DISSERTATION. zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der

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August Reuter
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1 Isolierung und Charakterisierung eines Hemmstoffes der Na + /K + -ATPase aus Penicillium lagena und Optimierung der Wachstumsbedingungen bezüglich der Bildung von Hemmstoffen der Na + /K + -ATPase in verschiedenen Mikroorganismen DISSERTATION zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg von Diplom-Chemikerin Edda Frerichs geb. am in Berlin Gutachter: l.prof. Dr. M. Luckner 2. Prof Dr. J. Lasch 3. Prof. Dr. M.-R. Kula

2 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Die Na7K + -ATPase als Transportenzym und Herzglykosid-Rezeptor Herzglykoside und Digitalis-Like Substances (DLS) Plectomycetes und Streptomycetes Zielstellung Testverfahren für Herzglykoside und Digitalis-Like Substances Hemmung solubilisierter Na7K + -ATPase (gekoppelter optischer Test) Rezeptorassay (RA) Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay (FPIA) Radioimmunoassay (RIA) Enzymgebundener Immunoassay (ELISA) Rubidium-Aufnahme intakter Zellen (Pumpleistung der Na + /K + -ATPase) Weitere Testmethoden an intakten Zellen Material und Methoden Testdurchflihrungen Gekoppelter optischer Test Durchfuhrung Auswertung Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay (Abbott TDxFLx ) Rezeptorassay mit [ 3 H]-Digoxin an solubilisierter Na7K + -ATPase Rezeptorassay an Na + /K*-ATPase von Kaninchen-Erythrozyten und Ghosts Gewinnung der Kaninchen-Erythrozyten Präparation der Erythrozyten-Ghosts nach BILLAH et al. (1976) Proteinbestimmung nach BRADFORD (1976) Hämoglobinbestimmung.! Durchfuhrung zur Bestimmung der Bindungskapazität der Erythrozyten Testdurchfuhrung mit Anthroylouabain Durchführung zur Bestimmung der Bindungskapazität der Ghosts Testdurchfuhrung mit [ 3 H]-Digoxin Mikrobiologische Arbeiten 23

3 3.2.1 Anzucht der Vorkulturen Stammhaltung und -konservierung Kulturführung Reinheit der Stämme Nährstoffbestimmung im Kulturmedium Zuckerbestimmung Ammoniumbestimmung Phosphatbestimmung Zellgewinnung Erstellung der Wachstumskurven Optimierung der physikalischen Wachstumsparameter ph-werte Schüttelfrequenz Temperatur Einfluß von Schikanen Inokulum Optimierung einiger Nährstoffparameter Glukosekonzentration Hefeextraktgehalt verschiedene Nährmedien Gewinnung der Rohextrakte (Extraktionsversuche) Adsorptionsversuche Chromatographische Trennmethoden Reversed-Phase-Chromatographie Gelpermeationschromatographie Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) Gaschromatographie (GC/MS) Hochleistungsdünnschichtchromatographie (HPTLC) Methoden zur Strukturaufklärung Kernresonanzspektroskopie (NMR) Massenspektroskopie (MS) Infrarotspektroskopie (IR) Chemikalien 34

4 4. Ergebnisse Aufbau eines Rezeptorassays an Kaninchen-Erythrozyten und ihren Ghosts Verwendung von Erythrozyten und fluoreszenzmarkiertem Ouabain (AO) Bestimmung der Bindungskapazität der Na7K + -ATPase von Erythrozyten mit AO Bestimmung der Nachweisgrenze im Ganzzell-Rezeptorassay mit AO Verwendung von Erythrozyten-Ghosts und tritiummarkiertem Digoxin Bestimmung der Bindungskapazität der Na7K + -ATPase von Erythrozyten-Ghosts mit [ 3 H]-Digoxin Bestimmung der Nachweisgrenze im Ganzzell-Rezeptorassay mit [ 3 H]-Digoxin Charakterisierung von Penicillhim lagena und Streptomyces californicus Optimierung der Wachstumsbedingungen bezüglich der Bildung von Hemmstoffen der Na7K + -ATPase in Mikroorganismen Vergleich der Hemmstärke von drei Mikroben Penicillhim lagena und Streptomyces californicus ". 2.1 ph-wert Temperatur Umdrehungszahl des Kreisschüttlers Alter des Inokulums Glukosekonzentration Hefeextraktkonzentration Andere Nährmedien Einfluß der Kultivierungsgefäße auf Produktbildung und Zellproduktion Nährstoffverwertung und Produktbildung (Wachstumskurven) Probenvorbereitung zur Hemmstoffisolierung aus Streptomyces californicus Gewinnung des Rohextraktes Rohextraktreinigung durch Adsorption an Extrelut Isolierung eines Hemmstoffes der Na7K + -ATPase aus Penicillhim lagena Trockenzellgewinnung aus dem Kulturmedium Probenvorbereitung Extraktion Adsorption Niederdrucksäulenchromatographie 62

5 Reversed-Phase-Chromatographie Gelpermeationschromatographie Hochdruckflüssigkeitschromatographie Aufreinigungsschema Strukturaufklärung Kernresonanzspektroskopie Gaschromatographie/Massenspektroskopie Infrarotspektroskopie ' Charakterisierung des isolierten Hemmstoffes Temperaturstabiliät Säure-Base-Einfluß auf das Hemmverhalten Vergleich des Hemmstoffs mit Herzglykosiden mittels HPTLC Charakterisierung der Hemmeigenschaften Kompetitive Verdrängung vom Rezeptor durch Kalium Diskussion Zusammenfassung Literaturverzeichnis Anhang Verzeichnis der Abkürzungen Verzeichnis der Abbildungen Verzeichnis der Tabellen Literatur-Spektren

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