Cornel Mülhardt. Molekularbiologie/ Genomics

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3 1 Was ist denn Molekularbiologie", bitteschön? Das Substrat der Molekularbiologie, oder : Molli-World für Anfänger Was brauche ich zum Arbeiten? Sicherheit im Labor 8 2 Einige grundlegenden Methoden Nucleinsäure ist gleich Nucleinsäure und auch wieder nicht Vom Fällen und Konzentrieren von Nucleinsäuren Alkohol-Fällung Konzentratoren Speed-vac Aussalzen" Die Reinigung von Nucleinsäuren Phenol-Chloroform-Extraktion Fällung mit PEG Proteinbindende Filtermembranen Anionenaustauschersäulen Glasmilch Cäsiumchlorid-Dichtegradient Dialyse Konzentrationsbestimmung von Nucleinsäurelösungen Methoden zur DNA-Präparation Präparation von Plasmid-DNA im kleinen Maßstab (Minipräparationen) Präparation von Plasmid-DNA im großen Maßstab (Maxipräparationen) Bakterienmedien Präparation von Phagen-DNA Präparation einzelsträngiger DNA mittels Helfeiphagen Präparation von genomischer DNA Das Werkzeug Restriktionsenzyme Gele Agarosegele DNA-Fragmente aus Agarosegelen isolieren Polyacrylamidgele (PA-Gele) DNA-Fragmente aus PA-Gelen isolieren Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) Kapillarelektrophorese Blotten 63

4 3.3.1 Southern Blot Northern Blot Dot und Slot Blot 69 4 Die Polymerase- Kettenreaktion (PCR) Die Standard-PCR Tips zur Verbesserung der PCR Nested PCR Multiplex PCR Amplifikation langer DNA-Fragmente (> 5kb) PCR- Anwendungen Reverse Transkription - Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) Rapid amplification of cdna ends (RACE) Amplifikation zufälliger Produkte Klassische quantitative PCR Real-time quantitative PCR Inverse PCR Biotin-RAGE und Supported PCR Mutagenese mit modifizierten Primern ARMS (amplification refractory mutation system) in-situ-pcr Cycle Sequencing cdna- Synthese Einzelzell-PCR RNA Methoden der RNA-Isolierung Methoden der mrna-isolierung Reverse Transkription (cdna- Synthese) In-vitro-Transkription (RNA-Synthese) Die Klonierung von DNA-Fragmenten Die Grundlagen des Klonierens Klonieren von PCR- Produkten Klonieren mit Rekombinase- Systemen Mit welchen Vektoren klonieren? Plasmide Phagen Cosmide PACs und BACs YACs Welche Bakterien? Herstellen kompetenter Zellen und Transformation 134

5 6.5 Probleme beim Klonieren Die Lagerung von Klonen Wie man DNA aufspürt Herstellung von Sonden Methoden zur Herstellung markierter Sonden Hybridisierung Nachweis der markierten DNA Autoradiographie Nicht-radioaktive Nachweismethoden Screenen von rekombinanten DNA-Banken Two-hybrid system DNA-Analyse Sequenzierung Radioaktive Sequenzierung Nicht-radioaktive Sequenzierung und automatische Sequenziergeräte Kurioses zum Thema Sequenzieren: Octamere Methoden zur Analyse von DNA auf Mutationen Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) Single strand conformation polymorphism (SSCP) Denaturierende Gradientengelelektrophorese (DGGE) Temporal temperature gradient electrophoresis (TTGE) Heteroduplexanalyse (HA) ARMS Enzymatische Spaltung von Fehlpaarungen (enzyme mismatch cleavage, EMC) Protein truncation test (PTT) Untersuchung der Funktion von DNA-Sequenzen Untersuchung der Transkription in Geweben Ribonuclease protection assay (RPA) Real-time quantitative PCR (RTQ-PCR) in-situ-hybridisierung Chromosomale Lokalisierung eines Gens (FISH) in-situ-pcr Microarrays Mutagenese in-vitro-translation Expressionssysteme Bakterielle Expressionssysteme B aculovirus-expressionssysteme 206

6 9.4.3 Heterologe Expression in Säugerzellen Weitere Expressionssysteme Transfektionsmethoden Kotransfektion mehrerer Gene Transiente und stabile Transfektionen Reportergene Transgene Mäuse Methoden des Gentransfers Regulation der Transgenexpression Das Tet-System Das Ecdyson-System Gentherapie Genomik Der Computer und Du Zu guter Letzt Anhang Nützliche Tabellen Standardlösungen Glossar Wer, was, wo? Lieferanten / Adressen Literatur 260

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