DNA-Analytik. Beispiel: Nachweis von gentechnisch veränderten Lebensmitteln

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1 DNA-Analytik Beispiel: Nachweis von gentechnisch veränderten Lebensmitteln rdna PCR mrna RT-PCR Protein (Enzym) Immunochemie Produkt Stoffanalytik 1. Extraktion der DNA aus den Lebensmitteln 2. DNA liegt in geringen Mengen vor: Amplifizierung mittels Polymerase- Kettenreaktion (PCR) 3. Elektrophoretische Auftrennung der amplifizierten DNA 4. Identifizierung der PCR-Produkte, z.b. durch Verdau mit Restriktionsenzymen

2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR): = spezifische Amplifizierung von DNA-Sequenzen durch Mechanismen der zellulären DNA-Replikation Biochemische Grundlagen: 1. Schritt: Auftrennung der Doppelhelix in zwei ungepaarte Einzelstränge durch die Helicase unter ATP-Verbrauch

3 2. Schritt: Replikation, katalysiert durch die DNA-Polymerase º Substrat: Nucleosid-5 -triphosphate º Matrize: DNA-Einzelstrang º Syntheserichtung: Ende, d.h. Ableserichtung: 3 65-Énde º Keine Neusynthese möglich, sondern nur Verlängerung (Elongation) eines zur Matrize komplementären (RNA-)Teilstückes (= Primer, mindestens Nucleotide); das Nucleotid wird an die 3 -Hydroxygruppe des Primers gebunden

4 Polymerase-Kettenreaktion: Natürliche DNA Replikation wird in vitro nachvollzogen. 1. Schritt: Auftrennung der Doppelhelix in Einzelstränge (Denaturierung): durch Hitzedenaturierung bei 95 C (= Schmelzen) 2. Schritt: Hybridisierung der Primer (Annealing); Voraussetzung: Nucleotidsequenz des zu amplifizierenden DNA-Abschnitts mit seiner Umgebung muss bekannt sein.

5 Auswahl und Synthese der Primer: mindestens Basenpaare in der unmittelbaren Umgebung des DNA-Abschnittes; durch Nucleotide von einander entfernt; Schmelzpunkt zwischen 55 und 80 C, möglichst für beide Primer gleich; keine Haarnadelstrukturen oder Dimerisierung (mit sich selbst oder mit dem 2. Primer); möglichst ausgeglichener G/C- zu A/T-Gehalt, keine repetitiven Sequenzen (Spezifität) computerunterstützte Auswahl Hybridisierung erfolgt durch Abkühlen unter die Schmelztemperatur. 3. Schritt: Polymerasereaktion (Extension) Zusatz der Nucleosidtriphosphate (datp, dctp, dgtp, dttp) und des Enzyms; Einsatz von Enzymen aus thermophilen Bakterien, die bei 95 C stabil sind kein erneuter Zusatz nach der Denaturierung; Temperaturoptimum bei 72 C (Taq- Polymerasen)

6 Temperaturcyclus: Wiederholung des Cyclus; nach 25 Cyclen ist die Zielsequenz auf das etwa fache amplifiziert

7

8 Probleme: þ LM-Bestandteile werden mit der DNA extrahiert und inhibieren die Polymerase falsch negative Ergebnisse; z.b. saure Polysaccharide und Polyphenole; z.b. Schwierigkeiten bei der PCR von Schokolade þ Bestandteile des Extraktionspuffers (z.b. SDS, Natriumchlorid, EDTA) können Polymerase inhibieren falsch negative Ergebnisse þ DNA kann während der LM-Zubereitung abgebaut werden (niedriger ph, thermische Belastung, Nucleaseaktivität) falsch negative Ergebnisse þ hochsensitive Technik: Nachweisgrenze von 5-10 Molekülen Problem der Kontamination falsch positive Ergebnisse i Einsatz spezieller Extraktionstechniken i positive Kontrollen (Doppel-PCR): parallele Amplifizierung von eukaryotischer DNA = DNA-Sequenzen, die praktisch bei allen Eukaryoten vorhanden sind. Nachweis, ob extrahierte DNA allgemein PCR tauglich ist i negative Kontrolle, um Kontaminationen auszuschließen

9 Quantifizierung: 0,9 % Verunreinigung als technisch unvermeidbar zugelassen Problem bei der Quantifizierung: Kinetik verläuft über eine exponentielle Kurve; zunächst exponentielle Phase, dann Plateauphase N = N 0 x 2 n N = N 0 x (1+E) n, 0<E<1 Bsp: 1,7 20 = ,8 20 = externe Eichkurve Aber: individuelle Inhibitoren in Proben können das Ergebnis stark beeinflussen interne Standardisierung parallele Amplifizierung eines DNA-Abschnittes in der Probe bekannter Konzentration (Bsp.: parallele Messung einer allgemeinen Maissequenz bei der Analyse von Bt-Mais) Erfassung von nicht-sequenzspezifischen Inhibitoren

10 Kompetitve PCR Zusatz eines Mimic-DNA Fragments zur Probe = DNA-Sequenz, die mit denselben Primern wie die Zielsequenz coamplifiziert wird und möglichst gleiche Größe hat kompetitive Amplifizierung, Unterscheidung durch selektive Hybridisierung oder RFLP

11 Real-Time PCR: Zusatz einer sequenzspezifischen Sonde, die an den Enden mit einem Reporterbzw. Quencher-Fluoreszenzfarbstoff markiert ist. Im intakten Molekül wird das Signal vollständig gelöscht. Während der PCR erfolgt eine Hydrolyse; dadurch werden Reporter und Quencher räumlich getrennt und es entsteht ein Fluoreszenzsignal. Das Signal steigt proportional zur Anzahl der synthetisierten PCR-Produkte; die Messung erfolgt während der PCR Quantifizierung mit Hilfe eines internen Standards; Erfassung des threshold-cycle (C T -Wert) = Cyclenzahl, bei der die Fluoreszenz über dem Grundrauschen liegt

12 Nachweis der amplifizierten DNA: durch DNA-Gelelektrophorese: Agarose-Gel, Anfärbung mit Ethidiumbromid; Auftrennung nach Molekülgröße

13 Identifizierung der DNA-Sequenz: i Einsatz von Sonden Durchführung eines Southern-Blots nach der Gelelektrophorese; Anfärbung der Membran durch markierte Sonden = zur Ziel-DNA komplementäre und markierte Oligonucleotide; diese hybridisieren auf der Membran mit der Ziel-DNA; Markierung erfolgt radioaktiv, enzymatisch oder durch Chemilumineszenz

14 i Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP-Analyse) Abbau der amplifizierten DNA durch Restriktionsenzyme; Auftrennung der spezifischen Fragmente durch Gelelektrophorese Beispiel: Unterscheidung von Sardellen und Substitutionsprodukten

15 Anwendung der DNA-Analytik bei Lebensmitteln º Nachweis gentechnisch veränderter Lebensmittel In der Regel kein Nachweis von Zielgenen, sondern Screening von Selektionsund Regulatorgenen, da diese bei vielen GVOs identisch sind (z.b Promotor und NOS-Terminator) Multiplex-PCR: Simultaner Nachweis mehrerer DNA-Abschnitte º Speziesdifferenzierung (Einsatz der RFLP-Analyse) z.b. Tierartdifferenzierung, Verschnitt von Coffea arabica durch billigeren Robusta (Nachweisgrenze 1 %), Nachweis von glutenhaltigen Getreide in diät. LM für Zöliakie º Geschlechtsunterscheidung z.b. Unterscheidung zwischen Ochsenfleisch (höhere Qualität) und weiblichem Rindfleisch; klassisch über Hormonanalyse; Nachweis von spezifischen Sequenzen im Y-Chromosom º schneller Nachweis von mikrobieller Kontamination z.b. Salmonellennachweis als 64 Methode aufgenommen; Listerien- und Campylobacternachweis Nachweis von lebenden Keimen: Reverse-Transcriptase-PCR

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