Analytische Chemie (für Biol. / Pharm. Wiss.)

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1 Analytische Chemie (für Biol. / Pharm. Wiss.) Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese) Dr. Martin Pabst HCI D323 martin.pabst@org.chem.ethz.ch ETH Zurich Dr. Martin Pabst martin.pabst@org.chem.ethz.ch Probenvorbereitung (Probenaufarbeitung) 2

2 Proben Flüssig Fest Gasförmig 3 Probenvorbereitung Analyten in Lösung bringen Abtrennen fester Störsubstanzen Abtrennen gelöster Störsubstanzen Anreichern der Analyten Aufkonzentrieren oder Verdünnen der Probe Überführen der Analyten in ein geeignetes Lösungsmittel 4

3 Analyten in Lösung bringen Soxhlet-Extraktion Feste Probe Lösungsmittel mit extrahierten Analyten de/ch/3/anc/dioxine/dioxinanalytik.vlu/page/vs c/de/ch/3/anc/dioxine/5_probenvorb/animation /soxhlet_m87te0300.vscml.html 5 Abtrennen fester Störsubstanzen Filtration Links: Faltenfilter Mitte: Filter auf Nutsche Rechts: Spritzenfilter Zentrifugation 6

4 Abtrennen gelöster Störsubstanzen Flüssig-Flüssig-Extraktion (liquid liquid extraction = LLE) Extraktion z.b. lipophiler Analyten aus einer Wasserprobe mittels eines org. Lösungsmittels Nernst-Verteilungsgesetz Je mehr Extraktionsschritte, umso effizienter die Extraktion Geeigneten ph einstellen Aussalzeffekt Für grössere Probenmengen (einige 10 ml bis einige 100 ml) geeignet 7 Abtrennen gelöster Störsubstanzen Festphasenextraktion (solid phase extraction = SPE) Adsorber: typische stationäre Phasen der HPLC (Kieselgel, RP-Kieselgel, Ionentauscher) Einweg-Kartuschen als Säulen Proben werden mittels Unterdruck durch die Kartuschen gesaugt 8

5 Abtrennen gelöster Störsubstanzen Festphasenextraktion (solid phase extraction = SPE) Konditionieren Adsorption Waschen Elution mit Lösungs mittel mit hoher Elutionskraft 9 Abtrennen gelöster Störsubstanzen Affinitätschromatographie (Aufkonzentrierung) Ablauf wie bei Festphasenextraktion (SPE) Adsorber: immobilisierte Moleküle, welche sehr spezifische (biochemische) Wechselwirkungen mit Analyten eingehen können 10

6 Abtrennen gelöster Störsubstanzen Festphasen-Mikroextraktion (solid phase micro extraction = SPME) Adsorption Desorption im Injektor Probenvorbereitungsmethode für die GC SPME-Faser: Glasfaser, häufig beschichtet mit stat. Phase der GC, z.b. Polydimethylsiloxan Adsorption in der Probenlösung oder Headspace-SPME Thermo-Desorption im GC-Injektor 11 Einstellen einer geeigneten Analytkonzentration in einem geeigneten Lösungsmittel Rotationsverdampfer Aufkonzentrieren von Lösungen Abdestillieren des Lösungsmittels Kolben rotiert zum Vermeiden von Siedeverzügen (Verlust von Analytmolekülen) Geeignet für grössere Probenmengen (einige 10 ml bis einige 100 ml) Gegen Ende der Destillation (kleines Volumen): Analytverluste möglich 12

7 Einstellen einer geeigneten Analytkonzentration in einem geeigneten Lösungsmittel speed-vac concentrator ml oder µl Reaktionsgefäß Aufkonzentrieren von Lösungen Abdestillieren des Lösungsmittels (Lösungsmitteltausch) Rotor rotiert in Unterdruckkammer Geeignet für kleinere Probenmengen (einige ml bis wenige µl) Gegen Ende der Destillation (kleines Volumen): Analytverluste möglich aber gering! 13 Einstellen einer geeigneten Analytkonzentration in einem geeigneten Lösungsmittel Einengen der Analytlösung im N 2 -Strom Entfernen letzter Lösungsmittelreste Geeignet für kleine Probenmengen Analyten sammeln sich im spitz zulaufenden Ende des Kolbens Analyten können im Anschluss in einem geeigneten Lösungsmittel in geeigneter Konzentration aufgenommen werden 14

8 Zusammenfassung Elektrophorese 15 Elektrophorese Gel-Elektrophorese Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese Natriumdodecylsulfat-PAGE Kapillarelektrophorese Kapillarzonenelektrophorese Mizellare Elektrokinetische Chromatographie 16

9 Übersicht Gel-Elektrophorese Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Trennung geladener Makromoleküle (z.b. DNA-Fragmente) Trennung aufgrund von Ladung und Grösse (Faltungszustand) Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE) Trennung von Proteinen (als SDS-Protein-Komplex) Trennung nur aufgrund des Molekulargewichts Kapillarelektrophorese (CE) Kapillarzonenelektrophorese (CZE) Trennung geladener, kleiner Moleküle (z.b. Aminosäuren, Ionen) Trennung von Kationen und Anionen (wegen EOF) Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC) Trennung ungeladener, kleiner Moleküle Trennung aufgrund der Polarität (Elutionsreihenfolge analog RP-HPLC) 17 Agarose-Gelelektrophorese Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Standard Probe Proben Aufbringung Moleküle wandern entsprechend ihrer Ladung im elektrischen Feld Das Gel behindert die Moleküle bei ihrer Wanderung Kleine Moleküle wandern schneller als grosse Detektion: chemische Anfärbemethoden (z.b. Fluoreszenz) Trennung aufgrund von Ladung und Molekülgrösse + Probe: DNA-Fragment mit 522 Basenpaaren (bp) z.b.: Auftrennung von DNA-Fragmenten ( Genetischer Fingerabdruck ) 18

10 SDS-PAGE SDS = sodium dodecyl sulfate Natriumdodecylsulfat Natriumlaurylsulfat C 12 H 25 NaO 4 S Tensid, Detergent = Herabsetzen der Grenzflächenspannung zwischen zwei Phasen z.b.: Öl und Wasser fein vermengbar SDS bildet Mizellen SDS denaturiert Proteine SDS bildet negativ geladene Komplexe mit Proteinen 19 SDS-PAGE Trennung von negativ geladenen Komplexen von SDS mit denaturierten, entfalteten Proteinen Faltung beeinflusst nicht die Trennung Zahl der SDS-Moleküle pro Protein hängt nur vom Molekulargewicht ab, Eigenladung der Proteine spielt keine Rolle Trennung von Proteinen nur aufgrund des Molekulargewichts 20

11 Kapillarelektrophorese (capillary electrophoresis = CE) Migration eines Ions im elektrischen Feld E z.b.: Kapillarzonenelektrophorese Analyten müssen geladen sein (basische oder acide Analyten) Elektrophorese ist keine Chromatographie! Adenosin Triphosphat Neuraminsäure 21 CE: Beispiel 75cm Kapillare Voltage: -15/-20/-25/-30 Ammonia bicarbonate EOF block, pumping Trennung von Metaboliten Detektion: In der Regel UV Detektoren Elektropherogramm Kopplung an Massen- Spektrometrie ist schwierig Trennung: Spannung (+/-) Kapillarlänge Puffer 22

12 Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC) Dem Puffer wird ein Tensid (z.b. SDS) zugegeben, welches Mizellen bildet. siehe SDS-PAGE! Abhängig von ihrer Polarität halten sich die Analyten v.a. in der Pufferlösung (polar) oder in den Mizellen (unpolar) auf. Trennung ungeladener Analyten (keine Ionen) Chromatographie Mobile Phase: Pufferlösung (polar) Pseudo-stationäre Phase: Mizellen (unpolar) 23 Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC) Trennung von ungeladenen Analyten Pufferlösung (mobile Phase) bewegt sich wegen EOF in Richtung Kathode Mizellen (pseudo-stationäre Phase) bewegen sich langsamer Elutionsreihenfolge wie in RP-HPLC: polare Moleküle eluieren vor unpolaren hoch Polarität der Analyten gering Detektor wegen EOF kathodenseitig angebracht 24

13 Done! Bei Fragen zur Vorlesung bzw. Prüfung: 25