Biophysik-Praktikum DNA/PNA Schmelzkurven. Teilnehmer Gruppe Betreuer

Transkript

1 Biophysik-Praktikum DNA/PNA Schmelzkurven Deckblatt Teilnehmer Gruppe Betreuer Termine: Versuchsdurchführung: Abgabetermin: Abgabe der 1. Korrektur: Abgabe der 2. Korrektur: Verbindliche Erklärung: Hiermit bestätigen wir, dass wir die nachfolgend angeheftete Ausarbeitung eigenständig und nur mit den angegebenen Hilfsmitteln angefertigt haben: Unterschriften: 1.) 2.) 3.) 4.) Organisatorische Anmerkungen: Durchführung OK? Fristgerechte Abgabe?! Ja! Ja! Nein! Nein Ausarbeitung akzeptiert?! Ja! Nein Folgende Nachbesserungen sind erforderlich: Wichtig: Bei Vorlage von Verbesserungen unbedingt die beanstandete Version beifügen!

2 DNA/PNA Schmelzkurven Seite 2/7 Messung der Schmelzkurven von DNA/PNA 1. Stichworte und Literatur zur Vorbereitung DNA, PNA, DNA/PNA Interaktion, UV/Vis-Spektroskopie, Schmelzkurven von DNA/PNA [1] R. Winter, F. Noll: Methoden der biophysikalischen Chemie, Teubner Studienbücher [2] P. Wittung et al.: DNA-like double helix formed by peptide nucleic acid, Nature (1994) [3] N. Patenge et al.: Inhibition of Growth and Gene Expression by PNA-peptide Conjugates in Streptococcus pyogenes, Molecular Therapy-Nucleic Acids (2013) 2 [4] V. Menchise et al.: Insights into peptide nucleic acid (PNA) structural features: The crystal structure of a D-lysine-based chiral PNA-DNA duplex, PNAS (2003) [5] K. K. Jansen et al.: Kinetics for Hybridization of Peptide Nucleic Acids (PNA) with DNA and RNA Studied with the BIAcore Technique, Biochemistry (1997) [6] M. C. Chakrabarti und F.P. Schwarz: Thermal stability of PNA/DNA and DNA/DNA duplexes by differential scanning calorimetry, Nucleic Acids Research (1999) [7] P. E. Nielsen: Peptide Nucleic Acids Methods and Protocols, Humana Press, Grundlagen In den letzten Jahren ist die Anzahl wirksamer Antibiotika aufgrund vermehrter Resistenzbildung vieler pathogener Bakterienstämme stark gesunken. Diese Tatsache führt dazu, dass man bei der Entwicklung hochwirksamer Antibiotika immer mehr auf neue Strategien angewiesen ist. Eine dieser Strategien besteht in der Entwicklung synthetisch hergestellten sogenannter Antisense-Peptid- Nukleinsäuren (PNAs). Als Beispiel hierfür sei auf eine Studie verwiesen in der das Wachstum des Bakteriums S. pyogenes durch die Anwendung von konjugierten (PNAs) gehemmt wird, die spezifisch an das, für das Bakterium wesentliche Gyrase A Gen (gyra) binden [3]. Hierbei handelt es sich um eine Knock-down-Strategie ähnlich der RNAinterfierence (RNAi) bei der mrnas, die für bestimmte Zielproteine kodieren ausgeschaltet werden können. Seite 3/7

3 Im Folgenden steht die Hybridisierung der gewählten PNA mit der spezifischen DNA im Fokus. Es soll primär gezeigt werden, dass sich die Absorption der PNA/DNA-Komplexe als Funktion der Zeit sigmoidal verhalten und somit im Unterschied zu einzelsträngiger PNA bzw. DNA einen kooperativen Schmelzvorgang aufweisen. 2.1 Desoxyribonukleinsäure (DNA) Die Desoxyribonukleinsäure-Moleküle kommen in allen Lebewesen vor und dienen dort als Speicher der genetischen Information. Zu den Basen der DNA zählen die beiden Purine Adenin (A) und Guanin (G), sowie die Pyrimidine Thymin (T) und Cytosin (C). Diese liegen in der DNA als Nukleotide vor. Hierbei sind die Basen jeweils über eine N-glycosidische Bindung mit einer Desoxyribose verknüpft, welche zusätzlich eine Monophosphatgruppe am 5 -Ende trägt. Ein DNA-Strang wird über die Phosphatgruppe des einen Nucleotids und dem 3 -Ende der Desoxyribose des anderen Nukleotids gebildet. Ein DNA-Molekül besteht in der Regel aus einem Doppelstrang, hierbei bildet die Base des einen Strangs Wassersoffbrücken mit der Base des anderen Strangs aus. Die Basenpaarung erfolgt zwischen A und T, sowie G und C. Die beiden Stränge der DNA sind miteinander zu einer helikalen Struktur verwunden, was als DNA-Doppelhelix bezeichnet wird. 2.2 Peptid-Nukleinsäure (PNA) Peptid-Nukleinsäuren (PNA) sind synthetische Moleküle, die durch Dr. Peter Nielsen, erstmals im Jahr 1993 entwickelt und kommerzialisiert wurden. Das Rückgrat besteht aus Wiederholungen von N-(2-Aminoethyl)-glycin-Einheiten, die über Peptidbindungen verbunden sind. Die verschiedenen Basen (A, G, C, T) sind durch Methylen-Carbonyle an das Rückgrat gebunden. Im Gegensatz zur DNA, enthalten PNAs keine Pentosezucker oder Phosphat-Gruppen (siehe Abbildung 1). Durch diese neutral geladene Struktur besitzen sie die Möglichkeit über Watson-Crick Basenpaarung sehr stabile Duplex Strukturen, komplementär zu DNA, RNA oder PNA Oligomeren, zu bilden. Die hohe Affinität von PNA zu komplementärer DNA oder RNA ist hauptsächlich auf die fehlende elektrostatische Abstoßungskraft zwischen dem ungeladenen PNA-Rückgrat und der natürlichen Nukleinsäure zurückzuführen. Entsprechend der höheren Affinität ist die Schmelztemperatur (T m ) aller PNA-Hybride generell höher als die von DNA/DNA oder DNA/RNA Komplexen. Die Erhöhung der Tm-Werte beträgt in etwa 1 C pro Basenpaar. Generell beträgt der Tm-Wert einer 10mer und einer 15mer PNA rund 50 C bzw. 70 C. Seite 4/7

4 Abbildung 1: Unterschied zwischen dem Aufbau der PNA und dem der DNA. Im Gegensatz zur DNA benötigt die PNA auf Grund ihrer neutralen Ladung keine erhöhte Salzkonzentration für die Hybridisierung. PNAs weisen auf Grund ihres ungeladenen Rückrades im Vergleich zu DNA und RNA eine erhöhte Hydrophobizität auf. Wegen der Stärke der PNA/PNA-Interaktion sollte verhindert werden, dass komplementäre PNA aneinander binden. Ein Vorteil der PNA ist, unempfindlich gegen den enzymatischen Abbau durch Nukleasen oder Peptidasen zu sein. 2.3 Schmelzkurve der DNA/PNA-Moleküle Doppelsträngige Desoxyribonukleinsäure besitzt im nativen Zustand eine hohe Stabilität. Wird die doppelhelikale Struktur der DNA in wässriger Lösung nun allerdings auf nahezu 100 C erhitzt, oder einem ph-wert über 11,5 ausgesetzt, kommt es zur Dissoziation des Doppelstrangs. Dieser denaturierende Phasenübergang wird als Schmelzvorgang bezeichnet und wird ebenso bei PNA/DNA-Komplexen beobachtet. Die Schmelztemperatur (Tm) wird als die Temperatur definiert, bei der die Mengen an basengepaarten Duplexen und ungepaarten Einzelsträngen im Gleichgewicht vorliegen. Die wichtigste Methode zur Bestimmung der Tm-Werte, sowie zum Bestimmen von Enthalpien (ΔH ) und Entropien (ΔS ) komplexer Assoziation/Dissoziation von PNA/DNA-Komplexen ist die Absorptionsmessung bei 260 nm als Funktion der Temperatur. Da der Einzelstrang einen 12-40% höheren Extinktionskoeffizienten hat, kann der Übergang von ds nach ss als Zunahme der Absorption bei 260 nm bestimmt werden. Wird die Änderung der UV-Absorption in Abhängigkeit von der Temperatur aufgezeichnet, ergibt sich auf Grund der Phasenumwandlung eine sigmoide Schmelzkurve, an deren Wendepunkt die Schmelztemperatur abgelesen werden kann. Der sigmoide Verlauf deutet auf einen kooperativen Schmelzvorgang hin, in dem die Basenstapelung aufgehoben, und die H-Brücken zwischen den Nukleinbasen getrennt werden. Seite 5/7

5 Ein wesentlicher Faktor für gute, reproduzierbare Ergebnisse, liegt darin, dass die Löslichkeit des Zielmoleküls hoch genug ist, um Komplikationen wie Aggregation zu vermeiden. Für thermodynamische Untersuchungen unter Verwendung der absorptiven Schmelzkurven sind die minimalen Konzentrationen der Oligomere in der Regel im µm Bereich. Für DNA und RNA, ist es normalerweise kein Problem, solche Konzentrationen in wässrigen Lösungen zu erreichen. Für bestimmte PNA-Sequenzen, insbesondere solche mit hohem Guanin-Gehalt, kann es sich allerdings als Problem herausstellen die gewünschte Konzentration zu erreichen. 3. Praktischer Teil 3.1 Herstellung des DNase-freien Hybridisierungspuffers Der verwendete Hybridisierungspuffer ist DNase-frei herzustellen, um dem möglichen Abbau der DNA vorzubeugen. Dazu wird der Puffer angesetzt (100 mm NaCl und 10 mm Phosphatpuffer, mit einem ph 7,0) und mit 0,1 % DEPC versetzt. Der Puffer wird über Nacht bei ca. 60 C unter ständigem Rühren inkubiert und anschließend autoklaviert. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur werden 0,1 mm EDTA hinzugefügt. 3.2 Schmelzkurven der PNA und der DNA Die Schmelztemperatur wird im selben Hybridisierungspuffer aufgenommen indem die Hypochromazität bei 260 nm als Funktion der Temperatur über die Zeit mit einem UV-VIS-Spektrometer gemessen wird. Die sspna und die ssdna werden dabei äquimolar (3-5 µm) im Hybridisierungspuffer gelöst. Vor der Aufnahme der Schmelzkurve wird die Probe der entsprechenden Einzelund / oder Doppelstränge auf eine hohe Temperatur (90 C) erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Probe sollte dann in eine geeignete Quarzküvette überführt werden. Um auszuschließen, dass sich Luftblasen in der Küvette bilden und die Probe nicht verdampft, wird die Quarzküvette vollständig befüllt und Luftundurchlässig mit Parafilm verschlossen. Um die Schmelzkurve eines PNA/DNA- bzw. PNA/RNA-Komplexes aufzunehmen muss zuvor ausgeschlossen werden, dass sowohl die PNA als auch die DNA (RNA) Selbstkomplementarität aufweist. Dazu wird eine Probe der PNA als auch des DNA-Oligos je auf dessen Hypochromazität getestet. Die Probe wird im Seite 6/7

6 Hybridisierungspuffer gelöst und im Intervall von 2 C/min über eine Temperaturspanne von 20 bis 80 C die Absorption (260 nm) über der Zeit gemessen. Die Konzentration der Probe ist so zu wählen, dass die Extinktionswerte nicht zu niedrig (>0,05), jedoch auch nicht zu hoch (<2) sind um ein zufriedenstellendes Signal zu Konzentrations-Verhältnis zu gewährleisten (Die Einzelaufnahme wird innerhalb der Gruppen aufgeteilt. Die Ergebnisse sollten ausgetauscht werden). 3.3 Einstellung des Temperaturprofils im Wasserbad Der PID-Regler des Wasserbades sollte so eingestellt werden, dass die gewünschte Temperatur schnell und dennoch mit möglichst geringfügig überschwingender Temperatur erreicht wird. Dazu müssen die Regelparameter X p, T n und T v ermittelt werden (X p Streckenverstärkung in K, T n Verzugszeit in s, T v Ausgleichszeit in s). Um weiterhin die Temperaturverzögerung zu beachten wird die Temperatur in den Küvettenhalterungen mit Hilfe externer Thermometer vor und hinter der Probe in einer Küvette mit einem Probenvolumen von 800 µl gemessen. Das Temperaturprofil wird über das Programm EasyTemp (Julabo) so gewählt, dass die Temperaturänderung in der Küvettenhalterung konstant ca. 2 C/min beträgt. Der Mittelwert dieser Messwerte wird ihnen vom Betreuer mitgeteilt. Seite 7/7

7 4. Auswertung 1. Erstellen sie mit dem Programm Mfold die 2D Struktur der DNA. Dabei werden jeweils die Strukturen verwendet, die bei 21 C die geringste freie Gibbs Energie aufwiesen. Markieren sie die Bindungsstelle der PNA (NCBI/ BLAST/ blastn). 2. Die Schmelzkurven sind mit Hilfe von IGORPro zu fitten und in Abhängigkeit des Temperaturprofiles darzustellen. 3. Enthällt die pentadecamere PNA2 alle vier Basen? Sind diese vollständig komplementär zu DNA2? Erläutern sie ihr Ergebnisse. 4. Erläutern sie anhand dieser Ergebnisse, ob eine Sekundärstruktur sowie eine mögliche Dimerbildung der sspna, sowie der ssdna bei der jeweils angemessenen Konzentration auszuschließen ist. 5. Warum ist es wichtig die Proben vor der Messung auf 90 C zu erhitzen? 6. Nennen sie min. ein Beispiel mit Literaturangaben welches die Verwendung von PNA in der Pharmazie wiederspielgelt. Anhang:

8 Durchführung Schmelzkurve Pipettierschema V Hyb.-Puffer in L V PNA in L V ges in L Verwendung des DNAse freien Puffers. Proben werden für 5 min bei 90 C (600 rpm) erhitzt und anschließend auf RT abgekühlt Probe Konzentration Volumen der Probe c = V = Einstellung PID- Regler 1/60/10 Zeit [sec] Temperatur Wasserbad [ C] Temperatur Thermometer 1 Küvettenhalter [ C] Temperatur Thermometer 2 Küvettenhalter [ C] Position BiTe 1 Windaus 4 30 erste UV Messung Durchschnittliche Temp [ C]