Bioinformatik I: Grundlagen der Gentechnik

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1 Bioinformatik I: Grundlagen der Gentechnik Prof. Jörg Kudla (Freisemester) Institut für Biologie & Biotechnologie der Pflanzen Schlossplatz 7 Dr. Stefan Weinl Schwerpunkte: Vorlesung 1: Einführung & Enzyme der Gentechnik Vorlesung 2: Methoden der Gentechnik Vorlesung 3: Vektoren & Klonierung Vorlesung 4: Reportergene Vorlesung 5: Transgene Organismen Vorlesung 6: Genomik und moderne Methoden Vorlesung 7: Proteine Transgene Organismen "Gentechnisch verändert ist ein Organismus, dessen genetisches Material in einer Weise verändert worden ist, wie sie unter natürlichen Bedingungen durch Kreuzen oder natürliche Rekombination nicht vorkommt" Gentechnik Gesetz 1

2 Postgenomics Die Ausgangssituation Transgene Pflanzen: das Grundprinzip der Transformation DNA Vektor Übertragungsweg Zielorgan(ismus) z.b. - cdna - gendna z.b. - Ti-Plasmid - Plasmid mit pflanzlichen Steuersequenzen z.b. - Agrobakterium- Transformation - Partikel-Kanone - Elektroporation z.b. - ganze Pflanze - Blattscheiben - Protoplasten -Wurzeln aber auch: - Kerntransformation - Plastidentransformation 2

3 stabile und transiente Transformation stabile Transformation: Integration in das Genom des Empfängerorganismus dauerhaft exprimiert und vererbt i.d.r. Expression einer Genkopie transiente Expression: Expression der Fremd-DNA im Zytoplasma des Empfänger (i.d.r. ohne Replikation) nur für einen begrenzten Zeitraum exprimiert (nicht vererbt) (i.d.r. (Über-)Expression von zahlreichen Genkopien) stabile und transiente Transformation stabile Transformation: Integration durch nichthomologe Rekombination z.b. Säuger: Injektion in Eizellen, retrovirale Vektoren Integration durch homologe Rekombination z.b. Hefe: Transformation mit linearer DNA und Selektion des Markergens Partikelbombardierung und Rekombination (z.b. Pflanzen) T-DNA vermittelte Transformation (z.b. Pflanzen) transiente Expression: Transfer von Plasmid DNA in Zellkulturen (z.b. chemisch, Elektroporation, Säuger: Transfektion) Transiente Transformation mit Agrobakterien (Zellkulturen, Blätter) Partikelbombardierung 3

4 Prinzip der Transformation: das Ti-Plasmid Prinzip der Transformation: das Ti-Plasmid LB modifizierte Transfer-DNA (T-DNA) Promotor Gen X Terminator Selektionsmarker RB vir- Gene Ti-Plasmid noc tra ori 4

5 Requirements for (plant) transformation 1. Selectable marker gene kanamycin resistance: neomycin phosphotransferase (nptii), hygromycin B: hygromycin phosphotransferase (hygb) streptomycin: streptomycin phosphotransferase herbicide bialaphos (phosphinothricin, BASTA): bacterial gene bar encoding the BASTA-inactivating enzyme phosphinothricin acetyltransferase (PAT) 2. Promoter (constitutive, tissue-specific or inducible) 3. coding region 4. polyadenylation site Transformation von Arabidopsis: Tauchtransformation Agrobacterium Kultur 28 C 2 Tage Dipping ( 5% Sucrose % L-77 ) Kultivierung in Anzuchtschrank für 2 3 Wochen Samen Reifung (Trocknung) Selektion (oberflächensterilisierte Samen auf Gewebekulturmedium mit Kanamycin) 5

6 Prinzip der Transformation: Infektion und Regeneration Transformation von Pflanzen: Promotor-Reportergen- Fusionen Prinzip: Gen X: ATG TAA Promotor cod. Region X Promotor GUS Promotor GUS Transformationsvektor 6

7 Transformation von Pflanzen: Promotor-Reportergen- Fusionen Prinzip: Gen X: ATG TAA Promotor cod. Region X Promotor GUS Promotor Promotor ATG TAA cod.region ATG TAA cod.region Promotor GUS Transformationsvektor Promotor Promotor Promotor ATG TAA cod.region ATG TAA cod.region ATG TAA cod.region GUS Transformation von Pflanzen: Protein-Reporterprotein- Fusionen Prinzip: ATG Promotor Gen GFP TAA CRY2::GFP Transformationsvektor CBL1::GFP Pflanze Zellkultur 7

8 Transgene Pflanzen: Struktur- Funktions-Untersuchungen Gen Protein Gen X: ATG x TAA Mutante GUS ATG TAA GUS GFP GUS X GFP GUS X GFP (Komplementation von Mutanten) Transformation von Pflanzen: Über-Expression von Genen Prinzip: Prom. X 35S ATG TAA Gen X Gen X - Viraler Promotor (CaM) - Konstitutive Expression - starker Promotor Transformationsvektor 8

9 Transformation von Pflanzen: Über-Expression des CBL1-Gens 35S-Prom CBL1 Term plant transformation WT cbl1 35S CBL1 RD29A CBF1 CBF2 PR1 actin Transformation von Pflanzen: Methoden 9

10 Biolistic (biological+ballistic) transformation Gene guns Biolistic (biological+ballistic) transformation 10

11 Biolistic (biological+ballistic) transformation Transiente Expression des GUS-Reporter Genes in Blättern nach Partikelbombardierung 11

12 Transiente Expression des GFP-Reporter Genes in Zwiebeln nach Partikelbombardierung (onion epidermal cells transiently transformed with CBL6::GFP) Stabile Transformation nach Partikel-Bombardierung 12

13 Anwendung der Partikelbombardierung: Die Transformation von Plastiden Gentransfer durch homologe Rekombination Anwendung der Partikelbombardierung: Die Transformation von Plastiden Gentransfer durch homologe Rekombination 13

14 Anwendung der Partikelbombardierung: Die Transformation von Plastiden Regeneration der transgenen Pflanzen Resistenter Callus mit sich regenerierender Pflanze Regenerationsmedium mit Antibiotika Blattscheibe Stabile Transformation von Pflanzenzellen 14

15 Transiente Expression: Injektion von Agrobakterien Plasmid Agrobacterium 4 Signalling responses 2-3 d time course Syntide-2 C D P K Syntide-2 - P 1 Infiltration of Agrobacterium containing NtCDPK2-myc 2 Treatment Biotic stress (elicitor, Cf-9/Avr9) Abiotic stress (wounding, flooding) 3 Preparation of extracts Western blot analysis 5 Immunoprecipitation in vitro kinase assay Transiente Transformation von Pflanzenzellen 15

16 Transiente Transformation von Pflanzenzellen Funktionsaufklärung von Genen (und ihren Produkten) durch Reverse Genetik Methoden der Reversen Genetik zur Funktionsaufklärung: zwei grundlegende Möglichkeiten: A) gerichtete Mutagenese B) zufällige Mutagenese 1. Rekombination (A, B) 2. T-DNA Insertions-Mutagenese 3. Transponible Elemente 4. RNA Interferenz 5. CRISPR/Cas9 16

17 forward / reverse genetics 1. forward genetics -Vorwärts-Genetik: vom Phän (otyp) zum Gen(otyp) Ausgangssituation: Ich isoliere eine interessante Mutante (d.h. ich analysiere das äußere Erscheinungsbild einer mutierten Genfunktion), kenne aber nicht die Sequenz des dazugehörigen Gens Experimentelle Situation und Strategien: Erlauben: Erfordern: - Beschreibung der Genfunktion - Gezielte Kartierung des Mutantenallels und die Isolierung des Gens 2. reverse genetics -Reverse Genetik: vom Gen(otyp) zum Phän(otyp) Ausgangssituation: Ich kenne die Sequenz eines Gens, weiß aber nichts über seine Funktion Experimentelle Situation und Strategien: Erlauben: - Gezielte Isolation einer Mutante Erfordern: - Suche nach dem Phänotyp der Mutante forward / reverse genetics 17

18 Reverse Genetik Genotyp: Bekannte Sequenz eines Gens Mutagenese/Auffinden einer Mutante: (Mutationsereignis im Gen muss erkennbar sein) - zufällig (T-DNA, Transposon) - gerichtet ( homologe Rekombination ): nicht in pfl.kergenom, aber Plastom Phänotypische Analyse Insertion Funktion? - zerstört/verändern Genfunktion - markiert gleichzeitig das Gen Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Hefe 18

19 Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Hefe Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Mäusen 19

20 Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Mäusen Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Mäusen 20

21 Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Mäusen Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Mäusen 21

22 Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Mäusen Herstellung transgener Mäuse durch zufällige Integration von Fremd-DNA 22

23 Notwendige Elemente: Herstellung Gewebe-spezifischer Kock-outs durch das cre-lox System loxp-dna-sequenzen: locus of X-over P1 13bp 8bp 13bp ATAACTTCGTATA - NNNTANNN -TATACGAAGTTAT Cre-Rekombinase: causes recombination oder Cyclization recombinase Die Sequenz zwischen den Lox-Sequenzen wird durch Rekombination entfernt Herstellung Gewebe-spezifischer Kock-outs durch das cre-lox System 23

24 Herstellung Gewebe-spezifischer Kock-ins durch das cre-lox System Herstellung Gewebe-spezifischer Kock-ins durch das cre-lox System 24

25 Reverse genetics: T-DNA-insertion mutagenesis LB T- DNA RB vir-gene noc tra ori Agrobacterium tumefaciens - enthält das Ti-plasmid - T-DNA (Region zwischen left und right Border) Reverse Genetik durch T-DNA-vermittelte Insertionsmutagenese Insertion ATG TAA Insertion ATG TAA... T-DNA Insertion ATG TAA 25

26 PCR-Analyse von T-DNA-Insertionen Mutante mit Insertion Wildtyp ohne Insertion S LB T-DNA RB A S A Marker S+LB S+LB A+RB A+RB wt mut wt mut Herstellung von Mutantenpopulationen BASTA Tauch-Infiltration mit Agrobakterium Samenernte Selektion mit BASTA Isolierung von Insertionslinien Kommerzielle Generierung großer Mutantenpopulationen Sequenzierung der flankierenden T-DNA Bereiche = FST: flanking sequence tag Bereitstellung der FST Sequenzen in einer Datenbank Sequenzvergleich der FSTs mit dem gewünschten Gen Bestellen des Samenpools, Isolierung und Verifizierung der gewünschten Mutante Phänotypische Analyse 26

27 Charakterisierung von Mutantenpopulationen Thermal Asymmetric Interlaced (TAIL) PCR: SP1 SP2 SP3 AP AP SP1 AP AP SP2 AP SP3 AP Adaptor PCR: E E E E Datenbankanalyse für Insertionsmutanten 27

28 Transposon-induced mutants DNA elements capable of moving ("transposing") about the genome Discovered by Barbara McClintock, largely from cytogenetic studies in maize, but since found in most organisms She was studying "variegation" or sectoring in leaves and seeds She liked to call them "controlling elements because they affected gene expression Transposon-induced mutants 28

29 T-DNA-induced mutants / Transposon-induced mutants T-DNA-induced mutants: Transposon-induced mutants: - easy to establish in Arabidopsis - technically restricted to Arabidopsis - random distribution of insertions - low insert copy number - endogenous/heterologous transposons - generation of stabilized transposons is genetically complicated - extends technology to other species - allows generation of multiple allels and revertants - non random distribution in genome - can have high insert copy number Transposon-induced mutants 29

30 Verschiedene RNAi Mechanismen Anwendung von RNAi in Pflanzen Intron LB T- DNA RB Transkription in planta Annealing vir-gene noc tra Splicing ori Targeting 30

31 Grundprinzipien des RNA silencing (RNA interference) dsrna Dicer small dsrna (ca nt mit 2 Nucleotid Überhang) RISC (RNA Induced Silencing Complex) mit Argonaute Protein small ssrna (sirna) mit RISC mrna Targeting Komplexbindung an endogene, komplementäre mrna Abbau der mrna Silencing nächste mrna CRISPR/Cas9 31

32 CRISPR/Cas9-Mechanismus CRISPR/Cas9-Mechanismus 32

33 CRISPR/Cas9-Mechanismus CRISPR/Cas9 Vorteile Im Vergleich zu den anderen Genome Editing-Verfahren hat CRISPR/Cas9 folgende Vorteile: Transgene Organismen sind einfacher herzustellen Sehr viel schneller als herkömmliche Methoden mehrere Genomveränderungen gleichzeitig durchgeführt werden Kostengünstiger In vielen Organismen verwendbar CRISPR/Cas9 arbeitet es weitaus präziser 33

34 CRISPR/Cas9 Vorteile 34

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