INHALTSVERZEICHNIS. 1. Einleitung
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- Astrid Schenck
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1 I Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Stickstoffmonoxid (NO) Reaktionswege von NO enos-defizientes Mausmodell Zellwanderung: Physiologie und Pathophysiologie Rezeptoren und Signalwege VEGF-Rezeptor Die Signaltranduktion von VEGF-R Cdc Ras (rat sarcoma) Organisation in der Struktur von Ras-Proteinen Regulationszyklus von Ras Ras und seine Funktion in der Signaltransduktion Ras-Effektoren Intrazelluläre Immunisierung gegen Ras Angiogenese Biologische Membranen Modelle biologischer Membranen Funktion der Plasmamembran Membranlipide Ordnung und Dynamik von Membranen (Fluidität)
2 II Cholesterin als Membranbestandteil Künstliche Membranen Fluoreszenzanistropie Prinzip der Fluoreszenzanisotropie Steady-state Fluoreszenzanisotropie Anwendung der Fluoreszenzanisotropie Fluoreszenzmarker DPH Endozytose Rezeptor-vermittelte Endozytose Endosomale Kompartimente Exozytose Molekulare Mechanismen der Endo- und Exozytose Steuerung des Vesikeltransportes bei der Endozytose Steuerung des Vesikeltransportes bei der Exozytose Ergebnisse Stickstoffmonoxid-vermittelte Zellwanderung Etablierung eines Wundheilungsexperiments mit T24- Blasenkarzinomzellen Wachstumsfaktor-induzierte Zellwanderungsbeschleunigung von transformierten T24-Blasenkarzinomzellen Konditionale Ras-Neutralisierung in transformierten T24- Blasenkarzinomzellen 63
3 III Hemmung der NO-Synthase in transformierten T24- Blasenkarzinomzellen Wiederherstellung der Zellwanderung nach Inhibition der NO- Synthase in Abhängigkeit der FCS-Konzentration Wachstumsfaktor-induzierte Zellwanderungsbeschleunigung von primären Maus-Aortaendothelzellen NO-vermittelte Zellwanderung von primären Maus- Aortaendothelzellen durch NO-Donoren Inhibierte Zellwanderung von primären Maus-Aortaendothelzellen durch Stickstoffmonoxid-Synthase-Inhibitoren Intrazelluläre NOS-Inhibtion Extrazelluläre Erniedrigung der NO-Konzentration enos-defiziente Mausaorta-Endothelzellen Gerichtete chemotaktische Zellwanderung in Abhängigkeit von NO NO-vermittelte Zellmotilität von primären Maus- Aortaendothelzellen Übergeordnete Rolle von NO gegenüber VEGF bei Zellwanderung Cdc42 und NO-vermittelte Zellwanderung Ras-abhängige Cdc42-Aktivität in transformierten T24- Blasenkarzinomzellen Abhängigkeit der Rac-Aktivität vom Aktivierungszustand von Ras Cdc42-abhängige Wachstumsfaktor-vermittelte Zellwanderungssteigerung in primären Mausaorta-Endothelzellen Cdc42-unabhängige NO-vermittelte Zellwanderungs- regulation in p primären Mausaorta-Endothelzellen
4 IV 2.3 NO-vermittelte Lipidbeweglichkeit Steigerung der lateralen Diffusion durch NO-Zugabe Senkung der Lipidbeweglichkeit durch Inhibition der NO-Synthase Inhibierung der enos durch L-NAME Lipidbeweglichkeit in enos-defizienten Endothelzellen Wiederherstellung der lateralen Diffusion in enos-defizienten MAECs durch NO-Zugabe Membranfluiditäts-Regulation durch Stickstoffmonoxid Membranfluidität in enos-defizienten und Wildtyp-MAECs Steigerung der Membranfluidität in enos-defizienten MAEC durch Erhöhung der NO-Verfügbarkeit Erniedrigung der Membranfluidität durch Hemmung der NO- Synthase Regulation der Membranfluidität in künstlichen Membranen durch NO-Applikation Wachstumsfaktor-abhängige Steigerung der Membranfluidität Src-Inhibition Übergeordnete Rolle von NO gegenüber VEGF-E bei Membranfluidität Regulation der neuronalen Membranfluidität durch NO Stickstoffmonoxid-induzierte Endozytose Transferrin-Aufnahme in enos-defizienten MAECs Wiederherstellung der retardierten Transferrin-Aufnahme in enosdefizienten MAECs 125
5 V Herabsetzung der Transferrin-Aufnahme durch Hemmung der NO- Synthase Wachstumsfaktor-vermittelte Steigerung der Transferrin- Aufnahme Übergeordnete Rolle von NO gegenüber VEGF-E bei Transferrin- Aufnahme Zellmorphologische Veränderungen durch Stickstoffmonoxid Stimulation der Filopodien-Ausbildung nach Behandlung mit VEGF-E NO-induzierte Veränderungen der Morphologie cgmp-unabhängigkeit des NO-vermittelten Effektes Diskussion Fluidisierende Wirkung von NO Anwendungsmöglichkeiten in der Medizin Modell der NO-induzierten Membranfluidität NO und Endozytose Zellwanderung und Stickstoffmonoxid Zellwanderungsmodell Zusammenfassung Ausblick Materialien Verwendete Zellkulturlösungen/-antibiotika
6 VI 6.2 Verwendete Chemikalien Verwendete Enzyme Verwendete Geräte Verwendete Verbrauchsmaterialien und Kits Verwendete Antikörper und Detektionsenzyme Verwendete Plasmide Verwendete Tiere Verwendete Zelllinien und primäre Zellkulturen Methoden Zellkultur Gelantine-Beschichtung von Deckgläschen Fixierung von Zellen auf Deckgläschen Kultivierung von transformierten T24-Blasenkarzinomzellen Isolierung von embryonalen Fibroblasten aus Mäusen Kultivierung muriner embryonaler Stammzellen Präparation von Mausaorta-Endothelzellen Kultivierung von Mausaorta-Endothelzellen Präparation von Rinderaorta-Endothelzellen Kultivierung von Rinderaorta-Endothelzellen Kryokonservierung von Zelllinien Wundheilungsexperimente Richtungsgesteuerte Migrationsexperimente Boyden Chamber Experimente Transferrin-Aufnahme-Experimente Qualitative Messungen 175
7 VII Quantitative Messungen Lipid-Fluoreszenzmarkierung Qualitativer NO-Nachweis (DAF-FM DA) Qualitativer Nachweis von Reactive Oxigen Species (Dihydroethidium) Proteinbiochemische Methoden Aufschluss von Zellen zur Gewinnung der Gesamtprotein-menge _ Proteinbestimmung mit Biorad DC Protein Assay GTPase-Präzipitation Acetonfällung von Proteinen Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS- PAGE) Coomassie-Färbung von Polyacryamidgelen Western Blot Ponceau-Färbung von Proteinen Immundetektion Redektion von Im m unoblots ( Stripping ) Saville-Griess-Assay (Nachweis von S-Nitrosylierungen) Biotin-Switch-Assay (Nachweis von S-Nitrosylierungen) Molekulargenetische Methoden PCR (Polymerase Chain Reaction) Gelelektrophorese von DNA Isolierung von DNA-Fragmente aus Agarosegelstücken Linearisierung von Plasmiden Dephosphorylierung von DNA 188
8 VIII Phosphorylierung mit T4 Phospho-Nukleotid-Kinase (PNK) Ligation von DNA Herstellung kompetenter Bakterien nach der RbCl 2 -Methode Transformation kompetenter Bakterien Plasmidpräparation im analytischen Maßstab Plasmidpräparation im präparativen Maßstab Restriktion von DNA UV-Photometrische Bestimmung der DNA bzw. RNA- Konzentration Biophysikalische Methoden Fluoreszenz-Anisotropie Liposomenherstellung Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP) Mikroskopische Methoden Rasterelektronenmikroskopie (REM) Literaturverzeichnis Lebenslauf Danksagung
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