ELISA für die Bestimmung von humanem Dickkopf 3 (Dkk3) in Urin. Gebrauchsinformation

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1 ELISA für die Bestimmung von humanem Dickkopf 3 (Dkk3) in Urin Gebrauchsinformation 1001PE00.FWD 12 x 8 Bestimmungen 2 8 C DiaRen UG (haftungsbeschränkt) Universitätsklinikum Starterzentrum Gebäude Homburg Tel.: +49 (0)6841/ info@diaren.de

2 Inhalt 1. Einführung und Hintergrund 2. Sicherheitshinweise und Vorsichtsmaßnahmen 3. Testprinzip 4. Inhalt des Testkits 5. Benötigte, aber nicht mitgelieferte Materialien 6. Aufbewahrung des Testkits 7. Reagenzien- und Probenvorbereitung / Anforderungen an die Proben 8. Durchführung des Tests 9. Auswertung und Qualitätskontrolle 10. Interpretation der Ergebnisse / Grenzen der Methode 11. Testcharakteristika Standardisierung Analytische Spezifität Nachweisgrenze (analytische Sensitivität) Homogenität der Festphase Linearität Wiederfindung Präzision Häufigkeitsverteilung von Dkk3 12. Garantie und Haftung 13. Symbole 14. Literatur 15. Kurzanleitung Das hier beschriebene Produkt wurde in Übereinstimmung mit der IVD-Direktive 98/79/EG hergestellt. Document Id.-No. / Version: 1001PE00.FWD 2206Q dt.doc / Steffens Biotechnische Analysen GmbH Baumgartenstr. 5 - D Ebringen (FRG)

3 1. Einführung und Hintergrund Dickkopf-3 (Dkk3), Mitglied einer Familie von Modulatoren des Wnt-Pathways [1], wurde kürzlich identifiziert als ein Stress-induzierter, von tubulären Epithelzellen stammender Regulator der Nieren-Fibrose. Genetische Deletion, Blockade durch Antikörper und für tubuläre Epithelzellen spezifische Dkk3-Abschaltung reduzierten interstitielle Fibrose und tubulären Gewebsschwund in verschiedenen Maus- Modellen der chronischen Nierenerkrankung (chronic kidney disease, CKD) und hielten so die Nierenfunktion aufrecht [2]. Mechanistisch verursacht Dkk3-Mangel eine Verminderung der regulären Wnt/ß-catenin Signalübertragung in tubulären Epithelien unter pathologischen Bedingungen, begleitet von verstärkter antifibrogener entzündlicher Antwort in der verletzten Niere. Darüberhinaus wurde Dkk3-Protein im Urin von Patienten entdeckt, die unter verschiedenen Typen der CKD litten, und zwar spezifisch und quantitativ korreliert mit dem Ausmaß interstitieller Fibrose und tubulärer Atrophy in den Nierenbiopsie- Proben [2]. Interstitielle Fibrose und tubuläre Atrophy sind gemeinsame pathologische Manifestierungen von ätiologisch unterschiedlicher CKD, die möglicherweise zu Organversagen führen [3]. Daher ist die Menge an Dkk3 im Urin ein nicht-invasiver, diagnostischer Marker progressiver interstitieller Fibrose und tubulärer Atrophy in CKD. Der vorliegende Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) ist dazu bestimmt, Dkk3 in menschlichem Urin quantitativ zu bestimmen. In dieser Hinsicht dient er als spezifisches Messwerkzeug für das Ausmaß von Nieren-Fibrose und damit für das Risiko der CKD-Progression. Der Test ist schnell (Inkubationszeit 4 x 30 Minuten) und flexibel (teilbare Festphase, gebrauchsfertige Reagenzien). 6 Standards erlauben quantitative Messungen; eine negative und eine positive Kontrolle prüfen die Funktion des Testansatzes. 2. Sicherheitshinweise und Vorsichtsmaßnahmen Der Test ist ausschließlich für die in vitro-diagnostik bestimmt; nicht für die interne oder externe Anwendung an Menschen oder Tieren. Die Reagenzien nicht über ihr Verfallsdatum hinaus verwenden. Es wird nachdrücklich empfohlen, das Protokoll genau einzuhalten. Probenpuffer, Standards und Kontrollen enthalten Na-Azid als Präservativ. Der Waschpuffer enthält Bromonitrodioxan als Präservativ, das Konjugat Methylisothiazolon / Bromonitrodioxan. Das Substrat enthält 3, 3', 5, 5'- Tetramethylbenzidin (TMB) und Wasserstoffperoxid (H2O2). Die Stoplösung, 0,2 M Schwefelsäure (H2SO4), ist sauer und ätzend. Diese Reagenzien sind giftig, wenn sie aufgenommen werden. Daher müssen die üblichen Vorsichtsmaßnahmen bei der Handhabung gefährlicher Chemikalien getroffen werden. Jeden Körperkontakt vermeiden, Handschuhe und Schutzbrille tragen. Sollte - 1 -

4 dennoch Haut (oder Schleimhaut) von einem Reagenz benetzt werden, die betroffene Stelle sofort mit viel Wasser abspülen. Nicht mit dem Mund pipettieren. Die Reagenzien gemäß lokalen / nationalen Vorschriften entsorgen. Na-Azid kann mit Kupfer- und Bleirohren reagieren und explosive Metallazide bilden. Beim Entsorgen mit Wasser nachspülen, um eine Akkumulation zu verhindern. 3. Testprinzip Die Festphase-Kavitäten sind mit einem monoklonalen Dkk3-Antikörper beschichtet. An dieser Oberfläche laufen folgende Reaktionen ab: 1. Reaktion: Dkk3-Moleküle aus der Probe binden an den immobilisierten Fänger- Antikörper; es bildet sich der Antigen-Antikörper-Komplex. Nicht-gebundene Probenbestandteile werden anschließend von der Festphase gewaschen. 2. Reaktion: Ein zweiter Dkk3-Antikörper, polyklonal und biotinyliert, wird zugesetzt und bindet an den Komplex. Überschüssiger Antikörper wird anschließend von der Festphase gewaschen. 3. Reaktion: Ein Konjugat aus Streptavidin und Meerretich-Peroxidase (horse-radish peroxidase, HRP) wird zugesetzt und bindet an die Biotin-Gruppe des zweiten Dkk3-Antikörpers. Überschüssiges Konjugat wird anschließend von der Festphase gewaschen. 4. Reaktion: Der Enzym-markierte Komplex setzt ein farbloses Substrat in ein farbiges Produkt um. Das Ausmaß der Farbentwicklung spiegelt die Dkk3- Konzentration in der Probe wider. 4. Inhalt des Testkits a. 1 Mikrowell-Platte, beschichtet einem monoklonalen Dkk3-Fänger-Antikörper. Hermetisch in einem Beutel aus laminierter Metallfolie verpackt, zusammen mit Trockenmittel. Die Platte besteht aus 12 Streifen, die sich jeweils in 8 Einzelkavitäten teilen lassen. b. Probenpuffer, 100 ml, gebrauchsfertig, orange gefärbt. Enthält Tris-gepufferte Saline (TBS), bovines Serumalbumin (BSA), Tween und Na-Azid

5 c. Waschpuffer, 100 ml, 10x-Konzentrat, blau gefärbt. Enthält TBS, Tween und Bromonitrodioxan. d. 6 Standards à 2,0 ml, und 2000 pg Dkk3 / ml, gebrauchsfertig, abgestuft blau gefärbt. Enthalten TBS, BSA, Tween und Na-Azid. e. Negative und positive Kontrolle, je 2,0 ml, gebrauchsfertig, grün bzw. rot gefärbt. Enthalten TBS, BSA, Tween und Na-Azid. f. Zweiter Dkk3-Antikörper, Biotin-markiert, 14 ml, gebrauchsfertig, rot gefärbt. Gepufferte Lösung mit stabilisierendem Protein, Methylisothiazolon und Bromonitrodioxan. g. Streptavidin-HRP-Konjugat, 14 ml, gebrauchsfertig, grün gefärbt. Gepufferte Lösung mit stabilisierendem Protein, Methylisothiazolon und Bromonitrodioxan. h. Substrat, 14 ml, gebrauchsfertig, farblos. Enthält eine gepufferte Lösung von TMB und H2O2, abgefüllt in einem Licht-undurchlässigen Gefäß. i. Stoplösung (0,2 M H2SO4), 14 ml, farblos, gebrauchsfertig. Vorsicht: Schwefelsäure ist ätzend. j. Gebrauchsinformation k. Chargen-spezifisches Analysen-Zertifikat 5. Benötigte, aber nicht mitgelieferte Materialien a. Deionisiertes oder destilliertes Wasser - 3 -

6 b. Messzylinder, 1000 ml c. Reagenzröhrchen für die Probenverdünnung (Transfer-Röhrchen im Mikrowell- Plattenformat empfohlen) d. Pipetten für 100 und 1000 µl (1- und 8-Kanalpipetten empfohlen) e. Mikrowell-Plattenwascher (optional), Mikrowell-Plattenphotometer mit 450 nm- Filter und ein ELISA Auswertungsprogramm (empfohlen) 6. Aufbewahrung des Testkits Der Testkit muss bei 2-8 C gelagert werden. Er ist bis zum Verfallsdatum einsetzbar, das auf dem Etikett der Verpackung angegeben ist; danach nicht mehr verwenden. 7. Reagenzien- und Probenvorbereitung / Anforderungen an die Proben Wegen möglicherweise unterschiedlichen Lagerungs- und Transport-Bedingungen dürfen korrespondierende Komponenten aus verschiedenen Kits nicht vermischt oder gegeneinander ausgetauscht werden. a. Den Beutel mit der Festphase akklimatisieren lassen, erst dann öffnen. Die für den aktuellen Test evtl. nicht benötigten Kavitäten sofort aus dem Gitterrahmen nehmen und zusammen mit dem Trockenmittel in den Folienbeutel zurücklegen. Diesen hermetisch verschließen und bis zur künftigen Verwendung weiter gekühlt lagern. b. Das Waschpuffer-10x-Konzentrat (100 ml, blau) wird mit 900 ml deionisiertem Wasser verdünnt und gut durchmischt. Gekühlt bei 2-8 C ist diese Lösung für mehrere Wochen stabil. c. Präparation der Proben: Patientenproben als potenziell infektiös betrachten und entsprechend vorsichtig handhaben. Vor ihrer Analyse müssen die Urinproben durch Zentrifugation geklärt werden; 10 Minuten bei ca. 370 g (2000 rpm). Den Überstand 1:10 verdünnen, bspw. 100 µl µl Probenpuffer. Die Verdünnungen gut durchmischen. Zum schnellen Dispensieren während des Testablaufs empfiehlt es sich, Standards, Kontrollen und Proben in Transferröhrchen (Microwell-Format) vorzulegen. Dann kann mit einer 8-Kanal-Pipette gearbeitet werden. Proben, die nicht sofort analysiert werden können, müssen bei 2-8 C gelagert und innerhalb von 3 Tagen gemessen werden. Ist eine längere Lagerung vorgesehen, so müssen sie eingefroren werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist zu vermeiden. Aufgetaute Proben vor dem Verdünnen durchmischen

7 Anforderungen an die Proben: Die mittlere Fraktion des Morgenurins in einen passenden Behälter mit dicht schließendem Deckel sammeln. Mikrobiell verunreinigte Proben können falsche Ergebnisse liefern und sollten vermieden werden. Proben mit erkennbarer Vollblut-Kontamination (Gesamt-Hämaturie) oder deutlicher Hämolysis können im Test interferieren und sollten verworfen werden. Umstände, die bekanntermaßen generell die Proteinbestimmung im Urin beeinflussen (bspw. Körperlicher Stress, Fieber, Infektion, Menstruationsperiode, Schwangerschaft) sollten berücksichtigt werden. 8. Durchführung des Tests Bevor der Test gestartet wird, müssen alle Kitkomponenten Raumtemperatur (23 ± 3 C) angenommen haben. Um das bestmögliche Ergebnis (d.h. ein maximales Verhältnis zwischen spezifischem und Hintergrund-Signal) zu erreichen, ist sorgfältiges Waschen ganz wesentlich (Schritte a, c und e). Insbesondere ist es wichtig, die Waschlösung vollständig aus den Kavitäten zu entfernen. Dazu klopft man die Mikrowell-Platte auf Saugpapier aus. Automatische Wascher müssen daraufhin geprüft werden, ob ihre Ergebnisse mit denen vergleichbar sind, die mit manuellem Waschen erzielt werden. a. Je 100 µl der Standards (je 2,0 ml, gebrauchsfertig, abgestuft blau), der Kontrollen (je 2,0 ml, gebrauchsfertig, grün und rot) sowie der verdünnten und durchmischten Proben zügig in die Kavitäten pipettieren. Doppelbestimmungen werden empfohlen. Die Mikrowell-Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur (23 ± 3 C) inkubieren. b. Die Kavitäten entleeren, dann mit je 350 µl Waschpuffer füllen und wieder entleeren. Die Prozedur noch dreimal wiederholen. c. Je 100 µl des zweiten Dkk3-Antikörpers (biotinyliert, 14 ml, gebrauchsfertig, rot) zügig (am besten mit einer 8-Kanal-Pipette) in die Kavitäten pipettieren. Die Mikrowell-Platte inkubieren wie in Schritt a. d. Waschschritt b wiederholen. e. Je 100 µl Streptavidin-HRP-Konjugat (14 ml, gebrauchsfertig, grün) zügig (am besten mit einer 8-Kanal-Pipette) in die Kavitäten pipettieren. Die Mikrowell-Platte inkubieren wie in Schritt a. f. Waschschritt b wiederholen. g. Je 100 µl Substrat (14 ml, gebrauchsfertig, farblos, im schwarzen Gefäß) zügig (am besten mit einer 8-Kanal-Pipette) in die Kavitäten pipettieren. Inkubieren wie in Schritt a. Das Substrat ist lichtempfindlich; direkte Belichtung (bspw. Sonnenlicht) während der Inkubation vermeiden

8 h. Je 100 µl Stoplösung (14 ml, gebrauchsfertig, farblos. Vorsicht ätzend!) zügig (am besten mit einer 8-Kanal-Pipette) in die Kavitäten pipettieren; in derselben Reihenfolge wie beim Substrat: Farbumschlag von blau nach gelb. Die Festphase für ein paar Sekunden agitieren, am besten auf einem Schüttler. i. Die Platte sofort im Mikrowell-Plattenphotometer bei 450 nm messen. Überschüssige Reagenzien weiter bei 2-8 C lagern, wenn sie später noch einmal verwendet werden sollen. 9. Auswertung und Qualitätskontrolle Die Messdaten werden anhand der Standardkurve quantitativ ausgewertet. Die unten dargestellte Kurve kann jedoch nicht die Messung der Standards bei der Testdurchführung ersetzen, zusammen mit den Kontrollen und den aktuellen Proben. Sie dient lediglich als Modell. Die Kurve wurde von einem üblichen ELISA Auswertungsprogramm mit einer 4-Parameter-Funktion errechnet; die Spline- Approximation ist ebenso geeignet mod 450nm pg Dkk3 / ml sample 1001PE00.FED / ver Steht keine Rechner-gestützte Auswertung zur Verfügung, so zeichnet man die Standardkurve per Hand und liest an ihr die Dkk3-Konzentration in den Proben ab (pg Dkk3 pro ml verdünnter Urin). Der Messwert mit 10 multipliziert ergibt die Dkk3- Konzentration in der Original-Probe. Anmerkung: 10 ist die empfohlene Probenverdünnung (Vgl. Abschnitt 7c). Es ist unkritisch, bei hochkonzentrierten Proben eine höhere Verdünnung als 10x zu - 6 -

9 verwenden. Allerdings könnte eine Verdünnung < 10x störende Matrixeffekte verursachen; die Ergebnisse solcher Proben sollten mit Vorsicht interpretiert werden. Qualitätskontrolle: Die positive und die negative Kontrolle dienen der Überprüfung des Tests. Ihre jeweiligen Sollwerte und akzeptablen Bereiche sind im Chargenspezifischen Analysen-Zertifikat angegeben. Die Messwerte der Kontrollen müssen innerhalb der Toleranzgrenzen liegen, sonst sind die Ergebnisse des Tests ungültig. 10. Interpretation der Ergebnisse / Grenzen der Methode Auf der Basis einer Serienmessung von gesunden Normalproben und eines positiven Kollektivs (s.u.) schlagen wir für die Beurteilung von Patientenurin vor: normaler (negativer) Bereich Cut-off grenzwertiger Bereich positiver Bereich < 420 pg Dkk3 pro ml unverdünntem Urin 500 pg Dkk3 pro ml unverdünntem Urin pg Dkk3 pro ml unverdünntem Urin > 600 pg Dkk3 pro ml unverdünntem Urin Diese Spezifikationen sind nur als Anhaltspunkt zu verstehen. Zu ihrer Überprüfung sollten in jedem Test Normal-Urine mitgeführt werden. Ein negatives Testergebnis zeigt, dass der Patient eine normale Dkk3-Konzentration im Urin aufweist. Bedingt durch die relativ geringe diagnostische Sensitivität des Tests (s.u.) kann dennoch eine geringe Verletzung von Nierengewebe nicht ausgeschlossen werden. Ein positives Testergebnis sollte als Hinweis auf eine Verletzung von Nierengewebe angesehen werden; also auf das Vorliegen interstitieller Fibrose. Wegen der relativ hohen diagnostischen Spezifität des ELISAs (s.u.) ist seine bestätigende Aussagekraft signifikant. Proben mit grenzwertigen Resultaten sollten als zweifelhaft betrachtet und als solche berichtet werden. Es empfiehlt sich, nach etwa 4 Wochen eine weitere Probe zu messen, parallel mit der zuerst entnommenen, um eine mögliche Änderung der Dkk3-Konzentration im Urin zu erfassen. Wie bei jedem serologischen Test sollten dessen Resultate nicht isoliert interpretiert werden, sondern im Zusammenhang mit den Symptomen des Patienten und anderen diagnostischen Kriterien. 11. Testcharakteristika Standardisierung Der Test ist kalibriert mit einem gereinigten Präparat von rekombinantem human- Dkk3. Die Dkk3-Konzentration der Proben wird in pg / ml angegeben

10 11.2. Analytische Spezifität Der Test erlaubt die spezifische Bestimmung von humanem Dkk3 in Urin Nachweisgrenze (analytische Sensitivität) Die Nachweisgrenze ist definiert als diejenige Konzentration des Analyten, die dem OD- Mittelwert des Probenpuffers entspricht, zu dem die 3-fache Standardabweichung (s) addiert wurde. Sie wurde zu < 30 pg Dkk3 / ml Probenpuffer bestimmt (n = 24). Berücksichtigt man die übliche 1:10-Probenverdünnnung, so erfasst der Test Dkk3 zuverlässig bis herunter zu ca. 300 pg / ml Original-Probe. Empfohlener Messbereich für die verdünnten Proben: pg Dkk3 / ml (vgl. Absatz 11.5) Festphasen-Homogenität Dieser Parameter ist regulärer Bestandteil der QC jeder Produktions-Charge. Die Homogenität wird bestimmt durch 288-fache Messung einer Dkk3-haltigen, aber nicht sättigenden Probe auf 3 ausgewählten Platten. Akzeptanz-Kriterium: mod- Variationskoeffizient (VK) über die Platten < 8%. Die folgenden Abbildungen zeigen einen repräsentativen Auszug einer solchen Analyse (Ch.-Bez. der Festphase: 2806P). line a line b line c line d line e line f line g line h mod 450nm mod450nm n/2 1 n n/2 2 n n/2 3 n n/2 4 n 4 plate # row # 1001PE00.FED Linearität Um die Dosis / Wirkungs-Beziehung des Tests zu bestimmen, wurden positive Seren in serieller Zweifachverdünnung gemessen. Akzeptanz-Kriterium: Die lineare Regression vierer sukzessiver Verdünnungen muss einen Korrelationsfaktor > 0,98-8 -

11 ergeben. Ein typisches Ergebnis ist hier abgebildet. Eine annähernd lineare Beziehung zwischen Dosis und Wirkung besteht bis zu einer Menge von 10 µl Original-Urin pro Kavität pg Dkk3 / ml urine 1 urine 2 urine 3 lin.regr.1 lin.regr.2 lin.regr nl urine / well 1001PE00.FED / ver Wiederfindung Um einen möglichen Quencheffekt der Probenmatrix zu erkennen, wurde die Wiederfindung von authentischem Dkk3 bestimmt, das zu negativen Urinproben gegeben wurde; ein Auszug ist hier wiedergegeben. Die Messungen zeigten keinerlei Ergebnis-Verminderung durch die Probenmatrix. Im Gegenteil wurde die Dkk3- Wiederfindung durchgängig zu ca. 120% gefunden. Probe endogenes Dkk3 Spike-Konzentration (pg / ml Urin) Dkk pg / ml Urin % Wiederfindung urine urine urine Präzision Um die Präzision des Tests zu ermitteln, wurde die Variabilität der Ergebnisse unter folgenden Bedingungen ermittelt: a. innerhalb eines Assays und zwischen 3 Assays, b. zwischen 3 Anwendern und c. zwischen 2 Kit-Chargen

12 a. Intra- und inter-assay Variabilität (n = 24 bzw. 72) Probe Mittelwert Variabilität (VK, %) pg Dkk3/mL verdünnter Probe intra-assay inter-assay ,1 4, ,4 5, ,5 5,1 b. Operator-zu-Operator Variabilität (n = 12) Probe Mittelwert Variabilität pg Dkk3/mL verdünnter Probe (VK, %) , , ,2 c. Variabilität zwischen 2 Kit-Chargen (n = 18) Probe Mittelwert Variabilität pg Dkk3/mL verdünnter Probe (VK, %) , , , Häufigkeitsverteilung von Dkk3 Diese wurde bestimmt in einem Urinproben-Kollektiv von augenscheinlich gesunden Probanden und einem Kollektiv von klinisch-definierten, positiv erwarteten Urinproben. Folgende Verteilung des Analyten wurde beobachtet. Augenscheinlich gesundes Kollektiv: n: 69 MW: 254 pg Dkk3 / ml urine MW + s: 451 pg Dkk3 / ml urine Median: 195 pg Dkk3 / ml urine 95. Perzentile: 693 pg Dkk3 / ml urine Kollektiv von Nierenpatienten mit Biopsie-diagnostizierter interstitieller Fibrosis: n: 49 MW: 3926 pg Dkk3 / ml urine MW - s: pg Dkk3 / ml urine Median: 805 pg Dkk3 / ml urine 5. Perzentile: 0 pg Dkk3 / ml urine

13 apparently healthy individuals 80 relative frequency (%) cut-off 0 < pg Dkk3 / ml urine patients with kidney interstitial fibrosis 80 relative frequency (%) cut-off 0 < pg Dkk3 / ml urine 1001PE00.FED / ver Mittels ROC-Analyse dieser Daten wurde der Cut-off des ELISAs zu 500 pg Dkk3 pro ml Urin bestimmt (4). Aus den hier gezeigten Daten ergibt sich eine diagnostische Spezifität des Tests von ca. 91 %, während seine diagnostische Sensitivität nur 61 % erreicht. Daher ist ein positives Ergebnis erheblich signifikanter als ein negatives; der Test eignet sich besser, eine Verletzung des Nierengewebes zu bestätigen als sie auszuschließen. Die genannten Werte gelten nur für die gemessenen Urinproben; andere Kollektive können abweichende Ergebnisse erzielen

14 12. Garantie und Haftung Steffens biotechnische Analysen GmbH (SBA) garantiert, dass das ausgelieferte Produkt gründlich getestet wurde, um sicherzustellen, dass es seine Spezifikationen erfüllt und der hier gegebenen Beschreibung entspricht. Weitergehende Garantien werden nicht gegeben. Die hier genannten Testcharakteristika wurden mit der angegebenen Methode ermittelt. Jede Änderung der Methode kann die Ergebnisse beeinflussen. In einem solchen Fall verweigert SBA jede Haftung, ob ausgesprochen, impliziert oder gesetzlich. Darüber hinaus kann SBA keinerlei Haftung für Schäden übernehmen, die aufgrund einer unkorrekten Lagerung oder Anwendung des Produktes entstanden sind; direkt, indirekt oder als Konsequenz. 13. Symbole Artikel Nummer Chargen-Bezeichnung enthält x Bestimmungen Für in vitro diagnostische Anwendung Conformité Européenne lichtgeschützt aufbewahren

15 bei 2-8 C lagern Verfallsdatum Gebrauchsinformation lesen Warnung biologisches Risiko Hergestellt von 14. Literatur 1. Glinka, A., et al.: Dickkopf-1 is a member of a new family of secreted proteins and functions in head induction. Nature 1998; 391: Federico, G., et al.: Tubular Dickkopf-3 promotes the development of renal atrophy and fibrosis. Journal of Clinical investigation Insight 2016; 1: e Liu, Y. Cellular and molecular mechanisms of renal fibrosis. Nature Reviews Nephrology 2011; 7: Sommer, R., and Eitelberger, F.: Wertigkeit der Gliadin-Antikörper im Serum zur Diagnose der Zöliakie. Wien Klin Wochenschr 104/4 (1992),

16 15. Kurzanleitung a. Die Urinproben 10 Minuten bei ca. 370 g zentrifugieren; den Überstand 1/10 in Probenpuffer (100 ml, gebrauchsfertig, orange) verdünnen; Verdünnungen durchmischen. b. Das Waschpuffer-Konzentrat (10x, 100 ml, blau) verdünnen und mischen. c. Je 100 µl der Standards (je 2,0 ml, gebrauchsfertig, abgestuft-blau), der Kontrollen (je 2,0 ml, gebrauchsfertig, grün und rot) sowie der geklärten, verdünnten und durchmischten Proben in die Kavitäten der Festphase dispensieren. Doppelbestimmungen sind zu empfehlen. 30 Minuten bei Raumtemperatur (23 ± 3 C) inkubieren. d. Die Kavitäten jeweils 4x mit 350 µl Waschpuffer waschen. e. Je 100 µl des biotinylierten Dkk3-Antikörpers (14 ml, gebrauchsfertig, rot) in die Kavitäten dispensieren. Inkubieren wie in Schritt c. f. Waschschritt d. wiederholen. g. Je 100 µl des Streptavidin-HRP-Konjugats (14 ml, gebrauchsfertig, grün) in die Kavitäten dispensieren. Inkubieren wie in Schritt c. h. Waschschritt d. wiederholen. i. Je 100 µl des Substrats (14 ml, gebrauchsfertig, schwarzes Fläschchen) in die Kavitäten dispensieren. Inkubieren wie in Schritt c. Dann je 100 µl Stoplösung (14 ml, gebrauchsfertig, farblos) zusetzen und die Platte kurz schütteln. j. Sofort die Absorption bei 450 nm messen. k. Die Standardkurve ermitteln und anhand dieser Kurve die Absorption der Proben in ihre jeweilige Dkk3-Konzentration (pg / ml) umformen. Multiplikation dieser Werte mit dem Verdünnungsfaktor (üblicherweise 10) ergibt die Dkk3- Konzentration der jeweiligen Original-Urinprobe