5. [Bib] 6. KIT COMPONENTS

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1 Viro-Immun IFA CMV -IgG/-IgM GB 1. INTENDED USE Immuno assay for the semiquantitative determination of antibodies against Cytomegalo virus in human serum and plasma IgG [REF] MK 156 G s 25 [IVD] kit IgG [REF] IF 156 G s 50 [IVD] kit IgG [REF] IF 157 G s 100 [IVD] kit IgM [REF] MK 156 M s 25 [IVD] kit IgM [REF] IF 156 M s 50 [IVD] kit IgM [REF] IF 157 M s 100 [IVD] kit 2. PRINCIPLE OF THE ASSAY The detection of antibodies is based on the principle of an Indirect Immuno Assay (IFA). The slides are coated with infected cells (inactivated). Any specific antibodies present in the patient s sample are bound during the first incubation. After removing unbound material by washing, the presence of specific antibodies is detected using Anti-Human IgG- or IgM-conjugate during the second incubation. Excess FITC conjugate is then removed. The formation of a stable three-part complex consisting of fluorescein antibody bound to human antibody, which is bound to antigen, can be visualized with the aid of a microscope 3. DIAGNOSTIC RELEVANCE AND INTERPRETATION OF RESULTS To obtain a final diagnosis the patient history and clinical symptoms should be included for the interpretation of the serological results and possible cross-reactivity should be taken into consideration. IgG- Ab IgM- Ab Ab = Antibodies; - = negative, + = positive Interpretation Acute or recent infection probable, reactivation or recent immunisation possible Possible previous infect or recent reinfection 4. PERFORMANCE CHARACTERISTICS Specificity/ Sensitivity Recommendation Monitoring of IgG and IgM antibodies (Sample collection within days) to determine seroconversion confirmatory tests e.g. ELISA, antigen detection, Western-Blot Monitoring of IgG antibodies (Sample collection within 10 to 14 days), a significant titre increase in the absence of IgM antibodies indicates a reinfection. 170 samples IgG/ 163 samples IgM were tested parallel in IFA CMV -IgG/ -IgM and comparison methods (ELISA). The specificity and sensitivity are based on the results found. Specificity: IgG 100% Sensitivity: IgG 100% Specificity: IgM 100% Sensitivity: IgM -----% (In IgM test no sufficient positive samples were available). The results refer to the groups of samples investigated. 5. [Bib] - Albert, S. et al.: Ärztl. Lab. 36, (1990) - Reimer, K. in: T. Porstmann, Diagn. Bibliothek, Vol. 4 (1992) - Selb, B.: Medizinische Virusdiagnostik (1992), Umschau Verlag, Frankfurt - Thomas, L.: Labor und Diagnose, 4. Auflage (1992), 6. KIT COMPONENTS Number and volume of the kit components are indicated on kit label. 1. SLIDES [SLIDES] slides coated with infected cells 5x5 wells (MK 156 G, MK 156 M);10x 5 wells (IF 156 G, IF 156 M) ; 10x10 wells (IF 157 G, IF 157 M) 2. FITC ANTI-HUMAN CONJUGATE [CONJ]FITC] [IgG] [IgM] ready-to-use anti-human IgG or IgM conjugate preservative: <0,1% sodium azide 2,5 ml (MK 156 G, IF 156 G, MK 156 M, IF 156 M); 2x2,5 ml (IF 157 G, IF 157 M) 3. NEGATIVE CONTROL [CONTROL]-] human plasma, ready to use preservative: <0,1% sodium azide 4. POSITIVE CONTROL [CONTROL]+] human plasma, ready to use preservative: <0,1% sodium azide The titre is reported on the label. 5. EVANS BLUE [EVBL] ready to use 3 ml (all kit size) 6. MOUNTING MEDIUM [MM] ready to use 3 ml (all kit size) 7. PBS-BUFFER [BUF]PBS] Powder 1 x (MK 156 G, MK 156 M); 2 x (IF 156 G, IF 156 M, IF 157 G, IF 157 M) The safety data sheet (MSDS) is available upon request. 7. STORAGE AND STABILITY Store all reagents at t2-8 C. Protect them from intense light and do not freeze. The expiration date of each component is indicated on the respective vial label. Do not use reagents beyond the expiration date. The diluted [BUF PBS] is stable up to 4 weeks when stored at t2-8 C. Use only [SLIDES] with an intact vacuum packaging. Precision and reproducibility In order to determine the inter-serial reproducibility (Interassay), slides out of 5 different lots have been tested with the positive control. The evaluation of the positive control showed no significant difference regarding the intensity. The intra-serial precision (Intraassay) was determined by using different defined samples (positive, negative, equivocal) in a multiple testing (n=15) within one IFA slide lot. The evaluation of the samples showed no significant difference regarding intensity in their defined category. Cross-reactivity Cross reactions with other members of Herpes group (HSV 1, HSV 2, VZV and EBV) cannot be excluded. Positive and equivocal results should therefore be confirmed with appropriate tests to exclude an infection with other herpes viruses. 8. MATERIALS AND EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT PROVIDED - distilled water - graduated cylinder - coplin jars or staining dishes - plastic squeeze bottle - test tubes for sample dilution - cover slips (24x60 mm) - volumetric pipette ( µl) with pipette tips - moist chamber - timer - microscope with FITC system, (excitation wavelength 490 nm, emission wavelength 510 nm) C GB 01/2011 1/3

2 9. WARNINGS OR PRECAUTIONS SAFETY PRECAUTIONS The IFA test is for [IVD] use only. 1. Only qualified and well-trained employees should carry out the assay procedure. 2. The instruction for use describes the applicable test method. In case of modification or applications others than the intended use, or the use of automatic processors, the user has to validate the procedure and take the responsibility for it. 3. Do not mix lot specific reagents, such as [SLIDES], controls and [CONJ FITC] from different kit lots. [BUF PBS], [MM] and [EVBL] can be used for all IFA tests. 4. Seal all bottles properly after use in order to avoid bacterial contamination. All samples and kit components should be considered potentially infectious. All control samples have been tested for Hepatitis Bs antigen, anti-hiv I and II, anti-hcv (CE/FDA) and found to be negative. 5. The coated [SLIDES] are inactivated. However, normal laboratory precautions should be maintained when handling with infectious material. Do not pipette by mouth. 6. Avoid contact with skin and mucous membranes when handling reagents, which contain preservatives (see kit contents). Wash thoroughly with water in case of contact. 7. Controls containing sodium azide may react with lead and copper plumbing, building up explosive metal acids. Flush with sufficient water when disposing of reagents. 8. For disposal the legal regulations have to be followed. 10. SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE 1. Microbial contaminated specimen may cause interference. 2. Lipaemic, haemolytic or icteric samples should only be tested with reservations although in our testing no negative influence has been found. 3. Suitable specimens are serum or plasma (heparinized, EDTA) samples obtained by standard laboratory techniques. 4. The samples should not be heat-inactivated since non-specific results may occur. 5. Patient samples should be stored at t2-8 C. For long-term storage t-20 C or lower is recommended. Avoid repeated freeze-thaw cycles. 6. Note: Diluted patient samples must be used on the same day. 11. REAGENT PREPARATION Bring all reagents to room temperature prior to use! 3. First wash step: Rinse the [SLIDES] gently with [BUF PBS], using a squeeze wash bottle. Do not focus the buffer stream directly onto the wells. To prevent cross contaminations avoid rinsing from one well across other wells. For ten-well slides run PBS-stream from the midline of the slides successive along both rows to the edge of the [SLIDES]. Soak the [SLIDES] three times for 5 minutes with [BUF PBS] in a coplin jar or staining dish with [BUF PBS]. 4. Second incubation: After the washing procedure, shake off excess [BUF PBS] (if necessary use blotting paper to draw off excess fluid but do not touch the wells directly) and place [SLIDES] back into moist chamber. Immediately add 1 drop of [CONJ FITC] to each well. Incubate [SLIDES] for the detection of IgG- Antibodies: IgM- Antibodies: 5. Second wash step: see First wash step 6. Counter stain: 30 minutes at room temperature in the dark 30 minutes at room temperature in the dark Add 5 drops [EVBL] to 100 ml [BUF PBS] solution in a staining dish, mix well and stain [SLIDES] for max. 5 minutes. [EVBL] covers unspecific background. 7. Remove [SLIDES] from the staining dish, rinse briefly with [BUF PBS], shake off the excess [BUF PBS] and apply 2-3 drops of [MM] across the slides. Gently lower the cover slip from the bottom to the top of the slides, avoid air bubbles. 9. Read [SLIDES] within 30 minutes at x total magnification, using a microscope (FITC filter combination). Avoid longer exposition of one field of vision to minimize bleaching of FITC. 13. SUGGESTIONS FOR TROUBLESHOOTING In case that the IFA instructions are followed strictly, the reagents are handled with care and the samples and reagents are pipetted carefully, the following kinds of errors can be avoided to a large extend. Prepare [BUF PBS]: Completely dissolve one vial of [BUF PBS] in 1 litre of distilled water. Reconstituted buffer solution should have a ph of 7,3 to 7,6. Dilution of samples: Dilute patient sample with [BUF PBS] according to test demands (screening titre). To minimize background reactions (due to patients condition) we recommend to dilute patient samples in [BUF PBS] + 1% BSA or IFA Dilution Buffer [SPE]DIL] IFA buffer (Art. No. IVP 100). By using a Rheumatoid factor absorption it is necessary to regard the final serum dilution. Please follow the instruction for the use of the IgG-RF-Sorbent used in the test. Controls are ready to use. 12. PIPETTING AND INCUBATION STEPS Screening Titre CMV IgG: 1:20 Screening Titre CMV IgM: 1:20 Note! Do not allow wells to dry at any time during the test procedure! 1. Take required [SLIDES] out of the foil packets shortly before use and identify [SLIDES] using a permanent marking pen. Do not touch the wells. 2. First incubation: Pipette 1 drop of each control and µl of each diluted sample onto the respective wells (covered completely) being careful not to touch cell substrate with pipette tip. The controls should be carried out for every test run. Place [SLIDES] into a well-closed moist chamber to prevent drying. Incubate [SLIDES] for the detection of ERROR Cross contamination Too few cells or substrate Inhomogeneous Unclear picture Little or no Background POSSIBLE CAUSES - Too much test material - Fluid remaining between the wells, should be carefully dried around outside edges if necessary - Cell lysis following prolonged contact with deionised water (observe the wash procedure) - Buffer squirted directly on the substrate in the well (observe the wash procedure) - Proteolytic enzymes have attacked the substrate - While placing the cover slip on [SLIDES], the monolayer was disturbed - Sample dried in the well, stronger at the edge (moist environment) - Sample does not cover the test well (air bubbles/ completely cover well with sample) - Buffer crystals on the [SLIDES] (wash) - Microscope incorrectly adjusted (check the adjustment of the microscope) - Unsuitable immersion oil - Too much [MM] or air pockets - Microscope is dirty (cleaning) - Microbial contamination of the sample or [CONJ FITC] (check storage) - Microscope not adjusted - ph-value (7,3 7,6) of [BUF PBS] too low - [CONJ FITC] exposed to light (store [CONJ FITC] protected from the light) - [SLIDES] dried in a hot air stream (do not use a hairdryer and do not let the wells dry) - Microbial contaminated specimen - Marking the [SLIDES] with a wax pencil produces a film on the [SLIDES] (use a waterproof glass marker) IgG- Antibodies: IgM- Antibodies: 30 minutes at room temperature 45 minutes at room temperature C GB 01/2011 2/3

3 14. VALIDITY OF THE ASSAYS All controls should be carried out with every test run. The intensity of the [CONTROL +] is shown in the Quality Control Certificate. If controls give invalid levels then results from test samples are invalid too and retesting is required. 16. Symbole nach IVD/ symbols used with IVD devices/ Symbole / Símbolos/ Simboli/ Simbolos/ Symboly [SLIDES] Objektträger/ slides/ lames/ portaobjetos/ vetrini/ lâminas 15. READING OF THE RESULTS Fluorescence intensity: The intensity may be semi-quantified following our introduction: 3+ bis 4+ = maximal, brilliant yellow-green 2+ = less brilliant yellow-green 1+ = definite but dull yellow-green Equivocal (+)= very dim yellow-green The degree of intensity is not of clinically relevance and has only limited value as an indicator of titre. Differences in microscope optics, filters and light source may result in differences of +1 or more in intensity. Interpretation: [BUF PBS] PBS-Puffer/ PBS-buffer/ Tampon PBS/ Buffer PBS / tampone PBS/ Tampão PBS [CONJ FITC] [CONTROL +] [CONTROL -] FITC-Konjugat/ FITC conjugate/ Conjugue FITC/ conjugado FITC / FITC Coniugato/ Conjugado FITC Positive Kontrolle/ positive control/ Contrôle positif/ control positivo/ controllo positivo/ controle positivo Negative Kontrolle/ negative control/ Contrôle négatif/ control negativo/ controllo negativo/ controle negativo CMV FLUORESCENCE INTERPRETATION IgG: Screening titre IgM: Screening titre Negative No or barely visible of infected cells No IgG- or IgMantibodies to CMV detectable [EVBL] [MM] Evans Blue/ Evans Blue/ Bleu Evans/ Azul de Evans/ Blue di Evan/ Azul de Evans Einschlussmedium/ Mounting medium/ Liquide de Montage/ Medio de Montaje/ Mezo di montaggio/ Meio de Montagem IgG: Screening titre IgM: Screening titre Positive Yellow-green of infected cells IgG or IgM antibodies to CMV detectable [Bib] [LOT] Literatur/ Literature/ Littérature/ Bibliografia/ Bibliografía/ Literatura/ Charge/ lot/ Lot/ lote/ carcia/ lote Fluorescence pattern of the infected cells Cytoplasm Inclusions IgG (+) IgM Typical pattern of the inclusions Bean shaped, round (homogenous) Fc -receptor Cytoplasmic of all cells Result + positive negative + ++ Bean shaped, round (fine granular staining) positive (+) negative - = negative, (+) = weak positive, + = positive, ++ = strong positive Equivocal results found at the screening dilution of the samples should be retested. Following the confirmation of the equivocal result the monitoring of the patient s antibodies is recommended in order to exclude unspecific reactions resp. crossreactivity, which may also cause equivocal results. Note: By the detection of IgG- antibodies unspecific cell can occur caused through autoantibodies (ANA, AMA etc.). By the detection of IgM antibodies unspecific cell can appear caused through non-immune fluorochromic proteins. Note for IgM assay: In case of a positive IgM antibody detection the samples should be confirmed with IFA Sorb ([REF] ISB 100). [IVD] In-vitro-Diagnostikum/ in vitro diagnostic/ Diagnostic in vitro / diagnóstico In-vitro/ [REF] s 100 I t e Artikel Nr./ reference or order number/ Référence ou numéro de commande/ referencia o número de pedido/ codice di riferimento o di commissione/ referência ou número de encomenda 100 Bestimmungen/ tests/ testś / determinazioni/ testes Gebrauchsanweisung beachten/ consult instructions for use/ consulter le mode d'emploi/consultar las instrucciones de uso/ consultare le istruzioni per l'uso/ consultar instruçõesde uso Temperaturgrenzen/ temperature limitation/ Limites de température/ Limites de temperatura/ Limiti di temperatura/ Limites de temperatura/ Verfallsdatum:/ expiry date/ date d'expiration/ Fecha de caducidad/ Data di decadenza/ Limite de validade/ Datum Expirace A. SEMIQUANTITATIVE TITRE For the semi-quantification of the test results the [CONTROL -] and the [CONTROL +] must be tested with every test run. The intensity of the sample can then be compared visually with the intensity of the [CONTROL +]. M Hergestellt von/ manufactured from/ fabriqué par/ elaborado por/ fabbricato da/ produzido por B. QUANTITATIVE TITRE For quantification of the test results, the samples must be diluted to the endpoint titre. The endpoint titre is determined as the last dilution in which an equivocal (+) reaction is visible. Sample titration: If the intensity of the sample is < the intensity of the Positive control, please dilute the sample to the endpoint titre of the Positive control (the titre is reported on the label). If the intensity of the sample is > the intensity of the Positive control, please dilute the sample at least two dilutions higher than the endpoint titre of the Positive control (the titre is reported on the label). M 0123 VIRO-IMMUN Labor-Diagnostika GmbH, In der Au 29, D Oberursel, Germany -Tel.: Fax: info@viro-immun.de For further information please visit our website: C GB 01/2011 3/3

4 Viro-Immun 1. VERWENDUNGSZWECK IFA CMV -IgG/-IgM Immunfluoreszenz Test zur semiquantitativen Bestimmung von Antikörpern gegen Cytomegalie-Virus in humanem Serum und Plasma. IgG [REF] MK 156 G s 25 [IVD] Testpackung IgG [REF] IF 156 G s 50 [IVD] Testpackung IgG [REF] IF 157 G s 100 [IVD] Testpackung IgM [REF] MK 156 M s 25 [IVD] Testpackung IgM [REF] IF 156 M s 50 [IVD] Testpackung IgM [REF] IF 157 M s 100 [IVD] Testpackung 2. TESTPRINZIP Der Nachweis der Antikörper basiert auf dem Prinzip des Indirekten Immunfluoreszenz Tests (IFT). Die Objektträger sind mit infizierten Zellen beschichtet (inaktiviert). In der Untersuchungsprobe des Patienten vorhandene spezifische Antikörper werden an das Antigen gebunden. Nach sorgfältigem Waschvorgang, bei dem alle nicht gebundenen Probenbestandteile entfernt werden, wird Anti-human IgG- oder IgM-FITC-Konjugat pipettiert, das sich an die bereits gebundenen Antikörper anlagert. Im Waschprozess wird überschüssiges FITC-Konjugat entfernt. Der mit FITC-Konjugat gebundene Antigen-Antikörperkomplex lässt sich mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskopes darstellen. 3. DIAGNOSTISCHE RELEVANZ UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE Für eine endgültige Diagnose sollten die Patientenanamnese und die klinischen Symptome in die Interpretation der serologischen Ergebnisse eingeschlossen werden; mögliche Kreuzreaktionen sollten in Erwägung gezogen werden. IgG- AK IgM- AK Interpretation Akute oder vor kurzem erfolgte Infektion wahrscheinlich, Reaktivierung möglich Wahrscheinlich zurückliegende Infektion oder Reinfektion Ak = Antikörper; - = negative, + = positive 4. TESTCHARAKTERISTIKA Spezifität / Sensitivität Empfehlung Verlaufskontrolle der IgG+IgM- Antikörper (Proben im Abstand von Tagen gewonnen).serokonversion aufzeigen; Bestätigungsteste z.b. ELISA, Antigennachweis, Western-Blot Verlaufskontrolle der IgG-Ak (Proben im Abstand von Tagen erneut testen): signifikanter Titeranstieg bei fehlenden IgM-Ak läßt auf eine Reinfektion schließen Es wurden 170 Proben IgG/ 163 Proben IgM im IFA CMV -IgG/ -IgM parallel mit Vergleichsmethoden (ELISA) getestet. Die Angaben zur Spezifität und Sensitivität des IFA beziehen sich auf die gefundenen Ergebnisse. Spezifität: IgG 100% Sensitivität: IgG 100% Spezifität: IgM 100% Sensitivität: IgM -----% (Im IgM Test waren keine ausreichende Anzahl positiver Proben vorhanden). Die Berechnungen zur Bestimmung der Spezifität und Sensitivität beziehen sich nur auf die untersuchten Probenkollektive. Präzision und Reproduzierbarkeit Für die Bestimmung der interseriellen Reproduzierbarkeit (Interassay) wurden 5 Objektträgerchargen mit der Positiven Kontrolle überprüft. Es zeigten sich keine Unterschiede hinsichtlich der Fluoreszenzstärke. Die intraserielle Präzision (Intraassay) wurde mittels unterschiedlich reaktiver Proben (positiv, negativ und grenzwertig) an 15 Tagen innerhalb einer Charge ermittelt. Bei der Auswertung wurden keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Fluoreszenzstärke der Proben festgestellt. Kreuzreaktionen Kreuzreaktionen mit anderen Viren der Herpesgruppe (HSV 1, HSV 2, EBV und VZV) können nicht ausgeschlossen werden. Bei positiven und grenzwertigen Ergebnissen ist es daher ratsam, durch geeignete Testverfahren Infektionen mit oben genannten Erregern auszuschließen. 5. [Bib] - Albert, S. et al.: Ärztl. Lab. 36, (1990) - Reimer, K. in: T. Porstmann, Diagn. Bibliothek, Vol. 4 (1992) - Selb, B.: Medizinische Virusdiagnostik (1992), Umschau Verlag, Frankfurt - Thomas, L.: Labor und Diagnose, 4. Auflage (1992), 6. KITKOMPONENTEN Angabe der Anzahl und Volumen der Kitkomponenten auf Kitetikett 1. OBJEKTTRÄGER [SLIDES] Objektträger beschichtet mit infizierten Zellen 5x5 Testfelder (MK 156 G, MK 156 M);10x 5 Testfelder (IF 156 G, IF 156 M) ; 10x10 Testfelder (IF 157 G, IF 157 M) 2. FITC ANTI-HUMAN KONJUGAT [CONJ]FITC] [IgG] [IgM] FITC-konjugiertes Antihuman IgG oder IgM; gebrauchsfertig Konservierungsmittel < 0,1% Natriumazid 2,5 ml (MK 156 G, IF 156 G, MK 156 M, IF 156 M); 2x2,5 ml (IF 157 G, IF 157 M) 3. NEGATIVE KONTROLLE [CONTROL]-] Humanplasma gebrauchsfertig Konservierungsmittel < 0,1% Natriumazid 4. POSITIVE KONTROLLE [CONTROL]+] Humanplasma gebrauchsfertig Konservierungsmittel < 0,1% Natriumazid Der Titer ist auf dem Fläschchenetikett angegeben. 5. EVANS BLUE [EVBL] Gebrauchsfertig 3 ml (alle Kitgrößen) 6. MOUNTING MEDIUM [MM] Einschlussmedium gebrauchsfertig 3 ml (alle Kitgrößen) 7. PBS-PUFFER [BUF]PBS] Pulverförmig 1 x (MK 156 G, MK 156 M); 2 x (IF 156 G, IF 156 M, IF 157 G, IF 157 M) Das Sicherheitsdatenblatt (MSDS) ist auf Anfrage erhältlich. 7. LAGERUNG UND STABILITÄT DE Alle Reagenzien sind bei t2-8 C zu lagern. Reagenzien nicht einfrieren sowie vor direkter Sonneneinstrahlung schützen. Die Haltbarkeit der Reagenzien ist auf den Etiketten angegeben, nach Verfallsdatum sind diese nicht mehr zu verwenden. Die Gebrauchsverdünnung des [BUF PBS] ist bis zu 4 Wochen bei t 2-8 C haltbar. Nur [SLIDES] mit intakter Vakuumverpackung verwenden. 8. ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE MATERIALIEN - Destilliertes Wasser - Messzylinder - Küvetten - Plastikwaschflasche - Probenverdünnungsröhrchen - Deckgläschen (24x60 mm) - verstellbare Pipetten ( µl) mit Pipettenspitzen - Feuchte Kammer - Stoppuhr - Fluoreszenzmikroskop mit FITC-Filterkombination (Anregungswellenlänge 490 nm und Emissionswellenlänge 510 nm) C DE 01/2011 1/3

5 9. HINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN SICHERHEITSHINWEISE Der Test ist ausschließlich für [IVD] hergestellt. 1. Die Testdurchführung muss durch ausgebildetes Fachpersonal erfolgen. 2. Die Gebrauchsanweisung enthält die Angabe über die Testmethode. Eine Modifikation oder andere Anwendung sowie die Anwendung von automatischen Prozessoren müssen vom Anwender validiert werden und liegen in dessen Verantwortung. 3. Chargenspezifische Reagenzien wie [SLIDES], Kontrollen und [CONJ FITC] aus Kits unterschiedlicher Chargen nicht austauschen. [BUF PBS], [MM], und [EVBL] können bei allen IFA Testen chargen- und kitunabhängig verwendet werden. 4. Alle Fläschchen nach Gebrauch gut verschließen, um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden. Alle Patientenproben und Kontrollen müssen als potentiell infektiös angesehen und entsprechend den Richtlinien für Laborarbeiten behandelt werden Die Kontrollen wurden auf HBs-Ag, HCV- und HIV I und II Ak (CE/FDA) getestet und für negativ befunden. 5. Die beschichteten [SLIDES] sind inaktiviert. Jedoch sollte auch hier auf die im Labor übliche Sorgfalt für das Arbeiten mit infektiösem Material geachtet werden. Nicht mit dem Mund pipettieren! 6. Einige Reagenzien (siehe Kitinhalt) enthalten Konservierungsmittel. Der Kontakt mit Haut und Schleimhaut ist zu vermeiden. Bei Kontakt gründlich mit Wasser spülen und gegebenenfalls einen Arzt aufsuchen. 7. Das in den Kontrollen enthaltene Natriumazid bildet bei Kontakt mit Bleiund/ oder Kupferrohren explosive Metallazide, deshalb sollte bei deren Beseitigung mit reichlich Wasser nachgespült werden. Gesundheitsschädlich, beim Verschlucken Arzt aufsuchen. 8. Zur Entsorgung sind die gesetzlichen Regelungen zu beachten. 10. PROBENGEWINNUNG UND LAGERUNG 1. Bakteriell verunreinigte Proben können zu unzuverlässigen Testergebnissen führen. 2. Lipämische, hämolytische sowie ikterische Proben (Serum oder Plasma) sollten nur unter Vorbehalt eingesetzt werden, obwohl in unseren Untersuchungen kein negativer Einfluss festgestellt wurde. 3. Serum- oder Plasma- (Heparin, EDTA) proben, die nach Standard-Labortechniken entnommen sind, sind zur Untersuchung geeignet. 4. Hitzebehandelte Proben dürfen nicht verwendet werden. 5. Kurzfristige Lagerung der Proben bei t2-8 C, eine längerfristige Lagerung wird bei t-20 C empfohlen. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren der Proben ist zu vermeiden. 6. Hinweis: Verdünnte Proben müssen am gleichen Tag im Test eingesetzt werden. 11. VORBEREITUNG DER REAGENZIEN Vor Gebrauch alle Reagenzien auf Raumtemperatur bringen. Herstellung [BUF PBS]: Den Inhalt eines Flakons in 1 Liter destilliertem Wasser lösen, der Puffer muss vollständig gelöst sein. Der ph-wert des gebrauchsfertigen [BUF PBS] sollte bei 7,3 7,6 liegen! Probenverdünnung: Patientenproben entsprechend ihrem vorgeschriebenen mit hergestellter [BUF PBS] Lösung verdünnen. Um die Hintergrundsreaktion von Seren (patientenabhängig) zu minimieren, empfehlen wir die Verdünnung der Proben in [BUF PBS] + 1% BSA oder in IFA PROBENVERDÜNNUNGSPUFFER [SPE]DIL] (Art. No. IVP 100). Sollte eine Rheumafaktor-Absorption (z.b. mit RF-Sorbent) durchgeführt werden, ist darauf zu achten, dass die gewünschte Probenverdünnung eingehalten wird Die Kontrollen sind gebrauchsfertig. 12. PIPETTIER- UND INKUBATIONSSCHRITTE CMV IgG: 1:20 CMV IgM: 1:20 Die Objektträger dürfen während der Testdurchführung nicht austrocknen! 1. Die benötigte Anzahl [SLIDES] unmittelbar vor Gebrauch aus den Folien entnehmen und mit einem Permanentmarker kennzeichnen. [SLIDES] nur an den Rändern anfassen Inkubation: Je 1 Tropfen der Kontrollen und µl der verdünnten Proben auf die entsprechenden Testfelder pipettieren (Testfelder komplett bedecken). Für jeden Testansatz ist die [CONTROL +] und die [CONTROL -] mitzuführen. Beim Pipettiervorgang ist ein Berühren der Pipettenspitze mit den Testfeldern zu vermeiden. Die [SLIDES] in eine gut verschließbare, feuchte Kammer legen, um ein Austrocknen zu vermeiden. Inkubation der [SLIDES] für die Bestimmung der IgG-Antikörper: IgM-Antikörper: Waschschritt: 30 Minuten bei Raumtemperatur 45 Minuten bei Raumtemperatur [SLIDES] vorsichtig mit [BUF PBS] (Plastikspritzflasche) abspülen, dabei den Strahl nicht direkt auf die Testfelder richten. Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, sollte die ablaufende Flüssigkeit nicht über andere Testfelder laufen. Bei [SLIDES] mit 10 Testfeldern den Pufferstrahl auf die Mittellinie des Objektträgers richten und nacheinander beide Reihen abspülen. Anschließend [SLIDES] für ca. 15 min. in eine Küvette mit [BUF PBS] stellen. Den [BUF PBS] nach je 5 min. wechseln Inkubation: Nach dem Waschvorgang [SLIDES] der Küvette entnehmen und überschüssigen [BUF PBS] durch kräftiges Schütteln entfernen (bei Bedarf Ränder der Objektträger vorsichtig mit Saugpapier trocknen). 1 Tropfen [CONJ FITC] auf jedes Testfeld auftragen. Die [SLIDES] in eine gut verschließbare, feuchte Kammer legen. Inkubation der [SLIDES] für die Bestimmung der IgG -Antikörper: IgM-Antikörper Waschschritt: siehe 1. Waschschritt 6. Gegenfärbung: 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln Pro 100 ml [BUF PBS] 5 Tropfen [EVBL] in die Küvette geben und mischen. [SLIDES] max. 5 Minuten färben. Mit [EVBL] können unspezifische Reaktionen überdeckt werden. 7. [SLIDES] aus der Küvette entnehmen und überschüssigen [BUF PBS] durch kräftiges Schütteln entfernen (bei Bedarf, Ränder der Objektträger vorsichtig mit Saugpapier trocknen). Anschließend zwischen die Testfelder 2-3 Tropfen [MM] geben und das Deckglas vorsichtig in Position bringen, Luftblasen vermeiden; hierzu das Deckglas an einem Ende des [SLIDES] aufsetzen und auf das andere Ende herablassen. 8. Beurteilen der [SLIDES] innerhalb von 30 Minuten mit dem Fluoreszenzmikroskop (FITC-Filterkombination) bei x Vergrößerung. Dabei ein Gesichtsfeld nicht zu lange betrachten, um ein Ausbleichen der Fluoreszenz zu verhindern. 13.TROUBLESHOOTING (PROBLEMLÖSUNGEN) Bei konsequenter Einhaltung der Arbeitsvorschrift, sorgfältigem Umgang mit Reagenzien und sorgfältiger Pipettierung von Proben und Reagenzien können die folgenden Fehler / Probleme weitgehend vermieden werden. Probleme Kreuzkontaminationen Zu wenige Zellen/ zu wenig Substrat Inhomogene Fluoreszenz Unscharfe Bilder Wenig oder keine Fluoreszenz Hintergrundfluoreszenz Mögliche Ursachen -Zuviel Untersuchungsmaterial -Flüssigkeitsrückstände zwischen den Testfeldern -Lysis der Zellen; zu langer Kontakt mit dest. Wasser (Waschbedingungen einhalten) -Waschflüssigkeit direkt auf das Substrat/Testfeld gerichtet; (Waschprozedur einhalten) -Proteolytische Enzyme haben Substrat angegriffen -Beim Eindecken wurde Monolayer zerrissen -Probe auf Testfeld eingetrocknet, Fluoreszenz am Rand verstärkt (feuchte Kammer) -Probe bedeckt nicht ganzes Testfeld (Luftblasen/ Probe auf Testfeld verteilen) -Pufferkristalle auf [SLIDES] (Abspülen) -Nicht justiertes Mikroskop (Justierung Mikroskop beachten) -Ungeeignetes Immersionsöl -Zuviel [MM] oder Luftblasen -Mikroskop ist schmutzig (Reinigung) -Bakterielle Kontamination der Proben bzw. des[conj FITC] (Lagerung beachten) -Mikroskop nicht justiert -ph-wert des [BUF PBS] zu niedrig (ph-sollwert 7,3 7,6) -[CONJ FITC] Licht ausgesetzt ([CONJ FITC] nur lichtgeschützt lagern) -[SLIDES] im Heißluftstrom getrocknet (keinen Fön verwenden, [SLIDES] nicht austrocknen) -Bakteriell verunreinigte Proben (nur frische Proben verwenden) -Kennzeichnung mit Fettstift hat Film gebildet (nur wasserfeste Glasschreiber verwenden) C DE 01/2011 2/3

6 14. VALIDITÄT DES ASSAYS Zur richtigen Beurteilung der Reaktion sollten die [CONTROL +] und [CONTROL -] hinzugezogen werden. Die Fluoreszenzstärke der [CONTROL +] entnehmen Sie bitte den Daten auf dem Qualitätskontroll-Zertifikat. Werden die Sollwerte nicht erreicht, sind die Testergebnisse der Proben invalide und der Test muss wiederholt werden. 15. TESTAUSWERTUNG Fluoreszenzstärke: Die Fluoreszenzstärke kann entsprechend unserer Empfehlung eingeteilt werden: 3+ bis 4+ = maximale Fluoreszenz, brillant gelb-grün 2+ = weniger brillante gelb-grüne Fluoreszenz 1+ = eindeutige, aber matt gelb-grüne Fluoreszenz fraglich (+)= sehr schwache gelb-grüne Fluoreszenz Die Intensität der Fluoreszenz spiegelt nicht die Antikörperkonzentration wieder und hat keine klinische Bedeutung. Unterschiede zwischen Optik, Filtern und Lichtquellen bei verschiedenen Mikroskopen können zu Unterschieden in der Fluoreszenzstärke von mehr als einer Stufe führen. Bewertung: 16. Symbole nach IVD/ symbols used with IVD devices/ Symbole / Símbolos/ Simboli/ Simbolos/ Symboly [SLIDES] Objektträger/ slides/ lames/ portaobjetos/ vetrini/ lâminas [BUF PBS] PBS-Puffer/ PBS-buffer/ Tampon PBS/ Buffer PBS / tampone PBS/ Tampão PBS [CONJ FITC] [CONTROL +] [CONTROL -] FITC-Konjugat/ FITC conjugate/ Conjugue FITC/ conjugado FITC / FITC Coniugato/ Conjugado FITC Positive Kontrolle/ positive control/ Contrôle positif/ control positivo/ controllo positivo/ controle positivo Negative Kontrolle/ negative control/ Contrôle négatif/ control negativo/ controllo negativo/ controle negativo IgG: IgM: CMV FLUORESZENZ INTERPRETATION Negativ Keine bis mattgrüne Anfärbung der infizierten Zellen Keine IgG- bzw IgM- Antikörper gegen CMV nachweisbar [EVBL] [MM] Evans Blue/ Evans Blue/ Bleu Evans/ Azul de Evans/ Blue di Evan/ Azul de Evans Einschlussmedium/ Mounting medium/ Liquide de Montage/ Medio de Montaje/ Mezo di montaggio/ Meio de Montagem IgG: IgM: Positiv Gelb-grüne Fluoreszenz der infizierten Zellen IgG- bzw. IgM- Antikörper gegen CMV nachweisbar [Bib] Literatur/ Literature/ Littérature/ Bibliografia/ Bibliografía/ Literatura/ Fluoreszenzbild infizierte Zellen CMV Einschlüsse IgG (+) Typisches Bild d. Einschlüsse Rund, bohnenförmig (homogen) Fc- Rezeptoren Cytoplasma aller Zellen Cytoplasma Ergebnis + positiv negativ IgM + ++ Rund, bohnenförmig (fein körnig) positiv (+) negativ - = negativ, (+) = schwach positiv, + = positiv, ++ = stark positiv Proben, die in der Verdünnung des angegebenen s zu fraglichen Ergebnissen führen, sollten wiederholt untersucht werden. Um unspezifische Reaktionen bzw. Kreuzreaktionen, die auch zu einem grenzwertigen Ergebnis führen können auszuschließen, empfehlen wir bei Bestätigung des grenzwertigen Testergebnisses eine Verlaufskontrolle anzuschließen. Hinweis: Beim Nachweis von IgG-Antikörpern ist eine Fluoreszenz in allen Zellen (Kern oder Cytoplasma) durch das Vorhandensein von Autoimmun-Antikörper (ANA,AMA etc.) möglich. Beim Nachweis von IgM-Antikörpern können Fluoreszenzen in allen Zellen durch unspezifische Reaktionen nichtimmunologischer Färbungen fluorochrombeladener Proteine auftreten. Hinweis zum IgM Test: Um den Nachweis spezifischer IgM - Antikörper zu bestätigen, sollten positive Proben mit IFA Sorb ([REF] ISB 100) wiederholt werden. A. SEMIQUANTITATIVE TITERBESTIMMUNG Für die Semi-Quantifizierung der Probenergebnisse muss die [CONTROL +] und die [CONTROL -] bei jedem Testansatz mitgeführt werden. Die semiquantitative Titerbestimmung der Probe erfolgt visuell durch den direkten Vergleich der Fluoreszenzstärke der Probe mit der Fluoreszenzstärke der [CONTROL +]. B. QUANTITATIVE TITERBESTIMMUNG Bei der quantitativen Titerbestimmung muss die Patientenprobe austitriert werden. Der jeweilige Endtiter der Probe ist definiert als diejenige Verdünnung, in der die Probe noch eine fragliche -(+) Fluoreszenz zeigt. Titration der Proben: - Ist die Fluoreszenzstärke der Probe < der Fluoreszenzstärke der Positiven Kontrolle: Austitrieren der Probe bis zur Titerstufe der Positiven Kontrolle (angegeben auf dem Etikett). - Ist die Fluoreszenzstärke der Probe > der Fluoreszenzstärke der Positiven Kontrolle: Austitrieren der Probe mindestens 2 Titerstufen höher als die, auf dem Etikett angegebene Titerstufe der Positiven Kontrolle. Weitere Informationen finden Sie auch auf unserer website: [LOT] Charge/ lot/ Lot/ lote/ carcia/ lote [IVD] In-vitro-Diagnostikum/ in vitro diagnostic/ Diagnostic in vitro / diagnóstico In-vitro/ [REF] s 100 I t e M Artikel Nr./ reference or order number/ Référence ou numéro de commande/ referencia o número de pedido/ codice di riferimento o di commissione/ referência ou número de encomenda 100 Bestimmungen/ tests/ testś / determinazioni/ testes Gebrauchsanweisung beachten/ consult instructions for use/ consulter le mode d'emploi/consultar las instrucciones de uso/ consultare le istruzioni per l'uso/ consultar instruçõesde uso Temperaturgrenzen/ temperature limitation/ Limites de température/ Limites de temperatura/ Limiti di temperatura/ Limites de temperatura/ Verfallsdatum:/ expiry date/ date d'expiration/ Fecha de caducidad/ Data di decadenza/ Limite de validade/ Datum Expirace Hergestellt von/ manufactured from/ fabriqué par/ elaborado por/ fabbricato da/ produzido por M 0123 VIRO-IMMUN Labor-Diagnostika GmbH, In der Au 29, D Oberursel, Germany -Tel.: Fax: info@viro-immun.de C DE 01/2011 3/3

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