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1 Validierung von Analysenmethoden

2 Grundlagen Analytische Ergebnisse haben oft weitreichende Konsequenzen. Die Untersuchungen müssen demnach mit nachweislich geeigneten Methoden durchgeführt werden. Die Validierung ist der Nachweis der Gebrauchstauglichkeit.

3 Was bedeutet Validierung EN/IEC 17025: Eine durch Überprüfung erlangte Bestätigung, dass alle Voraussetzungen für eine beabsichtigte Anwendung erfüllt sind Ein Prozess der feststellt, dass eine Methode geeignet ist Validierung einer Analysenmethode beinhaltet: Festlegung der analytisch/chemischen Anforderungen Bestimmung der Methodenparameter Überprüfung, dass die Methode die Anforderungen erfüllt Angabe der Gültigkeit

4 Ziel der Validierung Charakterisierung der Methodenperformance (Kenndaten) Umfang/Anwendungsbereich und Limitierungen Identifizierung von Faktoren die die Charakteristik der Methode ändern können (auch Ausmaß der Änderung) Welchen Analyten kann eine Methode in welcher Matrix in Gegenwart welcher Störungen bestimmen? Mit welcher Messunsicherheit geschieht das?

5 Ziel der Validierung Charakterisierung der Methodenperformance (Kenndaten) Umfang/Anwendungsbereich und Limitierungen Identifizierung von Faktoren die die Charakteristik der Methode ändern können (auch Ausmaß der Änderung) Welchen Analyten kann eine Methode in welcher Matrix in Gegenwart welcher Störungen bestimmen? Mit welcher Messunsicherheit geschieht das?

6 3 Milestones der ISO/IEC Validierung (validation) Basisvalidierung (für in-house Methoden und nicht normierte bzw. von der Norm abweichende Verfahren) Bestätigung (im Falle von über ÖNORM, ISO, EN, DIN etc. normierten Verfahren) Rückführbarkeit der Analysenergebnisse (tracebility) Unsicherheit der Analysenergebnisse (uncertainty)

7 Wozu? Sicherung der Qualität der Analysenergebnisse (im eigenen Interesse) Voraussetzung für Akkreditierung Juristisch abgesichert Forderung der Auftraggeber

8 Wann? Entwicklung einer Methode Änderung einer Methode Wenn Kontrollunterschungen zeigen, daß sich die Methode verändert hat Wenn eine anerkannte Methode in einer neuen Umgebung eingearbeitet werden soll.

9 Checklist Kenndaten der Analysenmethode (im Wesentlichen durch die Grundkalibrierung abgedeckt) Arbeitsbereich - linearer Bereich) / working range - linearity Empfindlichkeit / sensitivity Selektivität, Spezifität / selectivity, specificity Nachweis, Bestimmungsgrenze / limits of detection, determination Eigenschaften des Analysenresultates Rückführbarkeit / traceability (z.b. auf das Internationale Einheitssystem SI) Unsicherheit / uncertainty, unter Berücksichtigung von: Wiederfindung / recovery Robustheit / robustness Wiederholbarkeit / repeatability Reproduzierbarkeit / reproducibility

10 Checklist Kenndaten der Analysenmethode (im Wesentlichen durch die Grundkalibrierung abgedeckt) Arbeitsbereich - linearer Bereich) / working range - linearity Empfindlichkeit / sensitivity Selektivität, Spezifität / selectivity, specificity Nachweis, Bestimmungsgrenze / limits of detection, determination Eigenschaften des Analysenresultates Rückführbarkeit / traceability (z.b. auf das Internationale Einheitssystem SI) Unsicherheit / uncertainty, unter Berücksichtigung von: Wiederfindung / recovery Robustheit / robustness Wiederholbarkeit / repeatability Reproduzierbarkeit / reproducibility

11 Arbeitsbereich / working range Wird durch technische und praktische Erwägungen festgelegt und durch die Validierung bestätigt. (Meist bestimt durch den niedrigsten und höchsten Kalibrations Standard) NWG BG Arbeitsbereich

12 Empfindlichkeit / sensitivity Ein Maß für die Signalauflösung eines Verfahrens. Steigung der Kalibrationsgeraden Differenz in der Analytkonzentration, die der kleinsten detektierbaren Signaldifferenz entspricht

13 Selektivität Spezifität t / selectivity - specificity Selektivität bedeutet bis zu welchem Ausmaß eine Methode geeignet ist, einen Analyten in einer Matrix ohne Störungen der anderen Komponenten zu bestimmen. Spezifität bedeutet 100% Selektivität Die IUPAC empfiehlt diesen Begriff nicht zu verwenden, weil praktisch keine Methode spezifisch ist.

14 Selektivität t / selectivity S E L E K T I V I T Ä T Wägen Photometrie LC LC-DAD LC/GC/CE-ICP-MS NAA GC GC-MS GC-MS-MS ICP-AES, ICP-MS, AAS LC-MS-MS-MS

15 Wiederfindung / recovery A measure of the trueness of a (measurement) procedure (IUPAC 1999) Referenzwert von: R = Messwert Referenzwert - CRM - Spiken einer Reinsubstanz R = c R= C C observed c observed CRM c spike matrix Je näher R = 1, umso kleiner ist die Abweichung in der Prozedur

16 Wiederholbarkeit / repeatability Präzision ausgedrückt als Standardabweichung von n unabhängigen Wiederholmessungen unter Wiederholbarkeitsbedingungen: Gleiches Labor, gleicher Analytiker, gleiches Gerät, kurzes Zeitintervall Für die Variaton zwischen einzelnen Batches oder wiederholten Messungen Auch als Wiederholpräzision bezeichnet Fälschlicherweise mit Messunsicherheit gleichgesetzt

17 Reproduzierbarkeit / reproducibility Präzision unter intermediate precision conditions von n Wiederholungen: gleiches Labor gleiche Meßprozedur Messung über einen längeren Zeitraum Auch genannt: within-laboratory reproducibility, R w Präzision unter reproducibility conditions : Unterschiedliche Laboratorien Unterschiedlicher Analytiker, Gerät, Zeit Gleiche Methode Auch genannt: between-laboratory reproducibility,r Typically used for studying variation on measurements made between laboratories. (Reproducibility according to ISO )

18 Don t forget

19 Robustheit / robustness or ruggedness Wiederholbarkeit (repeatability) und Reproduzierbarkeit (reproducibility) der Analysenergebnisse eines Analysenverfahrens unter Variation verschiedener Bedingungen wie z.b. Methodenparameter (ph, T), Personen, Laboratorien, Geräte oder Geräteteile

20 Rückführbarkeit / traceability des Messergebnisses Lückenlose Rückführung aller, das Meßergebnis beeinflussenden Größen (Waagen, Volumsmeßgeräte, Kalibrationsstandards) auf nationale oder internationale Meßnormale (z.b. SI Einheiten).

21 Nachweisgrenze / Bestimmungsgrenze Es ist wichtig eine statistisch sichere Unterscheidung zwischen dem Messsignal einer Probe und dem Mess-signal des Blindwerts vorzunehmen. α-fehler (falsch positive Entscheidung): Die Wahrscheinlichkeit, dass eine Probe substanzfrei ist, obwohl ein positiver Messwert vorliegt. β-fehler (falsch negative Entscheidung): Die Wahrscheinlichkeit, dass die untersuchte Probe die Substanz doch enthält, obwohl der Messwert als Blindwert angesehen wird.

22 Nachweisgrenze (limit of detection) (Entscheidungsgrenze für f r das Vorhandensein eines Analyten) Die Nachweisgrenze stellt den kleinsten Meßwert dar, der mit einer vorgegebenen Sicherheit vom Blindwert zu unterscheiden ist. Besitzt eine Probe genau diesen Gehalt des Analyten, so wird in 50% der Fälle der konkrete Meßwert kleiner als die Nachweisgrenze sein (β-fehler = 50%). Erhält man bei einer Analyse Meßwerte im Bereich der Nachweisgrenze, kann mit der vorgegebenen Sicherheit (Signifikanz) von z.b. 99% entsprechend einer Unsicherheit von 1% (α-fehler) davon ausgegangen werden, daß der Analyt vorhanden ist. Blindwert Nachweisgrenze 50 % negativ 50 % positiv X 0 X NG Meßwert

23 Nachweisgrenze (limit of detection) (Entscheidungsgrenze für f r das Vorhandensein eines Analyten) Die Nachweisgrenze stellt den kleinsten Meßwert dar, der mit einer vorgegebenen Sicherheit vom Blindwert zu unterscheiden ist. Besitzt eine Probe genau diesen Gehalt des Analyten, so wird in 50% der Fälle der konkrete Meßwert kleiner als die Nachweisgrenze sein (β-fehler = 50%). Erhält man bei einer Analyse Meßwerte im Bereich der Nachweisgrenze, kann mit der vorgegebenen Sicherheit (Signifikanz) von z.b. 99% entsprechend einer Unsicherheit von 1% (α-fehler) davon ausgegangen werden, daß der Analyt vorhanden ist. Blindwert Nachweisgrenze Vorgegebene Sicherheit 3σ = 99.7% => NG = 3 x σ BW 50 % negativ 50 % positiv X 0 X NG Meßwert

24 Erfassungsgrenze nur DIN! (kleinste Konzentration eines Analyten, die mit hoher Wahrscheinlichkeit nachgewiesen werden kann Untere Grenze für f r die Quantifiziernug eines Analyten) Um den β-fehler der Nachweisgrenze zu verringern, wurde die Erfassungsgrenze eingeführt. Sie stellt den Meßwert dar, bei dem der β-fehler gleich dem α-fehler ist. Damit entspricht die Erfassungsgrenze dem 2 fachen der Nachweisgrenze. Unter Zugrundelegung eines α-fehlers von 1% ist der Analyt auch hier, wie bei der Nachweisgrenze, mit einer Sicherheit von 99% nachgewiesen. Blindwert Nachweisgrenze Erfassungsgrenze Vorgegebene Sicherheit = 99.7% α = ß = 1% ß-Fehler α-fehler => EG = 2 x NG = 6 x σ BW X 0 X NG X EG Meßwert

25 Bestimmungsgrenze (limit of determination) (kleinste Konzentration eines Analyten, die quantitativ mit einem m vorgegebenen relativen Fehler bestimmt werden kann Untere Grenze für f r die Quantifizierung innerhalb eines bestimmten Fehlers) Die Analysenpräzision sollte über den gesamten Messbereich gleich groß sein. Die relative analytische Unpräzision (VB) nimmt mit sinkender Konzentration zu. Die BG entspricht jener Konzentration, ab der die geforderte Analysenpräzision (zumeist 33.3%) erfüllt ist. 140 Rel. analyt. Unpräzision VB rel in % % 20 0 XB Konzentration

26 Bestimmungsgrenze (limit of determination) (kleinste Konzentration eines Analyten, die quantitativ mit einem m vorgegebenen relativen Fehler bestimmt werden kann Untere Grenze für f r die Quantifizierung innerhalb eines bestimmten Fehlers) Im Konzentrationsbereich der Bestimmungsgrenze wird die Anwesenheit des Analyten vorausgesetzt. Über das die Kalibrationsgerade umschliessenden Vertrauensband errechnet sich der Bestimmungsfehler ± VB. VB ist in der Arbeitsbereichsmitte am kleinsten und steigt mit zunehmender Entfernung von der Mitte. Es gilt BG = k* VB, näherungsweise auch BG = k * NG. Die Bestimmungsgrenze bezeichnet den Konzentrationswert, bei dem der relative Fehler erstmals die vorgegebene Schranke der Ergebnisunsicherheit unterschreitet. z.b. k=3 entsprechend 33,3% f(x) VB VB Annähernd: BG 3.33 NG => BG = 10 x σ BW x k * VB BG

27 Bestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode Bestimmung erfolgt über das Blindwertrauschen (Blindwertstatistik) => Gültig für alle nicht kalibrierbare Methoden => Gute Annäherung für kalibrierbare Methoden Instrumenteller Blindwert (=> instrumentelle NG) Methodenblindwert (=> NG der Methde) Lineare Kalibrierfunktion (ohne Blankkorrektur) : y=kx + d s bl... Standardabweichung des Blanksignals y NWG =Y bl + 3 s bl y BG =Y bl + 10 s bl NWG = (y NWG d)/k BG = (y BG d)/k

28 Bestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode lineare Kalibration Intensität [cps] Intensität [cps] lineare Kalibration Konzentration[ ng g-1] Konzentration[ ng g-1]

29 Bestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode lineare Kalibration Intensität [cps] 2000 BW 1000 σ Konzentration[ ng g-1]

30 Bestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode lineare Kalibration Intensität [cps] 3 x σ = NG 2000 BW 1000 σ Konzentration[ ng g-1]

31 Bestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode lineare Kalibration Intensität [cps] 3 x σ = NG 2000 BW 1000 σ Konzentration[ ng g-1]

32 Bestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode lineare Kalibration Intensität [cps] 3 x σ = NG 2000 BW 1000 σ 0 NG Konzentration[ ng g-1]

33 Bestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode lineare Kalibration Intensität [cps] 6 x σ = EG 3 x σ = NG 2000 BW 1000 σ NG Konzentration[ ng g-1]

34 Bestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode lineare Kalibration Intensität [cps] 6 x σ = EG 3 x σ = NG 2000 BW 1000 σ NG Konzentration[ ng g-1] EG

35 Bestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode lineare Kalibration 4000 Intensität [cps] 10 x σ = BG 6 x σ = EG 3 x σ = NG BW 1000 σ NG Konzentration[ ng g-1] EG BG

36 Bestimmung über die Kalibrationsgerade Bestimmung erfolgt über die Kalibrationsgerade bei kalibrierbaren Methoden (z.b. Mittels Software DIN Test ): Ausreisserkontrolle + Statistik (t-test...) Bestimmung der NG/EG/BG über die Vertrauensbänder (Berechnung nach DIN 32645) Nachteil der Berechnung: Standards, aus denen die Kalibrationskurve erstellt wurde, müssen eigentlich dieselbe Probenvorbereitungsprozedur wie die Proben durchlaufen, um einen dem Methodenblank entsprechende NG/BG und EG zu ergeben. Standards sollten äquidistant in der Nähe der NG liegen. Bei nicht-linearer Kalibration: Gewichtung der Punkte

37 Bestimmung über die Kalibrationsgerade NG/BG eines Verfahrens kann nicht aus einer einmaligen Kalibrierung ermittelt werden Bei einmaliger Kalibrierung dient die Berechnung der EG zur Überprüfung des unteren Arbeitsbereichsendes. Das untere Arbeitsbereichsende ist nur dann statistisch abgesichet, wenn EG kleiner als die Konzentration des niedrigsten Standards ist. Zur Ermittlung der EG aus der Kalibration wird mehrfach mit immer kleineren Standarkonzentrationen kalibriert. Liegt die berechnete EG im Bereich der niedrigsten Standardkonzentration, wird das Ergebnis als EG genommen.

38 Angabe von Analysenergebnissen lt. DIN x < NG: nicht nachgewiesen (mit NG), Höchstgehalt EG NG < x < EG: nachgewiesen, nicht quantifizierbar EG < x < BG: quanitifzierbar x > BG: Gehalt mit Konfidenzintervall bzw. Messunsicherheit Allgemein: x < NG : < NG NG < x < BG: [Wert] x > BG: Wert +/- Fehler NG und BG müssen für jede Probenart (Matrix) separat ermittelt bzw. angegeben werden und dürfen sich nicht nur auf Standardlösungen beziehen. Beim Vergleich der NG und BG verschiedener Laboratorien ist es wichtig, wie diese Parameter ermittelt worden sind und auf welche Matrix sich diese beziehen. Für worst case -Betrachtungen von Werten unter der NG (n.n. Werte) kann gemäß DIN die Erfassungsgrenze als möglicher Höchstgehalt herangezogen werden.

39 Angabe von Analysenergebnissen lt. DIN x < NG: nicht nachgewiesen (mit NG), Höchstgehalt EG NG < x < EG: nachgewiesen, nicht quantifizierbar EG < x < BG: quanitifzierbar x > BG: Gehalt mit Konfidenzintervall bzw. Messunsicherheit Allgemein: x < NG: < NG NG < x < BG: [Wert] x > BG: Wert +/- Fehler NG und BG müssen für jede Probenart (Matrix) separat ermittelt bzw. angegeben werden und dürfen sich nicht nur auf Standardlösungen beziehen. Beim Vergleich der NG und BG verschiedener Laboratorien ist es wichtig, wie diese Parameter ermittelt worden sind und auf welche Matrix sich diese beziehen. Für worst case -Betrachtungen von Werten unter der NG (n.n. Werte) kann gemäß DIN die Erfassungsgrenze als möglicher Höchstgehalt herangezogen werden.

40 Beispiel Bei der Bestimmung von Pb in Trinkwasser mittels ICP-MS wurde eine Kalibrationsgerade von I[cps] = x c[ng g -1 ] (nach Blank Korrektur). Für den Blank wurden nun folgende Intensitäten gemessen: 1520; 1340; 1850; 1250; 1670 cps Berechnen Sie die NG/EG/BG dieser Messung.

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