Chlamydia MIF IgA (Deutsch)

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1 (Deutsch) REF IF1250A Rev. R Mikro Immunofluoreszenz-Assay (MIF) zum Nachweis humaner Serum-IgA-Antikörper gegen Chlamydia pneumoniae und Chlamydia trachomatis Diese Packungsbeilage ist nur für den Export und nicht für den Vertrieb in den USA. Außerhalb der Vereinigten Staaten: Für die In-vitro-Diagnostik ANWENDUNGSBEREICH Der Chlamydia Mikro Immunofluoreszenz-Assay (MIF) IgA von Focus Diagnostics ist für den qualitativen Nachweis und zur Semiquantifizierung humaner IgA-Serumantikörper gegen Chlamydia pneumoniae und Chlamydia trachomatis bestimmt. Der Assay ist nicht zur Eigenverwendung vorgesehen. ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG DES TESTVERFAHRENS Chlamydien sind obligat intrazelluläre Organismen, die in Säugetieren und Vögeln akute und chronische Krankheiten verursachen. Der Lebenszyklus der Chlamydien kann in zwei verschiedene Phasen unterteilt werden: eine nicht-vermehrungsfähige, extrazelluläre und infektiöse Phase und eine obligat intrazelluläre, aber nicht-infektiöse Vermehrungsphase. Die infektiöse Form der Chlamydien, das so genannte Elementar-Körperchen (EK), haftet sich an die Zielzelloberfläche an und wird durch Phagozytose in die Zelle aufgenommen. Nach der Aufnahme in die Zelle reorganisiert sich das Elementarkörperchen zu Retikularkörperchen (RB), welche Einschlusskörperchen bilden, und die Vermehrung durch Spaltung der Retikularkörperchen beginnt. Nach etwa 18 bis 24 Stunden findet eine Kondensation der Retikularkörperchen zu Elementarkörperchen statt, die daraufhin aus der Zelle freigesetzt werden und einen neuen Infektionszyklus beginnen können 1. Die Elementarkörperchen der Chlamydien besitzen gattungs- oder gruppenspezifische, artspezifische und serotypenspezifische Antigene. Die gruppenspezifischen Antigene sind am engsten mit dem Lipopolysaccharid (LPS) der äußeren Membran verbunden. Dieses LPS kann extrahiert werden und wird häufig zur Herstellung gruppenspezifischer Antigene für serologische Assays verwendet. Das häufigste Protein der äußeren Membran (MOMP) enthält art-und serotypenspezifische Antigene und bildet ca. 60% der äußeren Membran des Organismus. Mit der äußeren Membran der Chlamydien sind noch mehrere andere strukturelle Proteine assoziiert, bei der Induktion der Immunantwort im Menschen dominieren jedoch LPS und MOMP 9. Die Gattung Chlamydia wird durch drei unterschiedliche Arten repräsentiert. Chlamydia trachomatis besteht aus 12 verschiedenen Serotypen (A bis L) und ist der ätiologische Verursacher von Trachomen, Lymphogranuloma venereum (LGV), Urogenitalinfektionen und Pneumonien im Kindesalter 2. 65% der Kinder, die per Vaginalgeburt von infizierten Müttern zur Welt gebracht werden, werden mit C. trachomatis infiziert. 3 Die meisten Infektionen mit C. trachomatis verlaufen asymptomatisch. 3 65% der Kinder, die per Vaginalgeburt von infizierten Müttern zur Welt gebracht werden, werden mit C. trachomatis infiziert. 3 C. psittaci wird durch viele Serotypen repräsentiert, die für die Psittakose beim Menschen verantwortlich sind. Bei der Psittakose handelt es sich um eine akute Zoonose, die durch infizierte Vögel übertragen wird 4. C. psittaci wird durch viele Serotypen repräsentiert, die für die Psittakose beim Menschen verantwortlich sind. Bei der Psittakose handelt es sich um eine akute Zoonose, die durch infizierte Vögel übertragen wird 4. Die seit kurzem bekannte Art C. pneumoniae wird mit Pneumonien in Verbindung gebracht. Antikörper gegen C. pneumoniae sind bei 25 bis 45% der untersuchten Erwachsenen nachweisbar und verursachen ungefähr 10% aller Pneumoniefälle 7,8. Eine Infektion mit C. pneumoniae kann subklinisch verlaufen. Zur Diagnose von Chlamydien-Infektionen können Zellkultur, der direkte Fluoreszenzantikörper (DFA)-Test und Serologie herangezogen werden. PCR, positive Kulturen und DFA sind dabei die aufschlussreichsten Tests. DFA und Kulturverfahren sind jedoch aufwändig, bedingt vor allem durch die Gewinnung des benötigten Materials, durch den Transport und durch die Komplexität des Testverfahrens selbst 4,10. Als Folge davon werden für Routinediagnosen hauptsächlich serologische Verfahren wie die Komplementfixierung (KF), der indirekte Immunofluoreszenz-Assay (IFA) und der Enzym-Immunoassay (EIA) verwendet 3. Die Serologie kann für die vorläufige Diagnose bestimmter Chlamydieninfektionen (LGV, Säuglingspneumonien durch C. trachomatis, Psittakose, Pneumonien durch C. pneumoniae) herangezogen werden; für die Routinediagnostik von Genitalinfektionen durch C. trachomatis ist sie jedoch nicht geeignet. KF- Chlamydientests sind seit 1940 erhältlich. Dieser Test verwendet angereichertes LPS-Antigen zum Nachweis gruppenspezifischer Antikörper. KF-Tests sind technisch schwierig durchzuführen und zeichnen sich durch geringe Sensitivität aus 4. Kommerziell vorhandene EIAs verwenden ein häufig vorkommendes kreuzreagierendes Antigen, das in der Regel aus einem LGV-Serotyp stammt. Die Konsequenz davon ist, dass, ähnlich zu den KF-Tests, nur gruppenspezifische Antikörperreaktionen nachgewiesen werden können 9. Es stehen zwei verschiedene Arten von indirekten Immunofluoreszenz-Assays zur Verfügung. Infizierte Zellen, die komplette Chlamydien-Einschlusskörperchen exprimieren, stellen das Substrat der einen Gruppe von IFA dar. Dabei werden von den Retikularkörperchen, aus denen die Einschlusskörperchen bestehen, gattungsspezifische Epitope gebildet, was den differenzierten Nachweis artspezifischer Antikörperreaktionen verhindert 11. Die andere Art von IFA, ein Mikro- Immunofluoreszenz-Assay (MIF), der in den 70er Jahren vorgestellt wurde 9, verwendet gereinigte Elementarkörperchen (EK) als Substrat. Durch die Entfernung gattungsreaktiver LPS-Antigene können die gereinigten EK zum Nachweis art- und serotypenspezifischer Antikörperreaktionen gegen Chlamydien verwendet werden. Elementarkörperchen können aus allen Chlamydienarten und -serotypen gereinigt und entweder gemeinsam oder individuell als Substrat verwendet werden 9. In den Vereinigten Staaten sind Pneumonien die führende Todesursache bei Infektionserkrankungen. Jährlich gibt es in den Vereinigten Staaten ungefähr 4 Millionen Fälle von Community-acquired Pneumonia (außerhalb des Krankenhauses erworbene Pneumonie; CAP) und dies führt zu einer Million Krankenhauseinweisungen. Eine Pneumonie ist eine akute Atemwegsinfektion, die von einem Infiltrat auf Röntgenaufnahmen des Brustkorbs begleitet ist oder beim Abhören aufgrund ihrer typischen Anzeichen (z.b. veränderte Atemgeräusche) erkannt wird. Diagnose und Behandlung einer CAP werden zunehmend durch neu aufkommende Krankheitserreger erschwert. Zu den häufigsten Erregern einer atypischen Pneumonie gehören heute Chlamydien, Mykoplasmen und Legionellen. Die Beschreibung typisch ist in gewissem Sinn veraltet, da sie aus einer Zeit stammt, in der die Mehrzahl von Pneumonien durch Streptococcus pneumoniae verursacht wurde. Die primäre Immunantwort auf eine Chlamydieninfektion sind Antikörper vom IgM-Typ, die bereits in einer frühen Phase der Infektion erscheinen. Kurz nach der initialen IgM-Antwort erscheinen IgG- und IgA-Antikörper. Die frühe IgG-, IgM- und IgA-Antikörperantwort gegen Chlamydien ist gegen gruppen- und gegen artspezifische Antigene gerichtet. Bei einer primären Infektion mit Chlamydien ist ein vierfacher Anstieg des IgG-Spiegels diagnostisch eindeutig. Bei Verdacht auf Infektion mit C. pneumoniae oder mit C. psittaci ist ein nachweisbarer IgM-Spiegel hochdiagnostisch 12. Der Nachweis von IgM in Patienten mit C. trachomatis ist allerdings weniger prädiktiv für eine akute C. trachomatis-infektion. Die IgM-Antwort ist nur bei 28 bis 33% der Patienten mit akuter C. trachomatis-infektion nachweisbar, kann jedoch auch bei Patienten ohne aktive Chlamydieninfektion vorkommen 12. Charakteristisch für eine primäre C. pneumoniae-infektion ist die Ausbildung einer IgM-Antwort innerhalb von 2 bis 4 Wochen, eine verzögerte IgG-Antwort

2 Seite 2 innerhalb von 6 bis 8 Wochen 13 und eine schwache oder fehlende IgA-Antwort 18. Nach einer akuten C. pneumoniae-infektion verschwinden die IgM-Antikörper innerhalb von 2 bis 6 Monaten 13, während der IgG-Titer ansteigt und gewöhnlich langsam abfällt und IgA-Antikörper in der Regel rasch verschwinden 19. Jährlich gibt es weltweit rund 92 Millionen neue Fälle von Infektionen mit Chlamydia trachomatis (WHO, 2001). In den USA und anderen Industrienationen sind es jährlich geschätzte vier Millionen neue Fälle. Von den Infizierten sind bis zu 70% der Frauen und 50% der Männer asymptomatisch. Sowohl bei Frauen als auch bei Männern verursacht C. trachomatis häufig asymptomatische Infektionen des Genitaltraktes, wobei die Bakterien im Wirt monatelang infektiös bleiben können. Es gibt daher eine hohe Zahl von unerkannt infizierten Personen, die die Infektion durch sexuellen Kontakt auf andere Männer und Frauen übertragen. Männer lassen sich üblicherweise weniger häufig diagnostizieren, und die meisten berichteten Infektionen treten in der Altersgruppe von 15 bis 24 Jahren auf. Aus diesem Grund wird die Anzahl der Infizierten generell unterschätzt, obgleich C. trachomatis eines der häufigsten sexuell übertragbaren Humanpathogene ist, dessen Infektion heilbar ist. Diese Tatsache ist für das allgemeine Gesundheitswesen relevant, da C. trachomatis vor allem bei Frauen ernste Langzeitfolgen haben kann. Der Erreger ist als Verursacher von entzündlichen Beckenerkrankungen bekannt, die zu Unfruchtbarkeit, Eileiterschwangerschaften und chronischen Schmerzzuständen führen können. Diese Erkrankungen können für die Betroffenen erhebliche lebenslange Konsequenzen haben und können hohe Behandlungskosten verursachen. Bei Kindern, die von Chlamydia-infizierten Müttern entbunden werden, kann der Erreger darüber hinaus neonatale Konjunktivitis und Pneumonien verursachen. Eine entzündliche Beckenerkrankung oder PID (Pelvic Inflammatory Disease) ist ein komplexes Syndrom, zu dem unterschiedliche entzündliche Erkrankungen wie Endometriose, Salpingitis und Tuboovarialabszess gezählt werden. Diese Erkrankungen werden durch eine Reihe von unterschiedlichen Organismen verursacht. Im Gegensatz zur Behandlung von Infektionen mit anderen sexuell übertragbaren Organismen gibt es für Patienten mit PID keine bestimmte therapeutische Behandlungsform der Wahl. Einige Antibiotika haben sich bei Patienten mit PID als hoch wirksam erwiesen und eine klinische Heilung erreicht. Die Therapiemöglichkeiten für Patienten mit PID zielen in erster Linie auf Flexibilität ab. Dazu gehören typischerweise die Breitbandabdeckung möglicher ätiologischer Pathogene. Bei der Auswahl eines Behandlungsregimes sind Kriterien wie beispielsweise der verursachende Erreger sowie die örtliche Verfügbarkeit der Behandlung, Aspekte der Kostenkontrolle, die Akzeptanz auf Seiten des Patienten und regionale Unterschiede im Hinblick auf die antimikrobielle Suszeptibilität zu berücksichtigen. Diese Breitbandbehandlung für Patienten mit PID erfolgt so lange, bis das Ergebnis aus Untersuchungen zur genaueren Aufklärung vorliegt. Jedes Regime sollte C. trachomatis, N. gonorrhoeae, anaerobe Bakterien, gramnegative Stäbchen und Streptokokken abdecken 14. Screeningprogramme für C. trachomatis sollten speziell darauf ausgerichtet sein, einen wesentlichen Anteil an asymptomatischen Infektionen zu erfassen und zu behandeln, um dadurch eine Verringerung der Morbidität in Verbindung mit Chlamydieninfektionen sowie der Inzidenz und Prävalenz der Infektionen zu erzielen. Wenn auch die Serologie Verfahren zum Direktnachweis von Chlamydia trachomatis nie ersetzen kann, so gibt es dennoch Fälle, bei denen zuverlässige serologische Tests hilfreich sind. Tatsächlich sind Urogenitalinfekte mit diesen Bakterien häufig unauffällig. Die Bestimmung von Antikörpern gegen Antigene von C. trachomatis kann daher herangezogen werden, um nachzuweisen, ob ein Patient eine Infektion hatte. Beispielsweise ist ein positiver serologischer Test bei chronisch Infizierten, bei denen die Bakterien nicht mehr nachweisbar sind, unter Umständen die einzige Indikation einer Beteiligung von Chlamydien. 15 Mikroimmunfluoreszenztests (MIF) gelten als serologischer Goldstandard. Anhand von MIF können Akutphasen-Antikörper gegen C. trachomatis bei Patienten mit entzündlichen Beckenerkrankungen serologisch häufiger nachgewiesen werden als mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) oder mit Gewebekulturen von Zervix- oder Harnröhrenproben der Infizierten 17. Es stehen eine Reihe weiterer Tests zur Verfügung, um Antikörper gegen C. trachomatis in Humanserum nachzuweisen, darunter Komplementfixierung, EIA und Radioimmunoassays. Die in diesen Tests verwendeten Antigene variieren erheblich, aber alle Tests messen Antikörper gegen verschiedene Antigendeterminanten von Chlamydia-Arten. Bei den meisten Frauen mit akuter Beckenentzündung sind Serumantikörper gegen C. trachomatis nachweisbar, häufig mit hohem Titer. Da Serumantikörper nach der akuten Infektion jahrelang persistieren, ist die Diagnose einer akuten Chlamydien-PID mit Serumantikörpertests problematisch. Einige Untersuchungen lassen allerdings den Schluss zu, dass bestimmte kurzlebige Antikörper vom Typ Immunglobulin A (IgA) einen möglichen Marker einer aktiven Chlamydieninfektion darstellen. 16 In einer Studie 15 wurden mittels Western-Blot-Analyse von Serumproben von gesunden Blutspendern und Patienten mit C. trachomatis-infektion Antikörperantworten auf vollständige Antigene von C. trachomatis untersucht. Die Ergebnisse der Western-Blot-Analyse ergaben, dass die IgM-Antwort auf eine kleine Anzahl von Antigenen beschränkt zu sein scheint, wohingegen IgA und besonders IgG sehr viele Antigene erkannten. Es wurde außerdem gezeigt, dass die Anzahl der IgG-, IgM- und IgA-Antworten auf vollständige Chlamydia-Antigene in Serum von Patienten mit C. trachomatis-infektion höher war als bei Seren von gesunden Blutspendern. In Untersuchungen zum prozentualen Anteil an Personen mit Serumantikörpern gegen synthetische Proteine oder rekombinante Antigene wurde gezeigt, dass Patienten mit C. trachomatis-infektion signifikant mehr IgG gegen LPS, MOMP, hsp60 und pgp3 und mehr IgA gegen LPS und MOMP aufwiesen als gesunde Blutspender. Der Chlamydia MIF-Assay von Focus Diagnostics verwendet einen Stamm von C. pneumoniae, zwei Stämme von C. psittaci und acht Serotypen (D K) von C. trachomatis. Die Chlamydien-Elementarkörperchen werden mit einem rechtlich geschützten Verfahren behandelt, um das beeinträchtigende LPS zu entfernen, und werden daraufhin in 3%iger Dottersackmatrix verdünnt, um den Konttrast gegenüber der Hintergrundfluoreszenz zu erhöhen. Jeder Objektträger enthält zwölf Reaktionsfelder. Auf jedem Reaktionsfeld befinden sich vier einzelne Erkennungsstellen. Jedes Reaktionsfeld enthält dabei getrennte Erkennungsstellen für jede Spezies und eine separate Dottersack-Kontrolle. DAS TESTPRINZIP Der Mikro-Immunfluoreszenz-Antikörper (MIF) Assay ist ein Zwei-Schritt-Verfahren, ein sogenanntes Sandwich. Im ersten Schritt werden die Patientenseren mit PBS verdünnt. Die verdünnten Seren werden auf die einzelnen Reaktionsfelder pipettiert und zur Erkennung und Reaktion mit dem Substrat inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wird der Objektträger in PBS gewaschen, um ungebundene Serumantikörper zu entfernen. Im zweiten Schritt wird jedes Antigen- Reaktionsfeld mit Fluoreszein-markierten Antikörpern gegen humanes IgA inkubiert. Auf diese Weise können Antigen-Antikörper-Komplexe mit Fluoreszeinmarkiertem Anti-IgA reagieren. Nachdem die Objektträger gewaschen, getrocknet und eingedeckt sind, können sie im Fluoreszenzmikroskop untersucht werden. Im Falle einer positiven Reaktion erscheinen die EK hell und apfelgrün fluoreszierend vor der Hintergrundmatrix des Dottersackes. Halb-quantitative Endtiter der positiven Proben werden in einer seriellen Verdünnungsreihe bestimmt. GELIEFERTES MATERIAL Das Testkit von Focus Diagnostics beinhaltet genügend Material für die Durchführung von 120 Bestimmungen. Chlamydien MIF Substratobjektträger REF IF1201 Ag (Chlamydia MIF Substrate Slide) Zehn Objektträger mit jeweils 12 Reaktionsfeldern. Jedes Feld enthält vier Erkennungsstellen: eine Dottersack-Kontrolle und drei verschiedene Antigen- Erkennungsstellen mit EKs, suspendiert in einer Dottersackmatrix. Verschlossene Packungen bei 2 bis 8 C aufbewahren. Die verschlossenen Objektträger sind bis zum Datum auf dem Packungsetikett haltbar. Zur Vermeidung von Kondensation, die Objektträger vor dem Öffnen der Packung auf Raumtemperatur erwärmen lassen.

3 Seite 3 Hinweis: Die meisten Fluoreszensmikroskope erzeugen ein seitenverkehrtes Abbild des Objektträgers. Bei der Darstellung im Mikroskop erscheinen die Antigene wie unten abgebildet. IgA Konjugat Duale Spezies, 3,5 ml REF IF1209 CONJ IgA (IgA Conjugate-Dual Species) Ein Fläschchen mit einem Gemisch aus Fluoreszein-markiertem Ziegen-Anti-Human-IgA, spezifisch für die Alpha-Kette, und Fluoreszein-markiertem Ziegen- Anti-Maus-IgG. Anti-Maus-IgG wurde als Kontrolle der spezifischen Antigenreaktion standardisiert. Enthält Evans-Blue Gegenfärbelösung, Proteinstabilisator und Konservierungsmittel. Sofort verwendbar. Stabil bei 2 bis 8 C bis zum Verfallsdatum auf dem Packungsetikett. Nicht verwenden bei Verfärbung, Eintrübung oder anderen Anzeichen einer bakteriellen Kontamination. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Polyvalente Nachweisbare Kontrolle, 0,30 ml REF IF1214 CONT > (Polyvalent Detectable Control) Ein Fläschchen mit monoklonalen Antikörpern von der Maus, unverdünnt verwenden. Enthält Konservierungsmittel. Stabil bei 2 8 C bis zum Verfallsdatum auf dem Packungsetikett. Nicht verwenden bei Verfärbung, Eintrübung oder anderen Anzeichen einer bakteriellen Kontamination. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Nicht verdünnen. Nicht Nachweisbare Kontrolle, 0,25 ml REF IF1213 CONT < (Non-Detectable Control) Ein Fläschchen mit Humanserum, unverdünnt verwenden. Enthält Konservierungsmittel. Stabil bei 2 8 C bis zum Verfallsdatum auf dem Packungsetikett. Nicht verwenden bei Verfärbung, Eintrübung oder anderen Anzeichen einer bakteriellen Kontamination. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen beeinträchtigt die Qualität des Produkts und sollte vermieden werden. Nicht verdünnen. Eindeckmedium, 2,5 ml REF IF0007 REAG MONT (Mounting Medium) Eine Tropfenspenderflasche mit phosphatgepuffertem Glycerin, ph 7,2 ± 0,1. Enthält Konservierungsmittel. Bei 2 bis 8 C bis zum auf dem Packungsetikett angegebenen Datum haltbar. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen lassen. PBS REF IF0005 BUF (PBS) Ein Fläschchen mit gepufferter Salzlösung in Pulverform. In 1 Liter destilliertem (oder gereinigtem) Wasser auflösen. Die Lösung ist 0,01 M mit einem ph von 7,2 ± 0,1. PBS vor und nach dem Auflösen bei 2 bis 8 C aufbewahren. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Nicht verwenden bei Eintrübung, Einfärbung oder anderen Anzeichen einer bakteriellen Kontamination. BENÖTIGTE MATERIALIEN, DIE NICHT IM LIEFERUMFANG ENTHALTEN SIND x 50 mm Deckgläser 2. Teströhrchen und Gestell, Mikrozentrifugenröhrchen oder Mikrotiterplatte zur Herstellung von Serumverdünnungen. 3. Klinische Zentrifuge bis 37 C Inkubator oder Wasserbad zur Inkubation der Objektträger 5. 2 bis 8 C Kühlschrank 6. Spülflasche aus Plastik 7. Kalibrierte Pipetten oder Pipettoren mit Einwegspitzen 8. Coplingefäß oder Färbebesteck mit Objektträgerhalter 9. Saubere Reagenzbecher oder geeichte Zylinder, 1 Liter 10. Feuchte Kammer zur Inkubation der Objektträger 11. Destilliertes (oder gereinigtes)wasser 12. Stoppuhr 13. Absorbierendes Papier zum Abtupfen der Objektträger 14. Fluoreszenzmikroskop; empfohlene Parameter: Exzitationsfilter nm Barrierenfilter nm Lichtquelle HBO 100W, Hg Objektiv 20 40X, Fluoreszenz, hoch trocken WARNUNGEN UND SICHERHEITSVORKEHRUNGEN 1. Diese Packungsbeilage ist nur für den Export und nicht für den Vertrieb in den USA. Außerhalb der Vereinigten Staaten ist der Verwendungszweck für die In-vitro-Diagnostik. 2. Alle Blutprodukte sollten als potentiell infektiös angesehen werden. Das Ursprungsmaterial dieses Produktes (einschließlich der Kontrollen), ist mit US- FDA-anerkannten Methoden auf HBs-Antigen, Hepatitis C-Antikörper und HIV-1/2 (AIDS) Antikörper untersucht und für negativ befunden worden. Dennoch gewährleistet keine der bekannten Testmethoden absolute Garantie dafür, dass Produkte, die aus menschlichem Blut gewonnen wurden, die genannten oder andere infektiöse Krankheiten nicht übertragen können. Alle Kontrollen, Serumproben und Geräte, die in Kontakt mit den Proben kommen, sollten daher als potentiell infektiös angesehen und durch entsprechende Sicherheitsmaßnahmen dekontaminiert oder beseitigt werden. CDC und die nationalen Institute der Gesundheit empfehlen, dass möglicherweise ansteckende Mittel auf dem Biosafety Niveau 2 angefasst werden. 2,21,24

4 Seite 4 3. Evans Blue ist ein Karzinogen. Kontakt mit Haut oder Augen vermeiden. 4. Reagenzien nicht durch Komponenten anderer Packungen oder durch Reagenzien anderer Hersteller ersetzen. 5. Nur die Protokolle auf diesem Beipackzettel verwenden. Veränderung der angegebenen Inkubationszeiten oder Temperaturen kann zu einer Verfälschung der Testergebnisse führen. 6. Kreuzkontaminationen von Patientenproben auf den Objektträgern können zu einer Verfälschung der Testergebnisse führen. Patientenproben daher vorsichtig auf die Objektträger auftragen, um ein Zusammenmischen von Seren benachbarter Reaktionsfelder zu vermeiden. 7. Bakterielle Kontamination von Serumproben oder Reagenzien kann zu einer Verfälschung der Testergebnisse führen. Zur Vermeidung von Kontamination sterile Arbeitstechniken benutzen. 8. Den Assay bei Raumtemperatur durchführen (bei ca. 20 bis 25 C). 9. Korrekte Pipettiertechniken anwenden und die Reihenfolge des Pipettierens während des gesamten Vorgangs beibehalten, um optimale und reproduzierbare Werte zu gewährleisten. 10. Das Eindeckmedium enthält 30 bis 60 % Glycerin, welches bei Inhalation oder Hautkontakt zu Reizungen führen kann. Nach Inhalation oder Berührung sollten Erste-Hilfe-Maßnahmen eingeleitet werden. HALTBARKEITSDAUER UND HANDHABUNG DER KITS 1. Alle Komponenten sind stabil bis zum Monatsende des Verfalldatums bei einer Lagerung bei 2 bis 8 C. 2. Testausrüstung und deren Bestandteile nur bis Ablauf des Verfalldatums verwenden. 3. Reagenzien während der Lagerung oder Inkubation vor starkem Lichteinfall schützen. 4. Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen lassen. PROBENENTNAHME UND VORBEREITUNG Serum ist die bevorzugte Probenquelle. Es wurde nicht untersucht, ob auch andere Proben mit diesem Test untersucht werden können. Hyperlipämische, hämolysierte oder kontaminierte Seren können zu einer Verfälschung der Testergebnisse führen und ihr Gebrauch sollte daher vermieden werden. Probenentnahme und Handhabung Blutproben aseptisch unter Anwendung standardisierter Blutabnahme-Techniken und durch qualifiziertes Personal entnehmen 21. Die Blutproben vor dem Zentrifugieren bei Raumtemperatur koagulieren lassen. Auf einen sterilen Transfer des Serums in einen fest verschließbaren, sterilen Behälter zur Aufbewahrung achten. Wird der Assay nicht innerhalb von 5 Tagen abgeschlossen, die Proben bei mindestens 20 C einfrieren. Vor dem Gebrauch die Proben auftauen und gut mischen. Probenvorbereitung Die Screening-Verdünnung der Proben ist 1:16, verdünnt in PBS. Für die Herstellung einer seriellen Verdünnungsreihe der Screening-Verdünnungen und zur Bestimmung des Endtiters PBS verwenden. DAS TESTVERFAHREN (bei 37ºC inkubieren) 1. Objektträger aus dem Kühlschrank nehmen und vor dem Öffnen der Packung Raumtemperatur annehmen lassen, um Kondensation zu vermeiden µl der gebrauchsfertigen Nachweisbare Kontrolle auf das vorgesehene Reaktionsfeld geben µl der gebrauchsfertigen Nicht Nachweisbare Kontrolle auf das vorgesehene Reaktionsfeld geben µl der verdünnten Serumproben (siehe Probenvorbereitung, oben) auf die vorgesehenen Reaktionsfelder geben. Zur besseren Identifikation beim Ablesen der Ergebnisse Auftragsreihenfolge notieren. 5. Objektträger in einer feuchten Kammer für 30 ± 2 Minuten bei 35 bis 37 C inkubieren. 6. Objektträger aus der feuchten Kammer entfernen und die Reihen einzeln vorsichtig mit PBS spülen. Dabei nicht direkt auf die Reaktionsfelder zielen. Objektträger durch Eintauchen in Coplingefäß oder Färbetrog mit PBS für 10 Minuten waschen. 7. Gewaschene Objektträger kurz in destilliertes (oder gereinigtes) Wasser tauchen und an der Luft trocknen. 8. Ungefähr 25 µl IgA Konjugat Duale Spezies auf jedes Reaktionsfeld geben. 9. Objektträger in einer feuchten Kammer für 30 ± 2 Minuten bei 35 bis 37 C inkubieren. 10. Waschschritte 6 und 7 wiederholen. 11. Einige Topfen Eindeckmedium auf die Objektträger auftropfen und mit einem Deckglas (24 X 50 mm) eindecken. Luftblasen absaugen und überschüssiges Eindeckmedium abtupfen. 12. Reaktionsfelder bei 400-facher Vergrößerung mit einem Fluoreszenzmikroskop untersuchen. Für optimale Fluoreszenz die Objektträger am selben Tag untersuchen; ansonsten im Dunkeln bei 2 bis 8 C bis zu 24 Stunden aufbewahren. DAS TESTVERFAHREN (bei Raumtemperatur inkubieren) 1. Objektträger aus dem Kühlschrank nehmen und vor dem Öffnen der Packung Raumtemperatur annehmen lassen, um Kondensation zu vermeiden µl der gebrauchsfertigen Nachweisbare Kontrolle auf das vorgesehene Reaktionsfeld geben µl der gebrauchsfertigen Nicht Nachweisbare Kontrolle auf das vorgesehene Reaktionsfeld geben µl der verdünnten Serumproben (siehe Probenvorbereitung, oben) auf die vorgesehenen Reaktionsfelder geben. Zur besseren Identifikation beim Ablesen der Ergebnisse Auftragsreihenfolge notieren. 5. Objektträger abgedeckt für 60 ± 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 6. Objektträger-Reihen einzeln vorsichtig mit PBS spülen. Dabei nicht direkt auf die Reaktionsfelder zielen. Objektträger durch Eintauchen in Coplingefäß oder Färbetrog mit PBS für 10 Minuten waschen. 7. Gewaschene Objektträger kurz in destilliertes (oder gereinigtes) Wasser tauchen und an der Luft trocknen. Hinweis: Bei Gebrauch einer automatischen Waschvorrichtung ist es ggf. nicht möglich, die Objektträger vor Zugabe des Konjugates lufttrocknen zu lassen. 8. Ungefähr 25 µl IgA Konjugat Duale Spezie auf jedes Reaktionsfeld geben. 9. Objektträger abgedeckt für 30 ± 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 10. Waschschritte 6 und 7 wiederholen. 11. Einige Topfen Eindeckmedium auf die Objektträger auftropfen und mit einem Deckglas (24 X 50 mm) eindecken. Luftblasen absaugen und überschüssiges Eindeckmedium abtupfen. 12. Reaktionsfelder bei 400-facher Vergrößerung mit einem Fluoreszenzmikroskop untersuchen. Für optimale Fluoreszenz die Objektträger am selben Tag untersuchen; ansonsten im Dunkeln bei 2 bis 8 C bis zu 24 Stunden aufbewahren. QUALITÄTSKONTROLLE Jedes Mal, wenn ein oder mehrere Objektträger untersucht werden, sollten sowohl Nachweisbare als auch Nicht Nachweisbare Kontrollen enthalten sein.

5 Seite 5 Validität des Tests 1. Die Nachweisbare Kontrolle sollte auf allen Elementarkörperchen eine 2+ bis 4+ Fluoreszenz und mit der Dottersack-Kontrolle eine vernachlässigbare Fluoreszenz ergeben. 2. Die Nicht Nachweisbare Kontrolle sollte keine Reaktivität mit Elementarkörperchen aufweisen. Weichen die Ergebnisse der Kontrollen von diesen Angaben ab, sollten die Patiententests als ungültig betrachtet und der Test wiederholt werden. Die Nachweisbare und Nicht Nachweisbare Kontrolle sollen sicher stellen, dass die Testreagenzien korrekt arbeiten. Die Nachweisbare Kontrolle wird mithilfe von Maus-Antikörpern und nicht mit Antikörpern des Menschen hergestellt. Die Nachweisbare Kontrolle dient lediglich der Gewährleistung einer korrekten Funktion. Entsprechend den Richtlinien oder Vorgaben der örtlichen, bundesstaatlichen und/oder staatlichen Behörden oder Zulassungsorganisationen können zusätzliche Kontrollen getestet werden. Validität der Proben Hintergrundfluoreszenz. In manchen Fällen kann eine Probe mit Dottersackverdünnung reagieren. Der Test kann nicht interpretiert werden, wenn der Anti- Dottersack-Titer gleich oder größer ist als der Anti-Chlamydien-Titer. Diese Anti-Dottersack-Reaktion kann durch Untersuchung der Reaktionsstellen mit Dottersack-Kontrolle bestätigt werden. Fluoreszenz an dieser Stelle deutet auf eine nicht-spezifische (nicht-chlamydien) Reaktion hin. Test mit verdünnten Patientenseren wiederholen. Ist der Anti-Dottersacktiter gleich oder größer als der Anti-Chlamydientiter, ist das Resultat nicht erklärbar und sollte nicht gewertet werden. INTERPRETATION DER TESTERGEBNISSE Die Intensität der Fluoreszenz und des Endtiters werden durch die Optik des Mikroskops sowie die Art und Einstellung der Lichtquelle bestimmt. Bei jeder Testreihe daher die Kontrollfelder zuerst ablesen, um eine korrekte Interpretation zu gewährleisten. Ablesen der Objektträger Die Intensität der Fluoreszenz der EK (siehe Hinweis unten zu Elementarkörperchen und grün fluoreszierende Partikel) wird wie folgt bewertet: 2 bis 4+ Mittlere bis starke apfelgrüne Fluoreszenz. 1+ Eindeutige, aber schwache Fluoreszenz. Negativ Keine Fluoreszenz oder ähnliche Fluoreszenz wie auf der Reaktionsstelle der Dottersack-Kontrolle oder der Nicht Nachweisbare Kontrolle. Elementarkörperchen und grün fluoreszierende Partikel. Beurteilt wird nur die Fluoreszenz der Elementarkörperchen. Elementarkörperchen haben eine einheitliche Größe und eine gleichmäßige Verteilungsdichte im gesamten Antigen-Spot. Ungleichmäßig verteilte und unregelmäßige grün fluoreszierende Partikel (falls vorhanden) sind nicht als positive Reaktivität auszulegen. Interpretation der Patientenprobenergebnisse Der reziproke Wert der höchsten Serumverdünnung, die eine eindeutige (1+) apfelgrüne Fluoreszenz aufweist, wird als Endtiter bezeichnet. Bei niedrigeren Verdünnungen können die Proben mit allen drei Chlamydienspezies kreuzreagieren. Zur Bestimmung der Chlamydienspezies, die die vorherrschende Immunantwort auslöst, die Proben seriell bis zum Endtiter verdünnen. Serologische und klinische Daten als Hilfsmittel bei der Diagnose kombinieren. 1:16 Ein Endtiter von IgA-Serumantikörpern gegen C. trachomatis von 1:16 in einer einzelnen Probe ist als Anzeichen einer Infektion zu einem unbestimmten Zeitpunkt zu betrachten. Die weitere Auswertung richtet sich nach dem klinischen Erscheinungsbild des Patienten sowie nach den IgG- und IgM-Ergebnissen. Ein erhöhter IgA-Titer ohne IgM-Titer könnte auf eine erneute Infektion oder eine chronische Infektion hindeuten, während ein positiver IgA-Titer in Verbindung mit einem positiven IgM-Titer auf eine Primärinfektion hinweist. <1:16 Keine IgA-Antikörper nachweisbar. Intragenus-Reaktivität Chlamydia-MOMP enthält sowohl art- als auch gattungsspezifische Antigene, und sowohl bei akuten als auch bei rekonvaleszenten Proben können serologische Kreuzreaktionen auftreten. Die C. psittaci- und die C. trachomatis-antigenfelder, die als Kontrollen zur Chlamydien-Spezifizierung dienen, sollen die Auswertung der Spezifität der serologischen Reaktion gegen C. pneumoniae unterstützen. Bei Auftreten von Kreuzreaktionen ist die Spezifität der Immunreaktion mit Vorsicht zu interpretieren. In den meisten Fällen ist der Endtiter einer C. pneumoniae-spezifischen Reaktion mindestens doppelt so hoch wie die Titer der anderen beiden Chlamydienantigenfelder. Zur Bestimmung, ob die Immunantwort hauptsächlich gegen C. pneumoniae gerichtet ist, wird eine Verdünnungsreihe der Proben hergestellt, um den Endtiter zu ermitteln. Zur Diagnosestellung sind die serologischen Ergebnisse mit den klinischen Befunden zu kombinieren. Die C. psittaci- und die C. pneumoniae-antigenfelder, die als Kontrollen zur Chlamydien-Spezifizierung dienen, sollen die Auswertung der Spezifität der serologischen Reaktion gegen C. trachomatis unterstützen. Beim Auftreten von Kreuzreaktionen ist die Spezifität der Immunreaktion mit Vorsicht zu interpretieren. In den meisten Fällen ergibt eine C. pneumoniae-spezifische Reaktion Endtiter, die zwei- bis dreimal höher sind als die Titer, die bei den beiden anderen Chlamydien-Antigenspots beobachtet werden. Zur Bestimmung, ob die Immunantwort hauptsächlich gegen C. trachomatis gerichtet ist, wird eine Verdünnungsreihe der Proben hergestellt, um den Endtiter zu ermitteln. Zur Diagnosestellung sind die serologischen Ergebnisse mit den klinischen Befunden zu kombinieren. EINSCHRÄNKUNGEN 1. Die Interpretation der IgA-Titer hängt vom klinischen Bild ab, das der Patient bietet. Alle Ergebnisse der Chlamydienserologien sollten daher mit der klinischen Anamnese und anderen Informationen korrelieren, die dem Arzt vorliegen. 2. Die Leistung dieses Assays ist für die allgemeine Bevölkerung, die Pädiatrie oder die Geriatrie nicht etabliert. 3. Die Leistung dieses Assays ist nicht für Medien etabliert, bei denen es sich nicht um Serum handelt. Nur aufgeführte Probentypen testen. 4. Die Leistung dieses Assays ist zur Überwachung einer Therapie nicht etabliert. 5. Ein negatives Ergebnis schließt eine gegenwärtig vorliegende aktive Infektion nicht aus. Es gibt Hinweise auf das Nichtvorhandensein von MIF- Antikörpern bei Personen, deren Proben in der Kultur ein positives Ergebnis aufweisen. Dies kommt bei Erwachsenen zwar selten, bei Kleinkindern jedoch möglicherweise häufiger vor. Zu früh während der primären Infektion entnommene Proben weisen unter Umständen keine nachweisbaren Antikörper auf. Bei Verdacht auf eine Infektion mit Chlamydien sollte 10 bis 21 Tage später eine zweite Serumprobe entnommen und parallel mit der Originalprobe untersucht werden. 6. Das Psittaci-Reaktionsfeld enthält zwar zwei C. psittaci-stämme (Papagei und Sittich), umfasst jedoch nicht alle C. psittaci-serotypen. Manche C. psittaci- Infektionen sind daher möglicherweise nicht nachweisbar. Allerdings treten Fälle einer Infektion mit C. psittaci nur selten auf (in der Regel <50 Fälle pro Jahr in den USA) und die meisten dieser Fälle werden von Papageien oder Sitticharten verursacht. Seren von Patienten, bei denen ein Verdacht auf Psittakose besteht, sollten zum Nachweis von Chlamydien-Gruppenantigenen außerdem durch KF getestet werden. 7. Der prädiktive Wert eines Positiv- oder Negativergebnisses hängt von der Prävalenz in der jeweiligen Bevölkerung und der vor dem Test bestimmten Wahrscheinlichkeit einer Infektion ab. 8. Bei einer Chlamydia-Infektion kann die Antikörperantwort kreuzreaktiv auf mehrere Chlamydia-Arten sein. Eine Kreuzreaktion kann auch die Folge der Exposition gegenüber mehr als einer Chlamydia-Art sein. 9. Werden artspezifische Antikörper nachgewiesen, kann dies an einer zurückliegenden Exposition oder Kreuzreaktivität infolge von Infektionen mit anderen

6 Seite 6 Chlamydia-Arten liegen. 10. Serologische Ergebnisse eignen sich nicht zur Bestimmung des Infektionsortes. 11. Eine serologische Testung kann bei mit Chlamydien infizierten Personen aufgrund der unterschiedlichen immunogenetischen Eigenschaften der Stämme und abhängig vom Infektionsort negativ verlaufen. ZU ERWARTENDE BEFUNDE Etwa 40% bis 60% der erwachsenen Bevölkerung weltweit verfügen über Antikörper gegen C. pneumoniae, was darauf schließen lässt, dass die Infektion außerordentlich prävalent ist und es häufig zu einer Reinfektion kommt 22. Typischerweise werden pro Jahr in den USA weniger als 50 Fälle einer Infektion mit C. psittaci gemeldet; 1999 waren es beispielsweise nur 16 Fälle 23. C. psittaci-infektionen werden nicht nur durch infizierte Vögel hervorgerufen; andere Quellen sind möglicherweise häufiger als derzeit anerkannt 22. Die Prävalenz von Infektionen mit C. trachomatis bei erwachsenen Frauen überschreitet in der Regel 10% und kann in manchen Populationen 40% erreichen. SPEZIFISCHE LEISTUNGSDATEN Kunden außerhalb der Vereinigten Staaten finden die spezifischen Leistungsdaten des Tests auf einem separaten Blatt. LITERATUR 1. Schacter, J Chlamydiae (Psittacosis-Lymphogranuloma Venereum-Trachoma Group), In E. Lennette, A. Balows, W. Hausler, and H. Shadomy (ed.), Manual of Clinical Microbiology 4ed, ASM Press, Washington, D.C. 2. Smith, T Chlamydia, In N. Schmidt and R. Emmons (ed.), Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections 6th ed, APHA, Washington, D.C. 3. Black CM. Current methods of laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infections. Clin Microbiol Rev Jan; 10(1): La Scolea, L The Value of Non-culture Chlamydial Diagnostic Tests. Clin. Micro. News Letter 13: Shor, A., C.C. Kuo, and D.L. 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