C i attomol Anti-Gangliosid-IgG/M Lineassay 5 Testkit zur Bestimmung von IgG- oder IgM-Antikörpern
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- Claudia Hartmann
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1 C i attomol Anti-Gangliosid-IgG/M Lineassay 5 Testkit zur Bestimmung von IgG- oder IgM-Antikörpern REF Bestimmungen GEBRAUCHSANWEISUNG 1. VERWENDUNGSZWECK Der Anti-Gangliosid LINA 5 ist ein manuell abzuarbeitender Streifentest zur qualitativen Bestimmung von IgGoder IgM-Antikörpern gegen folgende 11 Ganglioside in humanem Serum, welche bei der Differentialdiagnose von autoimmunen Neuropathien in Betracht kommen: GM1 GD1a GT1a GM2 GD1b GT1b GM3 GD2 GQ1b GM4 GD3 2. ANWENDUNGSHINTERGRUND Entzündliche Neuropathien des peripheren Nervensystems sind durch zahlreiche klinische Symptome gekennzeichnet, die von leichter Ermüdbarkeit und uncharakteristischem Missempfinden über neuromuskuläre Störungen bis zu Funktionsausfällen wie Atemlähmung und Herzstillstand reichen können. Bei Erkrankungen des peripheren Nervensystems sind in der letzten Zeit zunehmend Autoantikörper gegen Ganglioside identifiziert worden [1]. Ganglioside sind saure Glycolipide, die aus einem Lipid (Ceramid), einer Oligosaccharidkette und Sialinsäure bestehen. Ganglioside sind Bestandteile von Plasmamembranen, wobei sie besonders häufig auf der Oberfläche von Zellen des zentralen und peripheren Nervensystems anzutreffen sind. Gangliosiden ähnliche Strukturen kommen auch an der Oberfläche von Mikroorganismen vor. So treten entzündliche Neuropathien häufig infolge einer Infektion mit Campylobacter jejuni, Cytomegalievirus, Epstein- Barr-Virus, Mycoplasma pneumoniae oder Haemophilus influenzae auf [2,3,4]. Antikörper gegen Gangliosidstrukturen der Erreger können mit Gangliosiden von Markscheiden oder Nervenfasern kreuzreagieren und bewirken Entzündungen mit nachfolgender Demyelinisierung. Tab. 1 Beispiele für Anti-Gangliosid-Autoantikörper bei autoimmunen Polyneuropathien [5] Neuropathie Antikörper gegen IgG Antikörper gegen IgM Guillain-Barré-Syndrom (GBS/AIDP) GM1 (GD1a, GD1b, GT1b) GM1 Akute motor-axonale Neuropathie (AMAN) GM1, GD1a (GD1b, GT1b) Miller-Fisher-Syndrom (MFS) GT1a, GQ1b (GD1b, GD3, GT1b) Multifokal-motorische Neuropathie (MMN) GM1, (GM2, GM3, GD1a, GD1b) Chronische demyelinisierende Polyneuropathie (CIDP) Chronisch sensorisch-ataktische Polyneuropathie (CANOMAD) (GM1, GM2, GM3, GD1a, GD1b) GD1b, GD2, GD3, GT1b, GQ1b (GM3, GD1a, GT1a) Antikörper in Klammern sind Nebenreaktivitäten (z.t. bedingt durch Kreuzreaktivität mit dem Hauptantigen) REF 1185
2 3. TESTPRINZIP Auf dem Teststreifen (A) befinden sich ein Funktionskontrollfeld und 11 Testfelder. Jedes Testfeld ist mit einem hoch gereinigten immobilisierten Antigen (B) beschichtet. Dieses wird während des ersten Inkubationsschrittes durch in der Probe vorhandene spezifische Primärantikörper (C) gebunden. Nicht gebundenes Probenmaterial wird durch den ersten Waschschritt entfernt. Die nun immobilisierten humanen Primärantikörper werden während des zweiten Inkubationsschrittes spezifisch durch anti-human-igg- (oder -IgM-) Sekundärantikörper (D) gebunden, welche mit dem Enzym Peroxidase (E) konjugiert sind. Ungebundene Konjugatmoleküle werden durch den zweiten Waschschritt entfernt. Die Peroxidase setzt im dritten Inkubationsschritt enzymatisch die farblose Substratlösung (F) in ein dunkles, violettes Präzipitat (G) um. Dieses Präzipitat bindet auf Grund seines hydrophoben Charakters am Ort seiner Entstehung den hydrophoben Teststreifen. Diese Reaktion wird durch einen dritten Waschschritt gestoppt. Nachdem die Streifen getrocknet sind, werden sie auf der Archivmatrix fixiert und mittels Interpretationsschablone evaluiert. Es sollte ein Scanbild der beklebten Matrix zur Archivierung erstellt werden, da die Färbung der Streifen verblasst. A - Teststreifen B - Antigen C - Primärantikörper D - Sekundärantikörper E - Peroxidase F - Substrat (löslich) G - Produkt (präzipitierend) Abb. 1 Schema Funktionsweise REF 1185
3 4. PACKUNGSINHALT Tab. 2 Testkitbestandteile REF Bestandteil Menge Erläuterung t 307 Test strips 20 Stk. 18 Buffer 10x 15 ml 227 G-HRP 21x 1,2 ml 228 M-HRP 21x 1,2 ml 75 Substrate 11 ml Der Testkit enthält weiterhin: 1x Gebrauchsanweisung (je Gebinde) 1x Archivmatrix (Anti-Gangliosid LINA 5- Version ) 1x Interpretationsschablone (lotspezifisch) 2x Inkubationswannen 5. LAGERUNG UND HALTBARKEIT 1 Röhrchen mit 20 Teststreifen, 11 Antigene gebrauchsfertig Puffer 10x, farbloser Phosphatpuffer, weißer Verschluss 10-fach konzentriert IgG-Konjugat 21x (anti-human, peroxidasekonjugiert), rötlich gefärbt, konserviert, roter Verschluss 21-fach konzentriert IgM-Konjugat 21x (anti-human, peroxidasekonjugiert), grünlich gefärbt, konserviert, grüner Verschluss 21-fach konzentriert Tetramethylbenzidin (TMB), farblos, blauer Verschluss gebrauchsfertig Lagerung des Testkits bei 2-8 C, entsprechend des äußeren Etikettes. Einzelne Bestandteile können eine längere Haltbarkeit aufweisen (siehe Etikett). Nach Anbruch ist der Testkit noch 1 Monat haltbar. Puffer 1x (aus REF 18) ist bei 2-8 C mind. 30 Tage haltbar. Das Substrat (REF 75) lichtgeschützt aufbewahren. 6. ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE ARBEITSMITTEL, die nicht mitgeliefert werden Einkanal-Mikropipette 1000 µl verstellbare Einkanal-Mikropipette µl entsprechende Pipettenspitzen destilliertes oder entionisiertes Wasser (mind. Aqua dest.) Bechergläser Messzylinder Wippschüttler Pinzette Klebestift/ Klebeband zum Fixieren der Teststreifen auf der Archivmatrix handelsüblicher Flachbettscanner 2 8 C 2 8 C 2 8 C 2-8 C 2 8 C REF 1185
4 7. WICHTIGE HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN Dieser Reagenziensatz ist zum In-vitro-Gebrauch bestimmt und muss von geschultem Laborpersonal in einem entsprechend eingerichteten Labor durchgeführt werden! Die Testdurchführung erfolgt vollständig bei Raumtemperatur. Als Probenmaterial ausschließlich humanes Serum verwenden! Beim Umgang mit den Komponenten des Testkits und mit den Patientenproben sind die Vorschriften zur Unfallverhütung beim Umgang mit potentiell infektiösem Material und gefährlichen Chemikalien zu beachten! Insbesondere sind folgende Regeln einzuhalten: Nicht essen, trinken oder rauchen! Nie mit dem Mund pipettieren! Handschuhe zur Vermeidung von Kontakt mit den Reagenzien und Seren tragen! Sicherheitshinweise zu den einzelnen Testkomponenten beachten! Die Arbeitsanweisung muss strikt befolgt und jegliche Zeitverschiebung vermieden werden! Die angegebenen Lagerungstemperaturen der Einzelkomponenten des Testkits sind einzuhalten! Die Teststreifen vorsichtig nur mittels Pinzette aus dem Röhrchen entnehmen (nicht mit der ungeschützten Hand berühren)! Das Mischen von Testkitkomponenten verschiedener Chargen ist nicht erlaubt! Dies gilt auch für die Verwendung von Reagenzien anderer Hersteller zur Komplettierung eines geöffneten Testkits! Der Testkit oder seine geöffneten Reagenzien sind nur innerhalb der angegebenen Haltbarkeitsfristen zu verwenden! Tubes mit geringen Flüssigkeitsmengen vor dem Gebrauch kurz zentrifugieren! Wir empfehlen, mittels laborinterner Kontrollseren eigene Qualitätskontrollen durchzuführen (s. a. Eichordnung, Bundesgesetzblatt I, S. 1657, 1988 sowie Richtlinien der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung quantitativer laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen, Dt. Ärzteblatt 98, Heft 42, S. A , 2001). Die Entsorgung der verwendeten Materialien erfolgt nach länderspezifischen Richtlinien. 8. DURCHFÜHRUNG Probenvorbereitung Pro Bestimmung einer Patientenprobe werden 10 µl Serum benötigt (Verdünnung 1:101). Blutproben sind aseptisch nach den geltenden Verfahren zu gewinnen und nach deren Gerinnung zur Serumgewinnung umgehend zu zentrifugieren. Der Einsatz hitzeinaktivierter, mikrobiell kontaminierter, hämolytischer und/ oder lipämischer Serumproben sollte vermieden werden. Serumproben können bis zu ihrer Verwendung gekühlt bei 2-8 C für bis zu 5 Tage, sollten bei längerer Aufbewahrung aber bei -20 C gelagert werden. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. Testvorbereitung Alle im Testkit enthaltenen Materialien auf Raumtemperatur bringen. Reagenzien vor Gebrauch homogenisieren, Schaumbildung vermeiden! Puffer 10x (REF 18) mit destilliertem oder entionisiertem Wasser auf 1x-Konzentration verdünnen (1 Teil Puffer 10x + 9 Teile Wasser). Vor dem Verdünnen des Pufferkonzentrates müssen alle Salzkristalle gelöst sein. Wenn nötig, zum Lösen der Salzkristalle, kurz erwärmen. Für jeden zu entwickelnden Teststreifen werden 4 ml Puffer 1x benötigt. Die auf diese Weise verdünnte Pufferlösung ist bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Die Teststreifen sind in einem Röhrchen verpackt. Zum Gebrauch dieses öffnen und die benötigte Streifenanzahl mittels Pinzette entnehmen. Anschließend Röhrchen wieder verschließen! REF 1185
5 Testdurchführung Siehe Tab. 3 Ablaufprotokoll (alle Arbeitsschritte finden bei Raumtemperatur statt). Die Reihenfolge der Pipettierschritte und die Inkubationszeiten sind genau einzuhalten! Die Inkubation der Teststreifen findet in den mitgelieferten Inkubationswannen statt. Es ist darauf zu achten, dass sich keine Luftblasen unter den Teststreifen befinden. Sämtliche Inkubations- und Waschschritte finden auf einem Wippschüttler bei mittlerer Geschwindigkeit (ca Zyklen/ Minute) statt. Beim Entfernen der Inkubationslösungen Verschleppungen derselben in andere Vertiefungen vermeiden! Zeitbedarf für 20 Teststreifen: ca. 210 min Tab. 3 Ablaufprotokoll Schritt Beschreibung 1 Pipettieren von 1 ml Puffer 1x und 10 µl Probe je Kavität einer Inkubationswanne 2 Einlegen der Teststreifen (REF 307) mit Reaktionsseite nach unten! 3 Inkubation für 120 min bei 4 C 4 Probenverdünnung vollständig aus den Vertiefungen absaugen, oder vorsichtig abgießen 5 Waschen mit 1 ml Puffer 1x für 5 min bei 4 C 6 Pipettieren von 1 ml Puffer 1x und 50 µl IgG-Konjugat 21x (REF 227) oder IgM- Konjugat 21x (REF 228) (Verdünnung 1:21) 7 Inkubation für 60 min bei 4 C 8 Konjugatverdünnung vollständig aus den Vertiefungen absaugen, oder vorsichtig abgießen 9 Waschen mit 1 ml Puffer 1x für 5 min 10 Pipettieren von 0,5 ml Substrat (REF 75) 11 Inkubation für 10 min 12 Substrat vollständig aus den Vertiefungen absaugen, oder vorsichtig abgießen und gemäß lokaler Abfallbestimmungen entsorgen 13 Waschen mit 1 ml Aqua dest. für 2 min 14 Teststreifen kurz trocknen und anschließend auf die Archivmatrix kleben (Reaktionsflächen nicht überkleben!) und einscannen REF 1185
6 9. AUSWERTUNG Die auf der Archivmatrix fixierten trockenen Teststreifen können nur mit der mitgelieferten Interpretationsschablone ausgewertet werden (siehe Abb. 2). Die einzelnen Reaktionsfelder auf den Teststreifen werden dazu mit den Cut-Off-Feldern der Interpretationsschablone verglichen. Validierung Die Funktionskontrollbande muss gefärbt sein. Ist dies nicht der Fall, kann keine Beurteilung der Patientenseren erfolgen. Befundung Testfeld > Cut-Off Parameter ist positiv. Testfeld = Cut-Off Parameter ist grenzwertig. Testfeld < Cut-Off Parameter ist negativ. Abb. 2 Teststreifenauswertung Asymptomatische Probanden können positive Autoantikörperbefunde aufweisen. Besonders IgM-Antikörper treten wegen der Kreuzreaktivität mit mikrobiellen Antigenen auch bei Gesunden auf. Eine klinische Diagnose sollte nicht allein mit Hilfe der Ergebnisse einer einzelnen diagnostischen Methode erhoben werden. Zur Diagnoseerstellung sollten vom Arzt alle möglichen klinischen Befunde und Laborbefunde berücksichtigt werden. 10. PROBLEMBEHANDLUNG Nicht durchgängig gefärbte Testfelder eines Teststreifens lassen auf Luftblasen während der Testdurchführung schließen. Dies geschieht insbesondere dann, wenn der Teststreifen nicht in das erste Inkubationsmedium gelegt (s. Ablaufprotokoll), sondern das Inkubationsmedium auf den Teststreifen gegeben wurde. Der Teststreifen kann dennoch anhand der Färbung der Randbereiche ausgewertet werden REF 1185
7 11. LEISTUNGSMERKMALE Tab. 4 Methodenvergleich (Referenzmethode: Streifentest (IVD), n-zahl: 100, * Berechnung nicht möglich) Parameter Analytische Sensitivität Analytische Spezifität IgG IgM IgG IgM anti-gm1 100 % 100 % 100 % 93 % anti-gm2 - * 67 % 100 % 100 % anti-gm3 100 % 100 % 96 % 95 % anti-gm4 100 % 67 % 96 % 97 % anti-gd1a 86 % 100 % 98 % 99 % anti-gd1b* 100 % 100 % 100 % 98 % anti-gd2 100 % 88 % 100 % 99 % anti-gd3 100 % 100 % 95 % 100 % anti-gt1a 75 % 100 % 98 % 99 % anti-gt1b 75 % 92 % 100 % 100 % anti-gq1b 80 % 100 % 98 % 100 % Tab. 5 Präzision (n-zahl: 10) Leistung Wert Vergleichspräzision 100 % Wiederholpräzision 100 % 12. LITERATURANGABEN [1] Willison HJ, Yuki N: Peripheral neuropathies and anti-glycolipid antibodies. Brain, 2002, 125, [2] Khalili-Shirazi A, Gregson N, Gray I, Rees J, Winer J, Hughes R: Antiganglioside antibodies in Guillain-Barre syndrome after a recent cytomegalovirus infection, J Neurol Neurosurg Psychiatry, 1999, 66, [3] Schwerer B, Neisser A, Bernheimer H: Distinct immunoglobulin class and immunoglobulin G subclass patterns against ganglioside GQ1b in Miller Fisher syndrome following different types of infection. Infect Immun, 1999, 67, [4] Alaniz ME, Lardone RD, Yudowski SL, Farace MI, Nore GA: Normally occurring human anti-gm1 immunoglobulin M antibodies and the immune response to bacteria. Infect Immun, 2004, 72, [5] K. Conrad, W. Schößler, F. Hiepe: Autoantikörper bei organspezifischen Autoimmunerkrankungen, 2010, ISBN REF 1185
8 ANHANG 1 Tab. 6 Symbolerläuterungen Symbol Erläuterung h Hersteller l Chargennummer v verwendbar bis 2t 8 C Lagerung zwischen +2 C und +8 C b Bestellnummer i In-vitro-Diagnostikum pn Inhalt ausreichend für <n> Bestimmungen g Gebrauchsanweisung beachten - negativ +/- grenzwertig + positiv ++ stark positiv ANHANG 2 Wichtige inhaltliche Änderungen dieser Anleitung zur Vorversion 9 vom : Generelle Formatierungen, Rechtschreibkorrektur Tabellennummerierungen aktualisiert Artikelbezeichnung im Dokument deutsch (englische Kurzbezeichnung nur in Tab. 2) Kapitel 2 - Literaturstellen zugeordnet, Tab. 1 überarbeitet Kapitel 4 - Tab. 2 Spalte Erläuterung Inhalte harmonisiert, Korrektur der Versionsbezeichnung für die Archivmatrix Kapitel 11 - Tab. 4 Spalte 1 nun «Parameter» mit Vorsatz «anti-» in den Zeilen Kapitel 12 ergänzt, Prüfgrundsätze gelöscht REF 1185
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