Dem Fachbereich Biologie/Chemie. der Universität Osnabrück. zur Verleihung des akademischen Grades. Doktor der Naturwissenschaften

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1 STRUKTURELLE UND FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNGEN VON DOMÄNEN DES SPANNUNGSABHÄNGIGEN KALIUMKANALS TSHA3 AUS DER REGENBOGENFORELLE ONCORHYNCHUS MYKISS Dem Fachbereich Biologie/Chemie der Universität Osnabrück zur Verleihung des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften vorgelegte Dissertation von Regina Herrling Osnabrück, August 2013

2 Erstgutachter: Apl. Prof. Dr. Gunnar Jeserich Zweitgutachterin: Prof. Dr. Hildgund Schrempf II

3 The scientist does not study nature because it is useful, he studies it, because he delights in it, and he delights in it, because it is beautiful. Jules Henri Pointcaré Scientific work must not be considered from the point of view of the direct usefulness of it. It must be done for itself, for the beauty of science, and then there is always the chance that a scientific discovery may become like the radium, a benefit. Marie Curie III

4 INHALTSVERZEICHNIS 1. Einleitung Spannungsabhängige Kaliumkanäle- Klassifikation, elektrische Eigenschaften und Verteilung im Nervensystem von Wirbeltieren Struktur und Dynamik der spannungsabhängigen Kaliumkanäle Shaker Kanäle der Regenbogenforelle Fragestellung und Zielsetzung Material und Methoden Material Geräte und Versuchssysteme (Kits) Chemikalien Enzyme Oligonukleotide Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) und Zebrabärblinge (Danio rerio) Eukaryotische Expressionssysteme Escherichia coli Stämme, Vektoren und Plasmide Oligonukleotide Analysesoftware Molekularbiologische Methoden Quantifizierung von Nukleinsäuren Agarosegelelektrophorese zur Separation von DNA aus Gemischen und zur Abschätzung von Fragmentlängen Polymerase-Kettenreaktion Primerdesign für Polymerase-Kettenreaktionen: Standard-PCR qpcr zur Klonananlyse Ortsgerichtete Mutagenese Primerdesign für Mutagenesereaktionen Ortsgerichtete Mutagenesereaktion Techniken zur genomischen Veränderung von Bakterienzellen Plasmidisolierung Herstellung rekombinanter Plasmide: Restriktion, Dephosphorylierung, Ligation Hitzeschocktransformation von E. coli IV

5 Herstellung -kompetenter Zellen für die Hitzeschocktransformation von E. coli Hitzeschocktransformation Techniken zur Transkriptomanalyse Isolierung von mrna aus dem Gehirn von Forelle und Zebrafisch Reverse Transkription Proteinbiochemie I: Expression und Affinitätschromatographie rekombinanter Proteine Prokaryotische Systeme zur Proteinexpression Proteinexpression Vorbereitung löslicher cytosolischer Proteine aus prokaryotischer Expression Präparation von Inclusion Bodies Affinitätschromatographische Aufreinigung mit dem Strep-TagII System Eucaryotische Proteinexpression in Pichia pastoris Kultur von P. pastoris Herstellung kompetenter Pichia pastoris und Transformation mittels Elektroporation Herstellung von Plasmiden zur Hefetransformation Probeexpression von Proteinen in P. pastoris Herstellung von Zelllysaten aus Pichia pastoris Schnelle Mikrosomenpräparation zur Expressionskontrolle mittels SDS-PAGE/ WB nach [Lerner-Maramosh et al., 1999] Proteinisolierung aus P. pastoris Zellen für biophysikalische Experimente Proteinbiochemie II: Proteinanalyse Proteinkonzentrationsmessungen Elektrophoretische Analyse von Proteinlösungen: SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) Färbung von SDS-PAGES mit Coomassie-Brilliant-Blau R Western-Blot: Semidry-Verfahren der Proteinübertragung Antikörpernachweis von Proteinen Nachweis von Strep-tagII-Fusionskonstrukten Herstellung von Zellfraktionen Mikrosomenpräparation aus Sf21 Zellkulturen Herstellung von Gesamtzelllysaten aus Hefezellen Biochemische Analyse affinitätsgereinigter Proteine Dialyse Dot Blot Assay Pull-Down-Assay V

6 Tetramerisierungsassay Elektronenspray-Ionisierungs-Massenspektrometrie (ESI-MS) Biophysikalische Analysetechniken CD-Spektroskopie ESR-Spektroskopie Aufbau der ESR- Messapparatur Site-directed Spin-labelling cw ESR Spektren und Auswertung Kultur von Sf21 Zellen Einfrieren von Sf21 Zellen Auftauen von Sf21 Zellen Herstellung rekombinanter Baculoviren Transfektion von Sf21 Zellen Infektion von Sf21 Zellen Fluoreszenzmikroskopie und Laser-Scanning Mikroskopie Elektrophysiologie- Patch-Clamp Ableitungen von Sf21 Zellen Aufbau einer Patch-Clamp-Apparatur Patch-Clamp Ableitungen von Sf21 Zellen Ergebnisse Analysen von Struktur und Wechselwirkungen der freien N-Termini zweier Kv1 Kanäle aus Oncorhynchus mykiss Nervenzellen Computer-assistierte Zuweisung von Strukturelementen Herstellung gereinigter Proteinlösungen von Tsha3-NCD und Tsha1-NCD Herstellung von Expressionsvektoren zur Synthese von Tsha3-NCD und Tsha1-NCD und Ermittlung der optimalen Expressionsbedingungen Kompartimentierung der Expressionsprodukte innerhalb der E. Coli- Zelle Optimierung der Induktionsrate Säulenchromatographische Aufreinigung heterolog exprimierter Tsha3-NCD und Tsha1- NCD mit Affinitätstag Spektroskopische Analysen der Struktur und Dynamik von Tsha1-NCD und Tsha3-NCD Vergleichende Analyse der T1-Domänen von Tsha3-NCD und Tsha1-NCD mit cwesr- Spektroskopie Analyse der Mobilität des N-terminalen Abschnittes vor der T1-Domäne Inter- und intramolekulare Abstandsbestimmung mittels Tieftemperatur-ESR Analyse der Sekundärstruktur über CD-Spektroskopie VI

7 3.2. Interaktion zwischen Tsha3 und einer KV β- Untereinheit Gewinnung der cdna des KCNAB2.2 Gens zur Ligation in Expressionsvektoren Kv beta2 Expression und in-vitro-bindestudien In-vivo-Untersuchungen der Interaktion zwischen Kv 2c und Tsha Identifikation eines funktionellen cysteinfreien Kanals Rekombinante Baculoviren zur Expression von Tsha1 Mutanten für Funktionsanalysen Biochemische und fluoreszenzmikroskopische Analyse der Funktionalität Elektrophysiologische Analyse der Funktionalität der Cystein-mutierten Isoformen Etablierung eines Systems zur Herstellung von Tsha1 für Rekonstitution und ESR Herstellung Tsha1 exprimierender Hefen des Stammes ppicz Heterologe Expression von Tsha1 in Pichia Pastoris Diskussion Strukturelle Charakterisierung des Aminoterminus von Tsha Einfluss von Kv 2.2 auf Tsha3 und Tsha1 im heterologen Expressionssystem Cysteinfreie Tsha1 Isoform für ESR Messungen Zusammenfassung Abstract Anhang Literatur Tabellen Danksagung Erklärung über die Eigenständigkeit der erbrachten wissenschaftlichen Leistung: VII

8 1. Einleitung 1. EINLEITUNG 1.1. SPANNUNGSABHÄNGIGE KALIUMKANÄLE- KLASSIFIKATION, ELEKTRISCHE EIGENSCHAFTEN UND VERTEILUNG IM NERVENSYSTEM VON WIRBELTIEREN Spannungsabhängige Kaliumkanäle (Kv) vermitteln die Repolarisierung von Membranen während eines Aktionspotentials und beeinflussen dessen Kinetik, Schwelle und Frequenz (Byrne, 1980; Golowasch et al., 1992; Han et al., 1999; Kaang et al., 1992). Dadurch sind sie essentielle Bestandteile der elektrischen Erregbarkeit im Nerven- und Muskelsystem (Hille, 2001; Hodgin und Huxley, 1952). Sie sind im Nervensystem in die Informationsweiterleitung involviert und darüber hinaus in die Reizweiterleitung im Herzen und die Kontraktion und Relaxation von Muskeln. Genaue Kenntnisse der Funktionsweisen von Kaliumkanälen sind von essentieller Bedeutung, weil sie ein Grundverständnis der molekularen Grundlagen von Bewegung und Verhalten ermöglichen. Durch ihre zentrale Rolle im Nervensystem werden verschiedene Erkrankungen durch defiziente Kv hervorgerufen. Beispielsweise wurden chronische Herz-Rhythmus-Störungen (Van Wagoner et al., 1997; Wang et al., 1996), das Plötzlicher-Kindstod-Syndrom (Rhodes, 2008) und die autosomal dominant vererbte, nicht syndromische, progrediente Taubheit (Kubisch et al., 1999) auf Mutationen in Kaliumkanal-Genen zurückgeführt. Die spannungsabhängigen Kaliumkanäle (Kv) sind eine Multigenfamilie, die in vier Unterfamilien gegliedert wird. Nach der molekularbiologischen Identifikation aus dem Genom der Taufliege Drosophila melanogaster werden sie Shaker, Shab, Shaw und Shal benannt (Tempel et al., 1987; Butler, 1989). Für die Kanalfamilien haben sich die Bezeichnungen Kv1, Kv2, Kv3 beziehungsweise Kv4 etabliert. Sie gliedern sich in unterschiedlich viele Mitglieder beispielsweise Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3. Die Kategorisierung beruht auf Übereinstimmungen in der Aminosäuresequenz, die von funktioneller Bedeutung sind. Zellulär liegen gleichzeitig exprimierte Kv nicht ausschließlich als Homomere vor, sondern bilden auch als Heteromere von Subtypen einer Unterfamilie funktionelle Kanäle (Covarrubias et al., 1991, Jenkins et al., 2011). Die Kv der unterschiedlichen Unterfamilien lokalisieren neuronal in verschiedenen Kompartimenten (Dodson und Forsyth, 2004). Unterschiedliche Neuronentypen besitzen häufig ein charakteristisches Repertoire an Mitgliedern der unterschiedlichen Kv-Familien und Unterfamilien, die als Homo- und Heteromere die charakteristischen Stromeigenschaften der Zellen generieren (Lorincz und Nusser 2008; Kole et al., 2007). Die am häufigsten exprimierten Kv1 Kanäle im Vertebratenhirn sind Kv1.1, Kv1.2 und Kv1.4. Diese sind vorwiegend axonal und am Axoninitialsegment lokalisiert (Trimmer und Rhodes, 2004). Spannungsabhängige Kaliumkanale sind Komplexe aus mehreren Proteinen. Grundbestandteil sind vier Untereinheiten, die in die Zellmembran eingebaut sind und eine verschließbare Pore bilden. Sie erfüllen alle Grundfunktionen, die für einen spannungsabhängigen Kaliumkanal notwendig sind, wie Spannungsänderungen zu 1

9 1. Einleitung messen und ab einem bestimmtem Schwellenbereich die Kanalpore zu öffnen, durch die Kaliumionen aus der Zelle strömen (Iverson et al., 1988; Timpe, 1988). Den Untereinheiten können auf der cytosolischen Seite der Membran weitere Untereinheiten angelagert sein, die sich je nach Zelltyp unterscheiden und einen modulierenden Einfluss ausüben. Dabei binden die unterschiedlichen Subfamilien verschiedene Untereinheiten. Shaker Kanäle bilden oktamere Komplexe, indem sie am Aminoterminus jeder -Untereinheit eine -Untereinheit anlagern (Parcej et al., 1992; MacKinnon, 1991). Shal Kanäle oktamerisieren mit einem Tetramer aus KChIP Proteinen, die sich am Carboxyterminus anlagern (An et al., 2000). Des Weiteren oligomerisieren Shal-Kanäle mit dem regulativen Transmembranprotein DPPX (Nadal et al., 2003). Die akzessorischen Untereinheiten KChAP und der MinK-Familie assoziieren Unterfamilien-unspezifisch mit spannungsabhängigen Kaliumkanälen, (Kuryshev et al., 2000; Abbott et al., 2001a; Abbott et al., 2001b; Abbott et al., 1999; Sanguinetti et al., 1996a). Die akzessorischen Untereinheiten tragen in unterschiedlicher Weise zur Modifikation der Kaliumströme bei, wobei auch mehrere Funktionen durch ein interagierendes Protein ausgeübt werden können. Unter anderem können akzessorische Proteine als Chaperone das Expressionslevel, die Turn-over-Rate und den intrazellulären Transport der Kv beeinflussen, eine inaktivierende Domäne besitzen, die den Strom moduliert oder eine Calciumbindedomäne besitzen, die die Leitfähigkeit des Kanals von der intrazellulären Calciumkonzentration abhängig macht. Bei Kanälen des Shaker-Subtyps verändert beispielsweise die Anlagerung von Kv 1.1 Untereinheiten an Heteromere aus Kv1.1 und Kv1.2 Kanälen die Stromeigenschaften dieser Kanäle von auswärts-rektifizierenden Strömen zu denen des A-Typs (Rettig et al., 1994) STRUKTUR UND DYNAMIK DER SPANNUNGSABHÄNGIGEN KALIUMKANÄLE Jede -Untereinheit besitzt die in Abb. 1.1 dargestellte Sekundärstruktur aus sechs Transmembranhelices, sowie cytosolischen Amino- und Carboxytermini (Durell und Guy, 1992). Während die membranspannenden (transmembran, TM) Helices S5 und S6 die Kaliumpore ausbilden und die Selektivität des Kanals ausmachen, bilden die TM S1- S4 das sogenannte Spannungssensorelement, wobei in der Helix S4 sechs positiv geladene Aminosäuren lokalisiert sind, die sich spannungsabhängig über die Membran bewegen. Am cytosolischen Aminoterminus befindet sich die Tetramerisierungsdomäne, durch welche die Oligomerisierung der Kanaluntereinheiten während der Proteinbiosynthese initial organisiert wird (Shen et al., 1993). Zwei der Transmembrandomänen, die Helices S5 und S6 kleiden die Membranpore aus und bilden das Tor des Kanals. Sie werden durch eine Aminosäureschleife (Loop) verbunden, die in die Kanalpore hineinragt. S5, S6 und das Loop sind in Kaliumkanälen hochkonserviert. Das Öffnen und Schließen (Gating) wird durch dynamische Bewegung dieser Helices bestimmt. Ein gängiges Modell des Gating stellt einen Knick in S6 in den Mittelpunkt: wenn S6 als lineare Helix vorliegt, ist der Kanal geöffnet, wenn sie geknickt ist, ist der Kanal geschlossen (Sansom und Weinstein, 2000; del Camino et al., 2000; 2

10 1. Einleitung Delamotte et al., 2012). Neben dem Gating vermittelt die Porendomäne auch die Selektivität von Kaliumkanälen: der Loop trägt das konservierte Aminosäuremotiv TVGYG, welches den postulierten Selektivitätsfilter darstellt (MacKinnon et al., 1990; Yellen et al., 1991; Yool und Schwarz, 1991; Hartmann et al., 1991; Kavanaugh et al., 1991). Abb. 1.1: Strukturmodelle spannungsabhängiger Kaliumkanäle. Von links nach rechts: 1. Anordnung der Transmembran- und cytosolischen Domänen (nach Ruta et al., 2003); 2. Prozessierte elektronenmikroskopische Aufnahme eines Shaker-Kanals. Es ist deutlich erkennbar, dass die T1- Domäne eine hängende Gondel unterhalb des Kanals bildet. Die T1-S1 linker begrenzen die Eintrittsfenster der Kaliumionen, von denen eines mit Pfeil markiert ist (aus Sokolova et al., 2001); 3. Kristallstruktur einer Chimäre aus Kv1.2 und Kv2.1. Die vier einzelnen α-untereinheiten sind jeweils farblich codiert (aus Long et al., 2007). Die Transmembrandomänen S1 bis S4 sind in engem Kontakt zu S5 und S6 angeordnet. Die Helix S4 ist die Spannungssensordomäne des Kanals. Sie besitzt sechs positive Ladungen. Vier positive Ladungen werden durch Argininreste bereitgestellt, die sich bei Änderung des Membranpotentials innerhalb der Membran an unterschiedlichen Positionen ausrichten (Benzanilla, 2000; Jiang et al., 2003., Catterall 2010). Diese Positionsänderung bewirkt eine strukturelle Veränderung in der Porendomäne, die zum Gating führt. Die Helices S1-S3, verstärken diesen dynamischen Prozess. An ihrem Aminoterminus besitzen spannungsabhängige Kaliumkanäle eine Tetramerisierungsdomäne (T1-Domäne), über welche die -Untereinheiten oligomerisieren. Die Oligomerisierung der T1-Domäne findet kotranslational im Cytosol statt, d.h. noch während Ribosomen an die mrna assoziiert sind (Lu et al., 2001). Neben der Oligomerisierung vermittelt die T1-Domäne auch die Segregation der Unterfamilien: Die Interaktion wird vor allem durch Aminosäuren vermittelt, die spezifisch für die Subfamilien sind. Dabei assoziieren die vier Untereinheiten vor allem über Salzbrücken: 20 der 22 interagierenden Aminosäuren sind bei Shaker Kanälen polar. Vier der interagierenden Aminosäuren sind in allen vier Kv Familien konserviert (Bixby et al., 1999; Abb. 1.2). Sowohl aufgrund ihrer Funktion als Scharnier, das gerade so fest verhaken darf, dass noch ein Öffnen des Kanals möglich ist als auch aufgrund ihrer 3

11 1. Einleitung Lokalisation als hängende Gondel direkt unter der Kanalpore ist die T1-Domäne in das Gating involviert. Einerseits bewirken Spannungsänderungen eine Molekülbewegung innerhalb der T1-Domäne (Wang und Covarrubias, 2006). Andererseits besitzen einige Kv eine aminoterminale Verlängerung, die als Inaktivierungspartikel zu den Eintrittsstellen der Kaliumionen zurückfaltet (Baker et al., 2006). Neben ihrer Funktion als Tetramerisierungsdomäne und Modulator des Gating fungiert T1 als Interaktionsdomäne für akzessorische Untereinheiten wie die -Untereinheiten, die die elektrischen Eigenschaften des Kanals steuern. Somit verfügt die T1-Domäne über ein großes Repertoire an regulatorischen Mechanismen zur Modulation des Gating spannungsabhängiger Kaliumkanäle. Abb. 1.2: Interagierende Aminosäuren in der T1-Domäne von Shaker Kanälen. 1. Darstellung der von Bixby et al., 1999 identifizierten interagierenden Aminosäuren der im Tetramer jeweils linksseitigen Interaktionsfläche eines Monomers (vom Cytosol betrachtet); 2. Darstellung der interagierenden Aminosäuren zweier Untereinheiten des Tetramers der Shaker T1-Domäne aus Bixby et al., 1999 (in den farbigen Boxen). Die linke Säule stellt die linksseitige Interaktionsfläche dar, die rechte Säule die rechtsseitige Interaktionsdomäne. Nur die polaren Wechselwirkungen sind dargestellt. Aminosäuren, die bei allen Kv Kanälen Konsensus sind, sind grau unterlegt; Aminosäuren, die in Tsha3 abweichen, sind mit Positionsangabe neben die Boxen gezeichnet. 3. Darstellung der interagierenden polaren Aminosäuren der rechtsseitigen Interaktionsfläche analog zu SHAKER KANÄLE DER REGENBOGENFORELLE Arbeiten zur Funktion und Struktur spannungsabhängiger Kaliumkanäle wurden klassischer Weise an Kanälen aus Wirbellosen (vor allem Drosophila melanogaster und Aplysia) und Säugern (Mus musculus, Rattus norvegicus und Homo sapiens) durchgeführt. Die vorliegende Studie soll einen Beitrag darüber hinaus leisten, indem spannungsabhängige Kaliumkanäle aus Fischen als niederen Wirbeltieren untersucht werden. Teleostei besitzen im Vergleich zu Säugern eine höhere Anzahl von Subtypen ihrer Proteinfamilien, da in Knochenfischen eine Duplikation des Genoms nachzuweisen 4

12 1. Einleitung ist, die vor 200 Millionen Jahren stattgefunden hatte (Taylor et al., 2001; Taylor et al., 2003). Als Modellorganismus wird die Regenbogenforelle Oncorhynchus mykiss verwendet. In der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Jeserich wurden drei verschiedene Subtypen der Unterfamilie Kv1 (Shaker) aus dem Genom der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss; engl.: trout) identifiziert. Diese sind Tsha1 und Tsha2, die auswärts rektifizierende Ströme generieren und phylogenetisch konserviert sind. Während Tsha1 ortholog zu Kv1.2 ist, kann Tsha2 aufgrund ähnlicher Sequenzidentität zu Kv 1.1, Kv1.2 und Kv1.3 nicht exakt klassifiziert werden (Nguyen et al., 1998). Darüber hinaus wurde als weiterer Subtyp Tsha3 identifiziert, der phylogenetisch im Stamm der Wirbeltiere nicht konserviert ist und dessen Homomere in heterologen Expressionssystemen keine spannungsregulierten Ströme erzeugten (Piwowarski et al., 2004). Die stärksten Sequenzunterschiede zu anderen Kv1 liegen bei Tsha3 in der N-terminalen cytosolischen Domäne (NCD) vor. Diese Domäne besteht aus einer charakteristischen N- terminalen Verlängerung und aus der T1-Domäne, die die Konsensussequenzen für die subtypenspezifische Tetramerisierung und für die Interaktion mit Kvβ-Untereinheiten besitzt. Interessanter Weise besteht die größte Sequenzübereinstimmung mit dem humanen epithelialen Kanal hkcna 10, über dessen genaue Funktion bisher wenig bekannt ist. Tsha3 wurde über mrna-analysen ausschließlich in neuronalem Gewebe nachgewiesen (Panofen, 2001). Während Kv des Shaker Subtyps vor allem axonal lokalisiert sind, wurde Tsha3 immunologisch darüber hinaus auch im Soma nachgewiesen, während die Shaker-Untereinheiten Tsha1 und Tsha2 ausschließlich im Axon nachgewiesen werden konnten (Panofen, 2001) FRAGESTELLUNG UND ZIELSETZUNG Ein Ziel dieser Arbeit ist eine Charakterisierung von molekularen Besonderheiten der N- terminalen cytosolischen Domäne (NCD) des spannungsabhängigen Kaliumkanals Tsha3. Zur Beschreibung sollten Daten von Struktur und Dynamik des Aminoterminus von Tsha3 erhoben werden, wobei Tsha1 vergleichend analysiert werden sollte. Die Frage, ob Tsha3 trotz Abweichungen in der Sequenz der T1-Domäne in Shakerspezifischer Weise mit Kvα- und Kvβ-Untereinheiten interagiert, sollte in vitro an isolierten Domänen untersucht werden. Inwieweit solche putativen Interaktionen die Lokalisation, Expressionsrate und evozierte Ströme der Tsha3-Kanäle beeinflussen, sollte im heterologen Expressionssystem vertiefend untersucht werden. Darüber hinaus besteht ein grundlegendes Interesse an der Analyse von Struktur und molekularer Dynamik von Kv Kanälen im rekonstituierten Membransystem. Dazu soll ein System etabliert werden, in welchem Tsha1 als Shaker Subtyp für Untersuchungen der molekularen Dynamik eines Kv mit Techniken der Elektronenspinresonanzspektroskopie einsetzbar ist. 5

13 2. Material und Methoden 2. MATERIAL UND METHODEN 2.1. MATERIAL GERÄTE UND VERSUCHSSYSTEME (KITS) Die Herstellerangaben aller Geräte und Kits sind bei den jeweiligen Versuchsprotokollen angegeben CHEMIKALIEN Soweit nicht anders vermerkt, wurden alle in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien von Applichem, Carl Roth GmbH oder Sigma Aldrich bezogen. Dabei wurde jeweils der Hersteller mit dem in erforderlicher Reinheit (zur Analyse) ausgewählt. Puffer und Lösungen wurden mit H2Obidest aus einer Milli-Q-Water-System Filteranlage angesetzt ENZYME Alle Restriktionsendonukleasen wurden von Fermentas bezogen, Taq-DNA-Polymerase und Phusion-Taq von NEB, Pfu-Ultra-II-Polymerase von Stratagene, SuperscriptIII von Invitrogen OLIGONUKLEOTIDE Oligonukleotide wurden von Biomers oder Metabion bezogen. PCR-Oligonukleotide wurden in HPSF-gereinigter Qualität bezogen, Oligonukleotide für ortsgerichtete Mutagenesereaktionen in HPLC-gereinigter Qualität. Die Sequenzen aller verwendeten Oligonukleotide können dem Anhang entnommen werden REGENBOGENFORELLEN (ONCORHYNCHUS MYKISS) UND ZEBRABÄRBLINGE (DANIO RERIO) Junge Forellen (3-5 cm) wurden von dem Zuchtbetrieb Schloss Holte-Stukenbrok und handelsübliche Zebrabärblinge wurden von Fressnapf bezogen EUKARYOTISCHE EXPRESSIONSSYSTEME Zur Isolierung und Anreicherung eines vollständigen Kaliumkanals aus einem eukaryotischen System wurde der Pichia pastoris Expressionsstamm SMD1163 (his4, 6

14 2. Material und Methoden pep4, prb) verwendet. Für zellbiologische und elektrophysiologische Untersuchungen wurden Sf21-Insektenoozyten (BD Biosciences) verwendet, die mit Baculoviren infiziert wurden, die Kaliumkanalproteine exprimierten ESCHERICHIA COLI STÄMME, VEKTOREN UND PLASMIDE Tabelle 1: Genotypen der verwendeten Bakterienstämme Xl1 blue reca1 enda1 gyra96 thi-1 hsdr17 supe44 rela1 lac [F proab laciqzδm15 Tn10 (Tetr)]. Xl10 gold TetrD(mcrA)183 mcrcb-hsdsmr-mrr)173 enda1 supe44 thi-1 reca1 gyra96 rela1 lac Hte [F proab laciqz M15 Tn10 (Tetr) Amy Camr]. DH5αlpha F- 80lacZ M15 (laczya-argf) U169 deor reca1 enda1 hsdr17 (rk -, mk + ) phoa supe44 thi-1 gyra96 rela1 GM2163 F - dam-13::tn 9 dcm-6 hsdr2 leub6 his-4 thi-1 ara-14 lacy1 galk2 galt22 xyl- 5 mtl-1 rpsl136 tona31 tsx-78 supe44 mcra - McrB Bl21(DE3)pLysS F - ompt hsds B(r B -m B -) gal dcm (DE3) plyss (Cam R ) DH10bac F - mcra mrr-hsdrms-mcrbc) 80lacZ M15 lac74 enda1 reca1 deor ara,leu)7697 arad139 galu galk nupg rpsl bmaon1472/pmon7124 Tabelle 2: Vektoren Vektor Funktion Hersteller pgemt easy Vektor zum Klonieren von cdna-amplifikaten Promega pet 16b Expressionsvektor für C-terminale 6 x Histidin- Merck (Novagen) Fusionsproteine pet 23a Expressionsvektor für N-terminale 6 x Histidin- Merck (Novagen) Fusionsproteine pask-iba7 plus pask-iba3 plus pdsredn1 pacgfp-n1 ppicz pfastbac-1 Expressionsvektor für N-terminale Strep-TagII- Fusionsproteine Expressionsvektor für C-terminale Strep-TagII- Fusionsproteine Klonierungsvektor zur Herstellung von N-terminalen DsRed-Monomer-Fusionsproteinen zum Einbringen in Expressionsvektoren Klonierungsvektor zur Herstellung von N-terminalen EGFP-Monomer-Fusionsproteinen zum Einbringen in Expressionsvektoren Expressionsvektor für Pichia pastoris mit C-terminaler Fusion eines Myc-Tags und eines 6 x His-Tags. Shuttle-Vektor für das Einbringen von Sequenzen zu exprimierender Proteine in das Genom von Baculoviren IBA IBA Clontech Clontech Invitrogen Invitrogen 7

15 2. Material und Methoden Tabelle 3: bereitgestellte Plasmide Plasmid Funktion pgemteasy Tsha1/Tsha3- Amplifikation von Tsha3-NCD zum Einbringen in NCD Expressionsvektoren pfastbac dual GFP/ Tsha3 Herstellung von Baculoviren zur dualen Expression von Tsha3 und GFP pfastbac1 Tsha1-GFP Herstellung von Baculoviren zur Expression des Tsha1-GFP- Fusionskonstruktes als Kontrollversuch zur Expression selbst hergestellter Tsha1-GFP-Fusionskonstrukte pfastbac Tsha3-DsRed Herstellung von Baculoviren zur Expression vontsha3-dsred Fusionskonstrukten OLIGONUKLEOTIDE Tabelle 4: verwendete Oligonukleotide Name Sequenz (5 ->3 ) Verwendung Tsha1ntNDEv TTCGATTACTCATATGACTGTAGCC Ligation in pet23a+ Tsha3ntNDEv GGAATTCGCATATGGAGGTG Ligation in pet23a+ Tsha1nt_RWI_v ACTAGTATGACTGTAGCC Ligation in pet23a+ Tsha1nt_RWI_r GGAATTCAAAGAGCAGCCAC Ligation in pet23a+ Tsha1nt_RWII_v Tsha1nt_RWII_r CATATGACTGTAGCCACT CTCGAGTTCAAAGAGCAGCCA Ligation in pet23a+ mit 5 NDE- Restriktion Ligation in pet23a+; 5 Xho- Restriktion Tsha1nt_Xho_r CTGGAAACTCGAGGAGCAC Ligation in pet23a+ Tsha3nt_RWI_v GAATTCGATTATGGAGGTG Ligation in pet23a+ Tsha3nt_RWI_r CGAGCTGCACTGGAACTCTCT Ligation in pet23a+ Tsha3nt_RWII_v CATATGGAGGGCCAGTGGTG Ligation in pet23a+ Tsha3nt_RWII_r CTCGAGCTGCACTGGAACTCT Ligation in pet23a+ Tsha3nt_Xho_r CTGGAACTCTCGAGATACTCAAA Ligation in pet23a+ Tsha1nt_NarI_f GGCGCCGTATGACGTTAGCCACTG Ligation in pask-iba7+;pask-iba3+ Tsha1nt_NcoI_rI CCATGGTCAGGAAGTGGC Ligation in pask-iba7+;pask-iba3+ Tsha1nt_NcoI_rII CCATGGGTACTCAAAGAGCAGCC Ligation in pet16b Tsha1nt_SacII_f CCGCGGTATGACTGTAGCCACTGG Ligation in pask-iba7+;pask-iba3+ Tsha1nt_SacII_fI CCGCGGTATGACTGTAGCCAC Ligation in pask-iba7+;pask-iba3+ Tsha1nt_Xhor_16b CTCGAGCTACTCAAAGAGCAGCC Ligation in pet16b Tsha3nt_NarI_fI GGCGCCTTATGGAGGTGCCACTGGTG Ligation in pask-iba7+;pask-iba3+ Tsha3nt_NcoI_rI CCATGGAACTCTCTGGATACTC pask-iba7+;pask-iba3+ Tsha3nt_NcoI_rII CCATGGGAACTCTCTGGATAC pet16b Tsha3nt_SacII_vI CCGCGGTATGGAGGTGCCACT pask-iba7+;pask-iba3+ 8

16 2. Material und Methoden Tsha3nt_Xhor_16b CTCGAGCCAGCTCTGGAACTCTCTGG pet16b Tsha1nt_C49Av Tsha1nt_C49A-r Tsha1nt_C49S-v Tsha1nt_C49S-r Tsha1nt_C50A-v Tsha1nt_C50A-r Tsha1nt_C50S-v Tsha1nt_C50Sr Tsha3nt_C79A-v Tsha3nt_C79A-r Tsha3nt_C79S-v Tsha3nt_C79S-r Tsha3nt_C108A-v Tsha3nt_C108A_r Tsha3nt_C108S_r C49S-1 [mlyi] Antisense C49S-1 C49A-1[NspI] GACGCTGACCACGAGGCATGCGAGAGA Site directed mutagenesis GTGGTC GACCACTCTCTCGCATGCCTCGTGGTC Site directed mutagenesis AGCGTC GACGCTGACCACGAGTCATGCGAGAGA Site directed mutagenesis GTGGTC GACCACTCTCTCGCATGACTCGTGGTC Site directed mutagenesis AGCGTC CGCTGACCACGAGTGCGCAGAGAGAGT Site directed mutagenesis GGTCATCAAC GTTGATGACCACTCTCTCTGCGCACTC Site directed mutagenesis GTGGTCAGCG GCTGACCACGAGTGCTCAGAGAGAGTG Site directed mutagenesis GTCATCAA TTGATGACCACTCTCTCTGAGCACTCG Site directed mutagenesis TGGTCAGC GACTGCTAAAGGACAATCTAGAGCAAA Site directed mutagenesis CAGTCTGCTGTCCAACTT AAGTTGGACAGCAGACTGTTTGCTCTA Site directed mutagenesis GATTGTCCTTTAGCAGTC CTGCTAAAGGACAATCTAGATCAAACA Site directed mutagenesis GTCTGCTGTCCAAC GTTGGACAGCAGACTGTTTGATCTAGA Site directed mutagenesis TTGTCCTTTAGCAG CAATCAGCTGGTTCAGGAGGCACGTGA Site directed mutagenesis CAACGAAGAAGACC GGTCTTCTTCGTTGTCACGTGCCTCCT Site directed mutagenesis GAACCAGCTGATTG GTCTTCTTCGTTGTCACGTGACTCCTG Site directed mutagenesis AACCAGCTGA GACGCTGACCACGAGTCATGCGAGAGA Site directed mutagenesis GTGGTC GACCACTCTCTCGCATGACTCGTGGTC Site directed mutagenesis AGCGTC GACGCTGACCACGAGGCATGCGAGAGA Site directed mutagenesis GTGGTC Antisense C49A-1 GACCACTCTCTCGCATGCCTCGTGGTC Site directed mutagenesis 9

17 2. Material und Methoden AGCGTC CGCTGACCACGAGTGCGCTGAGAGAGT Site directed mutagenesis C50A_DdeI_v GGTCATCAAC C50A_DdeI_r C50S_DdeI_v C50S_DdeI_r C79A_AluI_v C79A_AluI_r C79S_BglII_v C79S_BglII_r C108S-1 [MlyI] Antisense C108S-1 C108A_HhaI_v C108A_HhaI_r GTTGATGACCACTCTCTCTGCGCACTC Site directed mutagenesis GTGGTCAGCG CGCTGACCACGAGTGCTCTGAGAGAGT Site directed mutagenesis GGTCATCAAC GTTGATGACCACTCTCTCAGAGCACTC Site directed mutagenesis GTGGTCAGCG CTGCTAAAGGACAATCTAGAGCTAACA Site directed mutagenesis GTCTGCTGTCCAAC GTTGGACAGCAGACTGTTAGCTCTAGA Site directed mutagenesis TTGTCCTTTAGCAG CTGCTAAAGGACAATCTAGATCTAACA Site directed mutagenesis GTCTGCTGTCCAAC GTTGGACAGCAGACTGTTAGATCTAGA Site directed mutagenesis TTGTCCTTTAGCAG TCAGCTGGTTCAGGAGTCACGTGACAA Site directed mutagenesis CGAAGAAGAC GTCTTCTTCGTTGTCACGTGACTCCTG Site directed mutagenesis AACCAGCTGA TCAGCTGGTTCAGGAGGCGCGTGACAA Site directed mutagenesis CGAAGAAGAC GTCTTCTTCGTTGTCACGCGCCTCCTG Site directed mutagenesis AACCAGCTGA Tsha1_SB_v1 TTACTGGTGTACAAATATCATACCCC Reverse Transkription von Tsha1 Tsha1_SB_v2 GAGATCCTGTGGCCGCCCGGTCTT Reverse Transkription von Tsha1 Tsha1_SB_v3 CTGCTCCCCCAGCAGAATGACTG Reverse Transkription von Tsha1 Tsha1_SB_v4 CAATGACGACGACGAACCGCACAG Reverse Transkription von Tsha1 Tsha1_SB_V5 CCTTTGAGTTCCTGGTGCGCTTGTT Reverse Transkription von Tsha1 Tsha1_SB_r1 AAATCTGACAGAAGGTCAGTTTGAG Reverse Transkription von Tsha1 Tsha1_SB_r2 TTGAGGGCAAGGTGTGACGAGCTA Reverse Transkription von Tsha1 Tsha1_SB_r3 CTCTGGTGTTTCTCACCACTCAC Reverse Transkription von Tsha1 tsha1_sb_r4 AGACTCGCACTAGACGGATGACCC Reverse Transkription von Tsha1 Tsha1_SB_r5 GGCCAGGGTGATGAAGTAAGGGAT Reverse Transkription von Tsha1 Tsha1C389S GATTGTGGGCTCCCTCTCCGCCATTGC Site Directed Mutagenesis AGGTGTGCTG Q238C GGAAAAGAAGCTATGGAATGCTTCCGT Site Directed Mutagenesis 10

18 2. Material und Methoden F245C tsha1_ecori_v tsha1_agei_r GAAATTGAGGGG TTCCGTGAAATTGAGGGGTGCATAACA GAACCTGAGCCG CGCATAGAATTCATGACTGTAGCCACT GG GGCACTACCGGTGGCACGTCTGTGAGC ATTTTGG Site Directed Mutagenesis Tsha1 in pfastbac-egfp und in pfastbac-dualgfp Tsha1 in pfastbac-egfp tsha1_sali_r CCTATTGTCGACTACACTGCTGTGAGC Tsha1 (incl. STOP) in pfastbac- DualGFP tsha1_ Xho_r CCAATACTCGAGCACGTCTGTGAGCAT Tsha1 in pet23a tsha1_ BamHI_r tsha1_sacii_v tsha1_ncoi_r tsha1_pshai_r tsha1_pshai_v TTTGG CCAATAGGATCCCTACACGTCTGTGAG CA GGGAGACCGCGGTATGACTGTAGCCAC TGG GCCATACCATGGTCCACGTCTGTGAGC ATTTTGG GCCATGACCATGGTCTCACGTCTGTGA GCATTTTGG CGCCGAGACCGCGGTCCCATGACTGTA GCCACTGGC Ligation von Tsha1 in pet16b (incl STOP), in pdsred-monomer-c1 und in pacgfp1-c1 Tsha1 in pask-iba3plus Tsha1 in pask-iba3plus Tsha1 in pask-iba7plus Tsha1 in pask-iba7plus tsha1_liesa3_v CCCCGAATTCATGACTGTAGCCACT Tsha1 in pdsred-monomer-c1 und in pacgfp1-c1 tsha1_liesa3_r GAAAAACCGGTGGCACACCTGTCCTAT CC Tsha1 in pfb-egfp und pfb-dsred tsha1_liesa1_v CCCCGGATCCATGACTGTAGCCACT Tsha1 in pfb-egfp und pfb-dsred tsha1_liesa1_r CCGGCCATGGTCACGTCTGTGAGCAT Tsha1 in pfb-egfp und pfb-dsred tsha1_liesa2_v CCCCTCCGGAATGACTGTAGCCACT Tsha1 in pdsred-monomer-c1 und in pacgfp1-c1 tsha1_liesa2_r CCGGGTCGACCTACACGTCTGTGAG Tsha1 in pdsred-monomer-c1 und in pacgfp1-c1 tsha1seq GGCTGCTCTTTGAGTACC Sequenzierung von Tsha1 tsha1seqr CATTTTGGTGATGTTGAC Sequenzierung von Tsha1 tsha3ntd1-40v AATTCCGCGGCTCAGAGGCGGTGCCT 1-40 Deletionsmutante von Tsha3 tsha3ntd1-80v AATTCCGCGGCAGTCTGCTGTCCAAC 1-80 Deletionsmutante von Tsha3 tsha3ntd1-126v GATCCCGCGGTCAGAAAGTGGTCATC Deletionsmutante von Tsha3 Tsha1nt_AgeI_for TACGACCGGTCAATGTGACCCTTG Tsha3nt_Tsha1nt Chimäre Tsha1nt_AgeI_rev ATTGACCGGTCGCCGCCGTAGCC Tsha1nt_Tsha3nt Chimäre 11

19 2. Material und Methoden Tsha1c180a Tsha1c224a Tsha1c239a Tsha1c424a Tsha1c476a Tsha1c389a CTATCGTAAGCTTCGCTCTGGAAACCC TGCCC CCTGGAGACGCTCGCTATCATCTGGTT CTCC GGTGCGCTTGTTCGCCGCTCCCAGCAA ATCAGGC GAGGAGCAGGCCCAGGCTCTAGGCCCA GTCAC CAAGACTCAGGCCAACGCTACGACGCT GGCCAACAC GATTGTGGGCTCCCTCGCTGCCATTGC AGGTGTGCTG Site directed mutagenesis Site directed mutagenesis Site directed mutagenesis Site directed mutagenesis Site directed mutagenesis Site directed mutagenesis tsha3ntbamhiv AATGGATCCATGGAGGTGCCACTGG Ligation Tsha3nt in pgex tsha3ntecorir CATGAATCCGCGGCTCAGGTTCTG Ligation Tsha3nt in pgex Tsha1Ppv1 Tsha1Ppv2 Tsha1Ppv3 Tsha1Ppv4 Tsha1_Pp_r2 KCNABsdmBGL ATTATTCGAAACGAGAGAATAATGTCT GTAGCCACTGGCGACCCC ACAATAATGTCTATGACTGTAGCCACT GGCGAC ACAATAATGTCTCACCACCACCACCAC CACCACCACCACCACATGACTGTAGCC ACTGGCGAC CGCATAGAATTCACAATAATGTCTCAC CACCACCACCACCACCACCACCACCAC ATGACTGTAGCCACTGGCGAC CTGGCGGCCGCCGCGGCTCGAGTTAAC GTCTGTGAGCA GGTTGAAGGACAAGATATTGAGCGAGG AGGGC Tsha1 mit integrierter Hefe- Consensussequenz für den Translationsstart Tsha1 mit Hefe-Consensus-sequenz für den Start der Translation Tsha1 mit Hefe-Consensussequenz und 10x HIS tag Tsha1 mit Eco-Schnittstelle, Hefe- Consensussequenz und 10x HIS tag Ligation in ppicz SDM-Entfernung der BglII- Schnittstelle aus dkcnab dkcnafit_v GGGTGACGTTTGGAGG Kontroll-PCR-Produkt dkcnab dkcnafit_r TCCGAGCAGCACAGAG Kontroll-PCR-Produkt dkcnab DKCNAB_XhoI_v DKCNAB_KpnI_r dβue_ndei_v dβue_bamhi_r CTCAGATCTCGAGCTAGAAACCTGGGG AAGTC AAGCTTGGTACCTTACTGTAGGGGTTT G GAAGGTCGTCATATGAGAAACCTGGGG AAGTC TTAGCAGCCGGATCCTTACTGTAGGGG TTTG Ligation von KCNAB in pfbredm Ligation von KCNAB in pfbredm Ligation von KCNAB in pet 16b Ligation von KCNAB in pet 16b 12

20 2. Material und Methoden Medien Alle Substanzen zur Herstellung von Medien für die Kultur von E. coli und P. pastoris wurden von BD Biosciences bezogen. Für Selektionsmedien wurden entsprechend der Antibiotika-Resistenzen der verwendeten Plasmide und Bakterienstämme 34 µg/ml Chloramphenicol, 50 µg/ml Ampicillin, 50 µg/ ml Kanamycin, 10 µg/ml Tetracyclin, 7 µg/ ml Gentamycin, 50 µg/ml Zeocin eingesetzt. (Außer Zeocin (Invitrogen) wurden alle Antibiotika von Applichem bezogen). Tabelle 5.: Medien zur Kultivierung von Bakterien-, Hefe-, und Insektenzellen Kultur Medium Rezeptur E. coli-stämme LB-Medium 1% (w/v) Baktotrpyton, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 0,5% (w/v) NaCl LB-Agarplatten 1,4 % (w/v) Bacto-Agar (BD Biosciences) in LB-Medium SOC-Medium 2 % (w/v) Typton, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 0,05% (w/v) NaCl, 2,5 mm KCl, 10 mm MgCl 2, 20 mm Glukose LB-Bac- Agarplatten 1 % (w/v) Typton, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 1% (w/v) NaCl, 1,4 % (w/v) Bacto-Agar, 100µg/ ml X-Gal, 40 µg/ ml IPTG Pichia pastoris YPD 1 % (w/v) Hefeextrakt, 2 % (w/v) Pepton, 2 % (w/v) Dextrose YPDS YPD mit 1 m Sorbitol YPD(S) Agar 2 % (w/v) Agar in YPD beziehungsweise YPDS MGY 1,34 % (w/v) YNB (Yeast nitrogen base), 1 % (v/v) Glycerol, 4 x 10-5 %(w/v) Biotin MM 1,34 % (w/v) YNB (Yeast nitrogen base), 4 x 10-5 %(w/v) Biotin, 0,5 % (v/v) Methanol Sf21 Zellen Spodopan (Pan Biotechnology) ANALYSESOFTWARE DNA-Sequenzanalyse Zur Erstellung von Klonierungsplänen und zur Auswertung von Sequenzierergebnissen wurde das Programm Clone Manager (Sci-Ed software) verwendet. Sekundärstrukturanalyse- Strukturvorhersagen: Phyre Computerassistierte Sequenzanalysen wurden mit dem online-programm Phyre durchgeführt (Kelley und Sternberg, 2009). 13

21 2. Material und Methoden 2.2. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN QUANTIFIZIERUNG VON NUKLEINSÄUREN Die Konzentration gereinigter Nukleinsäuren in destilliertem Wasser wurde mit dem Spektralphotometer (Biophotometer, Eppendorf) bei der Wellenlänge von = 260 nm durchgeführt. Dabei gilt, dass bei der OD600 ein Wert von 1 der DNA-Konzentration von 50 ng/µl beziehungsweise der RNA-Konzentration von 40 ng/µl entspricht. Die Reinheit der DNA wurde über Wert des Koeffizienten aus Extinktionsmaximum der Nukleinsäuren und der Proteine (OD260/OD280) abgeschätzt, wobei Werte zwischen 1,7 und 1,9 als reine DNA-Lösung gelten AGAROSEGELELEKTROPHORESE ZUR SEPARATION VON DNA AUS GEMISCHEN UND ZUR ABSCHÄTZUNG VON FRAGMENTLÄNGEN DNA aus Gemischen wurde über Agarosegelelektrophorese gereinigt. Dazu wurden Agarose-Gele in Tris-Acetat-EDTA-Puffer (TAE: 40 mm Tris-HAc ph 8.0, 10 mm Natrium 2000 bp mit 1,5 % (w/v) Agarose und mit Länge von >2000 bp mit 1% (w/v) Agarose eingesetzt wurde. DNA-Proben wurden zum Beschweren der Proben und zur Markierung der Lauffront mit 6x Auftragspuffer (Fermentas) versetzt und die Gele bei 100 ma in einer horizontalen Laufkammer (Biorad) in TAE-Puffer bis zur optimalen Auftrennung der Proben inkubiert. Anschließend wurde die DNA im Gel für 15 min in Ethidiumbromid-TAE [2µg/ml] angefärbt. Überschüssiges Ethidiumbromid wurde für 5 min mit destilliertem Wasser ausgewaschen. Die Visualisierung der DNA-Banden erfolgte auf einem Transilluminator (Biometra), mit dessen angeschlossener Kamera Aufnahmen gemacht wurden. Als Größenstandards wurden der SmartLadder (Eurogentec), der BpLadder low range (Fermentas) oder der BpLadder high range (Fermentas) eingesetzt. Die Reinigung von DNA aus Agarose-Gelen erfolgte über Silicamembran-basierte Säulenchromatographie mit dem NukleoSpin Extract Kit von Macherey Nagel nach Herstellerangaben POLYMERASE-KETTENREAKTION Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine enzymatische Reaktion, bei welcher in vitro DNA-Abschnitte amplifiziert werden (Saiki et al., 1988). Im Reaktionsansatz befindet sich die zu amplifizierende DNA (Template), kurze zu dieser Sequenz komplementäre Oligonukleotide (Primer), Desoxynukleotide (dntps) und eine DNA- Polymerase. Zunächst wird die DNA aufgeschmolzen. Anschließend wird die Temperatur soweit abgesenkt, dass kurze Abschnitte der DNA kondensieren. Dabei 14

22 2. Material und Methoden lagern sich die Oligonukleotide an das Template (Annealing). Zuletzt repliziert die Polymerase bei ihrer optimalen Elongationstemperatur von 72 C das Template durch Ligation komplementärer Nukleotide an die Primer. Dieser Amplifikationszyklus wird 35fach wiederholt. Dabei wird das Template exponentiell vervielfältigt PRIMERDESIGN FÜR POLYMERASE-KETTENREAKTIONEN: Als Primer wurde wurden Oligonukleotide aus drei Elementen gewählt: 1. einer Sequenz von Basen, die komplementär zu den endständigen Basen des zu amplifizierenden Templates sind. Dabei wurde darauf geachtet, dass am 3 Ende des Primers eine Base vorliegt, die drei Wasserstoffbrücken ausbildet. 2. eine Erkennungssequenz für Restriktionsenzyme im 5 Bereich, um die DNA in Vektoren zur genomischen Veränderung von Zellen einbringen zu können. 3. Vor diese Basen wurde am 5 Bereich weitere vier bis sechs frei gewählte Nukleotide integriert, weil Restriktionsendonukleasen endständige Erkennungssequenzen weniger effizient schneiden würden. Es wurde darauf geachtet, dass der G/C Gehalt der gewählten komplementären Sequenzen % betrug STANDARD-PCR Standard-Polymerase Kettenreaktionen (PCR) wurden mit dem Enzym Taq DNA Polymerase (New England Biolabs) nach Herstellerangaben durchgeführt. Dabei wurde im Allgemeinen in einem 50 µl Ansatz in PCR-Pufferlösung [5x Stock: 10 mm Tris HCl (ph 8.3), 50 mm KCI, 1.5 mm MgCl2] je 0,5 µm der Oligonukleotide, 400 µm einer äquimolaren Oligonukleotid-Mischung (Stammlösung mit 2,5 mm pro Nukleotid) und 1 10 ng Template angesetzt. Die PCR wurde im Thermocycler (Mastercycler, Eppendorf) durchgeführt, wobei zunächst der Ansatz ohne die Polymerase für 2 min bei 90 C zum Schmelzen der DNA inkubiert (hot start) wurde wonach bei 72 C 1 U Taq Polymerase zugegeben wurde. Anschließend erfolgten standardmäßig das Schmelzen für 30 s bei 94 C, das Annealing für 30 s bei 58 C und die Elongation für 30 s bei 72 C. Diese drei Schritte wurden 34 x wiederholt. Abschließend erfolgte eine Elongation bei 72 C für 5 min. Die Proben wurden bis zur Analyse über Agarosegelelektrophorese bei 4 C gelagert. In Abweichung vom Standard wurde zum einen die Annealingtemperatur zwischen 50 C und 60 C entsprechend der Schmelztemperatur der Primer gewählt, wobei die optimale Temperatur in einer Gradienten-PCR mit Parallelansätzen unterschiedlicher Annealingtemperatur festgestellt wurde. Zum anderen wurde die Elongationszeit entsprechend der Länge des Templates variiert, wobei beachtet wurde, dass die heutigen Taq DNA-Polymerasen 2 kb während der ersten Elongationsminute elongieren und pro weiteres kb eine weitere Minute Inkubationszeit amplifizieren. Als drittes wurde die DNA-Polymerase variiert, wobei für kurze Fragmente (< 1 kb) und Kontroll-PCR die Taq-Polymerase aus Thermophilus aquaticus (NEB) verwendet wurde, 15

23 2. Material und Methoden während für die Amplifikation von längeren Fragmenten (> 1 kb) zur Klonierung die biotechnisch modifizierte Fusion-Taq (Fermentas) eingesetzt wurde QPCR ZUR KLONANANLYSE Die schnelle Überprüfung des Genotyps einer E. coli Kolonie erfolgte über quantitative PCR (qpcr): Kolonien wurden mit einer sterilen 2 µl-200 µl Pipettenspitze von einer Kulturplatte abgenommen und in 50 µl sterilem bidestilliertem Wasser in einem Reaktionsgefäß resuspendiert. Nach Resuspension wurde mit derselben Spitze ein Ausstrich auf eine Masterplatte gesetzt, um ein späteres Animpfen derselben Kultur zu ermöglichen. Die Zellsuspension wurde für 5 min bei 95 C aufgekocht und anschließend das Debris für 1 min bei 11 x kg sedimentiert. Vom Überstand wurden 21 µl mit jeweils 2,5 µl PCR-Reaktionspuffer [10 mm Tris HCl (ph 8,3), 50 mm KCI, 1,5 mm MgCl2], 1 µl dntp, je 0,5 µm PCR-Primer und 0,5 U Taq-Polymerase versetzt. Abschließend wurde eine PCR mit einem wie in beschriebenen Programm durchgeführt, allerdings ohne Hotstart ORTSGERICHTETE MUTAGENESE Bei der ortsgerichteten Mutagenese werden einzelne Nukleotide einer Sequenz ausgetauscht, um bei Expression des entsprechenden Genprodukts einen Aminosäureaustausch zu erhalten. In der vorliegenden Arbeit wurden nach dem Prinzip des Quick Change Site-directed-mutagenesis Kits (Stratagene) mit Mismatch-Primern ganze Plasmide amplifiziert. Anschließend wurden die ursprünglichen Template- Plasmide enzymatisch mit dem Enzym DpnI, das ausschließlich methylierte DNA schneidet, verdaut. Die Amplifikate der Mutagenesereaktion wurden in Bakterien des Stammes E. coli Xl1 blue beziehungsweise E. coli Xl10 gold eingebracht, die über ein Nick-Repair-System verfügen und linearisierte Plasmide ligieren und replizieren können. Von diesen Transformanten werden Einzelkolonien herangezogen. Zur Kontrolle der erfolgten Mutagenese wird eine Kontrollrestriktion mit einem Enzym, das innerhalb der Info-Box 1: Beispiel eines OligoNukleotids für die Mutagenese: Tsha1-NCD C49S mit MlyI Schnittstelle Flankierende Originalsequenz: TGACCACGAGTGCTGCGAGAGAGT Flankierende Tripletts sind GAG (für die AA D) sowie TGC (für die AA C). Um aus dem C49 ein Serin zu machen, muss die Sequenz TGC in eine der folgenden Sequenzen umgewandelt werden: TCT, TCA, TCG, TCC, AGT oder AGC. Mögliche Restriktionsstellen nach Mutagenese könnten also die Sequenzen GAGTCN oder AGYTGC beinhalten. (Außerdem könnten die Sequenzen für die flankierenden AA gewobbelt werden, da auch hier zusätzliche Mutagenese erfolgen darf). Mit dem Enzymefinder wurde mit der Eingabe GAGTC die Schnittstelle GAGTCNNNNN für das Enzym MlyI gefunden. 16

24 2. Material und Methoden mutierten Sequenz schneidet durchgeführt. Zumeist werden dabei Enzyme identifiziert, die zusätzlich das Plasmid schneiden. Da die entstehenden Fragmente bei der Identifikation Fragmente des Inserts stören könnten, wurde zunächst die Insertsequenz amplifiziert und diese zur Kontrolle der erfolgten Mutagenese verdaut PRIMERDESIGN FÜR MUTAGENESEREAKTIONEN Für Kontrollrestriktion sollte durch die Mutagenese eine Restriktionsstelle eingeführt wurden. Dazu wurde für die auszutauschende Aminosäure (AA) eine Triplettsequenz gewählt, die mit einem flankierenden Triplett eine Restriktionsstelle ergibt. Die Triplettsequenz der flankierenden AA im 5 oder 3 -Bereich der zu mutierenden AA wurde in eine elektronische Datenbank mit Suchfunktion für Enzyme (z.b. identifiziert. Dabei wurde berücksichtigt, dass der genetische Code degeneriert ist und mehrere Möglichkeiten für die Tripletts der zu mutierende Aminosäure und im flankierenden Bereich vorliegen. Nach Auswahl der Sequenz für die Schnittstelle wurden an diese Sequenz beidseitig dem Template komplementäre Basen angehängt. Dabei wurden die erwähnten Angaben ( ) bezüglich des GC-Gehaltes und der terminalen Basen berücksichtigt ORTSGERICHTETE MUTAGENESEREAKTION Die ortsgerichtete Mutagenese von Plasmiden wurde in einem Volumen von 25 µl durchgeführt. Darin befanden sich 25 µg Template, 125 pmol des Mutagene- Oligonukleotides, 20 nmol dntps, 10 % Glycerin in einfach angesetztem Mutagenese- Reaktionspuffer. Diese Lösung wurde für 2 min bei 95 C gehalten und 0,1 U Pfu-UltraII- Polymerase (Stratagene) zugefügt. Anschließend wurde der Ansatz bei 90 C für 30 s geschmolzen, die Oligonukleotide bei 50 C für 60 s angelagert und die Plasmide bei 68 C amplifiziert, wobei die Angaben zur Amplifikationszeit unter berücksichtig wurden. Als Elongationszeit wurde beispielsweise bei pask-iba7+ (3,3kb) mit dem Tsha3 Insert (0.8 kb) 4 min gewählt. Zur Eliminierung der Ausgangsplasmide wurden die kompletten Mutageneseansätze mit 1 µl des Enzyms DpnI versetzt und für 3 h bei 37 C oder über Nacht bei 4 C inkubiert. Nachfolgend wurden 10 µl der Mutageneseansätze in 50 µl kompetente Xl1 blue-zellen oder Xl10 gold-zellen transformiert (wie in beschreiben) wobei der Hitzeschock bei 42 C für 45 s durchgeführt wurde. Die Transformanten wurden ausplattiert und zur Überprüfung der Plasmidsequenz eine qpcr durchgeführt. Die Amplifikate wurden mit dem Enzym verdaut, das die eingebrachte Sequenz schneidet (vgl ). Von positiv getesteten Klonen wurden 1 ml Kulturen mit 10 % DMSO versetzt und als Dauerkulturen bei -80 C eingelagert. 17

25 2. Material und Methoden TECHNIKEN ZUR GENOMISCHEN VERÄNDERUNG VON BAKTERIENZELLEN PLASMIDISOLIERUNG Für molekularbiologische Zwecke (Amplifikation von Inserts, Einbringen von Genabschnitten in Expressionsvektoren) wurde Plasmid-DNA aus 5 ml Übernachtkulturen die E. coli Zellen mit dem NukleoSpin Extract Mini Kit von Macherey Nagel nach Herstellerangaben isoliert. Diese Reinigungsmethode beruht auf dem Prinzip einer Anionenaustauschersäule. Dabei wurden in Volumina von 30 µl bis 100 µl Plasmidkonzentrationen von 50 ng/µl bis 500 ng/µl erhalten. Für die Isolation hochreiner Plasmide zur Transfektion von Sf21 Zellen wurden Plasmide mit dem NukleoSpin Extract Midi Kit von Macherey Nagel isoliert und anschließend mit dem Finalizer (Macherey Nagel) gereinigt HERSTELLUNG REKOMBINANTER PLASMIDE: RESTRIKTION, DEPHOSPHORYLIERUNG, LIGATION Zur Insertion eines Genabschnittes in einen Vektor müssen die zu inserierende DNA und der Vektor angereichert, isoliert und geschnitten werden. Dabei entstehen komplementäre kohäsive Enden (sticky ends), die die Ligation beider DNA-Abschnitte erlauben. Um die Religation von geschnittenem Plasmid zu verhindern, werden Plasmide an ihrem 5 Ende enzymatisch dephosphoryliert. Der zu inserierende Genabschnitt wurde wie in beschrieben über PCR amplifiziert, wobei die Amplifikate mit Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen versetzt wurden. Diese wurden über Gelelektrophorese aus dem PCR-Ansatz isoliert und gereinigt (2.2.2.). Vektoren wurden aus 5 ml Übernachtkulturen isoliert wie unter beschrieben wurde. Zur Restriktion wurden µg DNA des Vektors bzw. des Inserts in einem Ansatz von µl mit 1-2 U der entsprechenden Endonuklease in dem vom Hersteller vorgegebenen optimierten Nuklease-Puffer angesetzt und für 1 3 h bei 37 C im Thermoblock inkubiert. Bei hitzeinstabilen Enzymen folgte eine Thermoblockierung des Enzyms für 20 min bei 60 C. Anschließend wurde das Plasmid mit 1 U CIP (Alkalische Phosphatase aus Rinderdarm) für 30 min bei 37 C dephosphoryliert. Geschnittene Plasmide wurden über Agarosegelelektrophorese und Glasmilchsäulen aufgereinigt (2.2.2). Die Aufreinigung der Inserts erfolgte direkt über das NukleoSpin Extract Kit nach Herstellerangaben für die Isolierung von DNA aus enzymatischen Reaktionen, wobei die abgeschnittenen DNA-Enden ausgewaschen wurden, weil für die Assoziation an die Säule eine Mindestlänge von 50 bp erforderlich ist. Die Konzentration von gereinigter DNA des Vektors und des Inserts wurden nach bestimmt. Für Ligationsansätze wurden ng Vektor-DNA eingesetzt und Insert in 3-6fachem molarem Überschuss zugefügt. Vektor und Insert wurden auf Eis mit 1 U T4-Ligase und dem entsprechenden Puffer (New England Biolabs) versetzt und über Nacht bei 16 C im Thermocycler inkubiert. 18

26 2. Material und Methoden HITZESCHOCKTRANSFORMATION VON E. COLI HERSTELLUNG -KOMPETENTER ZELLEN FÜR DIE HITZESCHOCKTRANSFORMATION VON E. COLI Eine 5 ml Übernachtkultur wurde in 100 ml b-medium (0,5% (w/v) Hefeextrakt; 2% (w/v) Pepton; 0,5% (w/v) MgSO4; ph 7.6 (KOH)) überimpft und für circa zwei Stunden bei 37 C bis zur optischen Dichte bei den Wellenlänge 600 (OD600) von 0,5 wachsen gelassen. Die Zellen wurden für 5 min im Eiswasserbad abgekühlt und anschließend für 2 min bei 5000 x g und 4 C zentrifugiert. Der Medienüberstand wurde verworfen und das Zellpellet mit 40 ml eiskaltem Transformationspuffer I (TfbI-Puffer: KOAc, ph 5.8 [30 mm]; RbCl [100 mm]; CaCl2+2 H2O [10 mm]; Glycerin [15% (v/v)]; MnCl2+4 H2O [50 mm]] gewaschen. Nach Inkubation im Eisbad für 5 min wurde die Zentrifugation wiederholt. Das gewaschene Zellpellet wurde in 4 ml TfbII (MOPS-HCl, ph 6,5 [10 mm]; CaCl2+2 H2O [75 mm]; RbCl [10 mm]; Glycerin [15% (v/v)]; resuspendiert, für 15 min auf Eis inkubiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 C gelagert HITZESCHOCKTRANSFORMATION -kompetente Zellen wurden für bis zu 5 min vorsichtig im Eisbad aufgetaut. In einem sterilen Mikroliter-Zentrifugiergefäss wurden 100 µl kompetente Zellen mit 10 µl Transformationsansatz (Plasmide [2-5 ng/µl DNA], Ligationsansatz oder Ansatz einer Site-Directed-Mutagenesis) vorsichtig gemischt und für min auf Eis inkubiert. Der Hitzeschock erfolgte im Wasserbad bei 42 C, wobei DH5α und GM2163 Zellen für 75 s, Bl21(DE3)pLysS-und Rosetta origami-zellen für 60 sec und Xl1 blue-und Xl10 gold- Zellen für 45 s inkubiert wurden. Nach zweiminütiger Inkubation auf Eis erfolgte eine Inkubation im Thermoblock (Eppendorf) bei 37 C und 800 upm für 45 min. Die Zellsuspensionen wurden kurz in einer Tischzentrifuge sedimentiert, der Medienüberstand bis auf circa 100 µl abgenommen und das Zellpellet resuspendiert. Diese Suspension wurde auf eine 10 cm Agarplatte mit entsprechendem Selektionsmedium ausgestrichen TECHNIKEN ZUR TRANSKRIPTOMANALYSE ISOLIERUNG VON MRNA AUS DEM GEHIRN VON FORELLE UND ZEBRAFISCH Alle zur RNA-Isolierung verwendeten Arbeitsplätze wurden vor den Arbeiten gründlich mit entsprechenden Reinigungsmitteln (Applichem) von RNAse und möglicher kontaminierende DNA gereinigt. Präparierbesteck, fusselfreie Tücher und Staniolpapierstücke wurden über Nacht bei 200 C ausgebacken. Alle Arbeiten wurden auf Eis durchgeführt. Zur Isolierung des Gewebes wurden 6-10 cm große adulte Forellen bzw. 3-5 cm große adulte Zebrafische dekaptiert. Das Tectum wurde isoliert und auf RNAse-freier Aluminiumfolie ausgewogen. Anschließend erfolgte die Isolierung der RNA 19