Untersuchungen zur mikrobiologischen Qualität von Frischkäse verschiedener Herstellungsweisen

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1 Untersuchungen zur mikrobiologischen Qualität von Frischkäse verschiedener Herstellungsweisen Professur für Milchwissenschaften Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde der Justus-Liebig-Universität Gießen und Ewald Usleber Garmisch-Partenkirchen, 1. Oktober 2009 "Untersuchungen zur mikrobiologischen Qualität von Frischkäse verschiedener Herstellungsweisen" Vanessa Franzen 1

2 Gliederung 1. Hintergrund und Ziel der Arbeit 1.1 Hintergründe der Arbeit 1.2 Ziele der Arbeit 2. Material und Methoden 2.1 Probenmaterial 2.2 Methoden 3. Ergebnisse 4. Zusammenfassung und Ausblick 2

3 1.1 Hintergründe der Arbeit Entwicklung des Käsemarktes in Deutschland Produktion in t * Käse insgesamt (ohne Schmelzkäse) Frischkäse * seit 2000 enthalten die Produktionszahlen für Frischkäse auch Pasta-Filata-Käse 3

4 1.2 Ziele der Arbeit Untersuchung zur mikrobiologischen Qualität von Frischkäse (Schwerpunkt Enterobacteriaceae) Vergleich des Nachweis von Enterobacteriaceae und coliformen Keimen zur Kontrolle der mikrobiologischen Qualität Vergleich von Untersuchungsmethoden und Nährmedien für den Nachweis von Enterobacteriaceae und coliformen Keimen 4

5 2.1 Probenmaterial Untersuchung von 125 Frischkäsen bzw. Frischkäsezubereitungen - Frischkäse: Käse, der in der fettfreien Käsemasse einen Wassergehalt von > 73% aufweist ( 6 KÄSEV) - Frischkäsezubereitung: Frischkäse, der unter Verwendung von Früchten, Gemüse oder anderer Lebensmittel hergestellt wird ( 4 KÄSEV) Gruppierung der Proben nach Vermarktungsform, Herstellungsweise, Angebotsform und Hauptzutat 5

6 2.2 Methoden - Qualitativer Nachweis von Enterobacteriaceae in Anlehnung an ISO Nicht selektive Voranreicherung in gepuffertem Peptonwasser Selektive Voranreicherung in EEB Beimpfung von VRBG-Agar ECC-Agar Subkultur charakteristischer Kolonien auf CASO-Agar Bestätigung und Identifizierung EEB = Enterobacteriaceae Enrichtment Broth; VRBG-Agar = Violet-Red-Bile-Glucose-Agar; ECC-Agar = Selektiver E. coli /Coliformen-Chromogen-Agar; CASO-Agar = Caseinpepton-Sojamehlpepton-Agar 6

7 2.2 Methoden Quantitative Bestimmung von coliformen Keimen bzw. Escherichia coli in Anlehnung an die Methoden L und L nach 64 LFGB Herstellung einer dezimalen Verdünnungsreihe in Ringerlösung LST-MUG-Bouillon VRB-MUG-Agar ECC-Agar Bestimmung der Anzahl von coliformen Keimen bzw. E. coli Subkultur auf CASO-Agar Bestätigung und Identifizierung LST-MUG-Bouillon = Laurylsulfat-Tryptose-Bouillon mit 4-Methyl-umbelliferyl-ß-D-glucuronid (MUG); VRB-MUG-Agar = Violet-Red-Bile-Agar mit MUG 7

8 2.2 Methoden Molekularbiologische Charakterisierung der E. coli-isolate: Überprüfung des Vorkommens der Gene stx1 und stx2 Qualitativer Nachweis von Listeria monocytogenes in Anlehnung an die Methode L nach 64 LFGB Quantitative Bestimmung von Koagulase-positiven Staphylokokken in Anlehnung an die Methode L nach 64 LFGB Überprüfung der Veränderung des Enterobacteriaceae-Gehalts in Frischkäse während einer Lagerung von sieben Tagen bei + 6 C 8

9 3. Ergebnisse Methodische Aspekte zum Nachweis von Enterobacteriaceae in Frischkäse ECC-Agar erfüllt die Anforderungen eines alternativen Selektivnährmediums zum VRBG-Agar durch Verwendung des ECC-Agars Differenzierung von E. coli von anderen coliformen Keimen möglich Wachstum von Enterobacteriaceae auf VRBG-Agar Wachstum von E. coli und coliformen Keimen auf ECC-Agar 9

10 3. Ergebnisse Methodische Aspekte zur quantitativen Bestimmung von coliformen Keimen Positive Proben für coliforme Keime unter Verwendung von: LST-MUG Bouillon: 41 Proben (33 %) ECC-Agar: 34 Proben (27 %) VRB-MUG Agar: 28 Proben (22 %) bezüglich des ermittelten Keimgehalts für coliforme Keime keine wesentlichen Unterschiede zwischen den geprüften Medien deutliche Unterschiede für den Nachweis von E. coli hinsichtlich der Anzahl positiver Proben hinsichtlich der Differenzierung von E. coli von anderen coliformen Keimen 10

11 3. Ergebnisse Methodische Aspekte zur quantitativen Bestimmung von coliformen Keimen Fluoreszenz von LST-MUG-Bouillon unter UV-Licht (366 nm) LST-MUG beimpft mit: (von links nach rechts) coliformen Keimen aus Reinkultur coliformen Keimen aus Frischkäse E. coli aus Frischkäse E. coli aus Reinkultur 11

12 3. Ergebnisse Methodische Aspekte zur quantitativen Bestimmung von coliformen Keimen Wachstum von coliformen Keimen bzw. E. coli aus Reinkultur auf VRB-MUG-Agar Wachstum von coliformen Keimen bzw. E. coli aus Frischkäse auf VRB-MUG-Agar 12

13 3. Ergebnisse Unterschiede für den Nachweis von Enterobacteriaceae bei Voranreicherung und Direktbeimpfung höhere Nachweisrate von Enterobacteriaceae bei Durchführung einer Voranreicherung: Voranreicherung: 55 Proben (44 %) Direktbeimpfung: 41 Proben (33 %) Nachweisrate einzelner Enterobacteriaceae-Spezies variierte deutlicher Unterschied für den Anteil der E. coli-positiven Proben: Voranreicherung: 17 Proben (14 %) Direktbeimpfung: 7 Proben (6 %) 13

14 3. Ergebnisse Mikrobiologische Qualität von Frischkäse, Nachweis von Enterobacteriaceae 55 Proben (44 %) positiv für Enterobacteriaceae bei steigendem ph-wert zunehmender Anteil positiver Proben Unterschiede hinsichtlich: Angebotsform 70 % der unverpackten, nur 18 % der Proben in Fertigpackung positiv Vermarktungsform 73 % der Proben vom Wochenmarkt, 77 % der unverpackten Proben aus dem Einzelhandel positiv Herstellungsweise 49 % der konventionell, 28 % der ökologisch hergestellten Proben positiv Hauptzutat über die Hälfte aller Proben mit Gemüse ( mediterraner Typ ) und Gewürzen positiv, deutlich geringere Nachweisrate bei unverarbeiteten Frischkäsen 14

15 3. Ergebnisse Mikrobiologische Qualität von Frischkäse, Nachweis von Enterobacteriaceae bei 88 % der Proben lag der Keimgehalt von coliformen Keimen unterhalb von 10 2 KbE/g nur 7 Proben (6 %) enthielten > 10 3 KbE/g coliforme Keime (maximal 3,4 x 10 4 KbE/g) gemäß VO (EG) 2073/2005 keine mikrobiologischen Kriterien für coliforme Keime in Frischkäse festgelegt 15

16 3. Ergebnisse Mikrobiologische Qualität von Frischkäse, Nachweis von E. coli E. coli wurde in 17 Proben (14 %) nachgewiesen maximaler E. coli-gehalt 9,5 x 10 1 KbE/g keine Überschreitung der Grenzwerte gemäß VO (EG) Nr. 2073/2005 (m = 100 KbE/g; M = 1000 KbE/g) positive Proben fast ausschließlich unverpackt, vom Wochenmarkt oder Einzelhandel mit der Zugabe von Gemüse und (Kraut-) Gewürzen Überprüfung von 48 E. coli-isolaten auf das Vorkommen der Gene stx1 und stx2 in allen Fällen negativ 16

17 3. Ergebnisse Mikrobiologische Qualität von Frischkäse, Nachweishäufigkeit isolierter Enterobacteriaceae-Spezies Nachweishäufigkeit (n) in 125 Proben Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes Enterobacter gergoviae Enterobacter amnigenus Enterobacter intermedius Klebsiella pneu. ssp. pneumoniae Klebsiella oxytoca Klebsiella pneu. ssp. ozaenae Escherichia coli Escherichia vulneris Escherichia hermannii Serratia liquefaciens Serratia rubidaea Serratia odorifera Serratia plymuthica Serratia marcescens Pantoea agglomerans Pantoea spp. Citrobacter freundii Hafnia alvei Proteus mirabilis Proteus vulgaris Cedecea lapagei Cedecea spp. Kluyvera cryocrescens Kluyvera spp. Morganella morganii

18 3. Ergebnisse Mikrobiologische Qualität von Frischkäse Lagerung von Frischkäse über 7 Tage bei + 6 C Reduktion des Keimgehaltes von Enterobacteriaceae um ein bis zwei Zehnerpotenzen L. monocytogenes in keiner Probe nachweisbar, L. innocua in 3 Proben nachgewiesen S. aureus nur in einer Probe in niedriger Keimzahl (4,0 x 10 1 KbE/g) nachweisbar Überschreitung des Schwellenwertes m = 10 KbE/g gemäß VO (EG) Nr. 2073/2005 (m = 10 KbE/g; m = 100 KbE/g) 18

19 4. Zusammenfassung Mikrobiologische Qualität geringe Belastung von Frischkäse mit Enterobacteriaceae und S. aureus, Freiheit von L. monocytogenes bei Lagerung sogar Abfall des Keimgehaltes Kontaminationsrisiko erhöht bei unverpackter Angebotsform sowie Zugabe von Gemüse und (Kraut-)Gewürzen aber: nur geringer Einfluss von Herstellungsweise und Vermarktungsform 19

20 4. Zusammenfassung und Ausblick Methodische Aspekte Nachweis von Enterobacteriaceae und coliformen Keimen wichtige Untersuchungsparameter zur Kontrolle der mikrobiologischen Qualität - fast ausschließlich coliforme Keime isoliert - Nachweis von coliformen Keimen deutlich geringerer Aufwand ECC-Agar als alternatives Selektivnährmedium geeignet Ausblick: Inverkehrbringen ständig neuer Erzeugnisse und Zubereitungen verlangt kontinuierliche Bewertung möglicher Risiken bei Verwendung von Rohmilch zur Herstellung von Frischkäse Neubewertung der Risiken erforderlich 20

21 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! 21