Einbau von künstlichen nicht kanonischen Aminosäuren in ein Modellprotein in Saccharomyces cerevisiae durch Stop Codon Suppression

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1 Einbau von künstlichen nicht kanonischen Aminosäuren in ein Modellprotein in Saccharomyces cerevisiae durch Stop Codon Suppression Diplomarbeit von Julia Adam aus München Hochschule München Fachbereich 06 Feinwerk- und Mikrotechnik / Physikalische Technik Studienrichtung Bioingenieurwesen Erstprüfer: Prof. Dr. rer. nat. K. Trebesius Zweitprüfer: Prof. Dr. rer. nat. S. Diemer Betreuer: PD Dr. Nediljko Budisa, MPI Biochemie Tag der Einreichung: München,

2 Kurzfassung Kurzfassung Durch den Einbau von künstlichen nicht kanonischen Aminosäuren ist es möglich, die Funktionen, Eigenschaften und Synthese von Proteinen zu beeinflussen. In meiner Diplomarbeit beschäftigte ich mich mit dem Einbau kanonischer bzw. nicht kanonischer Aminosäuren in das Modellprotein Humane Superoxiddismutase 1 durch Suppression von Stop Codons in Saccharomyces cerevisiae. Hierfür wurde je ein orthogonales AminoacyltRNA Synthetase (aars)/suppressor-trna Paar für die kanonische Aminosäure Tyrosin und für die nicht kanonischen Aminosäuren p-azido-phenylalanin und p-propargyloxy- Phenylalanin verwendet. Die orthogonalen Paare ermöglichen den spezifischen Einbau der jeweiligen Aminosäure an der Position des Stop Codons. Dabei ergab sich ein erfolgreicher Einbau von Tyrosin in das Modellprotein jedoch keine Inkorporation von p-azido- Phenylalanin und p-propargyloxy-phenylalanin. Abstract By the incorporation of non canonical amino acids is it possible to influence the functions, properties and synthesis of proteins. In my diploma thesis I dealt with the incorporation of canonical and non canonical amino acids into the target protein human superoxide dismutase 1 by stop codon suppression in Saccharomyces cerevisae. For this purpose, an orthogonal aminoacy-trna synthetase/suppressor-trna pair was used, which was specific for the canonical amino acid tyrosine or the non canonical amino acids p-azidophenlylalanine or p-propargyloxyphenylalanine. These orthogonal pairs make it possible to incorporate particular amino acids site-specifically at an in-frame stop codon. In the course of this work I could demonstrate successful incorporation of tyrosine into the target protein but, unfortunately, no incorporation of p-azidophenlylalanine and p-propargyloxyphenylalanine.

3 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis KURZFASSUNG...2 ABSTRACT...2 INHALTSVERZEICHNIS...3 ABBILDUNGSVERZEICHNIS...6 TABELLENVERZEICHNIS EINLEITUNG Der genetische Code und dessen Erweiterung Einbau von kanonischen und nicht kanonischen Aminosäuren durch Stop Codon Suppression (SCS) Die verwendeten orthogonalen Paare und das Modellprotein in S. cerevisiae Orthogonale Paare Das Modellprotein humane Superoxiddismutase 1 (hsod1) Zielsetzung der Arbeit MATERIALIEN Bakterien Stämme Saccharomyces cerevisiae Stämme Plasmide Primer Enzyme Antikörper Standards Präparationskits Chromatographiesäulen Puffer Puffer für Agarosegele Puffer für SDS-Gele...21

4 Inhaltsverzeichnis Puffer für Western Blot Puffer für Zellaufschluss und Plasmidisolierung Puffer für Gesamtprotein-Extrakt Puffer für Strep-Tag Affinitätschromatographie Medien und Antibiotikalösungen Medien für E.coli Medien für Sacharomyces cerevisiae Antibiotika-Stammlösungen Chemikalien Materialien METHODEN Arbeiten mit DNA (Desoxyribonukleinsäure) PCR Polymerase Kettenreaktion Annealing und Primer Extension mit Taq-Polymerase Agarose-Gelelektrophorese Restriktionsverdau DNA Sequenzierung Arbeiten mit Bakterien Herstellung von kompetenten E. coli Zellen Transformation kompetenter E. coli Zellen mit Elektroporation Plasmidisolierung aus E. coli Arbeiten mit Hefen Plasmid Transformation in S. cerevisiae Zellen Plasmidisolierung aus S. cerevisiae Proteinexpression im kleinen Maßstab Proteinexpression im großen Maßstab für Aminosäure Einbauversuche Arbeiten mit Proteinen Proteinisolierung und Aufreinigung Herstellung von Gesamtprotein-Extrakten nach Riezmann Chemischer Zellaufschluss von S. cerevisiae Strep-TagII Affinitätschromatographie Proteinkonzentrationsbestimmung...39

5 Inhaltsverzeichnis UV-Vis-Spektroskopie SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) nach Laemmli Western Blot Massenspektrometrische Analyse via ESI-MS ERGEBNISSE UND DISKUSSION Optimierung der hsod1(trp33tag) Proteinaufreinigung Tag-Austausch: His(6x)-Tag zu Strep-TagII Testexpression und Testaufreinigung von hsod1(ala2lys)-strep Transformation der Tandemvektoren in InvSC1 {pyes2-pgal(ppgk1)- hsod1(trp33tag)-strep} Expression und Aufreinigung von hsod1(trp33tag)-strep Einbauversuch mit Tyrosin Einbauversuche mit azphe und poxphe Massenspektrometrische Analyse von hsod1(trp33tyr)-strep Optimierung des hsod1 Expressionsplasmids: Selektionsmarkeraustausch URA3 zu leu2-d ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK...72 DANKSAGUNG...74 LITERATURVERZEICHNIS...75 ANHANG...76 ERKLÄRUNG...79

6 Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abb. 1 Einbau von nicht kanonischen Aminosäuren durch Stop Codon Suppression Abb. 2 Plasmidkarte des Tandemvektors TyrRS/tRNA CUA Abb. 3 Plasmidkarten der Tandemvektoren pazphers1/trna CUA und pazphers6/trna CUA...15 Abb. 4 3D-Struktur der hsod1 (Monomer) mit Cu und Zn im aktiven Zentrum gebunden Abb. 5 Plasmidkarte des Expressionsvektors pyes2-ppgk1(pgal)-hsod1(trp33tag)(-strep)...17 Abb. 6 SDS- Gel der hsod1 Wild-Typ Aufreinigung mit His(6x)-Tag und Ni-NTA Chromatographie...44 Abb. 7 Ausgangsvektoren für den Tag-Austausch...46 Abb. 8 Erstellung des Strep-TagII-PCR-Produktes durch Annealing und Primer Extension Abb. 9 Analyse des Strep-TagII-PCR-Produkts via Agarose-Gelelektrophorese...48 Abb. 10 Schematische Darstellung der homologen Rekombination für den Austausch des His(6x)-Tag gegen den Strep-TagII Abb. 11 Expressionsvektoren nach erfolgreichem Tag-Austausch Abb. 12 SDS Gel der Testaufreinigung von hsod1(ala2lys)-strep mit Strep-Tag Affinitätschromatographie Abb. 13 Western Blot der Testaufreinigung von hsod1(ala2lys)-strep mit Strep-Tag Affinitätschromatographie Abb. 14 SDS Gel der Aufreinigung des hsod1(trp33tyr)-strep Proteins Abb. 15 Western Blot der Aufreinigung des hsod1(trp33tyr)-strep Proteins Abb. 16 SDS Gel der Aufreinigung der hsod1(trp33tyr)-strep, hsod1(trp33azphe)-strep und. hsod1(trp33poxphe)-strep Proteine Abb. 17 Western Blot der Aufreinigung der hsod1(trp33tyr)-strep, hsod1(trp33azphe)-strep und. hsod1(trp33poxphe)-strep Proteine...61 Abb. 18 Chemische Reaktionen von Aryl-Aziden unter Einfluss von UV-Licht und sichtbarem Licht Abb. 19 ESI-MS Spektrum von hsod1(trp33tyr) Abb. 20 Analyse des PCR-Produkts leu2-d via Agarose Gelelektrophorese Abb. 21 Plasmidkarte der Expressionsvektoren hsod1(trp33tag) mit leu2-d Marker...69

7 Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis Tabelle 1 Mutation der E. coli TyrRS zu azphers1 und azphers6. 7, Tabelle 2 Zusammensetzung dermedien für S. cerevisiae Tabelle 3 Y-PER Reagenz Zugabevolumen pro mg Zellpellet Tabelle 4 Zusammensetzung der verwendeten Polyacylamidgele (für 2 Gele) Tabelle 5 Vergleich von Strep-TagII mit His(6x)-Tag Tabelle 6 Auflistung der theoretischen Massen der möglichen hsod1(trp33tyr) Variationen durch natürliche post-translationale Proteinmodifikationen... 65

8 1 Einleitung Einleitung 1.1 Der genetische Code und dessen Erweiterung Der genetische Code ist das Bindeglied zwischen der Basensequenz der DNA bzw. mrna und der Aminosäuresequenz der Proteine. Dies bedeutet, dass drei Basen (Codon) eine Aminosäure von den 20 natürlichen proteinogenen Aminosäuren codieren. Diese 20 natürlichen Aminosäuren werden als kanonische Aminosäuren bezeichnet. Die vier verfügbaren Basen können zu 64 Basentripplets kombiniert werden, die theoretisch für 64 Aminosäuren codieren könnten. Da es aber nur 20 kanonische Aminosäuren in allen bekannten Lebensformen gibt, die für die Proteinbiosynthese relevant sind, existieren für die meisten Aminosäuren mehrere Codons, d.h., der genetische Code ist redundant. Dies ist er auch in Bezug auf die Translationsterminationssignale, es gibt auch drei Stop Codons. 1,5 Um Proteine mit nicht natürlichen funktionellen Gruppen ausstatten zu können, ist es notwendig den genetischen Code zu erweitern. Die Aminosäuren, die den genetischen Code erweitern, sind entweder natürlich vorkommende, aber nicht über den genetischen Code kodierte Aminosäuren oder synthetisch hergestellte Aminosäurederivate. Diese neuen nicht kanonischen Aminosäuren tragen verschiedene chemische funktionelle Gruppen und können daher die Funktion, die Eigenschaften und die Struktur von Proteinen beeinflussen. 1 Zusätzlich eröffnen sich, durch die Fähigkeit Aminosäuren mit definierten sterischen und geladenen Eigenschaften an bestimmte Positionen in Proteinen einzubauen, Möglichkeiten neue Proteinstrukturen und eigenschaften in vitro und in vivo zu erzeugen. 1 Die Bandbreite der chemischen Eigenschaften von nicht kanonischen Aminosäuren ist groß. Darunter befinden sich zum Bespiel photovernetzbare Aminosäuren mit photoreaktiven Gruppen (Arylazid- und Benzophenongruppen) wie p-azido-phenylalanin (azphe) oder p- benzoyl-phenylalanin. Diese Photocrosslinker können in vitro oder in vivo durch Licht vernetzt werden. Dadurch wird es mit Hilfe dieser Aminosäuren möglich, die Proteinstruktur und dynamik, sowie Protein-Protein- bzw. Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkung zu untersuchen. 2,3 Ebenso kommen Aminosäuren mit besonders hoher chemischer Reaktivität zur selektiven Proteinmodifikation zum Einsatz. Dabei handelt es sich um chemisch reaktive Gruppen wie Keto-, Azid-, Alkin- und Thioestergruppen, welche posttranslational hoch effektiv und selektiv derivatisiert werden können. 1 Proteine mit eingebauten nicht

9 1 Einleitung kanonischen Aminosäuren mit Azid- oder mit Alkingruppen wie p-azido-phenylalanin (azphe) oder p-propargyloxy-phenylalanin (poxphe) können durch eine Kupfer-vermittelte [2+3]-Cycloaddition ( Click-Chemie ) mit entsprechenden Alkinyl- oder Azid-Derivaten umgesetzt werden und dadurch selektiv, zum Beispiel mit Polyethylenglycol oder Fluorophoren modifiziert werden. 3 Ebenso ist es möglich Proteine N-terminal unter Berücksichtigung der N-End Rule zu glycosylieren. Die N-End Rule besagt, dass die Aminosäure am N-Terminus die Halbwertszeit eines Proteins bestimmt. So konnte gezeigt werden, dass die Aminosäure Lysin, die eine voluminöse Seitenkette trägt, im Protein Barstar an Aminosäurensequenzposition 2 und 3 verhindert, dass das eingebaute Methionin-Analogon Azidohomoalanine (Aha) N-terminal abgespalten wird. Dadurch wird es möglich den N- Terminus des Proteins im Anschluss selektiv zu modifizieren, wobei die Azido-Gruppe der nicht kanonischen Aminosäure mit einem alkinyl-derivatisierten Kohlenhydrat konjugiert werden kann. 4 Für eine erfolgreiche Biosynthese von Alloproteinen, d.h. Proteine, die nicht kanonische Aminosäuren enthalten, müssen die nicht kanonischen Aminosäuren zuerst effizient über Aminosäuretransporter in die Zelle aufgenommen werden. Da die unterschiedlichen Aminosäuren über verschiedene Aminosäuretransporter aufgenommen werden, ist nicht genau bekannt, welche Transporter für die nicht kanonischen Aminosäuren zuständig sind. Wenn die nicht kanonischen Aminosäuren in die Zelle gelangt sind, müssen sie stabil bleiben d.h. sie dürfen nicht verstoffwechselt werden. Dies ist wiederum Bedingung dafür, dass die nicht kanonischen Aminosäuren akkumulieren, damit sie effektiv von der spezifischen Aminoacyl-tRNA Synthetase (aars) erkannt und aktiviert werden, und auf die zugehörige(n) trna(s) beladen werden können. Beim Einbau in eine Polypeptidkette durch die beladenene trna, muss die nicht kanonische Aminosäure so beschaffen sein, dass sie sich ins aktive Zentrum des Ribosoms einfügen kann und die Tertiärstruktur des Proteins nicht stört. 5 Um nicht kanonische Aminosäuren in ein Protein einzubauen, muss die ribosomale Proteinsynthese neu programmiert werden. Dies geschieht durch eine Neuzuordnung der Codons zu den nicht kanonischen Aminosäuren. Dabei kann die Bedeutung sowohl von Sense Codons, die Aminosäuren kodieren, als auch von Stop Codons neu definiert werden. Im ersten Verfahren wird eine Aminosäureauxotrophie (bestimmte Aminosäure kann nicht mehr hergestellt werden) durch die nicht kanonische Aminosäure supplementiert, sodass deren Einbau im gesamten Protein erfolgt. Genauer gesagt bedeutet dies, dass der verwendete Organismus gezwungen wird eine ähnliche Aminosäure (nicht kanonische Aminosäure)

10 1 Einleitung anstelle der fehlenden, nicht hergestellten, kanonischen Aminosäure in das betroffene Protein einzubauen. Beim Sense Codon Reassignment wird eine kanonische Aminosäure durch ein Aminosäure Analogon ersetzt. Im letzteren Fall wird das Stop Codon durch eine mit einer nicht kanonischen Aminosäure beladenen Suppressor-tRNA überlesen. In Fall der Stop Codon Suppression wird keine der 20 kanonischen Aminosäuren entfernt, sondern es wird eine 21. nicht kanonische Aminosäure zu den kanonischen 20 hinzugefügt. 3 In dieser Diplomarbeit wurde als Methode für den Einbau von kanonischen und nicht kanonischen Aminosäuren ausschließlich die Stop Codon Suppression angewendet. 1.2 Einbau von kanonischen und nicht kanonischen Aminosäuren durch Stop Codon Suppression (SCS) Bei der Stop Codon Suppression (SCS) (Abb. 1) wird dem Stop Codon eine neue Bedeutung zugeordnet. Dabei bewirkt das Stop Codon nicht mehr den Translationsabbruch durch Release Faktoren sondern es wird von einer Suppressor-tRNA überlesen, welche mit einer kanonischen oder nicht kanonischen Aminosäure beladen ist. Hierbei kommt es zum ortspezifischen Einbau dieser Aminosäure an der Position des Stop Codons. Bei der Suppressor-tRNA handelt es sich in diesem Fall um eine in der Natur vorkommende mutierte trna aus E. coli. Gleichzeitig findet bei der SCS immer ein Konkurrenzkampf zwischen Suppressor-tRNA und Release Faktoren statt. 3 Daraus ist zu schließen, dass die Stop Codon Suppression nicht die effektivste Methode ist, um nicht kanonische Aminosäuren in ein Modellprotein einzubauen. Die Effektivität kann durch eine erhöhte Anzahl von SuppressortRNA in der Zelle verbessert werden. Zurzeit stellt SCS die einzige Möglichkeit dar, ortsspezifischen Einbau von nicht kanonischen Aminosäuren zu erreichen.

11 1 Einleitung Abb. 1 Einbau von nicht kanonischen Aminosäuren durch Stop Codon Suppression. 6 Als Stop Codon wurde das Amber Stop Codon (TAG) ausgewählt, da es von den drei existierenden Translationsterminationssignalen in E. coli und S. cerevisiae am wenigstens benutzt ist, und dadurch aberrante Proteinexpression durch unspezifische TAG-Suppression minimiert wird. 2,3 Laut Annahme der Arbeitsgruppe Budisa und Veröffentlichungen von P. G. Schultz kann das Stop Codon TAG zwar durch ortsgerichtete Mutagenese an jede beliebige Stelle in die Sequenz des Modellproteins eingefügt werden, allerdings wird es nicht an allen Positionen gleich gut überlesen. Das bedeutet, dass die Suppressionseffizienz und damit die Einbaueffizienz der nicht kanonischen Aminosäure von der umgebenden Sequenz abhängig ist. Ein gezielter Einbau der nicht kanonischen (bzw. kanonischen) Aminosäure an die Stelle des Amber Stop Codons in S. cerevisiae kann nur mit Hilfe eines einzigartigen orthogonalen aars/suppressor-trna Paares stattfinden. Orthogonal bedeutet zum einen, dass die Suppressor-tRNA nicht von den endogenen aars des Wirts beladen wird, und dass die fremde aars nur die Suppressor-tRNA mit einer Aminosäure belädt (aminoacyliert) ohne eine Kreuzreaktion mit zellulären trnas einzugehen. Ebenfalls ist wichtig, dass die orthogonale aars die zugehörige trna ausschließlich mit der gewünschten Aminosäure belädt und nicht mit einer endogenen Aminosäure. Die nicht kanonischen Aminosäure darf nicht von endogenen aars erkannt werden. 3 Das Verfahren der SCS mit nicht kanonischen Aminosäuren wurde als erstes von der Arbeitsgruppe um P. G. Schultz etabliert. Schultz entwickelte dafür ein spezielles in vivo

12 1 Einleitung Screening Verfahren, um auf Aminoacyl-tRNA Synthetasen mit Aktivität für verschiedene nicht kanonische Aminosäuren zu testen. Die Schwierigkeit besteht darin, die aars an bestimmten Stellen im aktiven Zentrum, welches für die Bindung und Aktivierung der Aminosäure zuständig ist, so zu mutieren, dass sie neue, nicht kanonische Aminosäuren erkennt und die Amber-Suppressor-tRNA damit beladen kann, aber mit kanonischen Aminosäuren hingegen nicht mehr reagiert. Damit aars Mutanten mit guter, neuer Substratspezifität gefunden werden können, muss sich die nicht kanonische Aminosäure strukturell von der kanonischen Aminosäure unterscheiden Die verwendeten orthogonalen Paare und das Modellprotein in S. cerevisiae Orthogonale Paare Um das Amber Stop Codon zu erkennen, muss eine natürlich vorkommende oder mutierte Amber-Suppressor-tRNA verwendet werden, die auch von einer zugehörigen AminoacyltRNA Synthetase erkannt wird. Wie bereits weiter oben ausgeführt, darf das orthogonale Paar nicht mit entsprechenden Komponenten des Translationsapparates der Hefe S. cerevisiae kreuzreagieren. Aus diesem Grund wurde das Tyrosyl-tRNA Synthetase (TyrRS)/Amber- Suppressor-tRNA (trna CUA ) Paar für die kanonische Aminosäure Tyrosin (Tyr) aus E. coli als orthogonales Ausgangspaar in S. cerevisiae gewählt. Ausgangspaar deshalb, weil dieses Paar als Grundlage für die Entwicklung weiterer orthogonaler Paare für andere nicht kanonische Aminosäuren diente. 8,9 Als Ausgangsvektor, der das orthogonale TyrRS/tRNA CUA Paar exprimiert, wurde der Tandemvektor ptyrrs/trna CUA verwendet (Abb. 2). Dieser Vektor wurde von der Gruppe von P. G. Schultz etabliert 7 und in der Masterarbeit von Sebastian Nehring 10 in der Arbeitsgruppe von N. Budisa, in der auch dieses Diplomarbeit entstanden ist, rekonstruiert bzw. nachkloniert.

13 1 Einleitung Abb. 2 Plasmidkarte des Tandemvektors TyrRS/tRNA CUA.. AmpR: Markergen für Ampicillin-Resistenz in E. coli; TRP1: Auxotrophiemarker für Selektion in S. cerevisiae; CoIE1 ori: Replikationsursprung in E. coli; 2µ: Replikationsursprung in S. cerevisiae; ADH1: konstitutiver Promotor für die Expression in S. cerevisiae Bei dem Tandemvektor ptyrrs/trna CUA handelt es sich um einen Shuttle-Vektor, d.h. dieser Vektor kann sowohl in S. cerevisiae also auch in E. coli repliziert werden. Zur Expression der TyrRS wird der starke konstitutive ADH1 Promotor eingesetzt. Bei der Suppressor-tRNA CUA aus E. coli handelt es sich zufällig um eine trna, die ohne zusätzliche Mutation in S. cerevisiae exprimiert werden kann. Sie enthält die notwendigen A- und B- Boxen (natürlicher Promotor), die für eine trna Expression in Hefen notwendig sind. 11 Außerdem handelt es sich, aufgrund des 2µ Replikationsursprungs, bei dem Tandemvektor um ein High Copy Plasmid in S. cerevisiae. Das orthogonale TyrRS/tRNA CUA Paar wurde in dieser Arbeit verwendet, um die kanonische Aminosäure Tyrosin durch Amber Stop Codon Suppression in ein bestimmtes Modelprotein einzubauen. Wie schon erwähnt, diente das orthogonale Paar TyrRS/tRNA CUA als Ausgangspaar für weitere orthogonale Paare für nicht kanonische Aminosäuren. Genauer gesagt, wurde die TyrRS im aktiven Zentrum, in welches das Tyrosin bindet, an bestimmten Stellen ortsgerichtet mutiert. Bei diesen Stellen handelt es sich um Positionen, die besonders wichtig sind für das Schlüssel-Schloss-Prinzip (biologischer Mechanismus bei dem Strukturen oder Substanzen räumlich zueinander passen) zwischen TyrRS und Tyrosin, d.h. hier herrschen wichtige Bindungen zwischen der Aminosäure und der aars. Dabei fand an 4 Positionen im aktiven Zentrum in der Aminosäuresequenz ein Aminosäurenaustausch statt. So wurden verschiedene neue Aminoacyl-tRNA Synthetasen erhalten. 12 Für diese Diplomarbeit waren

14 1 Einleitung folgende orthogonalen Paare relevant: p-azido-phenylalanyl-trna Synthetase 1 (azphers1)/trna CUA und p-azido-phenylalanyl-trna Synthetase 6 (azphers6)/trna CUA (Tabelle 1). Codon Nr E. coli TyrRS DNA-Seq. GCG TAT TGC GCG AAC AAC GAC TTC CTG AS Ala Tyr Cys Ala Asn Asn Asp Phe Leu azphers1 DNA-Seq GCA CTT TGT GCC AAT AAT TCT CTG GCG AS Ala Leu Cys Ala Asn Asn Ser Leu Ala azphers6 DNA-Seq GCA ACG TGT GCC AAT AAT TCG GCT CTT AS Ala Thr Cys Ala Asn Asn Ser Ala Leu Tabelle 1 Mutation der E. coli TyrRS zu azphers1 und azphers6. 7,12 Bei den gelb unterlegten Feldern, fand eine Mutation bzw. ein Aminosäurenaustausch statt. In den weiß unterlegten Feldern fanden stille Mutationen (wahrscheinlich zur Codon-Optimierung) und daher kein Aminosäureaustausch statt. DNA-Seq: DNA-Sequenz; AS: Aminosäuren Diese beiden aars/trna CUA Paare werden durch die Tandemvektoren pazphers1/trna CUA und pazphers6/trna CUA exprimiert (Abb. 3). Die Vektoren wurden ebenfalls in der Gruppe Budisa nach Angaben von Chin et al. 7 und Deiters et al. 12 konstruiert.

15 1 Einleitung Abb. 3 Plasmidkarten der Tandemvektoren pazphers1/trna CUA und pazphers6/trna CUA. Abkürzungen sind in Abb. 2 erklärt. Die Tandemvektoren pazphers1/trna CUA und pazphers6/trna CUA sind bis auf die Aminoacyl-tRNA Synthetasen mit dem Ausgangsvektor ptyrrs/trna CUA identisch. Die azphers1 erkennt spezifisch die nicht kanonische Aminosäure p-azido-phenylalanin (azphe) und aktiviert sie (azphe-adenosinmonophosphat), damit die zugehörige trna CUA mit ihr beladen werden kann. Im Gegensatz dazu besitzt die azphers6 die Fähigkeit, gleich zwei nicht kanonische Aminosäuren zu erkennen, und zwar zum einen p-azido-phenylalanin und zum anderen p-propargyloxy-phenylalanin (poxphe). Auf diese Weise können die nicht kanonischen Aminosäuren azphe und poxphe an der Position eines in-frame Amber Stop Codons in ein Protein eingebaut werden. Die Strukturformeln der kanonischen Aminosäure Tyr und der nicht kanonischen Aminosäuren azphe bzw. poxphe sind in Anhang 1 aufgeführt Das Modellprotein humane Superoxiddismutase 1 (hsod1) Die humane Superoxiddismutase 1 (hsod1) katalysiert die Umwandlung von zelltoxischen Superoxidradikalen, die im Laufe von Verstoffwechselungen durch Sauerstoff-Reduktionen entstehen können, zu Wasserstoffperoxid und Sauerstoff. Dadurch wird verhindert, dass die Zellen durch Superoxidradikale geschädigt werden. Das Enzym besitzt ein Kupfer-Zink- Zentrum (Abb. 4) und eine Aminosäurensequenz aus 154 Aminosäuren. Die hsod1 liegt in der Zelle als Monomer oder Dimer vor. 13

16 1 Einleitung Abb. 4 3D-Struktur der hsod1 (Monomer) mit Cu und Zn im aktiven Zentrum gebunden. Das Codon 33, an dessen Stelle der Einbau der nicht kanonischen Aminosäure stattfinden soll, wurde violett markiert. PDB Nummer: 1DSW; braun: erstellt wurde das Bild mit RasMol. Die hsod1 wurde deshalb als Modelprotein gewählt, da sie ein sehr stabiles Protein mit einer Größe von 17 kda (Monomer) ist und in S. cerevisiae sehr gut exprimiert werden kann. 14 Für den Einbau der kanonischen Aminosäure Tyr und der nicht kanonischen Aminosäuren azphe und poxphe durch SCS wurde in der codierenden Sequenz das Tryptophan (Trp) Codon (TGG) an Position 33 durch ortsgerichtete Mutagenese gegen ein Amber Stop Codon (TAG) ausgetauscht. Trp33 wurde ausgewählt, da es auf der Proteinoberfläche an der Außenseite einer β-faltblatt Struktur liegt. Deshalb kann davon ausgegangen werden, dass durch den Einbau von kanonischen oder nicht kanonischen Aminosäuren die Stabilität oder die native Proteinfaltung nicht gestört wird. 7,8 Ebenfalls sollte die Seitenkette der eingebauten Aminosäure für spätere Modifikationen, wie z.b. [2+3]-Cycloaddition, frei zugänglich sein. Zusätzlich trägt das Protein hsod1 einen C-terminalen Tag für die Proteinaufreinigung und Detektion. Chin et al. 7 und Chen et al. 8 verwendeten dafür einen His(6x)-Tag. Eine andere Möglichkeit wäre ein C-terminaler Strep-TagII. Der Sinn hinter diesem C-terminalen Tag ist, dass das Protein nur aufgereinigt bzw. immunodetektiert werden kann, wenn das Amber Stop Codon an der 33. Stelle mit einer kanonischen oder nicht kanonischen Aminosäure supprimiert wird und dadurch ein Volllängenprotein mit C-terminalen Tag entsteht. Findet

17 1 Einleitung kein Einbau statt, bricht die Proteinexpression an der 33. Stelle durch das Stop Codon TAG ab und es entsteht ein trunkiertes Protein ohne Tag. Für die Expression der hsod1(trp33tag) Mutante wurden die Expressionsvektoren pyes2-ppgk1 (pgal)-hsod1(trp33tag)(-strep) verwendet (Abb. 5), die wie der Tandemvektor ptyrrs/trna CUA im Zuge der Masterarbeit von Sebastian Nehring 10 in dieser Arbeitsgruppe nach Chin et al. 7 und Chen et al. 8 kloniert wurde. Abb. 5 Plasmidkarte des Expressionsvektors pyes2-ppgk1(pgal)-hsod1(trp33tag)(-strep). Der rote Stern markiert Trp33TAG. ppgk1: konstitutiver Promotor, pgal: induzierbarer Promotor; URA3: Auxotrophiemarker für Selektion in S. cerevisiae; His(6x)-Tag: C-terminaler Tag; Strep-TagII: C-terminaler Tag. Die weiteren Abkürzungen sind in Abb. 2 erklärt. Die Shuttlevektoren pyes2-ppgk1 (pgal)-hsod1(trp33tag)(-strep) für S. cerevisiae und E. coli besitzt einen 2µ ori (2µ = High Copy Plasmid) und einen URA3 Selektionsmarker für Hefe und einen CoIE1 ori und einen AmpR Resistenzmarker für E. coli. Der Expressionsvektor trägt als Promotor für die hsod1(trp33tag) entweder einen konstitutiven ppgk1 oder einen induzierbaren pgal Promotor. Bei dem verwendeten ppgk1 Promotor handelt es sich um einen Promotor, bei dem hsod1(trp33tag) unabhängig von äußeren Einflüssen ständig exprimiert wird. Im Gegensatz dazu sollen bei einem induzierbaren Promotor pgal die Hefezellen erst einmal ohne den Einfluss der hsod1 Expression in glukosehaltigem Medium gut anwachsen. Erst nach der Überführung in ein galactosehaltiges Medium wird der Promotor induziert und die Proteinexpression gestartet. Damit das Protein hsod1(trp33tag) aufgereinigt und immunodetektiert werden kann, wird als C-terminaler Tag entweder ein His(6x)-tag oder ein Strep-TagII verwendet.

18 1 Einleitung Zielsetzung der Arbeit Der Einbau von kanonischen und nicht kanonischen Aminosäuren in ein Modellprotein durch Stop Codon Suppression in S. cerevisiae ist eine Anwendung des Protein Engeneerings, welches noch im geringen Maße erforscht wurde. Vorreiter auf diesem Gebiet ist die Arbeitsgruppe um P. G. Schultz, die sich zum ersten Mal mit diesem Thema auseinander gesetzt hat. Da der gezielte Einbau von bestimmten charakteristischen Aminosäuren in ein Protein gewisse Vorteile für die Proteinmodifikation mit sich bringt, stellte sich in der Arbeitsgruppe von N. Budisa die Frage, ob das Schulz System funktioniert und wenn ja wie. Nach erfolgreichen Literaturstudien wurden in der Arbeitsgruppe von N. Budisa die Tandemvektoren und Expressionsvektoren der hsod1(trp33tag) mit C-terminalen His(6x)-Tag nach Deiters et al. 12, Chin et al. 7 und Chen et al. 8 rekonstruiert, um für zukünftige Einbauversuche verwendet werden zu können. Dabei war es fraglich, ob die konstruierten Vektoren, die gleiche Effektivität/Funktionalität aufwiesen wie die Original-Vektoren. Zusätzlich stellte sich die Frage, ob der His(6x)-Tag die ideale Tag-Wahl für die Proteinaufreinigung in Hefe ist. Diese Fragestellung entstand dadurch, dass bei der hsod1(wild-typ) Aufreinigung via Ni-NTA Affiniätschromatographie eine deutliche Verunreinigung (Nebenbanden) neben der hsod1 auf dem Gel beobachtet wurde. Um die entstandenen Fragen zu beantworten, mussten verschiedene biochemische sowie molekularbiolgische Methoden angewendet werden. Für die Einbauversuche mussten je nach Aminosäure der zugehörige Tandemvektor mit einem Expressionsplasmid der hsod1(trp33tag) in S. cerevisiae Zellen transformiert werden, um mit den Einbautests beginnen zu können. Ebenso musste ein verbesserter His(6x)-Tag Ersatz gefunden werden, der eine nahezu reine Proteinaufreinigung ermöglicht. Ziel dieser Arbeit ist es nun, das System von P. G. Schultz für den Einbau von Tyr, azphe und poxphe in die humane Superoxiddismutase 1 in S. cerevisiae in der Arbeitsgruppe von N. Budisa mit den nach Deiters et al. 12, Chin et al. 7 und Chen et al. 8 bereits konstruierten Tandemvektoren und Expressionsvektoren für hsod1(trp33tag) auszutesten. Dabei soll die Frage beantwortet werden, ob der Einbau von der kanonischen Aminosäure Tyr und den nicht kanonischen Aminosäuren azphe und poxphe mit diesem Ansatz möglich ist. Außerdem soll der ursprünglich beschriebene C-terminalen His(6x)-Tag im Expressionsplasmid pyes2- ppgk1 (pgal)-hsod1(trp33tag) gegen einen Strep-TagII ausgetauscht werden, da sich dadurch eine verbesserte Proteinaufreinigung aus Hefezellen ergeben könnte.

19 2 Materialien Materialien 2.1 Bakterien Stämme o E.coli DH5α 2.2 Saccharomyces cerevisiae Stämme o InvSc1 Invitrogen, Carlsbad, CA, USA (Genotyp: Sc1: MATa/α his3 1/ his3 1 leu2/leu2 trp1-289/trp1-289 ura3-52/ura3-52) 2.3 Plasmide o pyes2-pgal-hsod1(trp33tag) o pyes2-ppgk1-hsod1(trp33tag) o pyes2-pgal-hsod1(trp33tag)-strep o pyes2-ppgk1-hsod1(trp33tag)-strep o pyes2-pgal-hsod1(ala2lys) o pyes2-pgal-hsod1(ala2lys)-strep o pyes2-leu2d-pgal-hsod1(trp33tag)-strep o pyes2-leu2d-ppgk1-hsod1(trp33tag)-strep o ptyrrs/trna CUA o pazphers1/trna CUA o pazphers6/trna CUA o pyex4tps

20 2 Materialien Primer hsod1_strep_fp: AGGAAACGCTGGAAGTCGTTTGGCTTGTGGTGTAATTGGGATCGCCCAAAGCGCT TGGAGCCACCCGCAG hsod1_strep_rp: CCCTCTAGATGCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCT TATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCC pyes2-leu2d-homrec_fp: ATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACC pyes2-leu2d-homrec_rp: TGGTAAGGCCTCGTTAAAGG 2.5 Enzyme o EcoRI o NcoI New England Biolabs, Ipswich, MA, USA New England Biolabs, Ipswich, MA, USA 2.6 Antikörper o Strep MAB-Class o Goat Anti-Mouse IBA BioTAGnology, Götting, Deutschland IBA BioTAGnology, Götting, Deutschland 2.7 Standards o Gene Ruler 1kb DNA Ladder o Page Ruler Prestained Protein Ladder; Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland 2.8 Präparationskits o Plasmid Mini Kit; Qiagen, Hilden, Deutschland

21 2 Materialien Chromatographiesäulen o Strep-Tag purification System IBA BioTAGnology, Götting, Deutschland 2.10 Puffer Puffer für Agarosegele 50x TAE-Puffer: o 24,2% (w/v) Tris o 5,72% (w/v) Essigsäure o 3,72% (w/v) Na 2 EDTA * 2 H 2 0 auf ph 8,0 einstellen (mit HCl) 1x TAE-Puffer: o 50x TAE-Puffer 1:50 (v/v) mit ddh 2 O verdünnen. Wurde als Laufpuffer für die Agarose-Gelelektrophorese verwendet. 1% Agarose-Gel: o 1 g Agarose o 100 ml 1x TAE-Puffer o 5 µl Ethidiumbromid (0,5 mg/ml) Agarose-Auftragspuffer: o 6x Loading Dye New England Biolabs, Ipswich, MA, USA Puffer für SDS-Gele 4x Trenngel-Puffer (1,5 M Tris/Cl ph 8,8): o 1,5 M Tris

22 2 Materialien o 0,4% SDS auf ph 8,8 einstellen (mit HCl) 4x Sammelgel-Puffer (0,5 M Tris/Cl ph 6,8): o 0,5 M Tris o 0,4% SS auf ph 6,8 einstellen (mit HCl) 10x SDS-PAGE Laufpuffer: o 0,25 M Tris o 1,92 M Glycin o 1% (w/v) SDS auf ph 8,3 einstellen (mit HCl) 1x SDS-PAGE Laufpuffer: o 10x SDS-PAGE Laufpuffer 1:10 (v/v) mit ddh 2 O verdünnen. Wurde als Laufpuffer für die SDS-Gelelektrophorese verwendet. 5x SDS-Auftragspuffer: o 0,08 M Tris/Cl ph 6,8 o 10% SDS o 12,5% Glycerin o 4% (v/v) β-mercaptoethanol o 0,2% (w/v) Bromphenolblau Puffer für Western Blot 10x Transfer Puffer: o 1,92 M Glycin (144 g/l) o 1% SDS (10 g/l)

23 2 Materialien o 0,25 M Tris (30 g/l) 1x Transfer Puffer (Towbin): o 10x Transfer Puffer (100 ml/l) o MeOH (200 ml/l) o + 1 l ddh 2 O Endkonzentration: 192 mm Glycin, 0,1% SDS, 25 mm Tris und 20% (v/v) Methanol. Ponceau S stain: o 0,5% (w/v) Ponceau S in 1% (v/v) Essigsäure (0,5 g/100 ml) 10x TBS: o 0,5 M Tris (60 g/l) o 1,5 M NaCl (87 g/l) auf ph 8,0 einstellen (mit HCl) 1x TTBS: o 10x TBS (25 ml/250 ml) o 0,1% Tween20 (250 µl/250 ml) o ml ddh 2 O 1x TTBS + 3% BSA: o 1x TTBS 50 ml o 3% Bovine Serum Albumin (1,5 g/50 ml) 1x TTBS + 1,5% BSA: o 1x TTBS 50 ml o 1,5% Bovine Serum Albumin (0,75 g/50 ml)

24 2 Materialien Puffer für Zellaufschluss und Plasmidisolierung PBS: o 140 mm NaCl o 10 mm KCl o 6,4 mm Na 2 HPO 4 * 2 H 2 O Lysepuffer: o 2% (v/v) Triton X-100 o 1% (w/v) SDS o 100 mm NaCl o 10 mm Tris/HCl ph 8,0 o 1 mm EDTA Puffer für Gesamtprotein-Extrakt 2x Proben Puffer: o 100 mm Tris/HCl ph 6,8 o 4 mm EDTA 4% SDS o 20% Glycerin o 0,002% Bromophenol Blau Riezmann Puffer: o 2x V tot 2x Proben Puffer (1 ml/1,5 ml) o 1x V tot 1 M Tris Base (500 µl/1,5 ml) o 2% 2-mercaptoethanol (30 µl/1,5 ml)

25 2 Materialien Puffer für Strep-Tag Affinitätschromatographie Waschpuffer: o 100 mm Tris/Cl ph 8,0 o 150 mm NaCl o 1 mm EDTA Elutionspuffer: o 100 mm Tris/Cl ph 8,0 o 150 mm NaCl o 1 m EDTA o 2,5 mm Desthiobiotin Regenerationspuffer: o 100 mm Tris/Cl ph 8,0 o 150 mm NaCl o 1 m EDTA o 1 mm HABA (Hydroxy-Azophenyl-Benzoesäure) 2.11 Medien und Antibiotikalösungen Medien für E.coli LB-Medium o 1,0% Bacto-Trypton o 0,5% Bacto Yeast Extract o 1,0% NCl o für festes Nährmedium: + 1,5% Agar

26 2 Materialien o Bacto Trypton, Bacto Yeast Extract Difco Laboratories, MI, USA Medien für Sacharomyces cerevisiae Bacto Yeast Extract (g/l) Bacto Peptone (g/l) Glukose (g/l) Galaktose (g/l) Yeast Nitrogen Base (g/l) YSDOMS AS (g/l) AS (mg/l) YPD SC -ura 10 6,7 -ura 1,92 SC -ura GAL 10 6,7 -ura 1,92 SC -ura trp 10 6,7 -his leu trp ura 1,92 L-His: 76 L-Leu: 380 SC -ura trp GAL 10 6,7 -his leu trp ura 1,92 L-His: 76 L-Leu: 380 SC -leu 10 6,7 -leu 1,6 SC -leu GAL SC -leu -trp 10 6,7 10 6,7 -leu 1,6 leu trp 1,54 SC leu trp GAL 10 6,7 leu trp Für feste Nährmedien werden noch zusätzlich 20 g/l Bacto Agar hinzugefügt Tabelle 2 Zusammensetzung dermedien für S. cerevisiae. YSDOMS: yeast synthetic drop out medium supplements; AS: Aminosäure 1,54 Alle Medienbestandteile wurden von Sigma Chemie Gmbh (Deisenhofen, Deutschland), bezogen. Die Agarose stammte von Gibco BRL (Paislay Schottland).

27 2 Materialien Antibiotika-Stammlösungen Die Antibiotikalösung wurde dem fertigen sterilen Medium im Verhältnis von 1:1000 zugesetzt. o Ampicillin (Amp): 100 mg/ml 2.12 Chemikalien Pierce Super Signal West Pico: Pierce Rockford, IL, USA o Luminal Enhancer Solution o Stable Peroxide Solution Coomassie Brilliant Blau R250 Agarose Pierce Y-PER Serva, Heidelberg, Deutschland Gibco BRL, Paislay, Schottland Pierce Rockford, IL, USA Hier nicht aufgeführte Chemikalien wurden nur von den Firmen Merck AG (Darmstadt, Deutschland), Sigma Chemie GmbH (Diesenhofen, Deutschland), Thermo Fisher Scientific (Bonn, Deutschland) und Carl Roth GmbH Co. (Karlsruhe, Deutschland) bezogen Materialien o Glasperlen (Ø 0,5 mm) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA

28 3 Methoden Methoden 3.1 Arbeiten mit DNA (Desoxyribonukleinsäure) PCR Polymerase Kettenreaktion Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) macht es möglich, ein gewünschtes DNA-Segment in hoher Anzahl und Reinheit vervielfältigen zu können. Sie ist schnell und gezielt. Für die PCR werden zwei synthetische Oligonukleotide, die so genannten Primer gebraucht, die die Länge des PCR-Produkts festlegen. Die Sequenzen des Forward und Reverse Primers werden so entworfen, dass sie komplementär zum Anti-Sense Strang bzw. Sense Strang sind. Zusätzlich zu den Primern werden ein DNA-Template mit dem zu vervielfältigenden DNA- Abschnitt und Desoxyribonukleotide (dntp-mix) benötigt. Zuletzt fügt man dem Ansatz eine thermostabile DNA-Polymerase zu, die z.b. aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus (Taq-Polymerase) stammt. Der PCR-Ansatz wird in einen Thermocycler gestellt, welcher es ermöglicht, dass die DNA-Sequenz amplifiziert wird. Es werden viele Zyklen mit mehreren Schritten durchlaufen. Die Schritte unterteilen sich in Strangtrennung (Schmelzphase), Primer-Hybridisierung (Annealingphase) und DNA-Synthese (Elongationphase). In den meisten Fällen wurde folgender PCR-Ansatz verwendet: o 2,5 µl o 2 µl o 0,1 µl o je 0,5 µl o 1 µl o 18,4 µl 10x Reaktionspuffer 10 mm dntp-mix Taq-Polymerase 25 pmol/µl Primer (Oligonukleotide) DNA-Template ddh 2 O Die auszuwählenden PCR-Programme im Thermocycler richten sich nach der zu amplifizierenden DNA-Abschnittslänge (1 min Elongation pro 1 kb Fragmentlänge) und der Schmelztemperatur der Primer (die Annealingtemperatur wird gewöhnlich 4 C niedriger gewählt).

29 3 Methoden Annealing und Primer Extension mit Taq-Polymerase Diese Methode wird verwendet, um kurze doppelsträngige DNA-Fragmente von ca. 100 Basenpaaren mit Hilfe von zwei Primern zu generieren. Dabei wird kein DNA-Template verwendet mit dem die Primer hybridisieren, sondern die Primer hybridisieren direkt miteinander. Etwa jeweils 20 Basen an den 3 Enden der Primer sind dabei zueinander komplementär. Die einzelsträngigen Überhänge werden durch die DNA-Polymerase mit dntps aufgefüllt. Es wurde folgender PCR-Ansatz verwendet: o 2,5 µl o 2 µl o 0,1 µl 10x Reaktionspuffer 10 mm dntp-mix Taq-Polymerase o 0,5 µl 25 pmol/µl Primer 1 o 0,5 µl 25 pmol/µl Primer 2 o auf 20 µl mit ddh 2 O aufgefüllt Es wurde folgender PCR Ablauf im Thermocycler verwendet: o C für 5 min o C für 30 sec o C (Annealingtemperatur variiert je nach Primer) für 30 sec o C für 30 sec o 5. Schritte 2 4 ca. 10x wiederholen o C für 5 min Für spezielle Fälle wurde eine 2-Step PCR verwendet mit folgendem Ablauf: o C für 5 min o C für 30 sec o C (Annealingtemperatur variiert je nach Primer) für 30 sec o C für 90 sec

30 3 Methoden o 5. Schritte 2 4 ca. 5x wiederholen o C für 30 sec o C für 2 min o 8. Schritte 6 7 ca. 25x wiederholen o C für 10 min Es konnte mit dem PCR-Produkt sofort weitergearbeitet werden Agarose-Gelelektrophorese Durch die Agarose-Gelelektrophorese lassen sich Nukleinsäuren wie DNA und RNA, welche negativ geladen sind, im elektrischen Feld nach ihrer Größe auftrennen. Dabei wandern kleine Fragmente schneller durch das Gel als große. Dadurch kann eine Aussage über die Größe und die Menge der aufgetragenen Fragmente getroffen werden. Je höher die Agarose- Konzentration des Gels, desto kleiner werden die Gelporen, d.h., umso exakter werden kleinere Fragmente aufgetrennt. Bei niedrigen Agarose-Konzentrationen werden die Gelporen größer und somit können die Fragmente schneller durch das Gel wandern und eine genaue Auftrennung kann nur von großen Fragmenten stattfinden. Um die aufgetragenen sowie die aufgetrennten DNA Fragmente sichtbar zu machen, wurde dem Agarosegel eine geringe Menge Ethidiumbromid zugegeben, welche die Banden im UV- Licht sichtbar macht. Das Ethidiumbromid lagert sich in die DNA ein und fluoresziert bei einer Wellenlänge von 254 nm. Dies ermöglicht die fotografische Dokumentation sowie das Ausschneiden der Banden aus dem Gel, wodurch diese weiter analysiert werden können. Für die Herstellung der Gele mit 1% Agarose-Konzentration wurde 1 g Agarose in 100 ml TAE-Puffer kurz aufgekocht bis sie vollständig gelöst war. Gleich danach wurde die Lösung in eine horizontale Gelwanne gegossen. Sobald das noch flüssige Gel etwas abgekühlt war, wurden ca. 5 µl Ethidiumbromid-Lösung untergemischt. Zusätzlich wurde ein geeigneter Kamm zur Formung der Probentaschen eingesetzt. Nach vollständiger Polymerisation des Gels wurde dieser wieder entfernt und die Probentaschen mit den Proben (mit 6x Auftragspuffer gemischt) sowie mit einem DNA-Längenstandard befüllt. Die Elektrophorese lief bei 90 bis 120 V bis die Bromphenolblau-Front ca. 1 cm vom unteren Gelrand entfernt war.

31 3 Methoden Restriktionsverdau Restriktionsenzyme bzw. Restriktionsendonucleasen erkennen bestimmte DNA-Sequenzen und schneiden die DNA-Stränge an diesen spezifischen Stellen in definierte Fragmente. Sie erkennen eine bestimmte Basenpaarabfolge präzise und spalten innerhalb dieser Basensequenz in jedem DNA-Strang eine Phosphodiesterbindung. Die meisten Schnittstellen sind Palindrome (umgekehrte Sequenzwiederholungen). Je nach Enzym können durch die Spaltung 5 - bzw. 3 - überhängende oder glatte Enden entstehen. Diese Methode wurde benutzt, um Vektoren zu linearisieren oder um bestimmte DNA- Abschnitte aus einem Plasmid auszuschneiden. Folgender Ansatz wurde für den Restriktionsverdau verwendet: o ~0,5-2 µl DNA (PCR-Produkt, Plasmid) o 1 µl o 0,5 µl 10x Puffer (variiert je nach verwendeten Enzym) Restriktionsenzym (je eingesetzten Enzym) o auf 10 µl mit ddh 2 O auffüllen Der Ansatz wurde für 2 3 Stunden bei 37 C inkubiert. Auf die verwendeten Restriktionsenzyme wird in den entsprechenden Kapiteln hingewiesen DNA Sequenzierung Alle in dieser Arbeit hergestellten rekombinanten Vektoren wurden zur Kontrolle sequenziert. Damit konnten Fehler, wie Mutationen oder falscher Fragmenteinbau im Plasmid ausgeschlossen werden. Nach der Kontrolle wurden die korrekten Vektoren für die Expression weiter verwendet. Die benutzten Primer wurden selbst erstellt und waren so ausgewählt, dass der relevante DNA-Bereich, der verändert wurde, damit sequenziert werden konnte. Zur Sequenzierung wurde der hauseigene Sequenzier-Service genutzt. 3.2 Arbeiten mit Bakterien Es wurden ausschließlich sterile Geräte (Pipetten, Spitzen, Kolben, etc.), Reagenzien und

32 3 Methoden steril filtrierte oder autoklavierte Medien verwendet, um eine Kontamination mit Fremdorganismen zu vermeiden. Des Weiteren wurden bei der Entsorgung alle verwendeten Kulturen totautoklaviert Herstellung von kompetenten E. coli Zellen Da die Zellwand sowie die Zellmembran von Bakterien für Plasmide nicht durchlässig ist, muss die Permeabilität für kurze Zeit erhöht werden. Dazu werden die E. coli Zellen kompetent gemacht, d.h. sie sind fähig Plasmid-DNA aufzunehmen. Für die Herstellung wurden 500 ml LB Medium mit 15 ml einer Übernacht-Vorkultur mit E. coli angeimpft und bei 37 C bis zu einer OD 600 von ca. 0,7 0,8 inkubiert. Danach wurden die Zellen bei 6700 x g für 15 min bei 4 C abzentrifugiert. Das erhaltene Zellpellet wurde behutsam in 500 ml eiskaltem, sterilem 10%-Glycerin resuspendiert und bei 6700 x g für 10 min bei 4 C zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde noch einmal mit 500 ml eiskaltem 10%-Glycerin wiederholt. Nach dem Entfernen des Überstandes wurden die Zellen in dem zurückgebliebenem 10%-Glycerin resuspendiert. Die kompetenten Zellen wurden als Aliquots zu je 40 µl in vorgekühlte 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gefüllt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren Transformation kompetenter E. coli Zellen mit Elektroporation Damit ein Vektor in E. coli amplifiziert werden kann, muss dieser zuerst in kompetente Bakterienzellen transformiert werden. Als Methode wurde die Elektroporation gewählt. Hierbei wurden 40 µl der auf Eis gekühlten, elektrokompetenten Zellen mit ng Plasmid-DNA (entsalzt, damit kein Kurzschluss während der Elektroporation ausgelöst wird) in einer eisgekühlten Elektroporations-Küvette mit 0,1 cm Spaltbreite gemischt und in einen Elektroporator gestellt. Gepulst wurde unter folgenden Bedingungen: o U = 1,5 kv o R = 100 Ohm o C = 25 µf (unit control) / 20 µf (capacitance extender) Während der Elektroporation entsteht eine kurzzeitige Permeabilität der Zellmembran für

33 3 Methoden Nukleinsäuren. Durch das elektrische Feld, welches durch einen sich entladenden Kondensator entsteht, werden für kurze Zeit mikroskopisch kleine Poren in der Membran hervorgerufen. Die DNA wird im elektrischen Feld beschleunigt und durch die Poren in die Zelle aufgenommen. Direkt danach wurden die Zellen mit 1 ml LB-Medium versetzt und in einem sterilen Eppendorf-Röhrchen bei 37 C / rpm für 1 Stunde inkubiert. Die Zellsuspension wurde auf eine LB-Platte mit entsprechendem Antibiotikum ausplattiert und bei 37 C inkubiert bis Kolonien sichtbar wurden Plasmidisolierung aus E. coli Um Plasmide aus den transformierten E. coli Zellen zu isolieren, wurden Klone von den LB- Platten abgenommen und je in ein 5 ml LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum bei 37 C / 200 rpm über Nacht für ca Stunden inkubiert. Nach der Anzucht wurden die Zellen abzentrifugiert und chemisch lysiert, und die Plasmide mit einem Plasmid Mini Kit nach einer einfachen Binden Waschen Eluieren Methode nach Protokoll isoliert und aufgereinigt. Die Ausbeute der gewonnenen Plasmide reicht aus, um diese zu analysieren und identifizieren. 3.3 Arbeiten mit Hefen Hier wurde die gleiche Vorgehensweise angewendet wie bei dem Arbeiten mit Bakterien, um eine Fremdkontamination auszuschließen. Es wurden ebenfalls nur autoklavierte Geräte (Pipetten, Spitzen, Kolben, etc.), Reagenzien und steril filtrierte oder autoklavierte Medien benutzt. Ebenso wurden alle verwendeten Kulturen bei der Entsorgung totautoklaviert Plasmid Transformation in S. cerevisiae Zellen Um Fremd-DNA in Hefezellen transformieren zu können, ist es nötig die Zellwand sowie die Zellmembran permeabel zu machen. Zur Herstellung dieser kompetenten Hefezellen wurde die Lithiumacetat Methode gewählt. Die eigentliche Transformation findet unter Hitzeeinwirkung bei 42 C statt.

34 3 Methoden Als erstes wurde eine ~5 ml YPD Vorkultur mit dem zu transformierenden Hefestamm über Nacht bei 30 C / 220 rpm angesetzt. Davon wurden 50 ml vorgewärmtes YPD auf eine OD 600 von 0,2 angeimpft und für ca. 3 5 Stunden bei 30 C / 220 rpm bis zu einer OD 600 von 0,8 1,2 inkubiert. Die Zellkultur wurde bei 3000 x g, RT für 5 min zentrifugiert und anschließend wurden die geernteten Zellen in sterilem ddh 2 O resuspendiert bzw. gewaschen und erneut unter gleichen Bedingungen abzentrifugiert. Danach wurden die Zellen in 1 ml 100 mm LiOAc resuspendiert, in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen überführt und für 15 sec. bei maximal Geschwindigkeit bei RT zentrifugiert. Im Anschluss wurde das Pellet zu einem Endvolumen von 500 µl mit 100 mm LiOAc resuspendiert und die kompetenten Zellen auf Eis gestellt. Von den kompetenten Hefezellen wurden je Transformation 50 µl in ein neues Eppendorf-Röhrchen pipettiert und erneut bei maximal Geschwindigkeit für 15 sec bei RT abzentrifugiert. Nach dem Entfernen das restliche LiOAc, wurde folgender Transformations- Mix hinzugegeben und mit den Zellen gemischt: o 240 µl o 36 µl o 25 µl o 50 µl PEG (50% w/v) 1 M LiOAc ssdna (2,0 mg/ml) ddh 2 O und Plasmid DNA (0,1 10 µg) Nach vollständiger Auflösung des Pellets, wurde der Mix bei 30 C für 30 min inkubiert und anschließend in einem Heizblock bei 42 C für min einem Hitzeschock unterzogen. Die transformierten Zellen wurden bei 7000 rpm, 15 sec bei RT abzentrifugiert und der Überstand entfernt. In 250 µl sterilem ddh 2 O wurde das Zellpellet sachte resuspendiert und auf eine entsprechende Selektionsplatte ausplattiert und bei 30 C für 2 4 Tage inkubiert, bis Transformanten sichtbar wurden Plasmidisolierung aus S. cerevisiae Hierbei wurde eine effiziente und schnelle Methode angewendet, um Plasmide aus Hefen zu isolieren, die dann in E. coli Zellen amplifiziert wurden. Es wurden 5 ml YPD Medium mit einer einzelnen Hefekolonie, die das gewünschte Plasmid besitzt, beimpft und bei 30 C, 220 rpm über Nacht inkubiert. Danach wurden die Zellen in ein passendes Reagenzgefäß überführt und bei 4000 rpm, RT für 3 min zentrifugiert. Nach entfernen des Überstandes wurden das Zellpellet in 500 µl ddh 2 O resuspendiert (gewaschen) und in ein 1,5 ml

35 3 Methoden Eppendorf-Röhrchen überführt. Die resupendierten Hefezellen wurden bei maximaler Geschwindigkeit, RT für 5 sec. zentrifugiert und der Überstand wurde erneut entfernt. Zum lockern des Zellpellets wurde diese kurz und sanft mittels Vortexmixer aufgeschüttelt, um im Anschluss in Lysepuffer reuspendiert zu werden. Danach wurden 0,3 g Glasperlen und 200 µl CIP Reagenz (Chloroform, Isoamlyalkohol, Phenol) hinzugegeben und mit dem Vortexer mit höchster Geschwindigkeit für 3 min geschüttelt. Hierbei findet der mechanische Zellaufschluss statt und die Plasmide gelangen in die wässrige Oberphase im Eppendorf- Röhrchen. Um Phasentrennung zu erhalten, wurde das Eppendorf-Röhrchen mit dem isolierten Plasmid bei maximaler Geschwindigkeit, RT für 5 min. zentrifugiert. Von der wässrigen Phase mit dem Plasmid wurden 1 2 µl für die Transformation in E. coli entnommen Proteinexpression im kleinen Maßstab Für die Proteinexpression im kleinen Maßstab wurde ein Kulturvolumen von 50 ml gewählt. Dabei enthielt der verwendete transformierte Hefestamm InvSc1 das Plasmid, welches das gesuchte Protein exprimiert. Zuerst wurde eine Vorkultur von 5 ml mit dem der entsprechenden Vektor enthaltenden InvSc1 Stamm in SC-ura (SC-ura-trp, SC-leu-trp) Medium bei 30 C, 220 rpm über Nacht angezüchtet. Daraus wurde dann eine 50 ml Hauptkultur mit demselben Medium auf eine OD 600 von ca. 0,2 beimpft und bei 30 C, 220 rpm für 24 Stunden inkubiert (Proteinexpression). Falls das Plasmid einen Galaktose induzierbaren Promotor enthielt, wurde nicht für 24 Stunden inkubiert, sondern für ~4 Stunden bei 30 C, 220 rpm bis eine OD 600 von ~1 erreicht war. Nach der Messung wurde eine Zellmenge entsprechend 3 OD 600 für SDS-PAGE und Western Blot genommen (nicht induzierte Probe). Im Anschluss wurde die 50 ml Kultur für ca. 10 min bei 5000 rpm und RT abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wurde in 25 ml sterilem ddh 2 O resuspendiert und gewaschen, um das restliche Medium zu entfernen. Es wurde erneut zentrifugiert und die Zellen in 50 ml SC-ura (SC-ura-trp, SC-leutrp) GAL Medium aufgenommen und für 24 Stunden bei 30 C, 220 rpm inkubiert (Proteinexpression). Am Ende der Proteinexpressionsphase fand eine erneute Messung der OD 600 statt. Dann wurde eine Zellmenge, die 3 OD 600 entspricht, entnommen (induzierte Probe), die für weitere Analysen wie SDS-PAGE und Western Blot verwendet wurde.