Analytical Quality by Design in der HPLC Qualitätskriterien einer HPLC-Trennung

Transkript

1 Analytical Quality by Design in der HPLC Qualitätskriterien einer HPLC-Trennung Dr. Hans-Werner Bilke LC-Pharm-HPLC-Expert Service Analytical Quality by Design (AQbD) ist ein risikobasierter und wissenschaftlich fundierter Ansatz zur Entwicklung und Validierung von analytischen Methoden. Zur Trennung komplexer Gemische sollten in einem Chromatogramm möglichst viele Peaks mit genügender Auflösung nebeneinander Platz haben. Die Anzahl der Peaks ist umso größer, je höher die Trennstufenzahl der Säule ist und je länger man gewillt ist, auf den letzten Peak zu warten [1]. Durch die Angabe der Zahl möglicher Peaks ZMP ist ein weiteres Qualitätskriterium für eine HPLC-Trennung gegeben [2]. Es wird eine strukturierte Methodik zur Ermittlung der Zahl möglicher Peaks einer HPLC- Trennung unter Berücksichtigung von Auflösung, Analysenzeit und Robustheit vorgestellt. Einführung Wichtige Zielgrößen zur Optimierung einer HPLC-Trennung sind die kritische Auflösung Rs,krit. (Auflösung für das am schlechtesten getrennte Peakpaar im Chromatogramm) und die Retentionszeit des letzten Peaks im Chromatogramm trmax zur Minimierung der Analysenzeit. Die Zahl möglicher Peaks ZMP -Zahl der Peak, die mit einer bestimmten Auflösung, in der Regel 1.5, in einem definierten Retentionszeitfenster getrennt werden- könnte eine weitere Zielgröße in der Optimierung einer HPLC-Trennung sein. Mit den Retentionszeiten trmax und tr1 und den Peakbreiten whmax und wh1, die man ohne Mühe von jedem Chromatographie-Datensystem erhält, kann die Zahl möglicher Peaks einer HPLC-Trennung (Rs=1.5) einfach berechnet werden nach [3]: trmax tr1 ZMP 2.4(whmax wh1) ln whmax wh1 Eine mehr als 1 Zielgröße umfassende multifaktorielle Optimierung einer HPLC-Trennung kann alleinig mit einem Multizielgrößen-/Multieinflussgrößen-Modell zielführend durch Verknüpfung von chromatographischer Modellierungssoftware und statistischer DoE-Software realisiert werden. Das QbD-Konzept für die Sicherung der Qualität von HPLC-Trennungen verbindet die sehr effektiven Arbeitsweisen von Computer unterstützter (U)HPLC-Trennoptimierung (CMD) und statistischer Versuchsplanung (DoE) [4-11]. Zielgröße ZMP der HPLC-Trennung Zur Optimierung der HPLC-Trennung wird im 1. Schritt ein Rechtschaffner-Versuchsplan mit 29 Versuchen (Anhang) für die Modellierung der 6 Einflussgrößen tg, T, %Bs, %Be, ph, F und der Zielgröße ZMP erstellt, abgearbeitet und ausgewertet. In Auswertung der Versuchsplanexperimente der Maximierung der Zielgröße ZMP (Abbildung 1) wird ein ZMP-Wert von 40 ausgewiesen. Die einzelnen Faktoren haben einen stark unterschiedlichen Einfluss auf die HPLC- Trennung. Den größten Einfluss auf HPLC- Trennung hat Faktor tg mit 38.5%. Am geringsten wird die HPLC-Trennung durch den ph des wässrigen Eluenten A beeinflusst Abb. 2. Chromatogramm der Maximierung von ZMP. (2.7%). Die Abbildung 2 zeigt das Chromatogramm des robusten Arbeitspunktes der Maximierung der Zielgröße ZMP. Für das kritische Peakpaar 6/7 der HPLC-Trennung wird keine Trennung ausgewiesen und Peak 7 eluiert vor Peak 6 (Peakumkehr). In einem 2. Schritt lassen wir uns deshalb für die Maximierung der Zielgröße ZMP die Auflösungswerte Rs der 7 möglichen Peakpaare und die Retentionszeit für den letzten Peak im Chromatogramm trmax sowie die Faktoreinstellungen Abb. 1 Robuster Arbeitspunkt der Maximierung der Zielgröße ZMP. -1-

2 Rs = 0.26 Abb. 3 Prognostizierte Zielgrößen und Faktoreinstellungen der Maximierung der Zielgröße ZMP. für den robusten Arbeitspunkt des multidimensionalen Design Space voraussagen. Die prognostizierten Werte für Zielgrößen und Einflussgrößen der HPLC-Trennung sind in der Abbildung 3 wiedergegeben und in der Abbildung 4 visualisiert. In Auswertung der Versuchsplanexperimente wird die bei der ZPM-Maximierung gefundene unzureichende Auflösung für kritische Peakpaar 6/7 der HPLC-Trennung mit einem Rs von 0.4 bestätigt und ein geringfügig höherer ZMP-Wert von 41 prognostiziert. Die Abbildung 4 zeigt Chromatogramm und Daten des Chromatographie-Datensystems für den robusten Arbeitspunkt der ZMP-Maximierung Abb. 4. Chromatogramm mit Retentionszeiten und Basis-Peakweiten für alle Peaks sowie der Auflösung für die Peakpaare. unter Berücksichtigung der Prognosewerte für alle 9 Zielgrößen der HPLC-Trennung, simuliert mit der(u)hplc-modellierungssoftware DryLab 4.0. Aus den Chromatogramm-Daten lässt sich die Zahl der möglichen Peaks berechnen: ZMP ln 2.4( ) 0.04 = 43 Zwischen 1,16 min und 6.66 min haben theoretisch 43 Peaks mit einer Auflösung von R = 1.5 Platz. Zugleich ist aber auch aus dem Chromatogramm zu entnehmen, dass in der Praxis nicht alle benachbarten Peaks getrennt sind. Für das am schlechtesten getrennte Peakpaar (kritisches Peakpaar 6/7) wird eine unzureichende Auflösung von Rs = 0.3 angezeigt. Die mit statistischer Versuchsplanungssoftware (MODDE 12 Pro) berechneten und von Computer unterstützter (U)HPLC-Modellierungssoftware (DryLab 4.0) simulierten Qualitätskriterien Auflösung Rs, Retentionszeit trmax und Zahl möglicher Peaks stimmen recht gut überein. In einem 3. Schritt wird nun aufgezeigt, wie man sowohl einen maximalen ZMP-Wert als auch eine Auflösung von Rs 1.5 für das kritische Peakpaar einer HPLC-Trennung bei möglichst kurzer Analysenzeit erreichen kann. Abb. 5 Rohdaten der Versuchsplanexperimente. -2-

3 Rohdaten der Versuchsplanexperimente Betrachten wir zunächst die Zielgrößen-Daten der Versuchsplanexperimente (Abbildung 5). Die Rohdaten der 29 Versuchsplanexperimente des Rechtschaffner-Versuchsplanes weisen für das Peakpaar 6/7 negative Auflösungswerte (sehr häufig bei Optimierungsexperimenten aufgrund breiter Faktorvariierung) auf. Bedingt durch die Faktoreinstellungen der Experimente 3, 4, 5, 23 und 28 des Versuchsplanes kehrt sich die Elutionsreihenfolge für das kritische Peakpaar 6/7 um. Daher werden für dieses Peakpaar vorzeichenabhängige Auflösungswerte Rs von Rs = -3.3 bis 5.2 (Abbildung 6) prognostiziert. alle Faktoren nach Belieben variiert werden können, ohne dass Gefahr besteht, dass irgendein Auflösungs-Wert Rs unter 1.5 fällt. In der Abbildung 9 sind die Design Space Hypercube Plots für die Faktoren tg und F in Abhängigkeit von den Optimierungskriterien Maximierung und Minimierung der Auflösung des kritischen Peakpaares Rs 6/7 dargestellt. Diese beiden Faktoren haben den größten Einfluss auf die simultane, robuste Optimierung der 6 Faktoren tg, ph, T, F, %Bs, %Be und der 7 Zielgrößen Rs 1/2, Rs 2/3, Rs 3/4 Rs 5/6, Rs 6/7, trmax, ZMP. Mit dem Design Space Hypercube werden zusätzlich zum robusten Arbeitspunkt (Kreuz) die maximalen Faktor-Einstellungen grafisch Simultane Optimierung der 3 Zielgrößen Auflösung Rs, ZMP und trmax Für eine zielführende Optimierung der 3 Zielgrößen Auflösung Rs, ZMP und trmax ist es deshalb erforderlich zu überprüfen, welches der möglichen Optimierungskriterien Maximierung oder Minimierung der Auflösung des Peakpaares 6/7 zu einem größeren Design Space und somit zu einer robusteren HPLC-Trennung führt (Abbildung 7). Für beide Optimierungskriterium Maximierung oder Minimierung wird für alle Peakpaare eine Auflösung von Rs 1.5 gefunden und durch die Chromatogramme am robusten Arbeitspunkt bestätigt (Abbildung 8). Für die Minimierung der Zielgröße Rs 6/7 wird eine längere Analysenzeit (trmax = 7.84 min) und folgerichtig der größere ZMP-Wert mit 42 ausgewiesen. Mit dem Design Space Hypercube, dem größtmöglichen regelmäßigen Hyperwürfel im höchst unregelmäßigen Design Space Volumen [12], werden die Ergebnisse der ZMP- Optimierung visualisiert. Ein Hypercube (dunkelgrünes Rechteck), ist ein hochdimensionaler Würfel, der die Method Operable Design Region (MODR) definiert [13]: Für jeden Faktor wird ein Bereich angegeben, in dem Abb. 6 Abb. 7 Prognostizierte Grenzwerte Pred. min und Pred. max für die Zielgrößen Rs, trmax und ZMP der ZMP-Optimierung. Simultane a) Maximierung, b) Minimierung der Zielgröße Rs 6/7 und Maximierung der Zielgröße ZMP bei Minimierung von trmax. ZMP = 31 ZMP = 42 Rs = 2.2 trmax = 6.36min Rs = -2.6 trmax = 7.84min Abb. 8 Chromatogramme am robusten Arbeitspunkt Maximierung der Zielgröße Rs 6/7 und Minimierung der Zielgröße Rs 6/7. -3-

4 angezeigt. Augenscheinlich werden einerseits je nach Wahl des Optimierungskriteriums stark unterschiedliche globale Arbeitspunkte gefunden und andererseits führt die Wahl des Optimierungskriteriums Maximierung der Auflösung des kritischen Peakpaares 6/7 zu einem deutlich größeren Design Space Hypercube (dunkelgrünes Rechteck). Bei Minimierung der Auflösung des kritischen Peakpaares 6/7 wird mit 42 Peaks zwar die höchste Zahl an möglichen Peaks im definierten Retentionszeitfenster getrennt, jedoch verbunden mit einem deutlich kleineren Design Space Hypercube, d.h. mit einer wesentlich geringeren Robustheit der HPLC-Trennung. Ableitend vom Design Space Hypercube der HPLC-Trennung, wird nun für jeden Faktor der HPLC-Trennung der bewährte Bereich ermittelt. Mit den erhaltenen Design Space Hypercube -Grafiken für die simultane Maximierung/Minimierung der Zielgröße Rs 6/7 (Abbildung 10), werden die maximalen Faktor- Einstellungen tabellarisch durch die Werte für Hypercube low edge und Hypercube high edge ausgewiesen und in einem Balkendiagramm auch grafisch dargestellt. Die grünen Balken markieren die Bereiche, innerhalb derer alle Faktoren mit einem eingestellten Fehlerrisiko von 1% gleichzeitig und ohne weitere Einschränkungen geändert werden können unter Einhaltung der vorgegebenen Spezifikationen (Rs,krit. 1.5, trmax 9min). Sie sind für die simultane Maximierung der Zielgröße Rs 6/7 wesentlich breiter gegenüber jenen der simultanen Minimierung der Zielgröße Rs 6/7 und bestätigen die Aussagen zur Abhängigkeit der Robustheit der HPLC-Trennung vom Optimierungskriterium für die Zielgröße Rs 6/7. Die mit DryLab simulierten Chromatogramme (Abbildung 11 und 12) an den Punkten Hypercube low edge und Hypercube high edge des hochdimensionalen Design Space belegen die Einhaltung der vorgegebenen Spezifikationen (Rs,krit. 1.5, trmax 9min.) der ZMP-Optimierung, unabhängig von der Wahl des Optimierungskriteriums. Zusammenfassung Eine möglichst hohe Peakzahl, eine Trennung aller Peaks und eine möglichst kurze Analysenzeit wird bei einer ZMP-Optimierung nur erreicht, wenn die Zielgrößen Rs und trmax in die Optimierung mit einbezogen werden. Beim Vorliegen von negativen Werten für die Auflösung des kritischen Peakpaares, ist die Abhängigkeit der Zielgröße ZMP vom Optimierungskriterium des kritischen Peakpaares der HPLC-Trennung zu beachten. Abb. 9: Design Space Hypercube für Maximierung und Minimierung der Zielgröße Rs 6/7. Abb. 10: Abb. 11: Abb. 12: Design Space Hypercube-Tabelle Maximierung und Minimierung der Zielgröße Rs 6/7 mit dem Zulässigkeitsbereich für die Faktoren des robusten Arbeitspunktes. Chromatogramme Hypercube low edge und Hypercube high edge der Maximierung der Zielgröße Rs 6/7 (kleiner ZMP-Wert, hohe Robustheit). Chromatogramme a) Hypercube low edge und b) Hypercube high edge der Minimierung der Zielgröße Rs 6/7 (hoher ZMP-Wert, geringere Robustheit). Werden obige Aussagen berücksichtigt, ist die Zahl der möglichen Peaks ZMP durchaus ein Qualitätskriterium einer HPLC-Trennung und kann somit als Zielgröße für die Optimierung der HPLC-Trennung benutzt werden. Referenzen und Literatur [1] V.R. Meyer, Fallstricke und Fehlerquellen der HPLC in Bildern. Hüthig Verlag Heidelberg [2] T. Welsch, GDCH-Vortrag [3] T. Welsch, persönliche Mitteilung Januar (2018) [4] H.W. Bilke und S. Moser, LABORPRAXIS 4 (2013) [5] H.W. Bilke, LABORPRAXIS 8 (2014) [6] H.W. Bilke, LABORPRAXIS 9 (2015) [7] H.W. Bilke und A. Orth, LABORPRAXIS 11 (2016) [8] H.W. Bilke, LABORPRAXIS 4 (2017) [9] H.W. Bilke und A. Orth, Analytik News, Sept [10] H. W. Bilke, Analytik News, Nov [11] H. W. Bilke, Analytik News, Juni 2017 [12] C. Vikström Robust Optimization, MKS Umetrics AB, IFPAC presentation (2014). [13] A. Orth, GIT 3/

5 Anhang Abb. Anhang: Einflussgrößen, Zielgrößen und Rechtschaffner-Versuchsplan -5-