Optimierung der tuberkuloziden Wirksamkeitsprüfung nach DIN EN 14348
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- Klaudia Schulze
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1 Optimierung der tuberkuloziden Wirksamkeitsprüfung nach DIN EN F. H. H. Brill 1, J. Lenz 2, N. Radischat 3, C. Lach 2, H. Gabriel 1, L. Paßvogel 3, K. Steinhauer 3 1 Dr. Brill + Partner GmbH - Institut für Hygiene und Mikrobiologie, Hamburg; 2 Chemische Fabrik Dr.Weigert GmbH & Co.KG, Hamburg; 3 Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt DGKH-Kongress,
2 Relevanz von Mykobakterien im medizinischen Umfeld Tuberkulose neben HIV/AIDS & Malaria häufigste Infektionskrankheit Neuerkrankungen: ca. 9 Mio. pro Jahr ca. 1/3 der Weltbevölkerung infiziert Tote: ca. 1,4 Mio. pro Jahr: aufgrund unzureichender Behandlung Infektion wird i.d.r. über Aerosole von Patienten mit offener Lungentuberkulose übertragen Tuberkulose-Infektionen sind eigentlich heil- & vermeidbar Achtung: zunehmende Prävalenz von MDR und XDR Erhöhter Bedarf an Präventivmaßnahmen, z.b. Desinfektion Quelle: RKI-Ratgeber für Ärzte DGKH-Kongress,
3 Aktuelle Methode zur Tuberkulozidie-Prüfung Chemische Neutralisation ist beschrieben Kultivierung auf Middlebrook Nährboden für 21 Tage DGKH-Kongress,
4 Technische Herausforderungen bei der Wirksamkeitsprüfung nach aktueller EN (2005) Prüforganismus (M. terrae) neigt zur Aggregation (Woelk et al., 2003*) Reproduzierbarkeit nicht optimal Verdünnungs-Neutralisationsverfahren nicht immer erfolgreich z.b. bei Amin-basierten Produkten (keine validen Kontrollen) *Influence of Storage on Monodispersed Cells of Mycobacterium terrae Used for Quantitative Carrier Test pren 14563, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Nov. 2003, p DGKH-Kongress,
5 Neue Ansätze zur Verfahrensoptimierung Zu prüfenden Ideen: Anti-Aggregation der Mykobakterienzellen mit Ultraturrax Probleme der Neutralisation bei Amin-basierten Produkten beheben - Testung alternativer Neutralisationsmedien / -methoden DGKH-Kongress,
6 Ausgangsbedingungen EN 14348:2005 Tests mit dem Wirkstoff: Amin (Lonzabac ) Mycobacterium terrae (ATCC 15755) Einwirkzeit: 60 min Belastung: clean conditions 4 log-reduktion DGKH-Kongress,
7 Neutralisation Alternative chemische Neutralisation Einsatz zusätzlicher Stoffe: Lipofundin MTC 20% (gute Erfahrung bei Legionellen-Tests) Verdünnungen bis zu 0,01% Produkt Lipofundin MTC 20% : Öl Wasser Emulsion für Infusionen DGKH-Kongress,
8 Ergebnis-Beispiel Kontrolle C (Verfahrenskontrolle) nicht valide, kein Zellwachstum Kontrolle B valide, das Neutralisationsmittel ist nicht toxisch Keine logischen Keimzahlergebnisse bei Verdünnungen Verdünnung KBE unverdünnt 0 0 1: : DGKH-Kongress,
9 Aggregation der Mykbakterienzellen Fluoreszenzmikroskopische Bilder von M. terrae Zellen (x1.000) eingefärbt mit LIVE/DEAD BacLight bacterial viability kit a) Frisch homogenisierte Zellen b) gelagert bei 4 C für 48 h c) gelagert bei 4 C für 96 h Woelk et. al, 2003
10 Alternatives Neutralisationsverfahren mit Membranfiltration Idee: Membranfiltration ist in anderen Suspensionsversuchen, z.b. EN 13727, EN beschrieben In EN nicht als Option angegeben, warum? NEU: Sättigung der Membran mit Natriumoleat-Tween 80- Lösung um Amin-Rückstände auf der Membran zu verhindern (gute Erfahrungen mit Legionellen-Tests) Natriumoleat : Salz der Ölsäure DGKH-Kongress,
11 Neutralisation Membranfiltration in Kombination mit chemischer Neutralisation Vorspülen mit 200 ml Natriumoleat-Tween-Lösung (zur Membransättigung) Vorlegen von 400 ml Tween-Lecithin-Lösung Zugabe der Prüflösung Nachspülen mit 500 ml Aqua bidest DGKH-Kongress,
12 Anti-Aggregation nach Inaktivierung Verhinderung der Aggregation durch mechanische Behandlung Entscheidung für Ultra-turrax Gute Erfahrungen bei anderen Prüforganismen
13 Neutralisation Membranfiltration in Kombination mit chemischer Neutralisation Kontrolle C (Verfahrenskontrolle) ist valide Kontrolle B ist valide, das Neutralisationsmittel ist nicht toxisch logische Keimzahlergebnisse bei Verdünnungen Verdünnung KBE unverdünnt : DGKH-Kongress,
14 Neutralisation Membranfiltration in Kombination mit chemischer Neutralisation verringertes Spülvolumen Vorspülen mit 100 ml Natriumoleat- Tween-Lösung zur Membransättigung Vorlegen von 100 ml Tween-Lecithin- Lösung Zugabe der Prüflösung Nachspülen mit 100 ml Aqua bidest Prüfung ist auch valide! DGKH-Kongress,
15 Neutralisation- Membranfiltration Wiederfindung von ca. 100 Zellen Unterschiedliche Wiederfindungsraten: Ø: 47 mm Porengröße: 0,45 µm Filter Lab 1 Lab 2 Lab 3 Merck 76% 86% 80% Whatman 85% 85% 90% Sartorius 40% 17% 74% Wahl der Filter kann Einfluss auf das Prüfergebnis haben Filtereinsatz muss zunächst validiert werden ggf. Begründung für Ausschluss des Verfahrens in EN DGKH-Kongress,
16 Zusammenfassung Gemeinsame SOP wichtig für Zusammenarbeit (!) Neutralisation mit Membranfiltration Sättigung der Membran und Anti-Aggregation nach Neutralisation entscheidend Membranfiltersystem muss zunächst validiert werden DGKH-Kongress,
17 Ausblick Untersuchungen zur Aggregatbildung und Anti-Aggregation Vorbereitung einer Publikation Prüfung mit formulierten Produkten Einbringen der Erkenntnisse bei Revision der EN in 2019 Übertragung der Ergebnisse auf M. avium & Keimträgerversuche nach EN 14563? DGKH-Kongress,
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