In situ Hybridisierung an Hanf (Cannabis sativa L.) Chromosomen

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1 Aus dem Institut für Pflanzenzüchtung und Pflanzenschutz Der Landwirtschaftlichen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg In situ Hybridisierung an Hanf (Cannabis sativa L.) Chromosomen als Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor agriculturarum (Dr. agr.) vorgelegt von Diplomagraringenieur Marko Riedel Halle/Saale 2005 urn:nbn:de:gbv: [

2 Aus dem Institut für Pflanzenzüchtung und Pflanzenschutz Der Landwirtschaftlichen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg In situ Hybridisierung an Hanf (Cannabis sativa L.) Chromosomen als Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor agriculturarum (Dr. agr.) vorgelegt von Diplomagraringenieur Marko Riedel geb. am in Lutherstadt Wittenberg Gutachter: Prof. Dr. habil W. E. Weber Prof. Dr. habil W. Diepenbrock Dr. habil V. Schubert Verteidigung am: Halle / Saale 2005 urn:nbn:de:gbv: [

3 Inhaltsverzeichniss 1 Einleitung 1 2 Stand des Wissens Grundlagen der Geschlechtsbestimmung Geschlechtsbestimmungsmechanismen allgemein Entwicklung der Geschlechtschromosomen Geschlechtsbestimmung bei Pflanzen Sexuell monomorphe Pflanzen Sexuell polymorphe Pflanzen Hanf Botanik Cytologie Molekulargenetik 14 2 Material und Methoden Material Pflanzenmaterial Bakterien und Vektoren Methoden DNA-Isolierung Pflanzliche Gesamt-DNA Bakterien Plasmid-DNA (Plasmid Mini-Prep.) Hanfpollenisolierung Polymerase Kettenreaktion (PCR) basierende Methoden Standard PCR RAPD (random amplifiyed polymorphic DNA) DOP-PCR (degenerated oligonucleotid primed-pcr) I-PEP-PCR (improved primer extension preamplification-pcr) PCR Walking AFLP (amplified fragment length polymorphism) Touchdown-PCR DNA-Sequenzierung Elektrophorese Fragmentisolierung aus Elektrophoresegelen Klonierung von DNA-Fragmenten Bakterielle Dauerkulturen 22

4 2.2.9 Sondenherstellung Southern Blot Blotten von Bakterienkolonien DNA-DNA Hybridisierung Chomosomenpräparation FISH (Fluoreszens in situ Hybridisierung) 25 3 Ergebnisse Entwicklung männlich-spezifischer SCAR-Marker Isolierung von männlich-spezifischen PCR-Fragmenten Sequenzierung der Klone und Herstellung sequenzspezifischer Primer Test der SCAR-Primer an männlichen und weiblichen Hanfpflanzen Entwicklung PAR-spezifischer SCAR-Marker Sequenzierung der Klone und Herstellung sequenzspezifischer Primer Test der SCAR-Primer an Hanfpflanzen Differenzielles Screening einer Hanf-DNA-Bank nach repetitiven geschlechtsspezifischen Klonen Amplifikation von Pollen-DNA mit degenerierten Primern PCR Walking Southern-Blot Analyse Southern-Blot Analyse geschlechtsspezifischer Fragmente Southern-Blot Analyse PAR-spezifischer Fragmente Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Chromosomenpräparation für die FISH Etablierung der Fluoreszenz in situ Hybridisierung bei Hanf Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit geschlechtsspezifischen Sonden Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit PAR-spezifischen Sonden 56 4 Diskussion Entwicklung geschlechtsspezifischer Sonden Entwicklung von geschlechts- und PAR-spezifischen SCAR-Markern Konvertierung von geschlechtsspezifischen RAPD-Markern in SCAR- Marker Konvertierung von PAR-spezifischen AFLP-Markern in SCAR-Marker Southern-Blot Analyse molekularer Marker Screening von DNA-Banken nach geschlechtsspezifischen Klonen Fluoreszens in situ Hybridisierung (FISH) 77

5 4.2.1 Etablierung der FISH bei Hanf FISH mit geschlechtsspezifischen Sonden FISH mit PAR-spezifischen Sonden 84 5 Zusammenfassung 86 6 Literaturverzeichniss 88 7 Anhang 103 Abbildungsverzeichnis 103 Tabellenverzeichnis 104 Tabellen Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen