RP-HPLC für Anwender. Wolfgang Gottwald. VCH ^it Basel Cambridge Tokyo

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1 RP-HPLC für Anwender 2008 AGI-Information Management Consultants May be used for personal purporses only or by libraries associated to dandelon.com network. Wolfgang Gottwald _ «^ww T/Arix Weinheim New York VCH ^it Basel Cambridge Tokyo

2 Inhalt 1 Chromatographische Verfahren Chromatographiearten Adsorptionschromatographie Verteilungschromatographie 3 2 Funktionsweise einer HPLC-Anlage Das Laufmittel (Eluent, mobile Phase) Leitungen und Druckmessungen HPLC-Pumpen und Gradientensysteme Hochdruckgradient Niederdruckgradient Niederdruckdosiergradient Probeninjektion HPLC-Säulen Säulenfüllmaterial (stationäre Phase) HPLC-Methoden NP-HPLC (Normal-Phase) RP-HPLC (Reversed Phase) Verteilungs-HPLC Ausschluß-Chromatographie (SEC) Säulenmaterialien Silicagel (Kieselgel) Chemisch modifiziertes Silicagel (Kieselgel) Vernetztes Polystyrol Ionenaustauscherharz Detektorarten UV/VIS-Detektor Diodenarray-Detektoren (DAD) Brechungsindex-Detektoren (RI) 42

3 VIII Inhalt Leitfähigkeitsdetektoren Fluoreszenz-Detektor Registraturgeräte 43 3 Das HPLC-Chromatogramm 49 4 Störungen im Chromatogramm 52 5 Mathematische Grundlagen der HPLC Kapazitätsfaktor k' Trennstufenzahl N th und Bodenhöhe HETP Lineare Geschwindigkeit des Fließmittels Resolutionsfaktor R Berechnung und Bestimmung der Totzeit? T 59 6 Laufmittelauswahl in der RP-HPLC Laufmittelauswahl durch Probieren (Trial and Error) Laufmittelauswahl durch Optimierungsprogramme 67 7 Probenvorbereitung 72 8 Analytische HPLC Qualitative HPLC Quantitative HPLC Vorgehensweise beim Arbeiten mit korrigierten Peakflächen Vorgehensweise beim Arbeiten mit äußerem Standard Vorgehensweise beim Arbeiten mit innerem Standard 81 9 Erweiterte HPLC-Maßnahmen Säulenschaltungen Rückspulen der Säule Herausschneiden einer störenden Fraktion Säulenumschaltung 88

4 Inhalt IX 9.2 Derivatisierung der Proben Nachsäulenderivatisierung (Post-Column) Vorsäulenderivatisierung (Pre-Column) Praktischer Umgang und Fehlervermeidung Eluentenauswahl Eluentenvorbereitung Probenvorbereitung Umgang mit der Pumpe Handhabung bei der Injektion Umgang mit der Trennsäule Umgang mit dem Detektor Umgang mit den Auswertesystemen und Probenauswertungen Fehlererkennungen anhand des Chromatogrammes 12 Prüfung auf Reproduzierbarkeiten der Analyse Untersuchung auf Flußkonstanz (isokratisch) Untersuchung der Flußlinearität (Gradient) Gradiententest 150 no 13 Das ABT-Konzept (KAISER) zur Bestimmung der Trennleistung GLP (Good Laboratory Practice) Standard-Begriffe der GLP Organisation der GLP Qualitätssicherungsprogramm Prüfeinrichtung Geräte und Reagenzien 170

5 X Inhalt 14.6 Prüf- und Referenzsubstanzen Standardarbeitsanweisungen Prüfungsablauf Prüfungsbericht Archivierung Genauigkeit, Qualität und Statistische Prozeßführung (SPC) Einführendes Praktikum in die HPLC Die Tasten des verwendeten SHIMADZU-Integrators CR5A Aufnehmen von einfachen Normierungs-Chromatogrammen mit dem SHIMADZU-Integrator Grobeinstellung Feineinstellung Aufgabe: Bestimmung der Grenzempfindlichkeit der HPLC-Anlage (Naphthalin) Vorbereitung der HPLC-Anlage Vorbereitung des Detektors Ausgangsbedingungen des HPLC-Systems Einstellung des SHIMADZU-Integrators Bestimmung der spektralen Maximumwellenlänge Probenlauf Aufgabe: Qualitative Analyse von Aromaten mit Vergleichslösungen Vorbereitung des Detektors Bedingungen des HPLC-Systems Einstellung des SHIMADZU-Integrators Aromatenprobe Vergleichslösungen Vorgehensweise Aufgabe: Quantitative Analyse von Coffein nach der Methode des äußeren Standards Prinzip Bedingungen des HPLC-Systems Einstellung des Integrators Herstellung der Lösungen Proben- und Kalibrierlauf 194

6 Inhalt XI Auswertung Auswertebeispiel Aufgabe: Quantitative Analyse von Phenacetin mit innerem Standard nach der Diagramm-Methode Bedingungen des HPLC-Systems Einstellung des Integrators Herstellung der Lösungen Proben- und Kalibrierlauf Auswertung Auswertebeispiel Aufgabe: Quantitative Analyse von Phenacetin mit innerem Standard nach der Einpunkt-Methode Bedingungen des HPLC-Systems Einstellung des Integrators Berechnungsmethode des Integrators Herstellung der Lösungen Kalibrierlauf am Integrator Probenlauf Aufgabe: Qualitative Analyse von Zuckern mit Vergleichslösungen; Verwendung eines RI-Detektors Vorbereitung der HPLC-Anlage Vorbereitung des Detektors Bedingungen des HPLC-Systems Einstellung des Integrators Zuckerprobe/Wein Vergleichslösungen Vorgehensweise Aufgabe: Bestimmung der Halbwertsbreiten der Substanz Acetanilid bei verschiedenen Konzentrationen Ausgangsbedingungen des HPLC-Systems Einstellung des Integrators Probenlauf Auswertung Aufgabe: Abhängigkeit der Peaklänge und der Peakbreite vom Fluß Prinzip Herstellung der Untersuchungslösungen Versuchsbedingungen der HPLC-Anlage Detektor/Integrator-System Aufnahme der Chromatogramme Interpretation 209

7 XII Inhalt Aufgabe: Abhängigkeit der Retentionszeiten vom Wassergehalt in einer Methanol/Wasser-Mischung (Aromaten) Prinzip Herstellung der Untersuchungslösungen Versuchsbedingungen der HPLC-Anlage Detektor/Schreiber-System Aufnahme der Chromatogramme Auswertung Interpretation Aufgabe: Arbeiten mit dem Gradientensystem BECKMAN Prinzip Einstellen der Anfangsbedingungen im RUN-Modus Gradientenprogramm eingeben Programm ablaufen lassen Programm editieren Vorbereitung der Anlage (Beckman) Probenlösung Versuchsbedingungen der HPLC-Anlage Detektor/Schreiber-System Vorgehensweise Auswertung Aufgabe: Abhängigkeit der Peakform vom ph-wert der mobilen Phase bei der Chromatographie von basischen Aminen Prinzip Probe mit einem basischen, aromatischen Amin Versuchsbedingungen der HPLC-Anlage Detektor/Schreiber-System Versuchsdurchführung Auswertung Untersuchungen auf Gerätefunktionalität und Reproduzierbarkeiten Aufgabe: Überprüfung der berechneten Totzeiten Prinzip HPLC-Bedingungen Detektor/Schreiber-System Durchführung 226

8 Inhalt XIII : Aufgabe: Überprüfung der Reproduzierbarkeit der HPLC-Anlage; Konstanz der Peakfläche und der Retentionszeiten 226 Prinzip 226 Bewertung der Messungen Mischung und Eluent 228 Ausgangs-Bedingungen des Einstellung des Integrators Probenlauf 229 Meßläufe 229 Auswertung 229 Aufgabe: Überprüfung der 227 HPLC-Systems Reproduzierbar keit von HPLC-Anlagen, Linearität des Flusses 229 Prinzip 229 Bewertung der Messungen 230 Mischung und Eluent 230 Ausgangs-Bedingungen des Einstellung des Integrators Probenlauf 231 Meßläufe 232 Auswertung 232 Aufgabe: Bestimmung der und Auswertesystems 232 Prinzip 232 Bedingungen 233 Detektor/Schreiber-System Herstellung der Lösungen Probenlauf 234 Auswertung 234 Auswertebeispiel 234 Aufgabe: Überprüfung des Prinzip 235 HPLC-Systems Linearität des Detektor Einstellungen am HPLC-System 236 Detektor/Schreiber-System 236 Durchführung der Tests 236 Lineartest 236 Sprungtest 236 Test auf Welligkeit 237 Auswertungen der Tests 237 Gradientensystems 235

9 XIV Inhalt 17.6 Aufgabe: Überprüfung der Trennleistung eines HPLC-Systems nach dem ABT-Konzept. Optimierung der Flußrate Prinzip Bewertung der Messungen Mischung und Eluent Ausgangs-Bedingungen des HPLC-Systems Einstellung des Integrators Probenlauf Meßläufe Auswertung Literatur 241 Sachwortregister 243