laborwelt Laborautomation Marktübersicht: DNA-Synthese Nr. 6 / Jahrgang Großer Sonderteil: Medizintechnik und Laboratoriumsmedizin

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1 laborwelt Nr. 6 / Jahrgang Laborautomation Metabolom-Analyse von Industrie-Mikroorganismen im Hochdurchsatz Automatisierte Optimierung von Zellkultur-Parametern und Produktionsstämmen Großer Sonderteil: Medizintechnik und Laboratoriumsmedizin Marktübersicht: DNA-Synthese

2 Genome Sequencer FLX System Introducing the GS FLX Titanium Reagents Length Really Matters Mapped Reads Modal read length Length (base pairs) Example Read Length Distribution of 629,643 reads from E. coli K-12 (Genome size ~4.5 Mb) with a modal read length of 504 bases. Obtain sequencing read lengths of 400 to 500 bases. Generate more than 1 million sequencing reads per 10-hour instrument run. Improve performance by using GS FLX Titanium series reagents without instrument upgrades. Accelerate the pace of discovery with easy-to-use analysis tools for straightforward interpretation of data and biologically meaningful results. Performance, Results, Impact Learn more at For life science research only. Not for use in diagnostic procedures. 454, 454 LIFE SCIENCES, 454 SEQUENCING, GENOME SEQUENCER, and GS FLX TITANIUM are trademarks of Roche. Other brands or product names are trademarks of their respective holders Roche Diagnostics GmbH. All rights reserved. Roche Diagnostics GmbH Roche Applied Science Mannheim, Germany

3 Editorial Inhalt Laborautomation greift um sich Neue Methoden treiben seit jeher den Fortschritt in Biowissenschaften und Biomedizin voran. Zunehmend durchdringen automatisierte und parallelisierte Verfahren die Life Sciences. Einen regelrechten Wettstreit um größere Leseweiten und einen immer höheren Datendurchsatz pro Lauf liefern sich derzeit die fünf Anbieter der ultraschnellen Next-Generation-Sequenzer. Mit der Geschwindigkeit der Sequenziermaschinen wächst auch die auswertbare Datenmenge an DNA-Sequenzen, DNA- Strukturvarianten beziehungsweise SNPs, DNA-Methylierungsmustern und neuerdings auch Transkriptionsprofilen. Dies lässt auf ein besseres Verständnis biologischer Vorgänge hoffen. Als Voraussetzung für die schnelle Auwertung der Sequenzierläufe erweisen sich immer mehr fortgeschrittene Methoden der Bioinformatik (vgl. S. 4). Auch in anderen Gebieten bewegt sich etwas hinsichtlich der Automation von Methoden, so etwa beim hochparallelen Durchmustern von Metabolitmustern, die bestimmte Zellzustände kennzeichnen (vgl. S. 21). Klinischen Laboratorien und Forschern stehen darüber hinaus seit kurzem kostengünstige, CE-zertifizierte Automaten (z.b. Maxwell-16, Promega GmbH) zur Verfügung, um DNA-, RNA- oder Proteine aufzureinigen. Zudem können die Bedingungen für die individuelle Zellkultivierung neuerdings im 96 Well-Format erprobt werden (vgl. S. 8). Erstmals in dieser Ausgabe haben wir ein Spezialthema in LABORWELT integriert, um die wachsende Bedeutung angrenzender Disziplinen für die Biowissenschaften zu dokumentieren. Das Heft im Heft zum aufstrebenden Thema Medizintechnik und Laboratoriumsmedizin beginnt auf der Seite 35. Zugleich freuen wir uns, rund neue LABORWELT- Leser begrüßen zu dürfen. Durch den Beitritt der Deutschen Vereinten Gesellschaft für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin (DGKL) erweitert LABORWELT seine Leserschaft aus der Medizin. Wir begrüßen die neuen Mitglieder und freuen uns über Ihre Hinweise auf neue medizinisch relevante Methoden. Eine interessante Lektüre wünscht Thomas Gabrielczyk In diesem Heft Inhalt Blitzlicht Next-Generation-Sequencing 4 Next-Generation-Bioinformatik Dr. Kerstin Stangier et al., GATC Biotech AG, Konstanz Blitzlicht Fermentation/Zellkultur 8 Quantitative Mikrofermentation zur Stamm- und Medien-Optimierung Dr. Frank Kensy, m2p-labs GmbH, Aachen; Dr. Claudia Hüther, DASGIP AG, Jülich Titel: Laborautomation Mitarbeiter im Bereich des High Throughput-Screenings bei der Bestückung eines HT-Multifunktionsreaders im Roboter-/ Messraum der Bayer Schering Pharma AG, Berlin Foto: Bayer Healthcare AG Blitzlicht DNA-Rekombination 11 Schnelle und effiziente Gen-Editierung Dr. Rainer Ebel, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen Blitzlicht Sequenzier-Dienstleistungen 14 Neue Services dank Next-Generation Sequencing Dr. Steffen Krüger, AGOWA genomics, Berlin Blitzlicht Resequenzierung 16 Schneller von der Probe zur Sequenz Dr. Beate Rätz, Applied Biosystems Deutschland GmbH, Darmstadt Wissenschaft Massenspektrometrie 21 Hochdurchsatz-Metabolom-Analyse von Mikroorganismen Dipl.-Ing. Jana Spura, Prof. Dr. Dietmar Schomburg, Technische Universität Braunschweig Blitzlicht Synthetische Biologie 25 Neue Entwicklung: Gensynthese im Hochdurchsatz Prof. Dr. Ralf Wagner et al., GeneArt AG, Regensburg Blitzlicht Screening 27 Automatisierung von High Content-Zytokin-Screenings Jens Hamann, Dr. Hans-Peter Steffen, Perkin Elmer LAS (Germany) GmbH; Dr. David Bourdon et al., Perkin Elmer Life and Analytical Sciences Services, Downers Grove; Sheetal Patel et al., Invitrogen Corp., Camarillo, USA Service Marktübersicht 31 DNA- und Gensynthese-Dienstleistungen Sonderteil Inhaltsverzeichnis 35 Medizintechnik und Laboratoriumsmedizin 59 Produktwelt Sonderteil Marktübersicht: DNA- und Gensynthese Fortschritte bei der Gensynthese und dem Einbau der hergestellten DNA-Moleküle in das Genom von Mikroorganismen haben zu einer steigenden Nachfrage nach künstlich optimierten Genen geführt. Neben den Anbietern von Oligonukleotiden rücken damit neue Fimen auf, die das Feld der synthetischen Biologie vorantreiben. LABORWELT gibt einen Überblick über ausgewählte Dienstleister (Seite 31). 60 Stellenmarkt 66 Verbände 67 Produktwelt 69 Termine 70 Ausblick 70 Impressum LABORWELT 9. Jahrgang Nr. 6/2008 3

4 Blitzlicht DNA-Sequenzierung Next Generation- Bioinformatik Dr. Kerstin A. Stangier, Dr. Yadhu Kumar, GATC Biotech AG, Konstanz Heute ist es keine Herausforderung mehr, mit Sequenziergeräten der neuesten Generation sogenannten Next Generation-Sequenzern Sequenzrohdaten im Gigabasen-Bereich in wenigen Tagen zu generieren. In den letzten Jahren ist die Leistungsfähigkeit dieser Geräte regelrecht explodiert. Während ein klassisches, auf der Sanger-Technologie basierendes System im Durchschnitt täglich eine Megabase produziert, schafft ein Next Gen-Sequenzer mindestens 400 Megabasen pro Tag. Die Gerätehersteller entwickeln kontinuierlich neue Reagenzien, mit deren Hilfe die Leseweite erhöht und somit die Leistungsfähigkeit der Geräte weiter gesteigert wird. Die Leselänge macht den wesentlichen Unterschied zwischen den Technologien hinsichtlich der bioinformatischen Analyse aus. Sie variiert zum Beispiel bei den Short-read-Technologien von 50 bis 100 bp (Illumina Genome Analyzer II, Applied Biosystems SOLiD System), über rund 250 bp oder 400 bp (Roche Diagnostics GS FLX) bis zu bp der klassischen Sanger-Technologien (z.b. Applied Biosystems 3730xL). Aufgabe der Bioinformatik ist es, effiziente Methoden zur Auswertung dieser gigantischen Datenmengen und heterogenen Datentypen anzubieten. Dennoch hinkt die Entwicklung der Bioinformatik dem rasanten Fortschritt der Sequenziertechnologien noch hinterher. Es stellen sich viele Fragen, wie etwa: Welche verfügbaren Software-Tools können die Datenmengen verarbeiten und analysieren? Wie ist die Qualität der Analysen einzustufen? Ist es sinnvoll, Rohdaten für zukünftige Forschung zu speichern? Die derzeit von den Geräteherstellern mitgelieferten Software-Tools bieten noch keine optimale Lösung für alle Anwendungen. Dies trifft ganz besonders für Analysesoftware von Short Reads sowie bei Hybrid-Projekten zu, bei denen mehrere Technologien kombiniert werden. Zudem macht die Weiterentwicklung der Applikationsprotokolle (z.b. Paired-End- Analysen) eine kontinuierliche Anpassung und Verbesserung der verwendeten Algorithmen notwendig. Daher hat der Sequenzierdienstleister GATC Biotech aus Konstanz Anwender der Technologien von Roche, Illumina und Applied Biosystems mit einer jährlichen Kapazität von mehr als einer Tera-Base einige auf dem Markt verfügbare Analysetools getestet. Dabei ging GATC unter anderem insbesondere der Frage nach, ob die Ergebnisse einfach in andere Programme übertragen und benutzerfreundlich für Visualisierungen aufbereitet werden können. Assemblierung und Alignment Bei der Assemblierung werden die Daten komplett neu zu einer möglichst langen Sequenz zusammengesetzt. Alignments/Mappings Abb. 1: Grafische Darstellung der Contig-Verteilung einer de novo-assemblierung. Je größer der Kreis, desto größer das Contig. Es handelt sich um die Genomsequenz eines Bakteriums, sequenziert mit dem Roche GS FLX. basieren auf einer Referenzsequenz. Zunächst erscheint dies einfacher als eine de novo-assemblierung. Mapping ist wie das Zusammensetzen eines Puzzles, wobei sich einige Puzzle-Teile (reads) jedoch extrem ähnlich sind (Repeats). Ein Teil stimmt mit der Referenzsequenz überein, andere Abschnitte sind unterschiedlich aufgebaut (strukturelle Variationen, Segment-Duplikationen), oder Stücke des re-sequenzierten Genoms sind völlig neu (z.b. Insertionen). Reads aus repetitiven Strukturen sind in beiden Fällen kompliziert zu verarbeiten; einige bioinformatische Tools ordnen diese zufällig an den passenden Stellen an, andere sortieren sie ganz aus. Daher muss die eingesetzte Software abhängig vom jeweiligen Projekt sorgfältig ausgewählt oder sogar mehrere Tools nacheinander für eine sequentielle Analyse kritischer Bereiche in einer Pipeline zur Verfügung gestellt werden.eine weitere Herausforderung stellt die Analyse von Paired-End-Reads dar. Da die Protokolle für die Erstellung von Banken mit großen Inserts immer besser werden, kann mit der Kombination von Libraries unterschiedlicher Insertgrößen die Problematik repetitiver Strukturen überwunden werden. Assemblierung SeqMan NGen von DNASTAR kann auf einem Desktop-Computer Next Gen-Sequenzdaten von Illumina und Roche sowie Daten klassischer Sanger-Sequenzer miteinander assemblieren. Eine Schnittstelle zu SeqMan Pro in der DNASTAR Lasergene Suite erlaubt eine Visualisierung und weitere Analyse. Datenfiles aus SeqMan NGen können in SeqMan Pro importiert werden, um etwa Dual-End-Sequenzdaten darzustellen. Der Benutzer kann Basen editieren, Qualitätswerte anschauen sowie SNPs detektieren und filtern. Der mit dem Next Gen-System mitgelieferte GS De Novo Assembler (Newbler Assembler) von Roche/454 Life Science verarbeitet sowohl Single- als auch Paired-End-Reads. Auch Hybrid- Assemblies aus GS FLX-Daten und Sanger-Daten können generiert werden. Für den Export stehen verschiedene File-Formate zur Verfügung. MIRA (Mimicking Intelligent Read Assembly) 1 eignet sich besonders für die Verarbeitung von Genomen mit vielen repetitiven Sequenzen. Die derzeit verfügbare Version kann GS FLX-Reads und Sanger-Reads aus de novo-genomprojekten assemblieren. Velvet 2 ist eine vom European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI, Cambridge, UK) entwickelte Software zur de novo-assemblierung von sehr kurzen Next Gen-Rohdaten, auch in Kombination mit GS FLX-Daten. Um Repeats aufzulösen und Contigs zu orientieren, können Paired- End-Reads und Sequenzen aus der klassischen Sanger-Sequenzierung eingelesen werden. Edena (Exact De Novo Assembler) 3 ist ähnlich zu Velvet, kann derzeit aber keine Paired-End- Assemblies verarbeiten Jahrgang Nr. 6/2008 LABORWELT

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6 Blitzlicht DNA-Sequenzierung Bei Tests mit Datensätzen verschiedener Technologien oder deren Kombination und bei unterschiedlichen Organismengrößen zeigte sich, dass keines der Tools für alle Anwendungen das beste Ergebnis erzielt. Alignment / Mapping Einige der genannten Tools, z.b. SeqMan NGen, können für de novo-assemblierungen sowie Alignments eingesetzt werden. Neben SeqMan NGen und der Roche Diagnostics GS Reference Mapper-Software stehen auch für Alignments eine Reihe von Freeware-Tools zur Verfügung: ELAND (Efficient Large-Scale Alignment of Nucleotide Databases) sucht in einer Referenzsequenz identische Bereiche zu kurzen DNA-Reads und erlaubt dabei bis zu zwei Abweichungen innerhalb von 32 bp. Insertionen und Deletionen (InDels) werden nicht abgedeckt, da die Software in den gemappten Reads an solchen Stellen keine Lücken einfügt. Mosaik (von Michael Stromberg, Boston University) verarbeitet eine große Bandbreite unterschiedlicher Readlängen und kann über InDel-Bereiche mappen, aber keine Paired-end- Informationen nutzen. Maq ( ZOOM (Zillions of Oligos Mapped) 4 sowie SOAP (Short Oligonucleotide Alignment Program) 5 sind speziell für das Mapping von Short Reads konzipiert und können mit Insertionen und Deletionen umgehen. Auch hier ergab die genaue Betrachtung, dass sich lediglich Tendenzen erkennen lassen, nicht aber eine Software der Problemlöser schlechthin ist. Je nach Organismus, Homologie zur Referenzsequenz und anderen beeinflussenden Parametern muss das eingesetzte Tool zur Analyse mit Bedacht gewählt werden. Neben den beiden häufigsten Anwendungen, der Assemblierung und dem Alignment, sind teilweise nachgelagerte Analysen erforderlich, wie zum Beispiel BLAST und Annotation. Die Daten müssen nicht nur kompatibel, sondern auch transferierbar sein. Abb. 2: Grafische Darstellung mittels unterschiedlicher Schriftgrößen und -farben von SAGE- Tags (Serial Analysis of Gene Expression) eines Transkriptom-Experiments. Je größer die Schrift, umso häufiger wird das SAGE-Tag im Sample exprimiert. Unterschiedliche Farben repräsentieren unterschiedliche Tags. Die Sequenz stammt vom Mausgenom, sequenziert mit dem Illumina Genome Analyzer II. Datentransfer Die ursprünglichen Rohdaten, die die Next Generation-Sequenzer als Ergebnis generieren, sind Bilddateien mit riesigem Datenvolumen. Diese Dateien werden direkt in den Systemen zu Qualitäts- und Sequenzdaten verarbeitet. Aufgrund der extrem hohen Readzahl erreichen auch diese Files immer noch eine gewisse Größe. Zur weiterführenden Analyse müssen die Daten auf andere Computer transferiert werden, was dank der Entwicklung von Glasfaser-Kabel, High Speed-Internet und immer preiswerteren Datenspeichern mit sehr hoher Kapazität im Giga- und Tera-Bereich relativ einfach ist. Datenspeicherung Obwohl Datenspeicher heutzutage erschwinglich sind, stellt sich die Frage, wie sinnvoll eine Speicherung von Sequenzrohdaten ist. Es gibt noch keinen allgemeingültigen Standard für Datenformate von Next Gen-Sequenzdaten, obwohl Initiativen wie das SRF-Projekt ( sourceforge.net) versuchen, einheitliche Formate zu definieren und durchzusetzen. Auch gibt es keine Normen für analysierte Daten wie z.b. SNPs, InDels und Annotationen. Die Sequenziertechnologien und deren Leistungsfähigkeit, Kapazität und Anwendungsprotokolle entwickeln sich rasant weiter; damit werden die Sequenzierkosten weiter sinken. Daher kann es sogar preiswerter sein, Sequenzierprojekte zu wiederholen als Rohdaten vergangener Projekte zu speichern. Fazit Das Ziel eines Projekts und bereits vorhandene Sequenzdaten bestimmen nicht nur die Auswahl der Sequenziertechnologie oder Kombination zweier oder mehrerer Technologien, sondern sie diktieren auch den effizienten Einsatz der bioinformatischen Software. Daher ist zusätzlich zur detaillierten Fachkenntnis von Stärken und Einschränkungen der unterschiedlichen Next Generation-Sequenziertechnologien auch das Wissen um die zur Verfügung stehenden Analysetools der entscheidende kosten- und zeitsparende Faktor für die erfolgreiche Durchführung eines Projekts. Literatur [1] Chevreux, B., Wetter, T. and Suhai, S. (1999). Proceedings of the German Conference on Bioinformatics (GCB) 99, pp [2] D.R. Zerbino and E. Birney. Genome Research 18: [3] D. Hernandez, P. François, L. Farinelli, M. Osteras, and J. Schrenzel. Genome Research. 18: , [4] Hao Lin, Zefeng Zhang, Michael Q Zhang, Bin Ma, Ming Li, Bioinformatics (6 August 2008), btn416. [5] Ruiqiang Li, Yingrui Li, Karsten Kristiansen and Jun Wang BIOINFORMATICS APPLICATIONS NOTE Vol. 24 no , pages Kontakt Abb. 3: Vergleich einer de novo-assemblierung eines Bakteriengenoms, generiert mittels einer Technologie (Roche GS FLX, blau) bzw. mit kombinierten Technologien (Hybrid- Strategie mit Roche GS FLX und Illumina GA II, rot). GATC Biotech AG Dr. Kerstin A. Stangier k.stangier@gatc-biotech.com www. gatc-biotech.com 6 9. Jahrgang Nr. 6/2008 LABORWELT

7 Genome Sequencer FLX System Introducing the Titanium Series 1billion bases in less than 24 hours Long reads: More information & less downstream costs Obtain sequencing read lenghts of 400 to 500 bases. Generate more than 1 million sequencing reads per 10-hour instrument run. Improve performance by using GS FLX Titanum reagents without instruments upgrades. Perform more applications with longer sequencing reads. Learn more at For life science research only. Not for use in diagnostic procedures. 454, 454 LIFE SCIENCES, and 454 SEQUENCING are trademarks of 454 Life Sciences Corporation, Branford, CT, USA, a Roche company. GS FLX TITANIUM is a trademark of Roche Roche Diagnostics. All rights reserved. Roche Diagnostics GmbH Roche Applied Science Mannheim, Germany

8 Blitzlicht Fermentation/Zellkultur Quantitative Mikro- Fermentation zur Stammund Medien-Optimierung Frank Kensy, m2p-labs GmbH, Aachen; Claudia M. Hüther, DASGIP AG, Jülich Die umfassende und zunehmende biotechnologische Nutzung mikrobieller Prozesse führt zu immer größerer Komplexität. Dies erfordert es, Fermentationen besser und effizienter zu analysieren und zu optimieren. Die gezielte Charakterisierung unterschiedlicher Organismen, Stämme oder Klone sowie die Wahl der optimalen Medienkomponenten und Prozessparameter stellen eine große Herausforderung hinsichtlich des Probendurchsatzes dar. Um die Vielzahl der hierzu notwendigen Analysen zu prozessieren, bedarf es eines großen Probendurchsatzes (engl. High Throughput Screening, HTS). HTS-Ansätze lassen sich heute mit den in der Biotechnologie bereits als Standard etablierten Mikrotiterplatten bewältigen. Dabei ist es wünschenswert, bereits in diesem Kleinstmaßstab möglichst viele aussagekräftige Informationen aus den Fermentationsansätzen zu ziehen. Um einen Einblick in die zellulären Prozesse der jeweiligen Kultur zu erhalten, sollten zudem möglichst umfangreich physiologische Daten erfasst werden. Eine einfache und effiziente Lösung hierfür stellt das Mikrofermentationssystem BioLector dar, das hier vorgestellt wird. Abb. 1: BioLector (links) und Flowerplate (rechts) für die quantitative Mikrofermentation Das Mikrofermentationssystem ermöglicht die online-messung aller wesentlichen Fermentationsparameter, wie dem ph-wert und Gelöst-Sauerstoff (po 2 ), aber auch der Biomasse sowie der Konzentration an fluoreszenzmarkierten Proteinen, im Kleinstmaßstab. Auf einfache Weise können somit multiple physiologische Daten automatisch aus jedem Well einer Mikrotiterplat te ausgelesen werden. Rationale Entscheidungen können auf Basis einer quantitativen Mikrofermentation getroffen werden. Vorgestellt wird hier die Untersuchung des ph-wert-optimums für das Wachstum und die Proteinexpression bei der Hefe Hansenula polymorpha. In der biotechnologischen Forschung und bei der Produktion rekombinanter Proteine für pharmazeutische, chemische oder medizinische Anwendungen stellt die Selektion geeigneter Organismen oder Stämme sowie die Medienentwicklung eine der Zeit- und Ressourcen-intensivsten Arbeiten dar. Meist muss eine große Anzahl an Klonen und Medienkomponenten getestet werden, bevor ein optimaler Prozess etabliert werden kann. Die Größenordnung paralleler Screening- Ansätze kann dabei weniger als 50 bis hin zu mehreren Tausend Analysen betragen. Als geeignete Werkzeuge zur Handhabung derartiger Durchsätze haben sich Mikrotiterplatten in der Biotechnologie durchgesetzt. Die Bandbreite der kommerziell angebotenen Formate reicht dabei von 6 Wells pro Platte über 12-, 24-, 48-, 96- und 384- bis zu Well-Formaten. Zur Zellkultivierung im Kleinstmaßstab haben sich insbesondere 24- bis 96 Well-Formate mit Volumina von 100 µl bis 2 ml durchgesetzt, da hierbei für detaillierte Untersuchungen die Probennahme mit Mindest-Analytmengen von 10 µl bis 1 ml möglich ist. Die standardmäßige Verwendung von Mikrotiterplatten (MTP) in sogenannten MTP-Lesegeräten hat jedoch den Nachteil, dass sie meist nur Endpunkt-Analysen zulässt und keinerlei Einblick in die Kinetiken der Kultur gewährt. Häufig werden Mikrotiterplattenansätze empirisch betrieben, die Entnahme von Proben, die Bestimmung relevanter Kulturparameter, wie beispielweise dem ph-wert oder der optischen Dichte, aber auch der Abbruch der Fermentation, richtet sich meist nach einem gleichbleibenden Protokoll. Wertvolle Informationen und Kulturzustände können hierbei verlorengehen, und viele Versuchsergebnisse werden in der Folge falsch interpretiert. Kleinste Änderungen innerhalb eines Kultivierungsprozesses können teilweise erheblichen Einfluss auf das Resultat der Fermentation haben. Die ph-wert-entwicklung oder der Status der Substratversorgung nehmen beispielsweise direkten Einfluss auf das Wachstum einer Kultur. Steigende proteo lytische Aktivität nach Erreichen der stationären Phase kann zum sukzessiven Abbau von gebildeten Produkten wie beispielsweise Enzymen oder pharmazeutischen Proteinen führen 1. Um Fehldeutungen während eines Screenings vorzubeugen, ist es ratsam, bereits im Kleinstmaßstab geeignete online-monitoring-techniken einzusetzen, die den physiologischen Zellzustand lückenlos überwachen. Messmethodik Eine derartige Technologie stellt der BioLector dar 2. Dieses Mikrofermentationssystem bietet die Möglichkeit zur online-erfassung der Biomasse-Entwicklung, der Synthese fluoreszenzmarkierter Proteine, des ph-wertes und/oder des gelösten Sauerstoffs (po 2 ) während des gesamten Kulturverlaufs. Die vollständigen Fermentationsparameter können aus 24-, 48- und 96-Well-Mikrotiterplatten während des kontinuierlichen Schüttelvorgangs in Echtzeit detektiert werden. Das kontinuierliche Schütteln ( Upm) gewährleistet dabei die andauernde Durchmischung und Gas-Versorgung der Zellen mit O 2, CO 2 oder anderen zugeleiteten Gasen und vermeidet Artefakte durch Unterbrechungen des Schüttelvorgangs und damit auch der Gas-Versorgung der Zellen. Die Inkubationskammer des BioLectors bietet eine Temperatur- und Feuchte-Regelung im Bereich von 20 C bis 50 C und mehr als 75% relative Feuchte. Als Biomassesignal wird Streulicht der Zellen detektiert. Proteinkonzentrationen können über fluoreszierende Reporterproteine (z.b. GFP) in Fusion mit dem Targetprotein bestimmt werden 3. Die Akkumulation rekombinanter Proteine kann somit direkt mit der Biomasse in Korrelation gesetzt werden. Zeitgleich können ph- und po 2 -Werte über Fluoreszenzfarbstoffe, die am Boden der Mikrotiterplatten immobilisiert sind, ausgelesen werden (Abbildung 1). Da Standard-Mikrotiterplatten häufig stark in ihren Stofftransfer-Eigenschaften eingeschränkt sind 4, wurde zudem eine neue blumenförmige Mikrotiterplatte auf 48-Well- Basis mit stark verbesserten Stofftransfer- Eigenschaften entwickelt. Die sogenannte Flowerplate erzielt kla-werte von mehr als /h, was einen unlimitierten Sauerstoff- Transfer in die Kultur gewährleistet. Nur so 8 9. Jahrgang Nr. 6/2008 LABORWELT

9 lassen sich in der Mikrofermentation vergleichbare Bedingungen wie in Labor- und Produktionsfermentern erzielen. Anwendungen Die BioLector-Technologie findet überall dort Verwendung, wo Wachstum und Protein-Expression charakterisiert werden müssen. Als Hauptanwendungsbereiche lassen nennen: I das Stamm-, Klonscreening I das Medienscreening I die Optimierung von Fermentationspara metern I die Qualitätskontrolle (Zellaktivität, Medienqualität) I die Charakterisierung von Genen und regulatorischer Elemente in der Grundlagenforschung (Systembiologie). Äquivalent zu dem klassischen Schüttelkolben mit Stopfen werden hierbei Mikrotiterplatten mit gasdurchlässigen Abdeckmembranen verwendet. Nachdem die Platte manuell mit handelsüblichen Multichannel-Pipetten oder durch Liquid-Handling-Systeme mit Medium befüllt wurde, kann sie direkt mit dem Inokulum beimpft werden. Zum Gewährleisten der Sterilität wird die Platte anschließend mit einer Abdeckmembran versiegelt. Nach dem Einsetzen in den BioLector kann die Versuchsreihe direkt gestartet werden. In der hier beschriebenen Untersuchung wurde die Technologie zur Optimierung der Protein-Expression in der Hefe Hansenula polymorpha angewandt. Beim Screening unterschiedlicher synthetischer Medien stellte sich der ph-wert als wesentliche Einflussgröße heraus. Es konnte gezeigt werden, dass der initiale ph-wert der Hefekulturen direkten Einfluss auf die Wachstumsraten hatte (Abbildung 3). Je höher der ph-wert beim Start der Fermentation war, desto langsamer wuchsen die Kulturen. Diese Beobachtung ließ sich auch an den Verläufen der online-ph- und -po 2 -Werte nachvollziehen. Je langsamer die Kultur wuchs, desto niedriger war die Sauerstoffzehrung, und desto weniger wurde der po 2 -Wert abgereichert. Zudem ließ sich am Abfallen des ph-wertes die Zellaktivität nachvollziehen, wobei auch die Puffer- Kapazität des verwendeten Phosphat-Puffers (100 mm) Einfluss nahm. Mit einem pks-wert von 7,2 liegt das Puffer-Vermögen oberhalb von ph 7. Kleinere ph-werte (<7) werden nicht so stark abgepuffert, was sich auch in den durchgeführten Versuchen durch einen ph-abfall von bis zu einer ganzen ph-einheit ausdrückte. Mit diesem Versuchsansatz konnte das ph-optimum für die Protein-Expression eines rekombinanten Proteins in Hansenula polymorpha durch gezielten Puffereinsatz in wenigen Versuchen und ohne aktive ph-regelung ermittelt werden (Daten nicht dargestellt). Durch die reproduzierbare, quantitative Mikrofermentation im BioLector lassen sich bereits im Mikromaßstab unterschiedliche Organismen, Stämme oder Klone bezüglich Ihrer Wachstumskinetik, der Proteinbildungskinetik, dem Ansäuerungsverhalten und der Sauerstoffzehrung untersuchen. Im gleichen Maße ist der BioLector auch für die detaillierte Untersuchung unterschiedlicher Medien einsetzbar. Quantitative Aussagen zu Ausbeuten auf verschiedenen Substraten lassen sich mit geringem Zeitaufwand ableiten. Insbesondere für Hochdurchsatz-Analysen, bei denen wichtige, physiologische Parameter mitverfolgt werden sollen, eignet sich der BioLector und ermöglicht es, klare Schlüsse aus den hochparallelen Ansätzen zu ziehen. Automation und Daten-Analyse Der neue Tecan MultiChannel Arm 384 für die ultimative Automations-Kontrolle Ein neuer 384-Kanal Pipettierarm für Tecan s Freedom EVO Plattform verbessert Ihre Produktivität: Der automatische Wechsel zwischen 384- und 96-Kanal Pipettierköpfen ermöglicht Ihnen das Arbeiten mit gemischten Plattenformaten bis zu 1536 Wells, ohne dass manuelle Eingriffe notwendig sind. Pipettieren mit 8 oder 12 Einmal-Spitzen in Reihen oder Spalten für Serien- Verdünnungen oder Probenzugabe ohne Armwechsel. Großer Volumenbereich von 0.5 µl bis zu 125 µl pro Kanal. Kostenoptimiertes Pipettieren durch die Möglichkeit des automatischen Austauschs von Pipettierköpfen mit waschbaren, Teflon beschichteten Stahl-Spitzen oder für Tecan s hochwertige Einmal-Spitzen während der laufenden Anwendung. Das in den 384-Kanal Pipettierarm integrierte Greifmodul kann um 360 Grad rotieren und sich so an die Gegebenheiten des Worktables anpassen. Der Greifer kann sogar die Deckel der Platten während des Pipettierens halten und so ein schnelles Wiederverschließen ermöglichen - dadurch wird das Risiko einer Kontamination der Proben minimiert und der Durchsatz erhöht. More reasons to Talk to Tecan In vielen Laboren ist es heute üblich, hochparallele Ansätze mit Pipettierrobotern oder Liquid-Handling-Systemen durchzuführen. Diese lassen die Kombination vieler verschiedener Ansätze zu und können in Verbindung mit einem Fluoreszenz-Lesegerät auch gut die Endpunkt-Analytik eines Assays liefern. Die Kombination des BioLectors mit einem Pipettierroboter hat großes Potential. Bei der Evaluierung synthetischer Medien müssen beispielsweise bis zu Liquid Handling & Robotics Detection Sample Management Components Services & Consumables DE info.de@tecan.com LABORWELT 9. Jahrgang Nr. 6/ Scientific instrumentation. Not for use in human clinical or diagnostic procedures 2008 Tecan Trading AG, Switzerland, all rights reserved.

10 Blitzlicht Fermentation/Zellkultur Abb 2: Automatisierung und schnelle Daten-Analyse mit BioLection-Software (oben: Integration in Multiprobe IIex von Perkin Elmer; unten: Darstellung der BioLection TOP20-Funktion mit den 20 höchsten spez. maximalen Wachstumsraten aus einem Screening unterschiedlicher Hefe-Stämme) 50 Medienkomponenten zur Optimierung des Zellwachstums oder der Proteinbildung variiert, rekombiniert und untersucht werden. Ein Robotersystem gewährt dabei eine wesentlich höhere Reproduzierbarkeit und eine geringere Fehlerhäufigkeit als manuelle Verfahren. Nur so lassen sich systematisch Medienkomponenten variieren und analysieren. Des Weiteren können auch ganze Versuchspläne aus Design of Experiment (DOE) direkt im Pipettier roboter hinterlegt und automatisch durchgeführt werden. Mit dem integrierbaren BioLector können dann Biomasse- und Produktausbeuten quantitativ bestimmt und in das DOE einbezogen werden. Die automatische Probenentnahme durch den Pipettierroboter lässt sich während der laufenden Mikrofermentation Abb. 3: Fermentationsmonitoring im 500 µl- Maßstab zur Beurteilung synthetischer Medien mit unterschiedlichen Anfangs-pH-Werten (5,8-7,4) nach einem zeitlichen Muster oder aber bei einer bestimmten Biomassekonzentration beziehungsweise Wachstumsphase programmieren. Die gleiche Prozedur ist auch für die Zugabe von frischem Substrat oder Induktoren nutzbar. So lassen sich durch einen automatisierten Prozess Belastungen von Mitarbeitern sowie ausgedehnte Arbeitszeiten drastisch reduzieren. Der Bio Lector ist durch seine Kompaktheit zu den meisten Pipettierrobotern kompatibel. Eine Integration in ein Pipettierrobotersystem wurde bereits mit zwei führenden Herstellern realisiert. Angesichts der Vielzahl online-gemessener Mess parameter (maximal 6 x 96 parallele Signale), die der BioLector zur Verfügung stellt, ist eine einfache und schnelle Auswertung besonderes wichtig. Die BioLection- Software bietet hier eine Visualisierung der Daten sowie die Auswahl herkömmlicher Beurteilungskriterien aus der Bioprozesstechnik wie beispielsweise der maximalen spezifischen Wachstumsrate, der Biomasse- Ausbeute oder der Produkt-Ausbeute (siehe Abbildung 2). Damit steht eine einfache, automatische Analyse von Versuchsergebnissen zur Verfügung. Über eine Top10/Top20-Funktion können die Daten zudem nach den besten Klonen oder Ansätzen selektiert und für die weitere automatisierte Prozessierung an den Pipettierroboter weitergeleitet werden. Ausblick Nachdem die quantitative Mikrofermentation bereits ihre Vorzüge im Bereich der mikrobiellen Systembiologie zur Aufklärung von Wachstumskinetiken und physiologischen Zuständen gezeigt hat, erobert die Technologie zunehmend die Labore der Industriellen und Roten Biotechnologie. Auch hier bieten quantitative Aussagen im Mikromaßstab entscheidende Vorteile. Mit dem Wissen der Kinetik einer Kultur lassen sich Versuche besser planen, beurteilen und zudem die Probennahme gezielt einsetzen. Viele aufwändige Fermentationen im Labormaßstab lassen sich so einsparen und Entwicklungszeiten verkürzen. Da die Technologie eine einzigartige Informationsdichte über biologische Prozesse liefert, wird sie zunehmend auch für weitere Felder der Biotechnologie interessant. Derzeit wird die Technik auf die Felder der tierischen und pflanzlichen Zellkultur sowie die anaerobe Kultivierung ausgeweitet. Literatur [1] Viaplana, E.; Rebordosa, X.; Pi ol, J. and Villaverde, A. (1997): Secretion-dependent proteolysis of recombinant proteins is associated with inhibition of cell growth in Escherichia coli. Biotechnology Letters 19(4): [2] Samorski, M.; Müller-Newen, G. and Büchs, J. (2005): Quasi-continuous combined scattered light and fluorescence measurements: A novel measurement technique for shaken microtiter plates. Biotechnol Bioeng 92(1): [3] Su, WW. (2005): Fluorescent proteins as tools to aid protein production. Microb Cell Fact 4(1):12. [4] Hermann, R.; Lehmann M. and Büchs J. (2003): Characterization of gas-liquid mass transfer phenomena in microtiter plates. Biotechnol Bioeng 81(2): Korrespondenzadresse Claudia M. Hüther DASGIP AG Rudolf-Schulten-Straße Jülich Tel.: +49-(0) c.huether@dasgip.de Frank Kensy m2p-labs GmbH Forckenbeckstr Aachen Tel.: +49-(0) kensy@m2p-labs.com Jahrgang Nr. 6/2008 LABORWELT

11 Blitzlicht DNA-Rekombination Schnelle und effiziente Geneditierung Dr. Rainer Ebel, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen Die Kenntnis der Genomsequenzen verschiedener Organismen war ein erster Schritt zum Verständnis genetischer Zusammenhänge. Genetische, biochemische, zytologische und physiologische Untersuchungen sind notwendig, um den Zusammenhang von Gensequenz und Genfunktion zu verstehen. Hierzu kommen unter anderem Methoden zum Einsatz, mit denen gezielt Gene verändert werden können, beispielsweise das komplette Ausschalten eines Gens durch Knock-out. Erste Ansätze zur genetischen Editierung nutzten radioaktive Strahlung und chemische Agenzien zur Mutagenese. Hierbei können allerdings nur weitgehend zufällig über das Genom verteilte Mutationen erzeugt werden. Moderne Methoden ermöglichen durch homologe Rekombination einer exogenen Donor-DNA mit dem Zielgen das gezielte Ändern oder Ausschalten bestimmter Gene. Jedoch erreichten diese Methoden bislang kaum die Effizienz, die für eine umfangreiche Selektion notwendig wäre. Wissenschaftler sind somit ständig auf der Suche nach neuen Techniken, um gezielte Editierungen innerhalb eines Genoms effizienter und schneller vornehmen zu können. Zinkfinger-Proteine: Werkzeuge zur gezielten DNA-Erkennung In den frühen neunziger Jahren wurde die Zinkfinger-Domäne entdeckt. Zinkfinger sind Peptide von ungefähr 30 Aminosäuren Länge, die durch ein Zink-Ion zusammengehalten werden. Sie sind eine Klasse DNA-bindender Domänen verschiedener Expressionsfaktoren. Hierbei hat jeder Zinkfinger eine definierte Triplett-Sequenz als DNA-Bindestelle. Durch gezieltes Verbinden mehrerer Zinkfinger kann somit ein großes Zinkfinger-Protein (ZFP) hergestellt werden, das eine spezifische DNA-Sequenz erkennt. So können zum Beispiel vier Zinkfinger zu einem Zinkfinger-Protein zusammengebaut werden, das selektiv eine definierte Gensequenz von 12 Basen erkennt. Zinkfinger-Nukleasen: Genspezifische Scheren Von besonderer Bedeutung war die Erkenntnis, dass ein Zinkfinger-Protein mit katalytischen Proteinen verbunden werden kann. Die katalytische Domäne kann auf diese Weise mittels spezifischer Zinkfinger-Kombinationen gezielt an definierten Loci innerhalb eines Genoms positioniert werden. Durch die Bindung eines Zinkfinger-Proteins an die katalytische Domäne der Endonuklease Fok I ist es möglich, eine gerichtete Zinkfinger-Nuklease (ZFN) herzustellen. Eine Besonderheit der Endonuklease Fok I ist, dass sie nur schneidet, wenn sie als Dimer an die doppelsträngige DNA bindet. Folglich müssen Zinkfinger-Proteine immer als Paar entworfen werden, um zu gewährleisten, dass Fok I einen Doppelstrangbruch bewirkt (Abb. 1). Der Transport der Zinkfinger-Proteine in die ZelqPCR 2009 / 9-13 th March 2009 Symposium & Industrial Exhibition & Application Workshops 4 th intern. qpcr Event, Technical University Munich, Freising-Weihenstephan, Germany The event will focus on all aspects of qpcr technology and its applications in research and diagnostics. Leading academic researchers and industrial contributors in the qpcr field will participate in the symposium, which will be an arena for fruitful discussions between researchers of different backgrounds. The Symposium, the Industrial Exhibition and associated hands-on Workshops offer an overview of the present knowledge and future developments in qpcr technology and its wide application field. It is a pleasure to announce the Nobel Prize Laureate Kary Mullis in an own session 25 th Anniversary of PCR th March International qpcr Symposium Scientific Symposium chair - MW. Pfaffl Keynote lectures: K. Mullis, SA. Bustin, K. Livak Invited speakers: M. Kubista, J. Vandesompele, G. Shipley, A. Stahlberg, B. Liss, M. Bengtsson, J. Hellemans, U. Reischl, M. Castoldi, J. Huggett th March qpcr Industrial Exhibitionwith more than 30 leading qpcr companies th March qpcr Application Workshops held by Info & event organization: martina.reiter@bioeps.com I Martina Reiter I BioEPS GmbH, Freising, Germany qpcr2009@wzw.tum.de LABORWELT 9. Jahrgang Nr. 6/

12 Cell Culture goes fully automated a) DNA-Binding Domain FokI Bi o me k Cell Wo rksta ti o n b) DNA-Cleaving Domain FokI Abb. 1: Eine Zinkfinger-Nuklease (ZFN) enthält zwei funktionelle Untereinheiten: eine DNAbindende Domäne die aus mehreren einzelnen Zinkfingern besteht (a) und eine DNAschneidende Domäne in Form der Fok I-Nuklease (b). Da Fok I nur als Dimer schneidet, müssen die ZFNs immer als Paar vorliegen. Wenn alle ZFN-Bestandteile richtig zusammengebaut werden, wird ein hoher Grad an Genspezifität erreicht. le kann hierbei als mrna oder Plasmid mittels Transfektion oder Mikroinjektion erfolgen. Zinkfinger-Nuklease-vermittelte Änderungen im Genom Process to Solution Ideal für die Expansion von Zelllinien und die Produktion von Zellen in konstanter Qualität - vollautomatische Prozesskontrolle - integriertes Datenmanagement - integrierte Zellvitalitätsbestimmung mit Vi-CELL XR - Softwaremodul zur Definition neuer Prozesse Die ZFNs bewirken in lebenden Zellen einen Bruch des DNA-Doppelstranges an einer definierten Stelle im Genom, der zwei unterschiedliche Reparaturmechanismen induzieren kann: I Nicht-homologes Endjoining (NHEJ) I Homologe Rekombination (HR). Beim nicht-homologen Endjoining werden die beiden Enden an der doppelsträngigen Bruchstelle mittels eines Enzymkomplexes wieder zusammengefügt. Dieser Komplex arbeitet jedoch nicht fehlerfrei. So können aufgrund von Nuklease-Aktivitäten Basen entfernt oder aufgrund von Polymerase-Aktivitäten zusätzliche Basen eingefügt werden. Dadurch kann es zu einer Verschiebung des Leserahmens und somit zu einer Inaktivierung des resultierenden Proteins kommen. Dieser Mechanismus wird genutzt, um gezielt ein Gen zu inaktivieren1. Die Effizienzen liegen hier je nach Spezies zwischen 1% und 20% und damit deutlich höher als bei geläufigen Methoden. FokI Zinkfinger-Proteine können auch zur gerichteten Integration eines Transgens genutzt werden, wenn sie zusammen mit einem Donor-Vektor co-transfiziert werden, der homologe Sequenzen zur Zielsequenz aufweist. Bei diesem Mechanismus wird der Bruch des DNA-Doppelstranges mittels homologer Rekombination repariert, wodurch das Transgen effektiv in den Zielort integriert wird (Abb. 2). Knock-in-Experimente konnten belegen, dass mit der Zinkfinger-Protein-vermittelten Genintegration Einbaufrequenzen von bis zu 15% erzielt werden. So wurden beispielsweise in humanen Zellen ein 12 Basenpaar-Tag sowie eine 8 kb-antikörper-expressionskassette integriert. Ohne den Einsatz von Selektionsmarkern wurden Integrationsfrequenzen von 6% erreicht2. Ob Knock-out oder Knock-in, der Prozess der Zinkfinger-Protein-vermittelten Genänderung ist so einfach wie eine Transfektion. Bereits wenige Tage nach der Transfektion sind erste Änderungen bei bis zu 20% der Zellen festzustellen. Dadurch ist ein Einsatz von Selektionsmarkern nicht erforderlich. Durch Verdünnungsreihen der Zinkfinger-Protein-behandelten Zellen lassen sich innerhalb eines Monats verschiedene neue Knock-out- oder Knock-in-Linien erhalten. Intensive Studien von Zinkfinger-Protein-Knock- a) ZFN Pair Recognizes and Heterodimerizes around Target Site b) ZFN Pair Makes Double Strand Break and dissociates from DNA FokI a) FokI FOKI FokI break b) ZFN Pair Delivered into Cell by Transfection or Electroporation c) Krefeld Europark Fichtenhain B13 Tel / Genomics Proteomics Cell Analysis Centrifugation Lab Tools 12 9.Characterization Jahrgang Nr.Bioseperation 6/2008 Particle Lab Automation c) NO REPAIR TEMPLATE co-transfected with ZFN Pair: 1-20% of cells are mis-repaired resulting in a Gene Deletion. Cellular Process Used: NonHomologous End Joining OR Nucleus Beckman Coulter GmbH Erweiterung des Systems durch modularen Aufbau möglich (z.b. für automatische HochdurchsatzProduktionsanlagen für monoklonale Antikörper) d) GOI d) REPAIR TEMPLATE cotransfected with ZFN Pair: 1-20% of cells contain Gene Integration in Target Site. Cellular Process Used: Homologous Recombination Abb. 2: Die ZFN-vermittelte Genomeditierung findet im Zellkern statt. Hierzu muss ein Paar der genspezifischen ZFNs in die Zelle transfiziert oder injiziert werden. Der Knock-out wird dann durch NHEJ oder der Knock-in durch HR unter Co-Transfektion eines Donorkonstruktes erreicht. LABORWELT

13 out-zellen zeigten, dass der Phänotyp jenem der bereits existierenden Knock-out-Linie entspricht 3. Die Zinkfinger-Proteine können in einem breiten Spektrum von Organismen und Zellen eingesetzt werden. Dies gilt besonders für humane, murine und Ratten-Zelllinien. Zudem wurde über erfolgreiche Knock-out- Experimente in Zebrafischen 4, CHO- Zellen 3 und Knock-in-Experimente in humanen Stammzellen 5 berichtet. Zugang zur Welt der Zinkfinger-Nukleasen STOP SPECULATING. * START QUANTIFYING. Sigma-Aldrich und Sangamo Bioscience ein Pionierunternehmen bei der Entwicklung der Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs) haben im vergangenen Jahr ein exklusives Lizenzabkommen vereinbart, das es ermöglicht, diese Technik weltweit einem wissenschaftlichen Publikum zu Forschungszwecken zur Verfügung zu stellen. Das erste Produkt wurde im September 2008 vorgestellt. Es handelt sich um den CompoZr TM Custom ZFN-Service. Wissenschaftler können hier bequem und einfach Zinkfinger-Proteine gegen das interessierende Gen bestellen. Die Zinkfinger-Proteine werden auf Anfrage hergestellt und mit viel Aufwand validiert. Dadurch können sie direkt in den verschiedensten Anwenden, zum Beispiel in den Bereichen Funktionelle Genomforschung oder in der Arzneimittelentwicklung, eingesetzt werden. * * * Zusammenfassung Die Fähigkeit, Gene von Mensch, Tier und Pflanze gezielt zu verändern, wird seit langem von Wissenschaftlern genutzt, um komplexe genetische Funktionen zu verstehen oder um neue pharmazeutisch relevante Wirkstoffe zu finden. Eine routinemäßige Anwendung ist möglich, jedoch immer sehr aufwändig. Mit der CompoZr Zinc Finger Nuclease-Technologie von Sigma- Aldrich können Wissenschaftler nun sehr schnell und einfach Gene editieren. Weder die Herkunft der Zellen (Säugetier, Zebrafisch, Fruchtfliege) noch das Gen selbst schränken den Wissenschaftler in seiner Arbeit ein. Auch komplexe Organismen stellen kein Problem dar. Die Effizienz dieser Technik in verschiedenen Tiermodellen wird zur Zeit geprüft. * * Literatur [1] Morton, J. et al, Induction and repair of zinc-finger nuclease-targeted double-strand breaks in caenorhabditis elegans somatic cells. Proc Natl Acad Sci USA, 103(44): [2] Moehle, EA. et al, Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases. Proc Natl Acad Sci USA. 104(9): [3] Santiago, Y. et al, Targeted gene knockout in mammalian cells using engineered zinc finger nucleases. Proc Natl Acad Sci U S A, 105(15): [4] Doyon, Y et al, Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zincfinger nucleases. Nat. Biotechnol. U S A 26(6): [5] Lombardo et al, Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nat. Biotechnol. USA 25(11): [6] Bibikova, M. et al, Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161: [7] Lloyd, A. et al, Targeted mutagenesis using zinc-finger nucleases in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 102(6): [8] Wu, J. et al, Custom-designed zinc finger nucleases: What is next? Cell. Mol. Life Sci. 64: AbsoluteIDQ Kit With a sample volume of only 10µL, you can now identifiy and quantify over 150 metabolites in 4 compound classes in a matter of minutes, and keep your proprietary data in-house. Change your views of metabolomics with the intelligent new AbsoluteIDQ Kit. Korrespondenzadresse Dr. Rainer Ebel Sigma-Aldrich Chemie GmbH Eschenstr Taufkirchen CREATING KNOWLEDGE Tel.: +49-(0) FOR HEALTH Fax: +49-(0) rainer.ebel@sial.com sales@biocrates.com LABORWELT 9. Jahrgang Nr. 6/

14 Blitzlicht Sequenzierdienstleistungen Neue Services dank Next Generation Sequencing Dr. Steffen Krüger, AGOWA genomics, Berlin Durch das Next Generation Sequencing (NGS) ergeben sich beim Berliner DNA-Sequenzierspezialisten AGOWA genomics, der seit 2005 zur LGC-Gruppe gehört, völlig neue Möglichkeiten: deutlich höhere Kapazitäten, ein höherer Durchsatz und genomweite Untersuchungen. Nach mehr als 20 Jahren hat die Automatisierung der klassischen Sanger-Sequenzierung ihre Produktivitätsgrenzen erreicht. Next Generation Sequencing -Technologien eröffnen einen völlig neuen Servicetypus. AGOWA genomics hat das gerade auf den Markt gekommene Roche Genome Sequencer FLX Titanium-System in Betrieb genommen. Das speziell geschulte Sequenzierteam unter der Leitung von Dr. Gerald Nyakatura, der mehrjährige Erfahrungen mit Next Generation Sequencing -Technologien einbringt, hat bereits erfolgreich Sequenzierprojekte für Großkunden durchgeführt. Die Unterschiede in der Produktivität und die Kostenvorteile zwischen den alten und neuen Systemen sind erstaunlich. Zu den neuen Sequenzierleistungen gehören etwa die: I de novo-sequenzierung prokaryotischer und kleiner eukaryotischer Genome I Analyse von Metagenomen, Transkriptomen /normalisierter cdna, von Methylierungsmustern sowie Fosmid- und BAC-Pools I gezielte Re-Sequenzierung (Exon-/Amplicon- Sequenzierung) I Komplettierung von de novo-sequenzierungen (in Kombination mit der Sanger- Sequenzierung). Technologien im Vergleich In der Theorie wird die neue NGS-Technologieentwicklung als umwälzende oder diskontinuierliche Innovation beschrieben. Es handelt sich aber nicht um eine lineare Erweiterung oder ein Upgrade existierender Instrumente. Bei der konventionellen Sanger-Sequenziermethode wird auch mit den besten High-end-Geräten die eigentliche Sequenzreaktion im Wesentlichen einzeln, außerhalb des Gerätes durchgeführt. Der Sequenzer wird lediglich zur Auftrennung und Detektion der sequenzierten DNA-Fragmente eingesetzt. Dies erschwert die parallele Bearbeitung von Proben und limitiert die Anzahl der Proben, die gleichzeitig analysiert werden können, auf 96. Ein klassisches Gerät mit Sanger- Technologie (Applied Biosystems 3730xL) kann hochgerechnet ca. 350 Mio. DNA Basen pro Jahr generieren. Die neue Technologie stellt einen gewaltigen Sprung in der Anzahl der parallelen prozessierbaren Sequenzreaktionen dar. Dies wird unter anderem durch die Verlegung der Sequenzreaktion in den Sequenzer erreicht. Bei der vom GS-FLX genutzten Technologie kommt die Methode der Pyrosequenzierung zum Einsatz. Einzelne DNA-Moleküle werden mit spezifischen Primer-Sequenzen für die Sequenzierung und PCR jeweils auf kleinen Beads (Mikropartikeln) immobilisiert. Diese DNA wird durch Emulsions-PCR (empcr) angereichert, damit bei der Sequenzierung ein ausreichend starkes Signal entsteht. Sequenziert wird durch die Synthese des komplementären DNA-Stranges. Bei jedem Einbau eines Nukleotids wird Pyrophosphat und somit Energie freigesetzt, die in Photonen umgewandelt wird. Diese werden mit Hilfe einer Kamera gemessen. Die entstehenden Bilder werden von einer Software interpretiert und in die entsprechende Basensequenz übertragen. Mit dem neuen Roche GS FLX Titanium-System können bis zu 1,2 Mio. Einzelsequenzen und bis zu 500 Mio. DNA Basen in einem Lauf produziert werden. Roche Genome Sequencer FLX Titanium Die Roche GS FLX Titanium-Serie ist ein Upgrade des Roche GS FLX und bietet einen höheren Analysendurchsatz bei zugleich hochwertigeren Ergebnissen und zu niedrigeren Kosten pro Probe. Dies ist essentiell für die Forschungsarbeiten zur Entzifferung kompletter Genome. So eröffnet NGS noch unbekannte Entwicklungsgebiete. Die Kundennachfrage tendiert stark zu genomweiten Analysen wobei buchstäblich das gesamte Genom eines Organismus in sehr kurzer Zeit sequenziert wird sowie zu anderen neuen Anwendungen/Entwicklungen in der Biotechnologie und Medizin. Es gibt derzeit fünf Hersteller auf dem Markt, die neue Technologien anbieten. Für unsere interne Analyse haben wir das Feedback unserer Kunden, führende europäische Forschungszentren und von Kollegen des LGC-Geschäftsbereichs Research & Technology miteinbezogen und konnten dabei von unserer 15-jährigen Erfahrung profitieren. Die umfangreiche Analyse hat ergeben, dass Roche das am besten geeignete System für die Anforderungen bei AGOWA genomics, für anstehende Kundenprojekte und die LGC-interne Forschung bietet. Wir beobachten weiterhin die rasante Entwicklung der Technologien, denn die dritte Sequenziergeneration steht schon vor der Tür. Abb. 1: DNA-Sequenzierung mit Sequenzern der zweiten Generation Bild: Roche Korrespondenzadresse Dr. Steffen Krüger AGOWA genomics Ostendstr. 25, Berlin Tel./Fax: +49-(0) / service@agowa.de Jahrgang Nr. 6/2008 LABORWELT

15 LIFE SCIENCE ROBOTICS Build your personal, flexible Pipetting Robot with the modular STAR line. Choose from HAMILTON s preconfigured solutions for your application. Do you frequently extract DNA/RNA? Then your high-throughput Extraction STARlet would be equipped with: Individual Channels for Hit Picking and normalisation HAMILTON s proven STAR technology offers the highest process safety with CO-RE technology for forceless tip and tool attachment, Monitored Air Displacement for the utmost pipetting precision and innovations like Dual Liquid Level Detection (capacitive and pressure). And, of course, every STAR workstation can be upgraded with additional modules when your application changes or when you want to automate additional assays. Explore the possibilities and build your personal Pipetting Robot! infoservice@hamiltonrobotics.com

16 Blitzlicht Resequenzierung Schneller von der Probe zur Sequenz Dr. Beate Rätz, Applied Biosystems Deutschland GmbH, Darmstadt In vielen Studien, in denen Resequenzierungsmethoden eine Rolle spielen, ist die Amplifikation von DNA-Proben mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ein wichtiger erster Schritt. Resequenzierungsexperimente stellen Forscher vor besondere Herausforderungen: Die Sequenzierergebnisse müssen qualitativ hochwertig sein. Gleichzeitig ist es wichtig, die Analysezeit sowie den Verbrauch an Reagenzien, Arbeitsmaterialien und den Bedarf an wertvollem Probenmaterial möglichst gering zu halten. Die Fast PCR ist eine neue Technologie, die Laufzeiten entscheidend reduzieren kann. Die Methode beruht auf einer Kombination von neuen, robusten Protokollen, schnellen Instrumenten und optimierten Reagenzien. Alles zusammen ermöglicht schnellere Temperaturwechsel und gewährleistet eine höhere Temperaturstabilität bei gleichzeitig hohen Analysegeschwindigkeiten. Dadurch werden die Laufzeiten sowohl bei der PCR als auch beim Cycle-Sequencing verkürzt, und es können mehr Analysen pro Arbeitstag durchgeführt werden. Mit schnellen PCR-Technologien können Arbeitsvorgänge, die früher elf Stunden oder länger dauerten, innerhalb von etwa vier Stunden abgeschlossen werden. Die kürzere Analysezeit steigert die Produktivität. Zusätzlich können mit den neuen schnellen Arbeitsabläufen Probenmaterial und Reagenzien eingespart werden. Dies reduziert letztendlich die Kosten des Experimentes. Im Folgenden beschreiben wir ein neues Protokoll, das die Fast PCR mit einem schnellen Verfahren für das Cycle- Sequencing kombiniert. Fast Resequencing-Arbeitsablauf Der folgende Fast Resequencing-Workflow beschreibt den Arbeitsablauf für die schnelle Resequenzierung ein einfaches Verfahren, das aus sechs Schritten besteht (siehe Abbildung 1). Die vollständigen Arbeitsprotokolle für das Fast Resequencing können unter abgerufen werden. Abb. 1: Geschätzter Zeitbedarf geläufiger Verfahren zur Resequenzierung im Vergleich zum Fast Resequencing-Workflow Jahrgang Nr. 6/2008 LABORWELT

17 Tab. 1: Traditionelles versus schnelles Verfahren zur Resequenzierung: Vergleich der wichtigsten Parameter. Die Daten repräsentieren einen Durchschnitt aus den Werten von sechs Amplikons (HM2-1, HM2-10, HM2-16, HM2-2, HM2-4, HM2-8) mit einer durchschnittlichen Länge von 548 bp. Sequenzierparameter Schnelle Methode geläufige Methode Leselänge Kontinuierliche Leselänge KB-QV Zahl der KB-QV Hintergrund (Peak-unter-Peak) 4,1 % 4,6 % DNA-Extraktion Der Arbeitsablauf zur schnellen Resequenzierung beginnt mit einer DNA-Extraktion. Viele verschiedene Probentypen können eingesetzt werden: Blut, Zellkulturen sowie frisches, tiefgefrorenes oder FFPE-Gewebe (FFPE: formalin-fixed-paraffine-embedded). Welche Extraktionsmethode die beste ist, hängt meist von der Art und von der Gesamtzahl der Proben ab, die analysiert werden sollen. Das MELT Total NucleicAcid Isolation- System nutzt zum Beispiel magnetische Beads zur Aufreinigung von DNA und RNA und eignet sich für eine Vielzahl unterschiedlicher Probentypen. Die Technologie entfernt wirksam PCR- Inhibitoren und kann auch für größere Reaktionsmengen verwendet werden. Sie eignet sich auch für die Automation. Der Recoverall total nucleic acid isolation-kit wurde entwickelt, um Nukleinsäuren aus Formaldehyd-fixierten oder FFPE-Geweben zu extrahieren. Bis zu vier 20-μm-Sektionen beziehungsweise bis zu 35 mg nichtsektionierte Proben können in einem Ansatz aufbereitet werden. Primer-Design, Fast PCR- Amplifikation und -Aufreinigung Nach der Extraktion werden die betreffenden DNA-Regionen mittels PCR amplifiziert. Das VariantSEQr Resequencing-System ist eine Kollektion von PCR-Primern, mit denen Sequenzvarianten Hunderter menschlicher Gene schnell und einfach identifiziert werden können. Das System enthält Sätze vorgefertigter PCR-Primer und Protokolle. Es gibt VariantSEQr- Primerpaare für mehr als Amplikons, das entspricht etwa menschlichen Genen. Der AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix, UP produziert Amplikons, die sich hervorragend zur Erstellung hochwertiger Sequenzierdaten eignen. Im Vergleich zum Standard AmpliTaq Gold PCR Master Mix liefert der Fast PCR Master Mix gleichwertige oder sogar höherwertige Templates (Abbildung 2, S. 19). Die kontinuierlichen Leselängen und die KB-QV30 Basecall- Raten liegen über den Werten, die mit dem herkömmlichen Master Mix erreicht werden. Gleichzeitig werden Hintergrundsignale (prozentualer Anteil der Peak-unter-Peak-Produkte) reduziert (siehe Tabelle 1). Der Master Mix für die Fast PCR erzielt besser reproduzierbare Ergebnisse mit höherer Sensitivität als das herkömmliche Reagenz nur 10 Kopien eines einzelnen Gens können in 10 ng genomischer DNA nachgewiesen werden. Zusammen mit dem Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler und MicroAmp Fast 96-Well-Platten verkürzt der Master Mix die PCR-Reaktionszeit für die Amplifikation eines Fragements genomischer DNA mit einer Länge von 500 bp auf nur etwa 40 Minuten. Nach der PCR werden die Reaktionsansätze aufgereinigt, um nicht gebundene Primer, Desoxy-Trinukleotid-Triphosphate (dntps) und Salze zu entfernen. Speziell für die Probenaufreinigung vor dem Cycle-Sequencing ist ExoSAP-IT (USR Corporation, P/N 78200) zu empfehlen. Schnelles Cycle-Sequencing Die Ansätze werden sequenziert und im Anschluss mit Hilfe eines Genetic Analyzers detektiert und analysiert (siehe auch Protokoll unter fastsolutions). Für das schnelle Cycle Sequencing wird der BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing-Kit zusammen mit Microamp Fast 96-Well- Platten und dem Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler eingesetzt. Dieser BigDye Terminator- Kit wurde speziell für Anwendungen entwickelt, bei denen ein optimales Basecalling in unmittelbarer Nachbarschaft der Primer besonders wichtig ist. Er eignet sich besonders auch für die Sequenzierung kurzer PCR-Produkte auf Laufmodulen für schnelle Elektrophorese. Reinigung Fluoreszenzmarkierte Didesoxy-Terminatoren, dntps und Salze sollten vor der kapillarelektrophoretischen Analyse entfernt werden. Bisulfit-Sequenzier-Ansätze können mit Hilfe von Centri-Sep -Säulen (96-Well-Platten) oder durch Ethanolfällung gereinigt werden. Beide Methoden bedürfen besonderer Vorsicht bei der Durchführung, damit dabei möglichst wenig Probenmaterial Womit rechnen Sie? Ihr Syntheseprojekt Slonomics TM Technologie Intelligente Expres sions - optimierung Individuelles Angebot Wissenschaftliche Unterstützung ISO-Zertifizierung Persönlicher Service Bestes Ergebnis Tel: +49 (0) Precision in Diversity SlonoGene TM Gensynthese SlonoMax TM Variantenbibliotheken sales@sloning.com LABORWELT 9. Jahrgang Nr. 6/

18 Blitzlicht Resequenzierung :07:46 Uhr BIOCOM Verlag GmbH verlorengeht. Der BigDye XTerminator Purification-Kit ist eine gute Alternative zu den genannten Methoden. Er ist einfach zu handhaben und gestattet eine schnelle Durchführung. Der Kit entfernt zuverlässig ungebundene BigDye-Terminatoren bei besonders geringem Probenverlust. Detektion Die Analyse erfolgt im Anschluss an das Cycle Sequencing und die Probenreinigung durch Kapillarelektrophorese. Die hier vorge- Abb. 2: Elektropherogramm von sequenzierten PCR-Produkten. Die PCR-Produkte wurden mit Hilfe des AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix, UP beziehungsweise mit Hilfe des AmpliTaq Gold PCR Master Mix generiert. Die Qualität der Sequenzierergebnisse ist vergleichbar. stellten Daten wurden mit Hilfe der Applied Biosystems 3130 und 3130xl Genetic Analyzer erzeugt. Der 3130 Genetic Analyzer ist ein Vier-Kapillarensystem für den geringen bis mittleren Durchsatz. Es beruht auf einer ausgereiften Automation, die Zeit und Kosten spart und die Produktivität erhöht. Der 3130xl Genetic Analyzer ist ein 16-Kapillaren-Elektrophorese-Instrument für den mittleren Durchsatz. Für die schnelle Resequenzierung sollte es zusammen mit dem Rapid Sequencing (BDx_RapidSeq)- Laufmodul und dem POP-6 -Polymer eingesetzt werden. Analysis-Software v5.3.1 mit KB Basecaller v1.4, die SeqScape- Software v2.6, oder aber die Variant Reporter - Software geeignet. Vergleich: Schnelles versus herkömmliches Sequenzieren Mit Hilfe der Fast-PCR- und Fast Cyle-Sequencing-Protokolle und der beschriebenen Reagenzien können Ergebnisse erzielt werden, die eine vergleichbare Qualität besitzen wie die bislang verbreiteten 11-Stunden- Verfahren. Die neuen Workflows liefern entsprechende Ergebnisse jedoch in weniger als der Hälfte der Zeit (vgl. Abbildung 1). Abbildung 2 zeigt ein Elektropherogramm sequenzierter Amplikons. Der Vergleich mit dem herkömmlichen Protokoll und dem traditionellen AmpliTaq Gold PCR Master Mix zeigt, dass die Sequenzanalyseergebnisse einander sehr ähnlich sind. Dies belegen auch die in der Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse: Die Leistung des AmpliTaq Gold Fast PCR Master-Mix, UP liegen sogar etwas über der des herkömmlichen Master Mixes. Datenanalyse Jede Base der DNA-Sequenz wird nun genau bestimmt und mit einer Referenzsequenz verglichen, um Mutationen oder Sequenzvarianten zu identifizieren. Dafür ist eine geeignete Software unerlässlich. Für die Datenanalyse sind in diesem Arbeitsablauf entweder die Sequencing Korrespondenzadresse Dr. Beate Rätz Applied Biosystems Deutschland GmbH Frankfurter Str. 129 b Darmstadt Tel: +49-(0) Fax: +49-(0) beate.raetz@eur.appliedbiosystems.com www. appliedbiosystems.com Jahrgang Nr. 6/2008 LABORWELT

19 Hochdurchsatz- Metabolomanalyse von Mikroorganismen Dipl.-Ing. Jana Spura, Prof. Dr. Dietmar Schomburg, Bioinformatik & Biochemie, Technische Universität Braunschweig Für die schnelle und verlässliche Metabolomanalyse von Mikroorganismen wurde ein Verfahren entwickelt. Zellen wachsen in Mikrotiterplatten und werden anschließend semi-automatisiert für die Analyse vorbereitet. Durch die Teilautomatisierung konnte die bearbeitbare Probenzahl erhöht sowie die benötigte Zeit für die Probenvorbereitung um den Faktor 36 reduziert werden. Die durchschnittlich 150 identifizierten Metabolite pro Probe haben einen geringeren Fehler als in manuell bearbeiteten Proben (~13% statt ~25%). Durch einen beschleunigten GC/MS-Lauf (18 Minuten statt 60 Minuten) konnte die Analysezeit zusätzlich verkürzt werden. Mit dem Beginn der postgenomischen Ära wächst die Bedeutung der Metabolomanalyse für die Systembiologie. Ziel ist dabei die komplette Bestimmung der Genfunktionen, präsent in einer Zelle unter definierten Bedingungen und zu einem bestimmten Zeitpunkt. Durch die gestiegene Informationsmenge über Genomsequenzen von Organismen existieren bereits viele Informationen zu vorhandenen Genen. Bisher ist aber die Vorhersage ihrer Funktionen noch unvollständig. Dies ist aber vor allem für die Erstellung kompletter metabolomischer Biotechnologie `08 Kapital, Markt, Recht Herausgegeben von Hans-Eric Rasmussen-Bonne, Reinhold M. Lauer Die Biotechnologie ist eine noch relativ junge Wachstumsbranche, die sowohl auf Investoren- als auch auf der Unternehmerseite spezielles Knowhow voraussetzt. Ob an der Börse, in Kooperationen mit Pharmakonzernen oder gegenüber dem Finanzamt, überall betreten Biotech-Unternehmer für sie unbekanntes Terrain. In diesem Buch werden praxisnah wichtige Fragen erläutert, die zusammen mit aktuellen Branchenübersichten und Datensammlungen sowohl Unternehmern als auch Investoren ihre tägliche Arbeit erleichtern. Mit dieser zweiten Ausgabe wird die im Vorjahr begonnene Reihe fortgesetzt. Netzwerke und in silico-computermodelle eine Grundvoraussetzung. Die Metabolomanalyse ermöglicht die Charakterisierung des Phänotyps sowie durch Kopplung mit genomischen Daten die Bestimmung der Funktion von Genen. Eine mögliche Grundlage solcher Analysen stellen Transposonmutantenbanken dar. So wurde für das Gram-positive Bodenbakterium Corynebacterium glutamicum eine Strategie zur Erzeugung solcher Mutanten entwickelt 1. Die Mutation entsteht durch die spontane, ungerichtete Integration eines beweglichen ISBN Biotechnologie 08 H.E. Rasmussen-Bonne, R.M. Lauer (Hrsg.) Biotechnologie 08 Kapital, Markt, Recht BioPlus2_(0)_Titel_bioPLUS.indd :05:20 Uhr BIOCOM AG Verlag GmbH Abb. 1: Beispiel einer Kultivierung von Wildtypproben als Hauptkultur in einer 96-Deepwell- Platte. Die Wells 88 und 96 waren nicht beimpft und fungierten als Blanks und belegten, dass keine Kreuzkontaminationen auftraten. (modifiziert nach[5]) LABORWELT 9. Jahrgang Nr. 6/

20 HotStart_Euro_60x260_Ad 6/20/07 12:43 PM Page 1 Blitzlicht Massenspektrometrie HotStart-IT. Less Heat. No DNA Damage. We couldn t be more specific. Abb. 2: MPS2-Twister-Autosampler der Firma Gerstel. Eingesetzt für die Automatisierung einzelner Schritte in der Probenvorbereitung der Metabolomanalyse USB s novel hot start PCR method requires no extensive heat denaturation step. The result is no damage to precious samples with increased specificity and yield. HotStart-IT TM Taq DNA Polymerase Unique protein binds primers to prevent mispriming Primers are released during heat denaturation Benefits High Sensitivity Detects <10 target copies Linear dynamic range of 7 8 orders of magnitude, R Ease of Use Multiple instrument compatibility Now in Europe USB Europe GmbH Hauptstrasse Staufen Germany T: +49 (0) F: +49 (0) custserv@usbweb.de Transposon-Elementes mit dem gesamten Plasmid, auf dem es sich befindet, in das Genom des Bakteriums. Dabei kann es zur Deletion eines Gens und eventuell zu dessen Funktionsverlust kommen. Da aber Mikroorganismen komplexe regulatorische Mechanismen aufweisen, ist dieser Verlust nicht immer präsent. Vielmehr kann er durch zum Beispiel Isoenzyme kompensiert werden. Daher ist es sehr zeitaufwändig, jedes deletierte Gen zu bestimmen und anschließend nach Veränderungen des Phänotyps zu suchen. Bei einem Bakterium wie C. glutamicum, welches zirka Gene enthält 2,3, müssten, um statistisch gesehen jedes der Gene mindestens einmal getroffen zu haben, etwa Transposonmutanten generiert werden. Auch die gängigen Standard-Metabolomanalysen mit Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/ MS) 4 sind zu zeitaufwändig für eine so hohe Probenzahl. Um dennoch eine so komplexe Analyse durchführen zu können, wurde eine semi-automatische Hochdurchsatzmethode zur Metabolomanalyse von Mikroorganismen mittels GC/MS entwickelt 5. Kultivierung in Mikrotiterplatten Um eine große Zahl von Proben parallel bearbeiten zu können, wurde die Kultivierung nicht mehr in einem Fermenter oder Schüttelkolben, sondern in Mikrotiterplatten durchgeführt. Durch die Verwendung von Deepwell-Platten konnten 96 Proben gleichzeitig herangezogen werden. Zusätzlich sank das Kulturvolumen auf 400 µl. Wichtig war dabei, dass trotz des reduzierten Volumens eine ausreichend hohe Menge an Zelltrockengewicht erhalten wurde. Dafür ist eine genügende Versorgung mit Sauerstoff während der Kultivierung ausschlaggebend. Die Kultivierung erfolgte in vier Schritten. Nach der Ausplattierung der Proben, die als Glycerinstocks bei -80 C in Mikrotiterplatten gehalten wurden, wobei ein Replikator zur Übertragung auf die Vollmediumplatten (BHI) zum Einsatz kam, erfolgte die Inkubation bei 30 C für einen Tag im Brutschrank. Am darauffolgenden Tag erfolgte die Übertragung der Kolonien mittels Replikator in 96-well-Platten, die Vollmedium versetzt mit Antibiotikum enthielten. Wells, die mit dem Wildtyp inokuliert wurden, enthielten kein Antibiotikum, da lediglich die Mutanten resistent sind, da sie bei der Transposonintegration und der damit einhergehenden Integration des gesamten Plasmids ein entsprechendes Resistenzgen enthalten. Die Inkubation der Vorkultur sowie der nachfolgenden Kulturen erfolgte bei 30 C und 1050 rpm auf dem TiMix5 (Edmund Bühler, Tübingen, D, Orbit: 3 mm). Anschließend wurde die Übernachtkultur mit der Volkultur angeimpft. Diese Kultivierung erfolgte auf Minimalmedium 4, gegebenenfalls versetzt mit Antibiotikum. Die Hauptkultur wurde am nächsten Tag inokuliert. Dafür wurden 400 µl frisches Minimalmedium ohne Antibiotikum in eine 96-Deepwell-Platte vorgelegt, mit je 25 µl der Über-Nacht-Kultur angeimpft und für weitere sieben Stunden bei 30 C und 1050 rpm inkubiert. Um eine ausreichende Durchmischung und Versorgung der Zellen mit Sauerstoff zu gewährleisten, musste eine entsprechend hohe Schüttlerfrequenz von 1050 rpm gewählt werden. Außerdem wurden die Platten mit zwei kombinierten Folien verschlossen 5. Dies Jahrgang Nr. 6/2008 LABORWELT