Food DNA Extraktions Kit

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1 Datenblatt Artikel Nr. BS Artikel Nr. BS Artikel Nr. BS Aufreinigungen 50 Aufreinigungen 100 Aufreinigungen (Nur für die Forschung) Chargen-Nr.: Mindestens haltbar bis: Aussehen: Farbe: 1

2 Beschreibung Kit für die schnelle und effiziente Aufreinigung von DNA aus frischen oder verarbeiteten Lebensmitteln oder anderen tierischen/pflanzlichen Produkten. Der Kit beinhaltet Zentrifugations-Säulchen, Puffer und alle Reagenzien die für die Zelllyse, DNA Bindung, Waschschritte und Elution der DNA in einem möglichst kleinen Volumen benötigt werden. Im Kit enthalten ist ein detailiertes Anwendungsprotokoll für die Extraktion von DNA aus Vollblut, Zellen und Lebensmitteln. Die so aufgereinigte qualitative sehr hochwertige genomische DNA kann anschließend sofort für alle Folgeanwendungen (PCR, Hybridisierung, Restriktionsanalysen, Klonierung etc.) eingesetzt werden. Proben Blut, frisches oder gefrorene Proben, mit oder ohne Anti- Koagulierungsmitteln (z.b. EDTA, Heparin, Zitrat), Plasma oder Körperflüssigkeiten oder bis zu 10 7 Zellen (Suspensionskultur oder adhärent gewachsen). Lebensmittelproben (prozessierte, haltbare), Milch, Milchprodukte, Würste, Salami, Fleisch, Käse. Für die Isolierung von genomischer DNA zur Artenbestimmung oder der Bestimmung von bakterieller DNA (Pathogen Diagnostik). 2

3 Lieferumfang Aufreinigungen Lagerort Mini Zentrifugationssäulchen mit Deckel RT Sammel-Röhrchen 2.0 ml RT Lysepuffer UDC 2x 1,2 ml 11 ml RT Bindepuffer UHQ 2x 1,2 ml 11 ml RT Waschpuffer UHJ 3,6 ml 17,6 ml RT Waschpuffer DU 1,1 ml 5,1 ml RT Elutionspuffer FM 1,5 ml 6 ml RT Proteinase K (20 mg/ml) 220 µl 1,1 ml -20 C Wichtig vor Beginn: Präzipitate in Lyse Puffer UDC sollten durch Erwärmen auf 55 C gelöst werden. 3

4 Vorbereitung der Waschpuffer UHJ und DU: Waschpuffer UHJ und Waschpuffer DU sind Konzentrate. Vor der ersten Verwendung muss der Waschpuffer UHJ Isopropanol (100%) und der Waschpuffer DU Ethanol im folgenden Mengen zugegeben werden: Aufreinigungen Waschpuffer UHJ Waschpuffer DU Auf 3,6 ml Zugabe von 1,6 ml Isopropanol Auf 1,1 ml Zugabe von 4,1 ml Ethanol Auf 17,6 ml Zugabe von 7,6 ml Isopropanol Auf 5,1 ml Zugabe von 21 ml Ethanol Zugabe der entsprechenden Menge an Alkohol, anschließend gut durchmischen. 4

5 Zusätzlich benötigtes Material % (v/v) Ethanol 100 % Isopropanol Thermoblock oder Wasserbad Mikrozentrifuge Eppis (1,5 ml) Benötigte Inkubatoren /Wasserbäder Ein Wasserbad auf 55 C (für Proteinase K mit Lysepuffer UDC) und ein weiteres auf 70 C (für die kurze Inkubation nach der Zugabe des Bindpuffer UHQ) aufheizen. Elutionspuffer FM auf 70 C für die Elution der DNA erwärmen. Lagerbedingungen und Stabilität Die Zentrifugationssäulchen sind in geschlossenen Beuteln verpackt und sind bei Raumtemperatur (18-25 C) gelagert für mindestens 2 Jahre haltbar. Proteinase K wird als Lösung geliefert und sollte nach dem Erhalt bei -20 C gelagert werden. Die Puffer sollten bei Raumtemperatur (18-25 C) aufbewahrt werden. Bitte beachten Sie, dass eine Grantie wie in diesem Handbuch angegeben nur Gültigkeit hat wenn die Lagerbedingungen eingehalten werden. Bitte achten Sie darauf dass die Säulchen sollten Sie einmal geöffnet sein sofort verwendet werden. Präzipitate in Lyse Puffer UDC sollten durch Erwärmung auf 55 C gelöst werden. 5

6 Food DNA Extraktions Kit DNA Extraktion und Aufreinigung Vorbehandlung der Proben Empfohlenes Flüssigkeitsproben-Volumen Blut, Serum oder Zellen (oder /ml): 200 µl Milch oder andere Flüssigkeitsproben: 200 µl (direkt, ohne Zentrifugation) Aufkonzentrierung von Flüssigkeitsproben durch Zentrifugation Für die Isolierung genomischer DNA aus Bakterien in der Milch oder anderen nicht viskösen Proben können die Zellen durch Zentrifugation bei g für 10 min pelletiert werden. Überstand verwerfen und das Pellet in 200 µl Lyse Puffer für die nachfolgende DNA Extraktion resuspendieren (siehe Lyse). Probenanreicherung durch Kultivierung Für die Anreicherung von im flüssigen Medium enthaltenen Bakterien werden die flüssigen Proben in Tryptose-SojaMedium überführt. Das Flüssigmedium wird für 1-2 Tage inkubiert und eine 200 µl Probe wird für die Lyse verwendet (oder Aufkonzentrierung der Probe durch Zentrifugation). 6

7 Food DNA Extraktions Kit Feststoff-Proben /Essen Feststoff-Probe: 50 mg (Fleisch, Wurst, Salami). Zerteilen der Probe mit einem kleinen Skalpell oder Pulverisierung der Probe mittels flüssigen Stickstoff und anschließender Weiterbehandlung mit einem kleinen Mörser/Pistil oder kleinen Homogenisierer. Weiche Essensproben können direkt durch die Zugabe des Lysepuffers lysiert werden (siehe Schritt 1). Komplexe feste Proben wie z.b. Corn Flakes müssen mit einem Mini Homogenisierer oder Zahnstocher zerdrückt werden. Kontaminierung von festen Essen mit Bakterien Ca. 50 mg Essen-Probe welche eine Kontamination mit Bakterien besitzt (die meisten Bakterien befinden sich auf der Oberfläche der Essensprobe) können angereichert werden indem man sie in spezifischen Nährmedium (2ml5ml) inkubiert. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37 C unter permanenten Schütteln (Rotatoren oder Thermoschüttler) in einem geeigneten Gefäß, werden ca 200 µl Nährmedium für die Zelllyse entnommen (s. Protokoll). Um die Sensitivität zu erhöhen können alternativ µl angereichertes Medium für 10 min bei 5000 g pelletiert und anschließend mit 200 µl Lysepuffer resuspendiert werden. (siehe Lyseschritt). Anschließend mit der DNA Extraktion laut Protokoll fortfahren (siehe nächste Seite). 7

8 Food DNA Extraktions Kit Extraktionsprotokoll 1. Zugabe von 200 µl Lyse Puffer UDC + 20 µl Proteinase K Lösung (20mg/ml) zur Probe. Kräftig vortexen für 1min bei max. Geschwindigkeit. 2. Ansatz bei 55 C im Schüttler für 60 min inkubieren. 3. Zugabe von 200 µl Bindepuffer UHQ zum Lysat. Anschließend 10 sek vortexen und für weitere 10 min bei 70 C inkubieren. 4. Ansatz abzentrifugieren bei rpm ( g) für 5 min. Den Überstand (enthält die DNA) vorsichtig in ein neues Tube überführen (Pellet verwerfen). 5. Zugabe von 200 µl Ethanol zur DNA Lösung, anschließend 10 sek vortexen. 6. Zentrifugationssäulchen in ein vorbereitetes 2ml Sammeltube setzten. Zugabe von 600 µl flüssiger Probe auf das Säulchen, Abzentrifugation bei rpm (ca g) für 1 Minute. 7. Durchfluss verwerfen. Säulchen zurück auf dasselbe Sammeltube setzen. (Helfen Sie mit Abfall zu vermeiden und benutzen Sie dasselbe Röhrchen erneut). 8

9 Food DNA Extraktions Kit 8. Zugabe von 500 µl Waschpuffer UHJ (vor Gebrauch Isopropanol zum Puffer geben!) auf die Säule. Zentrifugation bei rpm (ca g) für 1 Minute. 9. Durchfluss verwerfen. Sammeltube setzen. Säulchen zurück auf dasselbe 10. Zugabe von 500 µl Waschpuffer DU (vor Gebrauch Ethanol zum Puffer geben) auf die Säule. Zentrifugation bei rpm (ca g) für 1 Minute. Durchfluss verwerfen Säule zurück auf dasselbe Sammeltube setzen. 11. Entfernung des verbliebenen Waschpuffers durch Zentifugation ( g, 1 Minute). Waschpufferreste auf der Säule können die DNA Ausbeute verringern. 12. Säule auf ein 1,5 ml Tube setzen (nicht im Kit enthalten). Erhitzen der Säule mit dem Tube auf 70 C für 5 Minuten um einen möglichen Rest-Alkohol auf der Säule zu entfernen. Zugabe von µl Elutionspuffer FM (vorgewärmt auf 70 C) auf die Säule; Inkubation bei Raumtemperatur für 2 Minuten. Zentrifugation bei rpm (ca g) für 1 Minute. (Dann Eluat bei offenen Deckel für 5 Minuten bei 70 C inkubieren um den Rest-Alkohol zu eliminieren). Das Eluat mit der gewonnenen DNA kann direkt in Folgeanwendungen (Gelelektrophorese, PCR etc.) verwendet werden. Die vollständige Entfernung des Rest-Alkoholes ist sehr wichtig, bitte Beachten Sie hierzu die Schritte 11, 12 und

10 Übersicht der DNA Extraktion Lyse 200 µl Probe µl UDC Lysepuffer + 20 µl Proteinase K, vortexen Inkubation bei 55 C für 60 Minuten µl Bindepuffer UHQ, 10 Minuten, 70 C Rückstände entfernen Zentrifugation: g, 5 Minuten Bindung der DNA an die Säule Klarer Überstand µl Ethanol, vortexen Säule Beladen ( µl) Zentrifugation: g, 1 Minute Waschschritte, Zugabe auf die Säule 1.: 500 µl Waschpuffer UHJ 2.: 500 µl Waschpuffer DU Filtrat verwerfen Zentrifugation: g, 1 Minute (für jeden Waschschritt) Säule trocknen /Alkohol entfernen: Zentrifugation g, 1 Minute Elution Vor der Elution: Säule trocknen bei 70 C für 2-5 Minuten! Elution mit Elutionspuffer FM (vorgeheizt auf 70 C). Inkubation der Säule bei RT für 5 Minuten Elution: Zentrifugation: g, 1 Minute Eluat mit DNA. Erhitzen des Eluates; 70 C für 5 Minuten mit offenen Deckel (Entfernung des Rest Alkohols) 10

11 Troubleshooting Problem Mögliche Ursachen Anmerkungen/Lösungsvorschläge Niedrige Ausbeute DNA smear Niedrige DNA perfor- Mance Ungenügende Lyse Lysepuffer UDC nicht zugegeben Bindepuffer UHQ nicht zugegeben Nuclease Aktivität/ Kontamination Salz im Eluat Aktivität der Proteinase K überprüfen. Sicherstellen, dass der Lysepuffer UDC zugegeben und mit dem Lysat vermischt wurde. Sicherstellen, dass der Lysepuffer UHQ zugegeben und mit dem Lysat vermischt wurde. Nach dem Aufschluss der Proben können zelluläre Nukleasen freigesetzt werden und zum Abbau genomischer DNA führen. Wenn möglich immer frische Proben verwenden und sofort verarbeiten. Nur sterilisierte Glas und Plastik Materialien verwenden um die Kontamination mit Nukleasen zu vermeiden. Sicherstellen, dass alle Waschschritte erfolgt sind. 11

12 Technische Daten Versand: Qualitätskontrolle: bei Raumtemperatur Die Leistung des Food DNA Extraktions Kit wird routinemäßig auf einer Lot-zu-Lot Basis überprüft Sicherheitshinweis Dieses Produkt sollte nur von Personen verwendet werden, die Routine in Laboranwendungen haben. Es sollte laborübliche Schutzkleidung wie Kittel, Handschuhe und Schutzbrillen getragen werden. Bei Kontakt mit Haut und Augen sollten die betroffenen Stellen umgehend mit Wasser gewaschen bzw. ausgespült werden. Nur für die Forschung! Wir sind für Sie da! Bei Fragen zu diesem Kit oder anderen Produkten von freuen wir uns über eine an: bietet kostengünstige, innovative und zuverlässige Produkte an. Besuchen Sie uns auf Wir sind die Guten. 12