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Kai Brinkerhoff
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1 Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis VI Tabellenverzeichnis VIII Abkürzungsverzeichnis IX 1 Einleitung 1 2 Material und Methoden Liste der verwendeten Geräte und Feinchemikalien Geräte Verbrauchsmaterialien Fein- und Radiochemikalien Enzyme und Antikörper Enzyme Antikörper Nukleinsäuren Oligonukleotide Plasmid-Vektoren Biologisches Material Bakterienstämme Pflanzenmaterial Anzucht und Lagerung des biologischen Materials Anzucht, Transformation und Lagerung von Bakterien Anzucht von Escherichia coli zur heterologen Überexpression von Proteinen Anzucht nicht steriler Pflanzen Sterilisation des Saatguts Aussaat und Anzucht auf Festmedium Molekularbiologische Methoden Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli Isolierung von Gesamt-RNA aus Pflanzen Enzymatische Manipulation von Nukleinsäuren Erzeugung von komplementärer DNA Polymerase-Kettenreaktion Gelelektrophoretische Trennung von Nukleinsäuren Sequenzierung doppelsträngiger DNA Biochemische Methoden Kopplung von 5-Hydroxy-L-tryptophan an Rinderserumalbumin 22 I

2 2.7.2 Synthese von [ 3 H] 3-6-Azido-L-tryptophan Synthese von [ 3 H] 2-6-Azidoindol-3-acetamid Synthese von [ 2 H] 5 -Indol-3-acetamid Kopplung von Immunglobulin G an Sepharose Präparationsmethoden Gewinnung bakteriell überexprimierter Strep-tag-II- und (His) 6 -Fusionsproteine Präparation einer bakteriellen Tryptophan-2-Monooxygenase Reinigung der Tryptophan-Synthase von Salmonella typhimurium Präparation pflanzlicher Enzymrohextrakte Extraktion indolischer Verbindungen aus Pflanzengewebe Enzymatische Analysen Photometrische Bestimmung der Aktivität heterolog exprimierter Amidase Bestimmung der Aktivität bakteriell exprimierter Amidase mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie Nachweis des Indol-3-acetamid-Umsatzes in pflanzlichen Proteinextrakten Aktivitätsbestimmung der Nitrilasen Bestimmung der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität Analyse der Tryptophanmetabolisierung in pflanzlichen Proteinextrakten mittels gekoppelter HPLC/GC-MS/MS-Technik Chromatographische Trenntechniken Hochleistungsflüssigkeitschromatographie Präparative Reinigung von [ 3 H] 3-6-Azido-L-tryptophan Isolierung indolischer Komponenten aus komplexen Substanzgemischen Flüssigkeitschromatographie Präparative Ionenaustauschchromatographie an Hydroxyapatit High Q-Anionenaustauschchromatographie Hochdruckgelpermeationschromatographie Affinitätschromatographie an Strep-Tactin-Sepharose Affinitätschromatographische Reinigung von (His) 6 -Fusionsproteinen Immunaffinitätschromatographie Massenspektrometrie Darstellung des Indol-3-essigsäuremethylesters Synthese von Diazomethan 34 II

3 Trifluoracetylierung des Indol-3-acetamid Gaschromatographisch-massenspektrometrische Darstellung von Indol-3- essigsäure Analyse indolischer Verbindungen mittels gaschromatographisch-massenspektrometrischer Methoden Peptidsequenzierung mittels ESI-QTOF-Massenspektrometrie Elektrophoretische Trenntechniken SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese Blau-Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese Elektrophoretische Elution geladener Makromoleküle Immunologische Methoden Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf Nitrocellulose Immunologischer Nachweis immobilisierter Proteine Immunisierung von Kaninchen und Gewinnung von Antiseren Nachweis Strep-tag-II-markierter Fusionsproteine Reinigung spezifischer Antikörper Photoaffinitätsmarkierung von Proteinen unter Einsatz der Radioliganden [ 3 H] 3-6-Azido-L-tryptophan und [ 3 H] 2-6-Azidoindol-3-acetamid Proteinbestimmung Radioaktivitätsbestimmung Rechnergestützte Sequenzanalysen Auswertung 42 3 Ergebnisse Vergleich der Aktivität der IES-Synthase in unterschiedlichen Pflanzenspezies Anreicherung der tryptophanmetabolisierenden Proteinfraktion aus Arabidopsis thaliana Anreicherung der Indol-3-essigsäure-Synthase mittels Chromatographie an Hydroxyapatit Anreicherung der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität mittels High Q- Anionenaustauschchromatographie Molekulargewichtsbestimmung und Anreicherung des Indol-3-essigsäure- Synthase-Komplexes durch Hochdruckgelpermeationschromatographie Chromatographie an einer Tryptophanaffinitätsmatrix zur Reinigung des Indol-3-essigsäure-Synthase-Komplexes 48 III

4 3.3 Trennung angereicherter Indol-3-essigsäure-Synthase-Fraktionen durch native Gelelektrophorese Separation von Proteinkomplexen über exponentielle Gradientengele Molekulargewichtsbestimmung und Anreicherung der Indol-3-essigsäure- Synthase-Aktivität mittels Blau-Nativer Gelelektrophorese Beteiligung einer Flavin-Monooxygenase (YUCCA) an der tryptophanabhängigen Indol-3-essigsäure-Biosynthese Konstruktion und Überprüfung eines Expressionssystems zur heterologen Expression eines (His) 6 -YUCCA-Fusionsproteins Gewinnung polyklonaler Antikörper gegen YUCCA-Proteine Immunologischer Nachweis von YUCCA im Pflanzenrohextrakt Immunpräzipitation der Indol-3-essigsäure-Synthase unter Verwendung von α-yucca-antikörpern Analyse potentieller Metaboliten und Inhibitoren der Indol-3-essigsäure- Biosynthese Wirkung von Indol-3-essigsäurehydrazid auf die Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität Tryptamin als putative Zwischenstufe der Indol-3-essigsäure-Biosynthese Verdünnung der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität durch Indol-3- acetamid Tryptophan als biosynthetische Vorstufe von Indol-3-acetamid Einfluß von Tryptophan auf den in-vitro-umsatz von Indol-3-acetamid zur Indol-3-essigsäure Stereoselektivität der Indol-3-acetamid Synthese Vorkommen und Bildung von Indol-3-acetamid in Arabidopsis thaliana Endogener Indol-3-acetamid-Gehalt in sterilen Arabidopsis thaliana-keimlingen Indol-3-acetamid als zweites Endprodukt der Nitrilasereaktion Untersuchungen zur Metabolisierung von Indol-3-acetamid in Arabidopsis thaliana Analyse abgeleiteter Aminosäuresequenzen für Indol-3-acetamid-Hydrolasen aus pflanzenpathogenen Bakterien Analyse der Aminosäuresequenzen der vier putativen Amidasen aus Arabidopsis thaliana Konstruktion und Verifikation von Plasmid-Vektoren zur heterologen Expression von Amidase-Proteinen Enzymatische Charakterisierung der heterolog exprimierten Amidasen aus Arabidopsis thaliana Substratspezifität der bakteriell exprimierten Amidase-Fusionsproteine 85 IV

5 3.8.2 Ermittlung enzymatischer Parameter der Amidase Untersuchungen zur Tertiärstruktur des Strep-Amidase 1-Fusionsproteins Immunologischer Nachweis der Amidase 1 und 2 aus Arabidopsis thaliana Bestimmung der Amidaseaktivität im Pflanzenrohextrakt und Anreicherung der Enzymaktivität durch Chromatographie an Hydroxyapatit Amidasen als Bestandteil des Indol-3-essigsäure-Synthase-Komplexes Immunpräzipitation der Indol-3-essigsäure-Synthase unter Verwendung der α-ami-seren Versuche zur immunaffinitätschromatographischen Anreicherung des Indol-3-essigsäure-Synthase-Komplexes Versuche zur Photoaffinitätsmarkierung der Indol-3-essigsäure-Synthase Markierung der Indol-3-essigsäure-Synthase mit [ 3 H] 3-6-Azido- L-tryptophan Photoaffinitätsmarkierung unter Verwendung von [ 3 H] 2-6-Azidoindol-3-acetamid 98 4 Diskussion Zusammenfassung Literaturverzeichnis 124 Anhang 141 Danksagung 145 Lebenslauf 146 V

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