatz dazu stellen J.F. Thompson und F. C. Steward (93) nach eindimensionaler Entwicklung mit Phenol grosse Verluste fest (Tabelle 15). Tabelle 15 Aminosäureverluste bei eindimensionaler Entwicklung der Chromatogramme in Phenol (Nach J.F. Thompson und F.C. Steward) Wiedergefundene Menge in % Glutaminsäure 88 Threonin 84 Alanin 87 Serin 88 Leucin 92 Indem Thompson und Steward die Verluste je zurückgelegte Wegeinheit berech neten (Tabelle 16), gelangten sie zum Schluss, dass diese Verluste zum weitaus grössten Teil durch Adsorption verursacht wurden. Tabelle 16 Prozentuale Verluste an Aminosäuren pro cm zurückgelegtem Weg (Nach J.F. Thompson und F.C. Steward) Lösungsmittel Behandlung Glutaminsäure Threonin Alanin Leucin Serin 1,78 1,43 0,39 0,67 1,07 Phenol Phenol Säure 0,37 0,62 0,08 0,30 0,42 Phenol Wasser 0,41 0,71 0,18 0,67 0,55 Es wird angenommen, dass die Adsorptionsverluste unter anderem durch Qxydationsprodukte des Phenols, vor allem aber durch im Papier enthaltene wasserlösli che Substanzen verursacht werden. Indem das Papier gewaschen wird, wobei jedoch ein nachheriges Puffern der Blätter erforderlich ist, werden die Verluste auf ein Mini mum beschränkt. Unsere eigenen Untersuchungen zur Frage der Adsorptionsverluste im Papier ergaben folgendes:

42 41 Valin, Leucin und Methlonin wurden mit ButanolEisessigWasser, dessen Front 35 cm zurücklegte, eindimensional entwickelt. Um anders geartete Verluste zu vermeiden, wurde die Lokalisation an Hand von Parallelstreifen durchgeführt. Ausser den Flecken wurden auch die zurückgelegten Strecken auf das Vorhandensein von Aminosäuren geprüft. Das Ergebnis dieser Untersuchung geht aus Tabelle 17 hervor. Wie die in Tabelle 17 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, waren die Adsorp tionsverluste bei Verwendung von Butanol im allgemeinen wesentlich kleiner, als sie von J.F. Thompson und F.C. Steward (93) mit Phenol allein gefunden wurden. Der Blindwert der Laufstrecken erscheint gegenüber dem Blindwert des Papieres nicht erhöht, was bedeutet, dass auf der Laufstrecke zurückgebliebene Aminosäuren nicht nachgewiesen werden konnten. Tabelle 17 Die Verluste an Aminosäuren im Papier nach eindimensionaler Entwicklung im Butanol (Aufgetragene Menge: 0,2 Mikromole. Mittel aus 5 Bestimmungen) Extinktion Wiedergefun Verlust pro cm Weg Blindwert der dene Menge Laufstrecke in % % % des Papierblindwertes Valin 0,410 98,5 0,10 96 Methionin 0,389 94,5 0, Leucin 0,389 95,4 0, Ein zweiter Versuch wurde mit Phenol als Lösungsmittel durchgeführt. Wir trugen 0, 2 Mikromole Valin in vierfacher Wiederholung auf und Hessen das Lösungs mittel 30 cm laufen. Unmittelbar nach beendetem Lauf wurde die gleiche Menge Va lin wieder in vier Punkten auf das noch feuchte Blatt aufgetragen, ohne sie laufen zu lassen. Die unter sonst gleichen Bedingungen durchgeführten Messungen ergaben die in Tabelle 18 enthaltenen Daten.

43 42 Tabelle 18 Durch den Lauf verursachte Valinverluste Vor dem Lauf aufgetragen Nach dem Lauf aufgetragen Extinktion Wiedegefundene Extinktion Wiedergefundene Menge in % Menge in % 0,394 94,7 0,408 98,0 Auch Tabelle 18 lässt einen nur geringen Adsorptionsverlust erkennen. Die ge fundene Differenz von 3,3 % entspricht einem Adsorptionsverlust von 0,14 % je cm zurückgelegten Weges. Zusammenfassend geht aus unseren Untersuchungen hervor, dass wohl Ad sorptionsverluste auftreten, wobei diese aber nicht so gross waren, dass die im Pa pier zurückgebliebenen Aminosäuren sich photometrisch nachweisen Hessen. In kei nem Falle überstiegen die Verluste bei den von uns untersuchten Aminosäuren 0,50 % pro cm zurückgelegten Weges. dd) Die Verluste bei der Entfernung der Lösungsmittel Im allgemeinen herrscht die Tendenz, bei der Papierchromatographie leicht flüchtige Lösungsmittel zu verwenden, die mühelos und ohne Verluste an Aminosäu ren zu verursachen, aus dem Papier entfernt werden können. Das einzige schwerer flüchtige Lösungsmittel, für das bis jetzt kein ebenbürtiger Ersatz gefunden werden konnte, ist das Phenol, dessen Entfernung aus dem Papier besondere Vorsichtsmassnahmen erfordert, wenn Verluste möglichst vermieden werden sollen. Solche entste hen vor allem dann, wenn die Blätter, um das Lösungsmittel zu entfernen, auf über 50 C erhitzt werden. Anderseits stört, wie Tabelle 19 zeigt, nicht entferntes Phenol die Farbreaktion im Reagenzglas. Tabelle 19 Der Einfluss des Phenols auf die Ninhydrinreaktion im Reagenzglas (Aufgetragene Menge: 0,2 Mikromole. Mittel aus 5 Bestimmungen) Phenol nicht entfernt Phenol entfernt Extinktion Extinktion absolut in % des Eichwertes absolut in % des Eichwertes Leucin 0, , Valin 0, , Phenylalanin 0, , Tyrosin 0, ,364 98

44 43 Wenn Phenol im ersten Lauf verwendet wird, ist seine Entfernung notwendig, um den zweiten Lauf nicht zu stören; wenn es im zweiten Laufe Anwendung findet, muss es eliminiert werden, damit keine Beeinträchtigung der Farbreaktion im Reagenzglas auftritt. Die Entfernung des Phenols kann auf verschiedene Weise erfolgen. Am ein fachsten lässt sie sich bewerkstelligen, indem man die Blätter bei Zimmertempera tur hängen lässt; doch dauert es 48 Stunden und länger, bis sich alles Phenol ver flüchtigt hat. L. Fowden (39) findet nach der Trocknung phenolhaltiger Blätter während einer Stunde bei 80 C nur noch 75 % der aufgetragenen Aminosäuren wieder und schlägt vor, um Verluste zu vermeiden, die Blätter bei Zimmertemperatur vor zutrocknen und dann das restliche Phenol mit Aether auszuwaschen. R. A. B o i s sonnas (12) entfernt das Phenol, indem er die Blätter während 10 Minuten auf 60 C erhitzt und anschliessend mit Aether auswäscht. In den nach dieser Vorschrift behan delten Chromatogrammen konnten wir mit Ferrichlorid noch beträchtliche Mengen an Phenol nachweisen. A.M. Smith unda.h. Agiza (85) entfernen das Phe nol, indem sie zwei Stunden bei Zimmertemperatur trocknen und anschliessend wäh rend vier Minuten auf 80 C erhitzen. Auch in den nach diesem Verfahren behandel ten Blättern konnten wir jedoch noch Phenol feststellen. Da das Auswaschen der Blätter mit Aether eine die Aminosäuren schonende Mass nahme darstellt, versuchten wir es in der Weise durchzuführen, dass wir die Pa pierbogen, nachdem sie bei 50 C vorgetrocknet worden waren, drei bis viermal unter einem Glasstab durch die mit Aether beschickte Chromatographierküvette durchzogen. Das Phenol liess sich aber auf diese Weise nicht vollständig entfernen, da die Aethermenge in den Küvetten zu gering war. Hingegen gelang es uns, das Phe nol rasch und ohne die Bestimmung der Aminosäuren zu beeinträchtigen dadurch zu entfernen, dass wir die Blätter dämpften. Es genügt schon, die Blätter in der Kapelle drei bis vier Stunden über ein Gef äss mit siedendem Wasser zu hängen. Bei diesem Vorgehen besteht jedoch die Gefahr, besser, verflüchtigt. dass die Blätter zu nass werden. Es ist deshalb sie direkt heissem Dampf auszusetzen, wobei sich das Phenol in kurzer Zeit Von den auf ein phenolhaltiges Papier aufgetragenen und heissem Was serdampf ausgesetzten Aminosäuren wurden im Mittel von fünf Bestimmungen die in Tabelle 20 angeführten Mengen wiedergefunden.

45 44 Tabelle 20 Der Einfluss der Heisswasserdampfbehandlung auf die Ergebnisse der chromatogra phischen Aminosäurebestimmung Es wurden wieder gefunden % Valin 99,7 Leucin 102,3 Phenylalanin 98,2 Methionin 100,5 Tryptophan 97,9 Die Werte der Tabelle 20 lassen erkennen, dass die Behandlung der Chromatogramme mit heissem Wasserdampf, die zu einer vollständigen Entfernung des Phenols führt, keine wesentlichen Verluste an Aminosäuren verursacht. Für unse re Untersuchungen wurde deshalb dieses Verfahren gewählt. ee) Der Einfluss der Lokalisationsmethode auf das Ergebnis der papierchromatographischen Aminosäurebestimmung Bei der quantitativen Auswertung eindimensionaler Chromatogramme lässt sich die Lage der Aminosäuren mit Hilfe eines Parallelchromatogrammes leicht feststellen, wobei man die Aminosäuren ohne irgendwelche weitere Beeinflussung aus dem Papierbogen ausschneiden kann. Bei zweidimensionalen Chromatogrammen müssen die Aminosäuren vor dem Ausschneiden irgendwie sichtbar gemacht werden, was meistens mit Hilfe einer verdünnten Ninhydrinlösung geschieht. Da aber die Farbreaktion auf dem Papier nicht streng quantitativ verläuft, so treten bei dieser Methode Verluste auf. Indem eine möglichst verdünnte Ninhydrinlösung verwendet wird, lassen sie sich auf ein Minimum beschränken. A.J. Landua und J. Awapara (54) empfehlen für die Lokalisierung der Aminosäureflecken eine 0,05 %ige Ninhydrinlösung. A. M. Smith und A. H. Agiza (85) arbeiten mit einer 0,1 %igen Lösung und erhitzen auf 80 C während zwei Minuten. R.A. Boissonnas (13) bringt mittels eines mit zahlreichen Me tallspitzen versehenen Stempels eine 3 %ige Ninhydrinlösung in einem Gemisch von tertiärem Butanol, Glyzerin und Wasser auf das Papier. Nach dieser Behandlung ge nügt es, die Blätter während einiger Sekunden über einem Infrarotstrahler zu erhitzen, um die Aminosäureflecken durch einzelne kleine Punkte kenntlich zu machen. Die durch dieses Lokalisationsverfahren zerstörte Aminosäuremenge soll weniger als 1 % betragen. Eine weitere Möglichkeit der Lokalisation besteht darin, dass die

46 45 Blätter 10 bis 15 Minuten bei 100 C erhitzt und alsdann ultraviolett bestrahlt werden, wobei die Aminosäuren als fluoreszierende Flecke erscheinen. Da die verhältnis mässig hohe Temperatur zu Verlusten führen kann und da schwache Aminosäure flecke oft nicht erkannt werden können, ist der Anwendungsbereich dieser Methode beschränkt. A. Pereira und J.A. Serra (76) bestimmten immerhin nach die sem Verfahren verschiedene Aminosäuren in minimalen Mengen quantitativ. L. Fowden (39) der ebenfalls nach dieser Methode arbeitete, fand, obschon er 15 Mi nuten bei 100 C erhitzte, keine messbaren Verluste. In unseren Versuchen verwendeten wir zur Lokalisation eine 0,1 %ige Ninhydrinlösung und erhitzen die Blätter bei 80 eben sichtbar wurden. C solange, bis die Aminosäureflecke 4. Zusammenfassende Beschreibung der verwendeten quantita tiven, zweidimensionalen Papier ehr omatographie Die in den vorhergehenden Abschnitten gemachten Ausführungen haben gezeigt, dass bei der quantitativen Auswertung zweidimensionaler Chromatogramme Schwie rigkeiten auftreten. Um diese nach Möglichkeit auszuschalten, hat sich auf Grund unserer Vorversuche das folgende Vorgehen als zweckmässig erwiesen: 1. Zweidimensionale Trennung der Aminosäuren mit den beiden Lösungsmittelpaa ren (Seite 23): 1. Lauf: nbutanoleisessigwasser 1. Lauf: tert. ButanolMethyläthylketon 2. Lauf: PhenolWasser oder 2 JSftert. ButanolMethanolWasser Die Entfernung des Phenols muss besonders vorsichtig erfolgen, sollen Amino säureverluste vermieden werden. Als sehr schonend und trotzdem wirksam hat sich die Behandlung der Chromatogramme mit heissem Dampf erwiesen (Seite 43). 2. Zwecks Lokalisation der Aminosäuren werden die Chromatogramme mit einer 0,1 %igen Ninhydrinlösung besprüht und anschliessend kurz auf 80 C erhitzt (vergl. oben). 3. Um den Blindwert der Papiere zu eliminieren, genügt es in der Regel, wenn die Blätter gleichmässig mit einer 1 % KOHLösung in Methanol bestäubt und wäh rend 15 Minuten bei 45 C getrocknet werden; bei der Analyse des Hefehydrolysates erweist es sich als notwendig, aus jedem Chromatogramm drei Papierstücke auszuschneiden, um mit diesen eine Blindwertkorrektur zu bestimmen (Seite 34).

47 46 4. Die ausgeschnittenen Aminosäureflecke werden zusammen mit 5 cm gepufferter Ninhydrinlösung nach R.A. Boissonnas in Reagenzgläser gegeben und wäh rend genau 20 Minuten im siedenden Wasserbad erhitzt. Alsdann werden die Glä 3 ser sofort im kalten Wasser gekühlt, worauf man die Lösungen mit 5 cm eines PropanolWasserGemisches verdünnt und photometriert; sungsmittels wird in gleicher Weise bestimmt (Seite 34). der Blindwert des Lö 5. Da bei der zweidimensionalen Entwicklung nicht zu vernachlässigende Verluste an Aminosäuren auftreten, müssen die Eichwerte der einzelnen Aminosäuren entspre chend korrigiert werden (Seite 38).

48 47 D. DIE ERGEBNISSE 1. Der qualitative Aminosäurenachweis in der Hefe Vorerst wurde sowohl die alkohollösliche (vergl. Seite 16) als auch die alkohol unlösliche Fraktion der Hefe nach den in Abschnitt C beschriebenen Methoden quali tativ auf das Vorkommen der verschiedenen Aminosäuren untersucht. Einen zusam menfassenden Ueberblick über das Ergebnis dieser Untersuchung vermittelt Abbil dung 1, Seite 48. a) Die Aminosäuren im Alkoholextrakt Ueber die im nichthydrolysierten Alkoholextrakt enthaltenen, freien Amino säuren gibt Abbildung 2, Seite 49, Auskunft. Mit Ausnahme von Cystin, Histidin, Methionin und Tryptophan erwiesen sich sämtliche Aminosäuren, die im Hefeprotein selbst festgestellt wurden, auch als frei vorkommend; es betrifft dies Alanin, Arginin, Glutaminsäure, Glycin, Leucin, Isoleucin, Lysin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tyrosin und Valin. Zusätzlich wurden im Extrakt noch folgende stickstoff haltige Verbindungen gefunden: ß Alanin, o( Aminobuttersäure, Y Aminobuttersäure, Citrullin, Ornithin, ausserdem die beiden Amide Asparagin und Glutamin so wie das Tripeptid Glutathion. Dazu kamen zwei unbekannte Flecke, nämlich Nr. 27 und Nr. 28 der Abbildung 1. Abbildung 3, Seite 49, gibt Aufschluss über die Aenderungen, die infolge der Hydrolyse des Alkoholextraktes eintraten. Die beiden Amide Asparagin und Gluta min wurden in die entsprechenden Säuren umgewandelt, während sich das Glutathion in seine drei Bestandteile Cystin, Glutaminsäure und Glycin auflöste. Mit Hilfe der Papierchromatographie sind in pflanzlichen Geweben neben den seit langem bekannten, am Aufbau der Proteine beteiligten Bausteine eine ganze An zahl weiterer, meist nur frei auftretender Aminosäuren gefunden worden. Ebenso hat sich ergeben, dass zahlreiche Aminosäuren, deren Vorkommen vor der Anwendung der Chromatographie als sehr selten betrachtet wurde, allgemein verbreitet sind. Das/3 Alanin, das dieser Gruppe angehört, ist in neuerer Zeit häufig nachgewiesen worden. R.G. Westall (97) fand es in den Wurzeln von Beta vulgaris, A.C. Hulme und W. Arthington (46) isolierten es aus Aepfeln, ferner W. Stepka und Mitarbeiter (91) aus Grünalgen. Im nichthydrolysierten Extrakt der Hefe konn ten wir es kaum feststellen; es trat aber nach der Hydrolyse wesentlich deutlicher in Erscheinung, was wir nicht mit Sicherheit begründen können. ß> Alanin ist meistens

49 4 1 I ' 48 Phenol o o 1=9 14/15 o17/25 16 o o 13 3 O 23 ol8 08 oll 27 ol o2 o 24»22 o7»12 o21 26 o i i i i.. Butanol 0.1 0,2 0,3 0,4 0,5 0, ,8 Abbildung 1 Karte der in der Hefe nachgewiesenen Aminosäuren nach zweidimen sionaler Trennung mit Butanol und Phenol. 1 Alanin 2 /a Alanin 3 o«. Aminobuttersäure 4 jf Aminobuttersäure 5 Arginin 6 Asparaginsäure 7 Asparagin 8 Citrullin 9 Cystin 10 Glutaminsäure 11 Glutamin 12 Glycin 13 Histidin 14 Isoleucin 15 Leucin 16 Lysin 17 Methionin 18 Ornithin 19 Phenylalanin 20 Prolin 21 Serin 22 Threonin 23 Tryptophan 24 Ty rosin 25 Valin 26 Glutathion 27 Homoserin? 28 Unbekannt

50 49 (0 S O I * Butanol Abbildung 2 Verteilung der im nichthydrolysierten Alkoholextrakt enthaltenen frei en Aminosäuren. # Ab sr (D 3 O Jk Butanol Abbildung 3 Verteilung der Aminosäuren im hydrolysierten Alkoholextrakt.

51 50 nur als freie Aminosäure nachgewiesen worden, kommt aber in den beiden Dipeptiden Carnosin und Anserin und in der Pantothensäure vor. Die Vermutung liegt nahe, dass es in der Hefe nicht frei, sondern in einer dieser Bindungen vorliegt. Auch O. L i n d a n und E. Work (56) konnten /3 Alanin im Alkoholextrakt von Bäckereihefe erst nach durchgeführter Hydrolyse nachweisen. Die X Aminobuttersäure ist neuerdings in fast allen pflanzlichen Geweben ge funden worden. Auf eine Aufzählung der einschlägigen Arbeiten muss hier verzichtet werden. Es sei einzig auf eine Untersuchung von L. J. R e e d (79), der diese Säure in einem Hefeextrakt nachweisen konnte, aufmerksam gemacht. Sehr zahlreich sind auch die Berichte über das Vorkommen von c< Aminobuttersäure in Extrakten pflanzlicher Herkunft. Das Citrullin konnte von uns mit Sicherheit im nichthydrolysierten Hefe extrakt mit Hilfe von pdimethylaminobenzaldehyd nach C E.. Dent (24) identi fiziert werden. Durch die Hydrolyse wurde es offenbar weitgehend denaturiert. J. K. Miettinen und A.I. Virtanen (62), die das Citrullin in den Wurzeln von Alnus nachgewiesen haben, stellten fest, dass es durch saure Hydrolyse zu ei nem grossen Teil in Ornithin umgewandelt wird. Diese Umwandlung spiegelt sich in den Abbildungen 3 und 4 sowie in den Ergebnissen der quantitativen Untersuchungen der Hefe (Tabelle 21, Seite 53), deutlich wieder. Der Ornithinfleck hat nach der Hydrolyse auf Kosten des Citrullins stark zugenommen. Neuerdings ist das Citrullin auch von C.B. Coulson (23) im Aethanolextrakt von Luzerneheu und von J. Ko 1 o u s e k und C.B. Coulson (49) in Samen von verschiedenen Wiesenpflanzen ge funden worden. Ornithin wird verschiedentlich als eine in Pflanzen frei vorkommende Verbin dung erwähnt. K. Miettinen unda.j. Virtanen (62) stellten es in Alnus fest. Ein Hinweis auf das mögliche Vorkommen von Ornithin in pflanzlichem Mate rial (Zuckerrübe) findet sich auch bei J. Vavruch (96). J. Close und Mitar beiter (20) wiesen Ornithin in Manioc nach, doch scheint es in diesem Falle während der Zubereitung des Materials durch die Einwirkung von Arginase auf Arginin gebil det worden zu sein. In unmittelbarer Nähe des Alanins und Threonins wurde von uns nach der Hydroly se ein äusserst schwacher Fleck (Nr. 27 der Abbildung 1) sichtbar. Trug man den Ex trakt konzentrierter auf, wurde er vom Alanin und Threonin teilweise überdeckt. Ein Bericht von J. K. Miettinen und Mitarbeitern (63) über das Vorkommen von Homoserin in Erbsenpflanzen brachte uns auf den Gedanken, es könnte sich beim Fleck Nr. 27 ebenfalls um Homoserin gehandelt haben. Versuche mit reinem Homo serin zeigten, dass sich dieses mit jenem Fleck tatsächlich zur Deckung bringen liess. Einer quantitativen Bestimmung war er nicht zugänglich.

52 51 Der andere, mit Nr. 28 bezeichnete Fleck konnte nicht identifiziert werden. Möglicherweise handelte es sich um Aethanolamin, das von J.K. Miettinen und A.J. Virtanen (62) in geringen Mengen in den Wurzeln von Alnus festge stellt wurde. Weiter könnte auch die von J. K. Miettinen und Mitarbeitern (63) aus Erbsenpflanzen isolierte Piperidin2Carboxylsäure in Frage kommen. Diese beiden Verbindungen besitzen in Phenol annähernd die gleichen RfWerte wie unser Fleck Nr. 28. O. Lindan und E. Work (56) haben die Zusammensetzung der aethanollöslichen und der aethanolunlöslichen Fraktion von Bäckerei und Brauereihefe un tersucht. Mit wenigen Ausnahmen stimmen die von uns mit Torula utilis erhaltenen Ergebnisse der qualitativen Analyse mit ihren Angaben überein. Bemerkenswert ist, dass auch sie das Vorkommen von oc und % Aminobuttersäure sowie von ß Alanin nachweisen konnten. In Abweichung von unserer Analyse fanden die genannten Auto ren unter den freien Aminosäuren auch Histidin, während Citrullin und die Verbin dung Nr. 27 von ihnen nicht beobachtet wurde. Sie erhielten allerdings aus Bäckerei hefe einen unbekannten Fleck, der gemäss seinem RfWert in Phenol Citrullin dar stellen könnte. Auch Lindan und Work fanden unter den freien Aminosäuren Cystin, Methionin und Tryptophan nicht vor. b) Die Aminosäuren in der alkoholunlöslichen Fraktion Die Hauptmenge der Aminosäuren in der alkoholunlöslichen Fraktion wird durch das Hefeprotein geliefert. Nach der sauren Hydrolyse des Rückstandes der Alkoholextraktion waren die folgenden Aminosäuren nachweisbar (vergl. Abbildung 4, Seite 52): Alanin, Arginin, Isoleucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tyrosin und Valin. Im alkalischen Hydrolysat wurde zusätzlich das Tryptophan nachgewiesen. Dieses Ergebnis deckt sich fast vollständig mit demjenigen, das O. Lindan und E. Work (56) bei der Analyse von Brauereihefe gefunden haben. Ein Unterschied zu unserem Befund zeigt sich immerhin darin, dass die genannten Autoren im Pro tein der Brauereihefe Ornithin feststellten. Anderseits konnten sie von den durch uns im Alkoholextrakt zusätzlich bestimmten Aminosäuren nur das ß Alanin nachweisen. K. Felix und J. Pendel (32) fanden im Eiweiss von Torula utilis auch Oxyprolin. Dass diese Aminosäure in Hefe zugegen ist, wurde unseres Wissens bis jetzt durch keine weitere Arbeit bestätigt.

53 52 w jp(p f Butanol Abbildung 4 Verteilung der Aminosäuren in der alkoholunlöslichen Fraktion. 2. Das Ergebnis der quantitativen Aminosäurebestimmung Um die Aminosäuren unserer Hefen quantitativ bestimmen zu können, wurden die verschiedenen Hefelösungen je nach dem Gehalt an der zu bestimmenden Amino 3 säure gemäss der in Abschnitt C beschriebenen Methode in Mengen von 5 bis 20 mm aufgetragen. Um möglichst kleine Flecke zu erhalten, erfolgte nach einem je 2 bis 3 3 mm zählenden Auftrag eine Zwischentrocknung. Die Ergebnisse der quantitativen Analyse wurden in Gramm Aminosäurestickstoff, bezogen auf 100 Gramm Totalstick stoff, ausgedrückt. Die einzelnen Werte stellen Mittelwerte aus drei bis fünf Einzel bestimmungen dar. Da eine saubere Trennung von Leucin und Isoleucin, wie schon erwähnt (Seite 26), nicht zu erreichen war, ist es durchaus möglich, dass die ange gebenen Werte für die beiden Aminosäuren mit einer gewissen gegenseitigen Ver schiebung behaftet sind.

54 53 a) Die quantitative Aminosäurebestimmung im Alkoholextrakt Auch die quantitative Bestimmung wurde sowohl im nichthydrolysierten als auch im hydrolysierten Alkoholextrakt ausgeführt. In Tabelle 21, sind die Ergebnis se zusammengestellt. Tabelle 21 Der Aminosäuregehalt des Alkoholextraktes g AminosäureN auf 100 g ExtraktN nicht hydroly hydrolysier Zunahme nach sierter Extrakt ter Extrakt der Hydrolyse Alanin 10,86 12,02 1,16 fi> Alanin Spur 0,16 0,16 e< Aminobuttersäure 0,13 0,25 0,12 X Aminobuttersäure 0,79 X Arginin 5,24 X Asparaginsäure 2,13 3,39 1,26 Asparagin 2,99 Citrullin 4,13 X Cystin 0,72 0,72 Glutaminsäure 17,58 25,80 8,22 Glutamin 12,09 Glycin 0,74 3,26 2,52 Histidin Isoleucin 0,37 0,40 0,03 Leucin 0,47 0,54 0,07 Lysin 1,52 1,91 0,39 Methionin Ornithin 1,10 2,07 0,97 Phenylalanin 0,61 X Prolin 1,87 X Serin 1,76 1,96 0,20 Threonin 1,33 1,80 0,47 Tryptophan Tyrosin 0,52 X Valin 1,84 X x = gleicher oder kleinerer Wert = nicht vorhanden Wie bereits im ersten Teil dieser Arbeit gezeigt wurde (Seite 16), trat nach der Hydrolyse des Alkoholextraktes kaum eine Zunahme des o^ Aminostickstoffes ein, was zu beweisen schien, dass Peptide im Extrakt nur in geringer Menge ent halten waren. Der o^aminostickstoff ist jedoch hinsichtlich dieser Aussage nicht ganz zuverlässig, da das Ergebnis seiner Bestimmung möglicherweise als Differenz

55 54 zwischen entstandenen Hydrolysenverlusten und den durch Aufspaltung von Peptiden neu hinzugekommenen <* Aminosäuren in Erscheinung tritt. Die quantitative papierchromatographische Analyse ergab denn auch, dass nach der Hydrolyse zahlreiche Aminosäuren mehr oder weniger deutlich zugenommen hatten (vergl. Tabelle 21, Seite 53). Der Anstieg an Cystin, Glutaminsäure, Glycin und Asparaginsäure ist einerseits auf die Spaltung des Glutathions, anderseits auf die Umwandlung von Asparagin und Glu tamin zurückzuführen. Aus dem Anstieg des Glycinstickstoffes um 2,52 % nach der Hydrolyse lässt sich, vorausgesetzt, dass kein Glycin aus andern Peptiden stammte, ein Glutathiongehalt der Hefetrockensubstanz von 0,52 % berechnen. J. C. Som o gyi (88) gibt ganz allgemein für Hefe einen Glutathiongehalt der Trockensubstanz von 0,5 bis 0,7 % an, während H. Fink und F. Just (34) für Torulahefen einen solchen von 0,43 bis 0,46 % mitteilen. Der Cystingehalt des hydrolysierten Extrak tes liegt allerdings weit unter dem aus der berechneten Glutathionmenge zu erwarten den Wert, was offenbar damit zusammenhängt, dass ein Teil dieser Aminosäure bei der Hydrolyse zerstört wurde. Auch die nach der Hydrolyse festgestellte Zunahme des Asparaginsäurestickstoffes, die, bezogen auf den Gesamtextraktstickstoff, 1,26% betrug, stimmt nicht ganz mit dem Wert überein, der sich gemäss dem Asparagingehalt hätte ergeben sollen (1, 50 %). Im weitern ist zu bemerken, dass die durch die Hydrolyse des Gluta mins herbeigeführte Zunahme des Glutaminsäurestickstoffs 6,05 statt 8,22 % hätte betragen sollen. Die Differenz zum gemessenen Wert von 8,22 % dürfte, vorausge setzt, dass keine anderen glutaminsäurehaltigen Peptide vorhanden waren, auf die aus dem Glutathion stammende Glutaminsäure zurückzuführen sein. Das Glutathion hätte somit 2,17 % Glutaminsäurestickstoff geliefert, ein Wert, der nicht schlecht mit der zuvor diskutierten und 2,52 % betragenden Zunahme an Glycinstickstoff übereinstimmt. Die nach der Hydrolyse festgestellte Zunahme des Ornithins kann auf Grund der schon erwähnten Untersuchung von K. Miettinen und A.I. Virtanen (62) Seite 50) auf die Umwandlung von Citrullin zurückgeführt werden. Die aus Tabelle 21 hervorgehende Zunahme der übrigen Aminosäuren deutet darauf hin, dass in der alkohollöslichen Fraktion noch weitere Peptide vorhanden waren. O. Lind an und E. Work (56) stellten nach der Hydrolyse des von ihnen untersuchten Extraktes eine Vergrösserung der Flecke von Alanin, ß Alanin, o< Aminobuttersäure, V Aminobuttersäure, Arginin, Asparaginsäure, Cystin, Gluta minsäure, Glycin und Lysin fest. Nach unsern Untersuchungen nahm der Anteil dieser Aminosäuren infolge der Hydrolyse ebenfalls zu, mit Ausnahme der Y Aminobutter säure und des Arginins, deren Anteil unverändert blieb. Dagegen beobachteten wir, abweichend von dem Ergebnis der erwähnten Autoren, auch eine Zunahme an Leucin, Isoleucin, Serin und Threonin.

56 55 Am Aufbau des nichthydrolysierten Alkoholextraktes sind zahlreiche Amino säuren beteiligt, doch liegt die Hauptmenge des Aminosäurestickstoffes in Form nur einiger weniger Aminosäuren vor. Die Glutaminsäure bestritt in unserem Falle 17,58 %, das Glutamin 12,09 % und das Alanin 10,86 % des Aminosäurestickstoffs dieser Fraktion, was zusammen für diese drei Aminosäuren 40, 53 % ergibt. Eine weitere Gruppe von Aminosäuren des nichthydrolysierten Extraktes ( ß, Alanin, o<und ^Aminobuttersäure, Glycin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin) beteilig ten sich je mit weniger als 1 % am Aminosäurestickstoff. Die übrigen Aminosäuren waren zu 1 bis 6 % an der Zusammensetzung dieser Stickstoffraktion beteiligt. Wie wir hat auch P. Roine (81) die Zusammensetzung der löslichen Stick stoffraktion von Torula untersucht und dabei festgestellt, dass das Wachstumssta dium und insbesondere die Ernährung der Hefe den Gehalt an löslichem Stickstoff und dessen Zusammensetzung stark beeinflussen. Diese Feststellung mag es er klärlich machen, warum die in Tabelle 22 zusammengestellten Untersuchungsergeb nisse verschiedener Autoren grosse Unterschiede erkennen lassen. Tabelle 22 Verteilung einzelner Fraktionen des löslichen Hefestickstoffes im nichthydrolysier ten Extrakt In % des löslichen GesamtN: Roine (76) Torulahefe Normal Narm er Narme Hefe hefe nährte Hefe mit (NH.) SO. ernährt4 * * Eigene Unter suchungen Lindan und Work(51) Brauerei hefe Torulahefe AmidN DirkarbonsäureN Nder basischen Aminosäuren ,1 19, ,8 AlaninN ,9 Neben der unterschiedlichen Ernährung und der verschiedenen Herkunft der Hefen, dürfte für die aus Tabelle 22 hervorgehende Unterschiedlichkeit der Ergebnisse auch der Umstand verantwortlich sein, dass die Analysen nach verschiedenen Methoden durchgeführt wurden. P. Roine bestimmte die Glutaminsäure, die Asparaginsau

57 3,67 0,73 0,92 56 re, das Glutamin und das Asparagin einzeln. Der Glutaminsäurestickstoff macht nach seinen Angaben im nichthydrolysierten Extrakt einer normal ernährten Hefe 94 % des Dikarbonsäurestickstoffs und der Glutaminstickstoff 79 % des Amidstickstoffs aus. In unsern Untersuchungen lauten die entsprechenden Zahlen für Glutaminsäure 89,2 % und für Glutamin 80,2 %. In Tabelle 23, Spalte 1 ist von jeder Aminosäure der Tabelle 21 jeweils der Tabelle 23 Der Aminosäuregehalt der Holzzuckerhefe g Aminosäurestickstoff in 100 g Stickstoff der der der alkohollösli alkoholunlösli Gesamt] chen Fraktion chen Fraktion 0,10 Alanin 12,02 5,11 5,91 [i> Alanin 0,16 0,02 0,03 o< Aminobuttersäure 0,25 Jf Aminobuttersäure 0,79 Arginin 5,24 8,65 8,12 Asparaginsäure 2,13 6,81 6,41 Asparagin 2,99 0,37 Citrullin 4,13 0,52 Cystin 0,72 0,54 0,56 Glutaminsäure 19,75 7,78 9,18 Glutamin 12,09 1,51 Glycin 3,26 4,30 4,12 Histidin 3,17 Leucin 0,54 5,09 4,46 Isoleucin 0,40 2,38 2,10 Lysin 1,91 10,23 9,06 Methionin 0,63 Ornithin 1,10 0,14 Phenylalanin 0,61 2,31 2,07 Prolin 1,87 2,19 2,12 Serin 1,96 3,45 3,22 Threonin 1,80 4,13 3,78 Tryptophan 0,79 Tyrosin 0,52 1,09 1,01 Valin 1,84 5,08 4,61 Total 76,08 74,46 74,01 höhere der im hydrolysierten bzw. im nichthydrolysierten Extrakt gefundenen Wer te eingetragen worden. Nur bei den Dikarbonsäuren und beim Ornithin mussten der Aufspaltung der Amide bzw. des Citrullins wegen die kleineren Werte des nichthydrolysierten Extraktes berücksichtigt werden. Der im nichthydrolysierten Extrakt

58 57 bestimmte Glutaminsäureanteil wurde um den vermutlich aus dem Glutathion stam menden Glutaminsäurestickstoff von 2,17 % erhöht. Nach Tabelle 23 macht der gesamte, im Alkoholextrakt papierchromatographisch bestimmte Aminosäurestickstoff unter Einschluss der Amide 76,08 % des löslichen Stickstoffes aus. Der aus dieser Analyse berechnete < Aminostickstoff, der bei der Bestimmung nach Slyke reagieren würde, nimmt mit 58,97 % am lösli chen Stickstoff teil. Bei dieser Berechnung wurde ausser dem gesamten C* Amino stickstoff auch der in der to Stellung vorhandene Stickstoff des Lysins und des Ornithins zu 95 % berücksichtigt. Gemessen an dem im Alkoholextrakt nach van Slyke bestimmten o< Aminostickstoff (65,63 %, Seite &saminostickstoffs wiedergefunden worden. 19) sind somit 89,85 % des Der Anteil des identifizierten am totalen Stickstoff der alkohollöslichen Frak tion macht insgesamt 78,62 % aus (76,08 % Aminosäurestickstoff + 2,54 % Am moniakstickstoff, Seite 19). Der Rest dürfte zum grössten Teil aus Nucleotidstickstoff bestanden haben, der nach P. Roine (81) in Normalhefe zu 18 % am lösli chen Stickstoff beteiligt ist. Diese Zahl darf immerhin in Anbetracht der Abhängig keit des Nucleotidstickstoffanteiles von den Ernährungsbedingungen der Hefe nicht vorbehaltlos auf unsere Untersuchung übertragen werden, umso mehr, als Roine die lösliche Fraktion durch Extraktion mit Trichloressigsäure gewann. b) Die quantitative Aminosäurebestimmung in der alkoholunlös lichen Fraktion Aus dem früher gesagten (Seite 19) ging hervor, dass der Hauptanteil der al koholunlöslichen Stickstoffraktion unserer Hefe als polypeptidisch gebunden zu be trachten ist. Der quantitative Aufbau der aus 18 Aminosäuren bestehenden alkohollöslichen Fraktion ist aus Tabelle 23, Seite 56, Spalte 2, ersichtlich. An ihrem Stickstoff beteiligte sich der papierchromatographisch bestimmte Aminosäurestickstoff mit 74,46 %. Aus diesem Aminosäureanteil lassen sich 62, 61 % o< Aminosäurestick stoff berechnen (vergl. oben), was 91,59% des in der hydrolysierten, alkohol unlöslichen Fraktion tatsächlich bestimmten o< Aminostickstoffes (68,36 %, Seite 19) ausmacht. Unter Einrechnung des Huminstickstoffes (3,72 %, Seite 19) und des Ammoniakstickstoffes (7,41 %, Seite 19) sind in der alkoholunlöslichen Fraktion 85,59 % des in ihr enthaltenen Stickstoffes identifiziert worden.

59 58 E. DIE BESPRECHUNG DER ERGEBNISSE Bei der nachfolgenden Besprechung stützen wir uns auf die in Tabelle 23, Spalte 3 enthaltenen Daten, welche sich auf die Zusammensetzung der gesamten, in der Hefe enthaltenen Stickstoffraktion beziehen. In Tabelle 24, Seite 59, werden die se Daten einigen Angaben der Literatur gegenübergestellt. Die zum Teil recht grossen Unterschiede zwischen den in Tabelle 24 aufgeführ ten Analysen könnten sich einerseits aus der Verschiedenheit des Untersuchungs materials, anderseits aus der Ungleichheit der angewandten Untersuchungsmethodik erklären lassen. Da nach H. Fink und F. Just (33) Bierhefe und Torulahefe und nach R. J. Block und D. Bolling (7) Bierhefe und Bäckereihefe in Be zug auf den Aminosäuregehalt des Proteins nur wenig voneinander abweichen, dürften die in Tabelle 24 zutage tretenden Differenzen im allgemeinen weniger durch die Unterschiedlichkeit des Untersuchungsmaterials als durch Unterschiedlichkeiten in der Methodik der Aminosäurebestimmung verursacht worden sein (vergl. dagegen Seite 64). Von den angeführten Autoren haben einzig K. Nehring und E. Schwertfeger (71) die quantitative Bestimmung der Aminosäuren grundsätzlich nach der gleichen Methode wie wir durchgeführt (Spalte 2 der Tabelle 24). Ein Vergleich mit ihren Ergebnissen zeigt, dass unsere Werte für Histidin, Tryptophan, Methionin und Cystin ziemlich tiefer liegen (bezogen auf unsere Daten, 20 % und mehr). Die ser Unterschied mag zum Teil auf die verschiedene Aufarbeitung des Materials zu rückzuführen sein. Im Gegensatz zu der von uns angewandten Hydrolyse, die 24 Stunden dauerte, hydrolysierten Nehring und Schwertfeger nur 12 Stunden, für die Bestimmung des Cystins sogar nur 5 Stunden, was sich offenbar auf die Erfassung der genannten Aminosäuren vorteilhaft auswirkte. Das Tryptophan, dessen Anteil wir aus dem alkalischen Hydrolysat erhielten, wurde von Nehring nach H. Roth und P. Schuster (83) direkt im Protein bestimmt. Im übrigen zeigen unsere Er gebnisse eine recht gute Uebereinstimmung mit den von Nehring und Schwertfeger gefundenen Werten. J.W. Spanyer und A.T. Thomas (89) bestimmten den Aminosäurege halt von Brauereihefe nach eindimensionaler Trennung mit Hilfe eines Densitometers direkt auf dem Papier (Spalte 3 der Tabelle 24). Ihre Befunde für einige Aminosäu ren, z.b. für Alanin, Glutaminsäure und Glycin sind auffallend tief, während für den Methioningehalt ein verhältnismässig hoher Wert angegeben wird. O. Lindan und E. Work (56) verwendeten für ihre Untersuchungen das "spotdilution"verfahren, das nur als halbquantitativ angesehen werden darf (Spalte 4 der Tabelle 24). Dies ist

60 (32) Pendl J. und Felix K. 9) (33) Just F. und Fink H. 6) (89) Thomas A.T. und Spanyer J.W. 3) (11) Block J. R. 8) (52) Schlottmann F. und Kraut H. 5) (71) Schwertfeger E. und Nehring K. 2) (53) Cheldelin V.H. und Kurth E.F. 7) (56) Work E. und O.Lindan 4) Analyse Eigene 1) 5,99 4,34 4, ,99 3,98 4,61 Valin 1,38 1,57 3,22 1,12 4,04 0,49 3,47 2,93 1,35 2,5 0, ,21 2,20 1,01 3,40 1,01 0,79 3,78 Tyrosin Tryptophan Threonin 2,77 2,09 2,39 2, ,83 2,01 1,74 3,22 2,12 2,07 Serin Prolin Phenylalanin 0,76 3,26 1,17 8,399,59 9,97 11,6 11,4 1 0,8 8 0,8 8 1,29 8,02 0,96 8,18 0,14 0,63 9,06 Ornithin Methionin Lysin 2,14 1,51 5,01 4,01 5,08 4,80 4,67 4,80 5,26 4, ,20 2,20 2,54 7,54 4,67 4,46 2,10 3,17 Leucin Isoleucin Histidin 5,71 7 0, ,28 4,22 4,12 1,51 9,18 Glycin Glutamin Glutaminsäure 0,42 0,80 1,71 1,6 1,50 0,5 1,25 0,4 0,67 0,56 0,52 0,37 Cystin Citrullin Asparagin 1,81 5,20 8,0410,05 11,79 10,92 11, , ,1 3,55 6,63 9,09 6,41 8,12 0,10 Asparagins äur e Arginin Aminobuttersäure Jf 5,56 0,05 9 0,4 0,4 9 2,85 0,03 0,02 5,91 Aminobuttersäure o< ß Alanin Alanin hefe Torula 9 Hefe 8 hefe Torula 7 kerhefe Holzzuk 6 hefe Bier 5 hefe hefe Brauerei Bäckerei 4 hefe Bier 3 hefe Futter 2 utilis) (Torula hefe Holzzucker 1 Hefeart unten) (s. Autor GesamtN) g 100 auf AminosäureN (Gramm Hefen verschiedener Aminosäuren an Gehaltes des Vergleich 24 Tabelle

61 60 vermutlich der Grund, warum einzelne Werte dieser Autoren von den Ergebnissen der andern Analysen besonders stark abweichen. Dass offenbar für die Uebereinstimmung bzw. Nichtübereinstimmung der in Ta belle 24 wiedergegebenen Resultate die Methodik der Aminosäurebestimmung ent scheidender war als die Art des Untersuchungsmaterials, geht deutlich aus dem Ver gleich der Analysen von H. Kraut und F. Schlottmann (52) einerseits und von H. Fink und F. Just (33) anderseits hervor (Spalte 5 und 6 der Tabelle 24). Beide Analysen wurden nach der gleichen Methode, nämlich nach der Methode van Slyke durchgeführt, wobei ihre Ergebnisse fast durchweg sehr gut übereinstimmen, obwohl es sich in einem Falle um Bierhefe, im andern um Holzzuckerhefe handelte. F.A. C o s o n k a (22) hält allerdings die eben genannte Methode für Hefe, ihres hohen Gehaltes an Purin und Pyrimidinstickstoff wegen, als nicht sehr geeig net. H. Fink und F. Just (35) weisen selbst darauf hin, dass die Cystinbestimmung nach der van SlykeMethode den unzuverlässigsten Wert ergebe. E. F. Kurth und V.H. Cheldelin (53) arbeiteten mit Hilfe mikrobiologischer Me thoden und erzielten dabei Resultate, die mit einigen Ergebnissen anderer in Tabel le 24 zitierten Autoren recht gut übereinstimmen (Spalte 7 der Tabelle 24). Die in Spalte 8 und 9 der Tabelle 24 angeführten Daten wurden mit Hilfe von Methoden ge wonnen, auf deren Beschreibung wir hier verzichten können. Im Vergleich zu den in Tabelle 24 enthaltenen Literaturangaben liegt die Mehr zahl der von uns gefundenen Werte eher an der unteren Grenze. Dies dürfte wenigstens teilweise mit der von uns verwendeten Methode der Papierchromatographie zusam menhängen, die eine gute Isolierung der zu bestimmenden Aminosäuren gestattete, so dass Fremdsubstanzen, die beispielsweise bei Fällungsreaktionen leicht mit eingeschlossen werden, kaum mitbestimmt wurden. Bei der Eiweissbausteinanalyse ist sondere Aufmerksamkeit zu schenken, den essentiellen Aminosäuren be da diese für den ernährungsphysiologischen Wert eines Proteins entscheidend sind. Wie aus chemischen Analysen und Fütter ungsversuchen geschlossen werden kann, nimmt das Hefeeiweiss eine Zwischen stellung zwischen tierischem und pflanzlichem Eiweiss ein. Nach einer Zusam menstellung von H. Kraut und F. Schlottmann (52) (Tabelle 25, Seite 61) weist das Hefeeiweiss im Vergleich zu tierischem Eiweiss einen geringeren HistidinTryptophan u.u. auch Tyrosingehalt auf. Umgekehrt übertrifft das Hefe eiweiss pflanzliches Eiweiss beträchtlich in seinem Gehalt an Arginin und Lysin.

62 61 Tabelle 25 Der Gehalt der Hefe und anderer Lebensmittel an essentiellen Aminosäuren (AminosäureN in % des GesamtN) Fleisch Kasein Lactalbumin Hefe Roggen Kartoffel Arginin 12,6 7,4 7,2 11,0 7,6 8,3 Histidin 10,4 6,2 4,6 3,0 2,1 3,8 Lysin 7,5 10,3 12,2 11,4 1,2 3,9 Cystin 1,5 0,2 1,3 1,6 0,2 3,1 Tryptophan 1,2 1,5 1,5 0,9 0,9? Tyrosin? 5,3? 2,5 1,2 2,0 Ein wichtiges Ziel der qualitativen und quantitativen Aminosäurebestimmung besteht darin, in Ergänzung oder an Stelle von Tierversuchen Aussagen über die biologische Wertigkeit der Stickstoffhaltigen Nahrungsfraktion zu erlauben. Im fol genden soll erörtert werden, inwieweit dieses Ziel verwirklicht werden kann. Verhältnismassig einfach scheint sich die Beurteilung der biologischen Wertig keit einer stickstoffhaltigen Nahrungsfraktion bzw. eines Proteins auf Grund der chemischen Analyse in der Weise zu gestalten, dass man den ermittelten Gehalt an essentiellen Aminosäuren dem Aminosäurebedarf der betreffenden Tierart direkt gegenüberstellt. Damit diese Methode zu brauchbaren Ergebnissen führt, müssen jedoch verschiedene Voraussetzungen erfüllt sein. Zu diesen gehören u. a. die Kennt nisse, in welchem Umfange die in einem Futter festgestellten Aminosäuren ausnutzbar sind; vor allem aber ist es notwendig, dass man über den Bedarf der verschiedenen Tierkategorien an essentiellen Aminosäuren möglichst gut unterrichtet ist. Gerade in dieser Beziehung bestehen heute noch grosse Lücken. Bis jetzt sind umfassende Daten betreffend den Bedarf an essentiellen Aminosäuren nur am Kücken und Ferkel sowie an der Ratte gewonnen worden. (Tabelle 26,Seite 62). Am besten ist der Aminosäurebedarf der Ratte abgeklärt. Diesem Bedarf kommt, wie neuere Untersuchungen gezeigt haben, allgemeinere Bedeutung zu. So fan den E. T. M e r t z und Mitarbeiter (60), dass Ferkel mit einer Aminosäuremischung, in der die Proportionen der einzelnen Komponenten denjenigen entsprachen, die für die Ratte optimal sind, ein ausgezeichnetes Wachstum aufweisen. Auch der von A.A. Albanese (1) ermittelte Aminosäurebedarf des Säuglings ist demjenigen der Ratte ähnlich. Eine neue Methode zur Beurteilung des ernährungspysiologischen Wertes der stickstoffhaltigen Nahrungsfraktion auf Grund der Bausteinanalyse besteht darin, dass das Ergebnis dieser Analyse mit einem möglichst vollwertigen Bezugseiweiss, z.b. Eiereiweiss, verglichen wird. Dieser Vergleich führt zunächst zur Berechnung

63 62 Tabelle 26 Bedarf an essentiellen Aminosäuren bei Kücken, Ferkel und Ratte Nach F.B. Morrison (68) nach W.C. Rose Kücken Ferkel säugende Ratte in % des in % des in % des Futters Futters Futters Lysin 1,00 1,00 1,0 Leucin 1,40 0,60 0,8 Valin 0,80 0,40 0,7 Phenylalanin 1,60 0,46 0,7 Methionin 0,70 0,22* 0,6 Isoleucin 0,60 0,70 0,5 Threonin 0,60 0,40 0,5 Histidin 0,15 0,20 0,4 Arginin 1,70 0,20 0,2 Tryptophan 0,15 0,20 0,2 Glycin 1,00 * Normaler Cystingehalt vorausgesetzt des sog. Eiproteinverhältnisses (EPV): FPV Aminosäure im Versuchsprotein. Aminosäure im Eiprotein K. Nehring (69) verwendet anstelle des Eiproteins Kuhmilchprotein als Bezugseiweiss und ermittelt daraus das Milchproteinverhältnis (MPV) wie folgt: MPV Aminosäure im Versuchsprotein Aminosäure im Milchprotein 100 H. Mitchell und R. J. Block (64) greifen zum Zwecke der Bewertung eines Proteins auf Grund der Eiweissbausteinanalyse nur die Aminosäure mit dem kleinsten Eiproteinverhältnis heraus und berechnen dann den sog. "chemical score". B. L. Oser (73) ermittelt einen EAAIndex (essential amino acid index), indem er das Eiproteinverhältnis aller essentiellen Aminosäuren (n) heranzieht und folgende Formel verwendet: EAAIndex y EPV EPV. a b EPV_ Methionin und Cystin sowie Leucin und Isoleucin werden in dieser Formel jeweils nur als eine Aminosäure gerechnet. K. Nehring (70) schlägt neuerdings vor, als Bezugseiweiss für die Bewer tung von Eiweissfuttermitteln nicht die Kuhmilch, sondern die Sauenmilch heranzuziehen. In Tabelle 27, Seite 63 finden sich Angaben über den Gahalt der verschiedenen in Frage kommenden Bezugsproteine an essentiellen Aminosäuren und die daraus auf Grund unserer Hefeanalyse berechneten EAAIndexe.

64 63 Tabelle 27 Berechnung des EAAIndexes der Holzzuckerhefe Aminosäuregehalt der Bezugsproteine und der Hefe in % des Roh proteins Vollei Kuhmilch Sauenmilch Holzzuckerhefe Block Block Beacon Beacon eigene Arbeit (11) (11) (2) (2) Lysin 7,0 8,7 8,53 7,39 7,56 Leucin 9,2 11,0 9,20 8,03 6,68 Isoleucin 7,7 7,5 5,85 4,24 3,14 Valin 7,2 7,0 7,12 5,04 6,17 Phenylalanin 6,3 5,5 4,76 3,49 3,90 Methionin 4,0 3,2 2,65 1,36 1,07 Cystin 2,4 1,0 0,76 Threonin 4,3 4,7 4,35 3,54 5,15 Histidin 2,4 2,6 2,70 2,18 1,87 Arginin 6,6 4,2 3,53 5,72 4,04 Tryptophan 1,5 1,5 0,92 EAAIndex der Holzzuckerhefe 66,7 72,7 76,2 88,7 Begrenzende Aminosäuren: 1.* Methionin Cystin Methionin Cystin Methionin Arginin 2.** Leucin Leucin Leucin Methionin Isoleucin Isoleucin Isoleucin * Kleinste EPV bzw. MPVWerte ** Nächst höhere EPVbzw. MPVWerte Wie aus Tabelle 27 hervorgeht, ist die Höhe des EAAIndexes je nach der Wahl des Bezugsproteins sehr variabel. Mit Kuhmilch werden allgemein höhere Werte er zielt als mit Eiereiweiss. Auffallend ist der von uns berechnete hohe Index bei Ver wendung von Sauenmilcheiweiss als Bezugsgrösse, was auf deren im allgemeinen geringeren Gehalt an essentiellen Aminosäuren zurückzuführen ist. K. Nehring (70) gibt für Brauereihefe bei Verwendung von Eiereiweiss als Bezugsgrösse einen EAAIndex von 70,6 an. In einer weiteren Arbeit berechnen K. Nehring und E. Schwertf eger (71) für Futterhefe einen EAAIndex von 73. Es wurde bereits da rauf hingewiesen (Seite 60), dass die Mehrzahl der von uns bestimmten Aminosäure werte, verglichen mit den Angaben der Literatur, eher an einer untern Grenze liegen,

65 64 weshalb der von uns berechnete EAAIndex niedriger ausfiel als der von Nehring und Schwertfeger ermittelte. Es erhebt sich die wichtige Frage, inwieweit die auf chemischem Wege gewon nenen Ergebnisse mit den Resultaten der biologischen Prüfung von Hefeeiweiss über einstimmen. C.W. Hughes unds. H äuge (45) geben auf Grund ihrer Versuche an wachsenden Ratten für getrocknete Brauereihefe, die 10 % der Ration ausmachte, eine biologische Wertigkeit von 61 an. J.A. Goyco und F. Äsenjo (40) be stimmten ebenfalls in einem Versuch mit wachsenden Ratten ausser der biologischen Wertigkeit einer Brauereihefe auch diejenige von zwei Torulahefen, wobei die Braue reihefe höhere Werte lieferte, wie die folgenden Zahlen zeigen: Torulahefe Brauereihefe Biologische Wertigkeit 484Ö'0 g.. '6 b9'd ßq K. Felix und J. Pen dl (32) stellten in einem Versuch mit Ratten bei 10 % Torula utilis in der Gesamtration eine biologische Wertigkeit des Hefeeiweisses von 63 bis 66 fest; diese Wertigkeit konnten sie durch Zulage von Cystin auf 70 bis 77 erhö hen. Es Hegen auch Tierversuche vor, in denen das Hefeeiweiss mit einem Standard Eiweiss, meist Milch oder EiEiweiss, verglichen wurde. Im Vergleich zu Milcheiweiss bestimmten H. Fink und H. Hock (36) in Versuchen mit Ratten den Wachstumswert verschiedener Hefearten mit folgenden Relativzahlen: Brauereinährhefe 84 % Entbitterte Brauereihefe 54 % Torulahefe auf Strohhydrolysat 64 % Torulahefe auf Buchenholz Sulfitablauge 33 % Torulahefe auf Holzzucker 34 % Ferner gibt A. Hock (43) für eine auf Sulfitablauge gezüchtete Torulahefe im Vergleich zu Milcheiweiss einen Wachstumswert von 70 % an. In einem weiteren Versuch von A. Hock (44) Hessen sowohl eine Brauereihefe als auch eine Torula hefe eine Relativzahl von etwa 70 % feststellen. Zusammenfassend ist festzustellen, dass die im Tierversuch ermittelten Da ten für den biologischen Wert des Hefeeiweisses ausserordentlich variieren. Es ist kaum anzunehmen, dass diese Variabilität nur auf Unterschieden und Ungenauigkeiten der angewandten Versuchsmethodik beruht. Vielmehr muss angenommen werden, dass zwischen den einzelnen Hefearten und selbst innerhalb derselben Art, vermutlich vor

66 65 allem als Folge ungleicher Wachstumsbedingungen, biologische Wertigkeitsdifferen zen bestehen, die realer Natur sind. Auf Grund des früher Gesagten (vergl. Seite 59) darf vermutet werden, dass diese Differenzen im allgemeinen weniger als Folge eines unterschiedlichen Aminosäuremusters denn als Folge einer unterschiedlichen, durch zahlreiche Faktoren bedingten Ausnützbarkeit dieses Musters in Erscheinung tritt. Diese Vermutung erhärtet die an sich nicht neue Feststellung, wonach Aussa gen über die biologische Wertigkeit der stickstoffhaltigen Nahrungsfraktion, die sich ausschliesslich auf qualitative und quantitative Aminosäurebestimmungen stützen, nicht ohne stark einschränkende Vorbehalte gemacht werden dürfen. Anderseits ist ohne weiteres anzuerkennen, dass die chemische Analyse der stickstoffhaltigen Nahrungsfraktion hinsichtlich deren biologische Wertigkeit wertvollste Anhaltspunkte zu liefern vermag und dass diesen Anhaltspunkten ein um so grösserer Aussage wert zukommt, je umfassender und zuverlässiger die Analyse ist, auf die sie sich stützen. Hinsichtlich der in Tabelle 27 angeführten Werte für die kleinsten EPV bzw. EMP und für den EAAIndex, welche Werte geeignet sein sollen, die biologische Wertigkeit des Hefeeiweisses mit einiger, wenn auch keineswegs absoluter Sicher heit charakterisieren zu lassen, sei noch folgendes bemerkt: Als begrenzende Aminosäuren in der von uns untersuchten Hefe (Aminosäuren mit dem kleinsten EPV bzw. MPVWert) kommen nach Tabelle 27, Seite 63, je nach der Wahl des Bezugsproteins Methionin, Cystin, ferner Leucin, Isoleucin und Arginin in Betracht. NachK. Nehr ing (70) sind Phenylalanin, Leucin und Me thionin, nach H.H. Mitchell und R. J. Block (65) Methionin und Cystin die jenigen Aminosäuren, die die biologische Wertigkeit des Hefeeiweisses begrenzen. Im Tierversuch wurde von verschiedenen Versuchsanstellern Methionin/Cystin als begrenzend ermittelt. A. Hock und H. Fink (42) konnten die Wachstumswir kung von Brauerei und Holzzuckerhefe bei jungen Ratten durch eine Cystinzulage in der Höhe von 2 % des verfütterten Nahrungseiweisses bedeutend erhöhen. A.A. Klose und H.L. Fevold (47) erzielten sowohl bei wachsenden Ratten als auch bei Kücken durch eine Zulage von Methionin eine wesentliche Steigerung der Wachs tumswirkung des Proteins von Brauerei und Torulahefe. J. S. C h i a o und W. H. Peter son (19) fanden bei verschiedenen Heferassen beträchtliche Unterschiede im Gehalt an Cystin und Methionin. Torulahefen wiesen allgemein einen tieferen Ge halt an schwefelhaltigen Aminosäuren auf als Brauereihefen. Wie A. Hock (44) bemerkt, wäre es nicht richtig, die beobachtete grosse Variabilität der biologischen Wertigkeit des Hefeeiweisses allein mit einem unterschiedlichen Gehalt an schwefel haltigen Aminosäuren erklären zu wollen. Sicher spielen noch andere Faktoren eine wichtige Rolle.

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