1. Grundoperationen der Gentechnik Schneiden von DNA

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1 1. Grundoperationen der Gentechnik Schneiden von DNA Eines der wichtigsten Werkzeuge der Gentechnik sind Restriktionsenzyme. Sie dienen sowohl dazu, die DNA aus dem Spenderorganismus in Bruchstücke zu zerlegen, als auch zum Aufschneiden der Transport-DNA, in die die Spender-DNA eingefügt werden soll. Restriktionsenzyme lassen sich aus Bakterien gewinnen, die sich mithilfe dieser Enzyme gegen eingedrungene Fremd-DNA schützen. Die Enzyme zerschneiden beispielsweise die eingeschleuste DNA von Bakteriophagen, sodass sich diese in der Bakterienzelle nicht mehr vermehren können. Wegen dieser Einschränkung oder Restriktion der Phagenvermehrung werden die Enzyme als Restriktionsenzyme bezeichnet. Exakt heißen sie Restriktionsendonucleasen, weil sie DNA nicht vom Ende des Moleküls her, sondern von innen abbauen. Die Benennung der verschiedenen Restriktionsenzyme richtet sich vor allem nach den Bakterien, aus denen sie isoliert wurden: Eco steht zum Beispiel für Escherichia coli, Hae für Haemophilus aegypticus, Hin für Haemophilus influenzae. Weitere Buchstaben bezeichnen den jeweiligen Bakterienstamm. Eine römische Ziffer gibt zusätzlich die zeitliche Reihenfolge ihrer Entdeckung an. Substratspezifität. Restriktionsenzyme sind wie alle Enzyme substrat- und wirkspezifisch. Jede Enzymart spaltet die DNA spezifisch an einer bestimmten Schnittstelle, die sie an der DNA- Sequenz erkennt. Diese Erkennungssequenzen zeigen häufig eine spezielle Symmetrie: Die Basensequenz des einen DNA-Strangs entspricht von links nach rechts gelesen der Basenfolge des komplementären Strangs in umgekehrter Lesrichtung. Solche Palindrome gibt es auch in der Sprache: Wörter, die vorwärts und rückwärts gelesen werden können wie STETS, REGALLAGER oder RELIEFPFEILER. Die Bakterien schützen ihre eigene DNA vor den Restriktionsenzymen, indem sie die Erkennungssequenzen durch Methylierung tarnen". In seltenen Fällen wird die DNA eingedrungender Phagen methyliert, sodass auch diese gegen den Abbau durch Restriktionsenzyme geschützt sind. Wirkspezifität. Restriktionsenzyme spalten die Zucker-Phosphat Bindungen in beiden DNA- Strängen. Dabei schneiden sie stets zwischen den gleichen Nucleotiden. HaeIII schneidet zum Beispiel immer zwischen G und C. Da es sich in diesem Fall um komplementäre Basen handelt, liegen die Schnittstellen auf beiden Strängen einander genau gegenüber. Die meisten Enzyme schneiden die DNA-Stränge jedoch versetzt, sodass die Schnitte einige Nucleotide voneinander entfernt liegen. Bei EcoRI sind die Schnittstellen beispielsweise um vier Basenpaare versetzt. Dadurch bleiben nach dem Schnitt einzelsträngige Enden stehen. Da diese Einzelstrangenden zueinander komplementär sind und sich wegen der Basenpaarung wieder zusammenfinden können, werden sie als klebrige Enden" bezeichnet. Anwendung. Inzwischen sind mehr als 3800 verschiedene Restriktionsenzyme bekannt und über 600 im Handel erhältlich, mit denen man DNA beliebiger Herkunft in Fragmente unterschiedlicher Größe zerlegen kann. Da jede DNA, die mit demselben Enzym geschnitten wurde, die gleichen klebrigen Enden aufweist, lassen sich DNA-Bruchstücke verschiedener Organismen miteinander verknüpfen. Die passenden Einzelstrangenden lagern sich spontan zusammen und werden durch das Enzym DNA-Ligase verbunden. Die für ein Individuum typische Verteilung der Restriktionsschnittstellen auf dem DNA-Molekül ist die Grundlage für den genetischen Fingerabdruck.

2 2. Grundoperationen der Gentechnik: Übertragen von DNA Rekombinante DNA kann nur dann in Genprodukte umgesetzt werden, wenn sie in eine Wirtszelle gelangt. Für die Übertragung benutzt man häufig Vektoren, DNA-Moleküle, die bestimmte Eigenschaften haben sollten. Vektoren müssen replizierbar sein, das heißt eine Sequenz aufweisen, die als Replikationsursprung dient. Außerdem sollte die Vektor-DNA Markergene enthalten, also zumindest für ein erkennbares Merkmal codieren, sodass sich leicht überprüfen lässt, ob die Übertragung erfolgreich war. Als Vektoren dienen Plasmide und Viren. Inzwischen gibt es aber auch verschiedene Verfahren zur direkten Übertragung von DNA. Plasmide als Vektoren. Die gebräuchlichsten Vektoren für die Genübertragung in Bakterien sind Plasmide. In gentechnischen Verfahren finden häufig konstruierte Plasmide Verwendung, die entsprechend den Erfordernissen des jeweiligen Versuchs aus Bestandteilen mehrerer natürlicher Plasmide zusammengebaut werden. Solche Plasmide werden dann nach ihrem Hersteller benannt: psc101 ist das Plasmid, das STANLEY COHEN bei seinem historischen Experiment benutzte. Ein häufig verwendetes künstliches Plasmid ist pbr322. Es besteht aus einem Plasmid von E. coli mit dem Replikationsursprung, einem Gen für die Resistenz gegen das Antibiotikum Tetracyclin aus dem Plasmid psc101 und einem Resistenzgen gegen das Antibiotikum Ampicillin. Beide Resistenzgene enthalten Schnittstellen für verschiedene Restriktionsenzyme. Zum Einschleusen fremder Gene in Pflanzenzellen dient häufig ein Plasmid aus dem Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens, das Tumoren an zweikeimblättrigen Pflanzen verursacht. Auf diesem Plasmid befinden sich Gene, die den Gentransfer und das Tumorwachstum steuern. Man bezeichnet es daher als Ti-Plasmid (für Tumor induzierend). Um die Tumorbildung zu verhindern, werden die daran beteiligten Gene entfernt und durch erwünschte Gene ersetzt. Viren als Vektoren. Da Agrobacterium tumefaciens auf zweikeimblättrige Pflanzen spezialisiert ist, kann das Ti-Plasmid bei wichtigen Kulturpflanzen nicht eingesetzt werden. Für einkeimblättrige Pflanzen benutzt man daher spezielle Viren als Vektoren. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist allerdings, dass die Vektor-DNA mit dem Fremdgen häufig nicht in das Genom der Empfängerzelle integriert wird. Außerdem kann die Infektion mit dem Virus die Pflanze schädigen. Beim Gentransfer auf Tierzellen werden meist modifizierte Viren als Vektoren verwendet. Hierbei spielen vor allem Retroviren eine Rolle. Retroviren, zu denen auch HIV zählt, sind bei Wirbeltieren verbreitet. Ihre Erbsubstanz besteht aus RNA. Mit Hilfe von zwei Enzymen, reverser Transkriptase und Integrase, verankern sie ihr Genom stabil in den Chromosomen der Zelle. Direkte Genübertragung. Vor allem in der Pflanzenzucht wird wegen der Probleme mit Vektorsystemen DNA häufig direkt übertragen. Grundlage dafür ist die Protoplastenkultur. Alle Verfahren beruhen darauf, dass die DNA durch Zellmembran und Kernhülle hindurch in den Zellkern gelangt. Die einfachste Methode ist die Inkubation. Dabei wird Fremd-DNA durch Endocytose in Protoplasten aufgenommen. Um die Aufnahme zu erleichtern, setzt man häufig Polyethylenglykol (PEG) ein, eine Substanz, die ursprünglich der Fusion von Protoplasten diente. Legt man für wenige Millisekunden eine hohe Spannung an, entstehen Poren in der Zellmembran, durch die DNA eingeschleust wird. Das Verfahren heißt Elektroporation. Beim Partikelbeschuss (engl. genegun) werden winzige Gold- oder Wolframkügelchen von 1 bis 3 m Durchmesser mit Fremd-DNA überzogen und mit hoher Geschwindigkeit in die Pflanzenzellen geschossen. Bei Tieren wird Fremd-DNA meist mithilfe einer feinen Hohlnadel oder Mikrokapillare in die Zellen injiziert. Das Verfahren, dass auch in der Gentherapie bei Menschen Anwendung findet, wird als Mikroinjektion bezeichnet.

3 3. Grundoperationen der Gentechnik: Selektion transgener Zellen Femd-DNA lässt sich nicht gezielt in einen Vektor einfügen. Zwar entscheidet die Wahl des Restriktionsenzyms darüber, an welcher Stelle der Vektor aufgeschnitten wird. Ob sich die DNA tatsächlich an die klebrigen Enden anlagert und in das Genom integriert wird, lässt sich jedoch nicht sicher voraussagen. Auch die Transformation, also die Aufnahme der Vektor-DNA in die Zellen, ist nicht immer erfolgreich. Für das weitere Verfahren ist es also notwendig, diejenigen Zellen zu selektieren, die das gewünschte Genn aufgenommen haben. Transformation. Bei der Übertragung von DNA auf Plasmide entstehen im Reagenzglas DNA-Ringe mit und ohne Fremd-DNA, die sich zunächst nicht unterscheiden lassen. Diese Mischung wird anschließend zu einer Kultur von Empfängerzellen hinzugegeben. Es wurden verschiedene Verfahren entwickelt, um die Transformation zu erleichtern. Coli- Bakterien behandelt man beispielsweise mit Calcium-lonen, damit Zellwand und Zellmembran durchlässiger werden. Trotzdem nimmt nur etwa jede Zelle ein Plasmid auf. Das Plasmid pbr322 enthält zwei Resistenzgene gegen die Antibiotika Tetracyclin und Ampicillin. Behandelt man das Plasmid mit dem Restriktionsenzym PstI, so wird der DNA-Ring im Bereich des Ampicillin-Resistenzgens aufgeschnitten. Fremd-DNA, die sich dort einfügt, macht das Resistenzgen unlesbar". In Plasmiden ohne Fremd-DNA bleibt das Ampicillin-Gen intakt. Alle Plasmide werden durch Zugabe von DNA- Ligase wieder geschlossen. Anschließend transformiert man E.-coli-Zellen mit dem Plasmidgemisch. Selektion. In einem ersten Schritt werden die Zellen ausgelesen, die überhaupt ein Plasmid aufgenommen haben. Der zweite Schritt dient dem Identifizieren der Zellen, deren Plasmid die Fremd-DNA enthält. Dazu kultiviert man die Bakterien zunächst auf einem Nährboden, der das Antibiotikum Tetracyclin enthält. Dabei gehen alle Zellen zugrunde, die kein Plasmid aufgenommen haben, während die Zellen mit Plasmid wegen der Tetracyclin- Resistenz zu Kolonien heranwachsen. Mithilfe eines Samtstempels überträgt man eine Kopie" der Kolonien auf einen zweiten Nährboden, der das Antibiotikum Ampicillin enthält. Da auf dem Nährboden mit Ampicillin nur Bakterien mit Plasmiden ohne Fremd- DNA zu Kolonien heranwachsen, können durch Vergleich mit dem ersten Nährboden die Kolonien identifiziert werden, die von transformierten Bakterien stammen. Heute benutzt man zur Selektion bevorzugt Markergene, die für fluoreszierende Proteine codieren. Pipettier-Roboter erkennen die fluoreszierenden Kulturen und wählen sie aus.

4 4. Grundoperationen der Gentechnik: Finden und Gewinnen von Genen Um ein Merkmal eines Spenderorganismus in einem Empfängerorganismus zur Ausprägung zu bringen, muss man wissen, welches Gen für dieses Merkmal codiert. Das Problem besteht darin, im gesamten Genom eines Organismus genau den DNA-Abschnitt zu finden, der das betreffende Gen enthält. In der Praxis werden drei Informationsträger zur Gewinnung von Genen genutzt: die Basensequenz der DNA selbst, die Basensequenz der davon kopierten mrna und die Amino-säuresequenz des danach synthetisierten Proteins. Genomische Bibliotheken. Ein DNA-Abschnitt lässt sich nur dann direkt aus dem Genom eines Organismus gewinnen, wenn die Anordnung der Gene auf der DNA und die Verteilung der Schnittstellen für Restriktionsenzyme bekannt sind. Da dies in der Regel nicht zutrifft, arbeitet man nach dem Schrotschuss-Verfahren. Dazu spaltet man die gesamte DNA durch ein Restriktionsenzym in Fragmente, die anschließend einzeln in Plasmide oder Phagen eingebaut werden. Die Vektoren werden in Bakterien eingeschleust und kloniert. Als Ergebnis erhält man Klone mit Tausenden von Kopien jedes DNA-Fragments aus dem Spender-Genom. Eine solche Sammlung von Genom-Fragmenten heißt genomische Bibliothek. Herstellung von cdna. Zellen, die auf die Herstellung eines Proteins spezialisiert sind, enthalten große Mengen an mrna für dieses Protein. Die mrna lässt sich isolieren und als Vorlage für einen komplementären DNA-Strang verwenden. Diese umgekehrte Transkription" wird durch das Enzym reverse Tronskriptase katalysiert, das bei Retroviren das in RNA codierte Virengenom in DNA umschreibt. Nach enzymatischer Entfernung der mrna Vorlage wird mithilfe von DNA- Polymerase der komplementäre DNA-Strang ergänzt. Diese cdna (von engl. copy: Kopie) ist die exakte DNA-Kopie einer mrna. Verwendet man für das Verfahren alle mrna-moleküle in einer Zelle, erhält man eine cdna-bibliothek. Sie ist bedeutend kleiner als eine genomische Bibliothek, da sie nur diejenigen DNA-Sequenzen enthält, die in der untersuchten Zelle gerade exprimiert wurden. Hybridisierung mit Gensonden. Um Gene in einer cdna- oder genomischen Bibliothek zu finden, verwendet man Gensonden. Das sind kurze, einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle, die zu Abschnitten der Basensequenz des gesuchten Gens komplementär sind und mit diesen hybridisieren, also Basenpaarungen eingehen. Das Verfahren dient auch dazu, homologe Sequenzen in DNA-Proben unterschiedlicher Herkunft nachzuweisen und so deren Ähnlichkeit zu bestimmen. Die Proben werden mit Restriktionsenzymen versetzt und durch Gelelektrophorese aufgetrennt. Für die Hybridisierung mit der Gensonde müssen die DNA- Fragmente auf einen festen Träger, meist eine Nitrocellulose- oder Nylonmembran, übertragen werden. Da man sich dabei der kapillaren Saugkraft der Membran bedient, wird die Methode nach ihrem Entdecker als Southern Blotting bezeichnet (von engl. blotting paper: Löschpapier). Die DNA-Fragmente werden denaturiert, also in Einzelstränge gespalten, sodass sich die Sonde anlagern kann. Ist diese radioaktiv markiert, lässt sich die Lage der gesuchten DNA-Sequenz autoradiographisch ermitteln. Durch In-situ-Hybridisierung (von lat. in situ: in der natürlichen Lage) lassen sich einzelne Gene oder DNA-Abschnitte auch direkt in Chromosomen- oder Gewebepräparaten sichtbar machen. Dafür verwendet man kurze DNA- oder RNA-Sonden, die mit unterschiedlichen Molekülen markiert werden. Für diese Moleküle gibt es jeweils spezifische Antikörper. Sind die Antikörper mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt, so kann man einzelne Gene im Fluoreszenzmikroskop anhand der Farbe lokalisieren. RFLP-Analyse. Bei der gelelektrophoretischen Auftrennung von DNA-Fragmenten erzeugt jedes Fragment einer bestimmten Länge eine Bande. So entsteht ein charakteristisches Bandenmuster. Untersucht man homologe DNA-Abschnitte von verschiedenen Personen, die sich in ihren Basensequenzen geringfügig unterscheiden, so erhält man verschiedene Bandenmuster, wenn von den Unterschieden auch Restriktionsschnittstellen betroffen sind. Das führt dazu, dass die Restriktionsfragmente der homologen DNA-Abschnitte verschiedener Personen unterschiedlich lang sind. Dieses Phänomen bezeichnet man als Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP). Schon wenige solcher RFLPs können einen genetischen Fingerabdruck eines Menschen liefern.

5 Aufgaben 1. Erklären Sie, weshalb nur solche Bakterien auf dem ampicillinhaltigen Nährboden zu Kolonien heranwachsen, die Plasmide ohne Fremd-DNA aufgenommen haben. 2. Wählen Sie anhand von Bild 1 auf AB 1 und Bild 2 auf AB 2 ein geeignetes Restriktionsenzym aus, um das Verfahren in umgekehrter Reihenfolge durchzuführen: Inaktivierung des Tetracyclin-Gens und Selektion mit Ampicillin. 3. Die Verwendung von Fluoreszenz- Markengenen bietet gegen über dem Einsatz von Antibiotika-Resistenzgenen einen Vorteil. Geben Sie an, worin der Vorteil besteht. Aufgaben 1. Erklären Sie, weshalb nur solche Bakterien auf dem ampicillinhaltigen Nährboden zu Kolonien heranwachsen, die Plasmide ohne Fremd-DNA aufgenommen haben. 2. Wählen Sie anhand von Bild 1 auf AB 1 und Bild 2 auf AB 2 ein geeignetes Restriktionsenzym aus, um das Verfahren in umgekehrter Reihenfolge durchzuführen: Inaktivierung des Tetracyclin-Gens und Selektion mit Ampicillin. 3. Die Verwendung von Fluoreszenz- Markengenen bietet gegen über dem Einsatz von Antibiotika-Resistenzgenen einen Vorteil. Geben Sie an, worin der Vorteil besteht. Aufgaben 1. Erklären Sie, weshalb nur solche Bakterien auf dem ampicillinhaltigen Nährboden zu Kolonien heranwachsen, die Plasmide ohne Fremd-DNA aufgenommen haben. 2. Wählen Sie anhand von Bild 1 auf AB 1 und Bild 2 auf AB 2 ein geeignetes Restriktionsenzym aus, um das Verfahren in umgekehrter Reihenfolge durchzuführen: Inaktivierung des Tetracyclin-Gens und Selektion mit Ampicillin. 3. Die Verwendung von Fluoreszenz- Markengenen bietet gegen über dem Einsatz von Antibiotika-Resistenzgenen einen Vorteil. Geben Sie an, worin der Vorteil besteht.

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