Spektroskopische Untersuchungen des lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfers in Roseobacter denitrificans

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1 Aerobe photosynthetische Bakterien Spektroskopische Untersuchungen des lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfers in Roseobacter denitrificans Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt von Claudia Schwarze September 2002

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3 Dekan: Prof. Dr. P. Gräber Vorsitzender des Promotionsausschusses: Prof. Dr. G. Schulz Referent: Prof. Dr. P. Gräber Koreferent: PD Dr. A. Labahn Tag der Bekanntgabe des Prüfungsergebnisses: 31. Oktober 2002 Teile der vorliegenden Arbeit bilden den Inhalt der folgenden Publikationen und Tagungsbeiträgen: Publikationen: C. Schwarze, A. V. Carluccio, G. Venturoli und A. Labahn (2000) Photo-induced cyclic electron transfer involving cytochrome bc 1 complex and reaction center in the obligate aerobic phototroph Roseobacter denitrificans. European Journal of Biochemistry 267, C. Schwarze, A. Labahn, A. V. Carluccio und G. Venturoli (1998) Evidence for lightinduced cyclic electron transfer in chromatophores of Roseobacter denitrificans. In Photosynthesis: Mechanism and Effects (Garab, G., ed.), Vol. III, pp Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, The Netherlands Vorträge: A. Labahn, O. Hucke, C. Schwarze und G. Venturoli Struktur und Funktion des photosynthetischen Apparates aerober photosynthetischer Bakterien Hauptversammlung der Deutschen Bunsen- Gesellschaft für Physikalische Chemie in Potsdam, Deutschland ( Mai 2002) C. Schwarze, O. Hucke, S. Herter, G. Drews, G. Venturoli und A. Labahn Die Funktion des Photosyntheseapparates im Bakterium Roseobacter denitrificans. Kolloquium Bioenergetik der Bakterien, Mauloff / Taunus, Deutschland ( September 2000) D. Zannoni, C. Schwarze, A. Labahn, M. Candela und G. Venturoli Electron transport and energy transduction in membranes from the obligate aerobic (photosynthetic) bacterium Roseobacter denitrificans. 10 th International Symposium on Phototrophic Procaryotes, Barcelona, Spanien ( August 2000) III

4 C. Schwarze, A. Carluccio, G. Venturoli und A. Labahn Q-Cycle model of photo-induced electron transfer in aerobic photosynthetic bacteria from Roseobacter denitrificans. 44 th Annual Meeting of the American Biophysical Society, New Orleans, Louisiana, U.S.A. ( Februar 2000) Biophysical Journal 78, 24A C. Schwarze, A. V. Carluccio, G. Venturoli und A. Labahn Elektronentransferreaktionen am Cytochrom bc 1 Komplex in Roseobacter denitrificans. Veranstaltung des Graduiertenkollegs Systeme von ungepaarten Elektronen in Chemie, Physik und Biologie in Titisee-Neustadt, Deutschland ( Januar 2000) C. Schwarze, A. V. Carluccio, G. Venturoli und A. Labahn Licht-induzierter zyklischer Elektronentransfer in aeroben Bakterien. Veranstaltung des Graduiertenkollegs Systeme von ungepaarten Elektronen in Chemie, Physik und Biologie in Titisee-Neustadt, Deutschland ( Januar 1999) Posterpräsentationen: C. Schwarze, A. Labahn, A. V. Carluccio und G. Venturoli Evidence for light-induced cyclic electron transfer in chromatophores of Roseobacter denitrificans. 11 th International Photosynthesis Congress, Budapest, Ungarn ( August 1998) O. Hucke, C.Schwarze, N.Gad on, G. Drews und A. Labahn FTIR difference spectroscopy and structural model of the bacterial reaction center from Roseobacter denitrificans. 11 th International Photosynthesis Congress, Budapest, Ungarn ( August 1998) IV

5 Zusammenfassung Die Umwandlung von elektromagnetischer Energie des Lichts in chemische Energie läuft im Reaktionszentrum photosynthetischer Bakterien ab. Bei den anaeroben photosynthetischen Bakterien wie z. B. Blastochloris viridis erfolgt die Ausbildung des Photosyntheseapparates und die Photosynthese nur unter Sauerstoffausschluss im Licht. Vor einigen Jahren wurden aerobe, photosynthetische Bakterien entdeckt. Roseobacter denitrificans gehört zu diesen Bakterien, die im Gegensatz zu den anaeroben photosynthetischen Bakterien den Photosyntheseapparat ausschließlich in Gegenwart von Sauerstoff ausbilden und ein lichtinduzierter Elektronentransfer findet nur unter aeroben Bedingungen statt. Die Ursache der Sauerstoffabhängigkeit der Photosynthese bei diesen Organismen ist bislang unverstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Zellen des Bakteriums von Roseobacter denitrificans semiaerob angezogen. Es wurde die Isolation der Reaktionszentren ausgehend von einer Literaturvorschrift optimiert, so dass aus 100 g Zellen 10 mg Reaktionszentren erhalten wurden. Es wurden erstmalig Reaktionszentren mit den Untereinheiten H, M, L und dem Tetrahämen Cytochrom c-untereinheit erhalten und es konnte der lichtinduzierte Elektronentransfer P + Q A - zu PQ A gemessen werden. Weiterhin wurden die photosynthetischen Membranen für spektroskopische Untersuchungen des blitzinduzierten Elektronentransfers isoliert und die blitzinduzierten Redoxänderungen der Cytochrome des b- und c-typs in den Membranen unter definierten Redoxbedingungen untersucht. Die Beteiligung eines Cytochrom bc 1 Komplexes am lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer konnte durch blitzinduzierte Reduktion von Cytochrom b 561 gezeigt werden, die durch Antimycin stimuliert und Myxothiazol gehemmt wurde. Das Cytochrom b 561 wurde, nach dem es nach Anregung durch den Blitz reduziert wurde, auch in Abwesenheit von Antimycin langsam reoxidiert. Die Geschwindigkeit der Reduktion des Cytochrom b 561 erhöht sich in Gegenwart von Antimycin bei Verringerung des eingestellten Redoxpotentials, was wahrscheinlich auf die fortschreitende Präreduktion des Ubichinon-Pools in der Membran zurückzuführen ist. Die Membran von Roseobacter denitrificans enthält 20 Ubichinon-10 Moleküle pro Reaktionszentrum. Unter optimalen Redoxbedingungen wurden nach Blitzanregung ca. 0,3 Cytochrom b pro Reaktionszentrum reduziert. Darüber hinaus wurde der lichtinduzierte Elektronentransfer von den Cytochromen des c-typs zum primären Elektronendonator P untersucht. In Abhängigkeit des eingestellten Redoxpotentials vor der Anregung wird der photooxidierte Donator durch eine schnelle Elektronenübertragung von Häm H1 (E m,7 = 290 mv), H2 (E m,7 = 240 mv) oder L1/L2 (E m,7 = 90 mv) der am Reaktionszentrum gebundenen Cytochrom c-untereinheit reduziert. Bei mittleren Redoxpotentialen (E h = mv) wird Häm H2 in einer weiteren Elektronentransferreaktion innerhalb von etwa 50 ms vom Cytochrom c 551 in einem diffusions-abhängigen Prozess rereduziert. Unter diesen Bedingungen lässt sich auch die Kopplung der Reduktion von Cytochrom b 561 mit der Rereduktion von photooxidiertem Häm H2 beobachten, was die Beteiligung des Cytochrom bc 1 Komplexes am lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer nach dem Q-Zyklus- Mechanismus anzeigt. Für ein Redoxpotential von E h = 50 mv wurde kein V

6 Elektronentransfer zu den reduzierten low potential Hämen L1 und L2 beobachtet, so dass der zyklische Elektronentransfer unterbrochen ist. Dies erklärt die Notwendigkeit von Sauerstoff für die Ausbildung des photosynthetischen Apparates in Roseobacter denitrificans, da bei niedrigem Redoxpotential in der Zelle dieser Prozess unterbrochen ist. VI

7 Einleitung Abkürzungen A Absorption A Absorptionsdifferenz APS Ammoniumperoxodisulfat ATP Adenosintriphosphat B Bacteriochlorophylle der Antennenkomplexe BCA 2,2 -Bicinchoninsäure BChl Bacteriochlorophyll BSA Rinderserumalbumin c Konzentration CMC kritische Mizellenkonzentration d optische Schichtdicke DEAE Diethylaminoethyl DTT 1,4-Dithiothreitol E Extinktion EDTA Ethylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalz, Dihydrat E h eingestelltes Redoxpotential E m,7 Halbstufenpotential bei ph=7,0 H1, H2 Häme mit hohem Halbstufenpotential (high potential Häme) HiPIP high potential iron-sulfur protein I Lichtintensität I Differenz der Lichtintensität ICM intracytoplasmatische Membran k AP Geschwindigkeitskonstante der Ladungsrekombination von P + Q - A nach PQ A k BP Geschwindigkeitskonstante der Ladungsrekombination von P + Q A Q - B nach PQ A Q B K D Dissoziationskonstante L1, L2 Häme mit niedrigem Halbstufenpotential (low potential Häme) LDAO N,N-Dimethyl-dodecylamin-N-oxid LH I (oder LHC I) Lichtsammelkomplex I LH II (oder LHC II) Lichtsammelkomplex II Mops 3-Morpholino-propansulfonsäure NADP + Nicotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat (oxidiert) NADPH Nicotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat (reduziert) OD optische Dichte P primärer Elektronendonator P + primärer Elektronendonator im oxidierten Zustand PAGE Polyacrylamid Gel-Elektrophorese PS I Photosystem I PS II Photosystem II Q Chinon Q A primärer Elektronenakzeptor Q B sekundärer Elektronenakzeptor Q i Chinon Reduktase katalytischer Bindungsplatz des Cytochrom bc 1 Komplexes Q o Dihydrochinon Oxidase katalytischer Bindungsplatz des Cytochrom bc 1 Komplexes Q x -Bande Absorptionsbande des primären Donators bei 590 nm Q y -Bande Absorptionsbande des primären Donators bei 860 nm VII

8 Einleitung RC rpm RT SDS SHE t 1/2 TEMED Tris Triton X-100 U U UQ UQH 2 v/v w/v x g 16S rrna ε Reaktionszentrum (reaction center) Umdrehungen pro Minute Raumtemperatur Natriumdodecylsulfat Standardwasserstoffelektrode Halbwertzeit N,N,N,N -Tetramethylethylendiamin Tris(hydroxymethyl)aminomethan Alkylphenylpolyethylenglykol Spannung Spannungsdifferenz Ubichinon Dihydroubichinon Volumenverhältnis Gewicht pro Volumen Vielfaches der Erdbeschleunigung 16S ribosomale Ribonukleinsäure molarer dekadischer Extinktionskoeffizient Hinweis: Rhodopseudomonas viridis wurde kürzlich unbenannt in Blastochloris viridis. In der vorliegenden Arbeit wurde die neue Nomenklatur verwendet. VIII

9 Einleitung Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung Abkürzungsverzeichnis V VII A. Einleitung 1 A.1. Photosynthese 1 A.2. Oxygene und anoxygene Photosynthese 2 A.2.1. Die Lichtreaktion der Photosynthese 3 A.3. Anoxygene photosynthetische Bakterien 5 A.3.1. Struktur und Funktion der Lichtsammelkomplexe 8 A.3.2. Struktur und Funktion des Reaktionszentrums 10 A.3.3. Elektronentransferreaktionen im bakteriellen Reaktionszentrum aus Rhodobacter sphaeroides 15 A.3.4. Struktur und Funktion des Cytochrom bc 1 Komplexes in photosynthetischen Bakterien 17 A.3.5. Der lichtinduzierte zyklischer Elektronentransfer als Q-Zyklus 19 A.4. Aerobe photosynthetische Bakterien 23 A.4.1. Habitat, Morphologie und Phylogenese 25 A.4.2. Pigmente 28 A.4.3. Struktur und Funktion der Antennenkomplexe in den aeroben photosynthetischen Bakterien 29 A.4.4. Struktur und Funktion der Reaktionszentren 31 A.4.5. Der lichtinduzierte zyklische Elektronentransfer in Roseobacter denitrificans und beteiligte Enzymkomplexe 34 A.5. Motivation und Ziele der Arbeit 41 B. Materialien und Methoden 43 B.1. Materialien 43 B.1.1. Chemikalien 43 B.1.2. Puffer und Lösungen 45 B Anzucht von Roseobacter denitrificans 45 B Präparation von Membranen und Reaktionszentren 46 B BCA-Proteinbestimmung 49 B SDS-PAGE-Gelelektrophorese 50 B Spektroskopische Untersuchungen 51 B Ubichinonstammlösung 52 B Inhibitorlösung für die Q B -Bindungsstelle 53 B Redoxmediatoren, Entkoppler und Inhibitoren für die Messungen an Membranen aus Roseobacter denitrificans 54 B.2. Methoden 55 B.2.1. Anzucht von Roseobacter denitrificans 55 B Stämme 55 B Anzucht 55 B Vorkulturen 56 B Hauptkulturen 57 B.2.2. Isolierung und Reinigung der Membranen aus Roseobacter denitrificans 59 B Waschen der Zellen 60 B Zellaufschluss und Isolierung der Membranen 60 IX

10 Einleitung B Pufferwechsel 61 B.2.3. Isolierung und Reinigung der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans 62 B Vorschrift nach K. Takamiya 62 B Waschen der Zellen 64 B Zellaufschluss und Isolierung der Membranen 64 B Solubilisierung der Membranproteine 65 B Anionenaustausch-Chromatographie 65 B Isolation durch Dichtegradientenzentrifugation 66 B Waschen der Zellen 67 B Zellaufschluss und Isolierung der Membranen 68 B Solubilisierung der Membranproteine 68 B Dichtegradientenfraktionierung der Membranproteine 69 B Anionenaustausch-Chromatographie 70 B Modifizierte Vorschrift nach K. Takamiya 71 B Waschen der Zellen 73 B Zellaufschluss und Isolierung der Membranen 73 B Solubilisierung der Membranen 74 B Ammoniumsulfat-Fällung 76 B Gelfiltration 79 B Anionenaustausch-Chromatographie 80 B Entsalzung 81 B Aufkonzentrierung 82 B Lagerung der Reaktionszentren 82 B.2.4. Charakterisierung der Proben 83 B Bacteriochlorophyll-Bestimmung 83 B Proteinbestimmung mit dem BCA-Proteintest 83 B SDS-PAGE-Gelelektrophorese 84 B Gießen der Gele 84 B Probenvorbereitung 85 B Elektrophorese 85 B Färbung der Gele mit Coomassie Brilliant Blue 85 B Gel-Dokumentation 86 B UV-VIS-Absorptionsspektren 86 B.2.5. Transiente Absorptionsspektroskopie 89 B Messung an isolierten Reaktionszentren 91 B Messanordnung 91 B Probenvorbereitung und Messbedingungen 92 B Absorptionsdifferenzspektroskopie: Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten der Ladungsrekombination von P + Q - A bzw. P + Q - B und des Besetzungsgrades der Q A - und Q B -Bindungsstellen im Reaktionszentrum aus Roseobacter denitrificans 93 B Messung an Membranen 97 B Messanordnung 97 B Probenvorbereitung und Messbedingungen 100 B.2.6. Redox-Potentiometrie 102 B.2.7. Bestimmung des Ubichinongehalts in der Membran aus Roseobacter denitrificans 107 X

11 Einleitung C. Ergebnisse 109 C.1. Anzucht von Roseobacter denitrificans 109 C.2. Untersuchungen an isolierten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans 113 C.2.1. Isolation der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans 113 C Isolation der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach der Vorschrift von K. Takamiya 114 C Isolation der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans durch Dichtegradientenfraktionierung 119 C Isolation der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach der modifizierten Vorschrift von K. Takamiya 119 C.2.2. Isolation und Aufreinigung von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach Optimierung der Präparationsvorschrift 127 C.3. Untersuchungen an Membranen aus Roseobacter denitrificans 139 C.3.1. Isolation der Membranen 139 C.3.2. Transiente optische Spektroskopie an Membranen aus Roseobacter denitrificans 140 C Probenvorbehandlung für die transiente optische C Spektroskopie 140 Differenzspektrum des primären Elektronendonators nach Anregung durch einen Blitz 142 C Lichtinduzierte Reduktion von Cytochrom b bei hohen Redoxpotentialen 149 C Kopplung zwischen der Reduktion von Cytochrom b und der Re-Reduktion der Cytochrome des c-typs nach Anregung durch einen Blitz 155 C Zeitaufgelöste Spektren der Redoxänderungen von Cytochromen des c-typs nach Anregung durch einen single turnover Blitz 167 C Der Einfluss von Viskosität und Ionenstärke auf den Elektronentransfer von Cytochrom c 551 zum Häm H2 des Reaktionszentrums 176 C Orientierung des Reaktionszentrums in der Membran 178 C Titration der blitzinduzierten Redoxänderungen von Cytochrome des b- und c-typs 184 C.3.3. Bestimmung des Ubichinongehalts in Membranen aus Roseobacter denitrificans 190 D. Diskussion 193 D.1. Anzucht von Roseobacter denitrificans, Isolation von photosynthetischen Membranen und Reaktionszentren 193 D.1.1. Anzucht von Roseobacter denitrificans 193 D.1.2. Isolierung der photosynthetischen Membran 195 D.1.3. Isolierung der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans 197 D.2. Der lichtinduzierte zyklische Elektronentransfer (Q-Zyklus) in Roseobacter denitrificans 201 D.2.1. Elektronentransfer von Cytochromen des c-typs zum primären Donator des Reaktionszentrums 201 D.2.2. Beteiligung eines Cytochrom bc 1 Komplexes am lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer in Roseobacter denitrificans 207 XI

12 Einleitung D.2.3. Das Halbstufenpotential des primären Elektronenakzeptors Q A im Reaktionszentrum aus Roseobacter denitrificans 211 D.2.4. Der lichtinduzierte zyklische Elektronentransfer in Roseobacter denitrificans: Schlussfolgerungen und Ausblick 213 Literaturverzeichnis 221 Abbildungsverzeichnis 241 Tabellenverzeichnis 245 Danksagung 247 XII

13 Einleitung A. Einleitung A.1. Die Photosynthese Die primäre Energiequelle für alle Lebewesen auf der Erde ist das Sonnenlicht. Den Prozess der Nutzbarmachung der Energie aus dem Sonnenlicht durch phototrophe Organismen bezeichnet man als Photosynthese. Durch diesen Prozess wird die Sonnenenergie letztlich über die Nahrungskette auch den heterotrophen Organismen (Tiere, Pilze etc.) zugänglich gemacht. Gemessen am Umsatz ist die Photosynthese der quantitativ bedeutendste chemische Prozess, der auf der Erde stattfindet. Schätzungen zufolge werden jährlich mehr als Tonnen Kohlenstoff durch diesen Prozess fixiert, was einer gespeicherten Energie von kj entspricht [1]. Die Photosynthese findet in bestimmten Zellkompartimenten, den Chloroplasten der Algen und höheren Pflanzen sowie in Cyanobakterien und photosynthetischen Bakterien statt. Durch diesen Prozess wird die elektromagnetische Energie des Sonnenlichts in chemisch gebundene Energie umgewandelt. Dabei werden einzelne Lichtquanten durch Lichtsammelkomplexe in der Zellmembran absorbiert und zu den Reaktionszentren weitergeleitet, in denen eine photoinduzierte transmembrane Ladungstrennung stattfindet. Dieser Elektronentransport ist mit einem Protonentransport über die Membran gekoppelt. Es wird also zusätzlich zur transmembranen Ladungstrennung eine elektrochemische Potentialdifferenz der Protonen über die Membran aufgebaut. Die so gespeicherte Energie wird anschließend in einer Reihe von lichtunabhängigen Reaktionen (Dunkelreaktion der Photosynthese) in das für alle Lebewesen als zentralen Energieüberträger dienende Adenosintriphosphat (ATP) und in Reduktionsäquivalente umgewandelt. In weiteren Reaktionen werden diese Substanzen für die Synthese chemischer Verbindungen, die die Zelle benötigt (wie z.b. Kohlenhydrate), eingesetzt. 1

14 Einleitung A.2. Oxygene und anoxygene Photosynthese Man unterteilt die Photosynthese in oxygene und anoxygene Photosynthese. Die oxygene Photosynthese ist charakteristisch für prokaryontische Cyanobakterien, eukaryontische Algen und höhere Pflanzen. Sie findet in den Thylakoidmembranen der Chloroplasten statt. Die Struktur des Photosyntheseapparates ist sehr komplex und setzt sich im wesentlichen aus zwei durch Elektronenüberträger und Redoxenzyme miteinander gekoppelten größeren Proteinkomplexen, den Photosystemen PSI und PSII, die die Lichtsammelkomplexe und jeweils ein unterschiedliches Reaktionszentrum enthalten, zusammen. Dazu kommen die ATP- Synthase und die Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase der Dunkelreaktion [1]. Im folgenden sind die Reaktionsgleichungen der Photosynthese dargestellt. Lichtreaktion: 12 NADP H 2 O 12 NADPH + 12 H O 2 Gleichung A ADP + 18 P i + 18 H + 18 ATP + 18 H 2 O Gleichung A.2.2 Dunkelreaktion: 6 CO ATP + 12 NADPH + 12 H 2 O C 6 H 12 O ADP + 18 P i + 12 NADP H + Gleichung A.2.3 Nettoreaktion: 6 CO H 2 O C 6 H 12 O O 2 Gleichung A.2.4 Zu den Vertretern der anoxygenen Photosynthese gehören Purpurbakterien, grüne Schwefelbakterien, Heliobakterien und grüne fädige Bakterien. Sie sind strukturell einfacher gebaut. Die Photosynthese findet in der inneren Cytoplasmamembran statt, die oft weitläufige Einstülpungen bildet, die intracytoplasmatische Membran (ICM). Der Photosyntheseapparat ist wesentlich einfacher gebaut und enthält nur einen Typ Reaktionszentrum. 2

15 Einleitung A.2.1. Die Lichtreaktionen der Photosynthese Die Primärschritte der Photosynthese sind in der oxygenen und anoxygenen Photosynthese prinzipiell ähnlich. Obwohl der oxygene Photosyntheseapparat viel komplexer ist, sind praktisch alle gültigen Prinzipien bei den anoxygenen photosynthetischen Bakterien bereits vorhanden, teilweise in vereinfachter Form. Deshalb spielt bei der Erforschung der Prinzipien der Photosynthese die Untersuchung der anoxygenen photosynthetischen Bakterien eine entscheidende Rolle. An dieser Stelle soll die Lichtreaktion bei den oxygenen Phototrophen kurz beschrieben werden. Die anoxygene Photosynthese wird ausführlicher im nächsten Kapitel beschrieben. Lichtreaktionen bei oxygenen Photosyntheseorganismen Im oxygenen Photosyntheseapparat sind Cyanobakterien, Algen und grüne Pflanzen in der Lage, durch Kopplung von zwei Lichtreaktionen einen Elektronentransfer von H 2 O auf NADP + durchzuführen. Die daraus resultierende transmembrane elektrochemische Potentialdifferenz der Protonen wird zur Synthese von ATP genutzt. Das sogenannte Z-Schema der Photosynthese ist schematisch in Abbildung A dargestellt [2]. Im ersten Schritt der oxygenen Photosynthese wird das Licht durch Lichtsammelkomplexe der Photosysteme I und II absorbiert. Im Photosystem I folgt der Lichtabsorption die Übertragung des Photons auf den primären Donator P700 1, der hierbei in den ersten angeregten Singulettzustand übergeht. Aus diesem wird ein Elektron über die Elektronenakzeptoren A 0 und A 1 auf Ferredoxin übertragen. Die Ferredoxin-NADP + -Reduktase katalysiert dann die Reduktion von NADP + durch Ferredoxin, wobei zwei reduzierte Ferredoxine ein Molekül NADP + reduzieren. Der oxidierte Donator P700 + wird durch ein reduziertes Plastocyanin wieder reduziert und kann dann erneut ein Photon aufnehmen. Alternativ können die Elektronen im PS I dem zyklischen Elektronenfluss folgen. Hierbei wird das Elektron aus dem angeregten Zustand des P700 bis zum Ferredoxin transportiert und von dort jedoch anstatt auf NADP + auf den Cytochrom b 6 f Komplex 1 Bei dieser Bezeichnung steht P für den primären Donator und 700 entspricht der Wellenlänge des Maximums im UV-VIS-Spektrum des primären Donators. 3

16 Einleitung übertragen. Aus diesem wird dann ein Elektron über ein Plastocyanin zurück auf das P700 + übertragen. Durch diesen zyklischen Elektronenfluss werden ausschließlich Protonen durch den Cytochrom b 6 f Komplex gepumpt, die eine transmembrane elektrochemische Potentialdifferenz erzeugen. Halbstufenpotential / V PS I PS II Abbildung A.2.1.1: Z-Schema des linearen Elektronentransfers in der oxygenen Photosynthese [2]. Das vom Photosystem II (PS II) gebildete reduzierte Plastochinon (QH 2 ) übergibt Elektronen auf den Cytochrom b 6 f Komplex (Cyt b 6 /f). Von dort transportiert reduziertes Plastocyanin (PC) Elektronen zum Photosystem I (PSI), das Ferredoxin (Fd) reduziert. Dieses überträgt sein Elektron über die Ferredoxin-NADP + -Reduktase (Fp) auf NADP +. Der Cytochrom b 6 f Komplex bildet die Verbindung zwischen den Photosystemen I und II (siehe Text). Die gestrichelten Linien kennzeichnen Elektronentransferreaktionen, die Pfeile die Absorption von Photonen. Im Photosystem II folgt der Lichtabsorption die Übertragung des absorbierten Photons auf den Elektronendonator P680, der daraufhin in den angeregten Zustand übergeht. Aus diesem erfolgt dann ein transmembraner Elektronentransfer über ein Chlorophyll und ein Phäophytin zu einem primären Plastochinon (Q A ), das reduziert wird. Von dort wird das Elektron auf ein sekundäres Plastochinon (Q B ) übertragen. Nach Reduktion von P680 + erfolgt ein zweiter lichtinduzierter Elektronentransfer, der zur weiteren Reduktion des zweiten Plastochinons führt, das nach Aufnahme zweier Protonen als Plastohydrochinon aus dem PS II in die Membran diffundiert und durch ein Plastochinon aus dem Membran-Pool ersetzt wird. Das nach Lichtabsorption und darauffolgendem Elektronentransfer im PS II entstandene Kationenradikal P680 + ist ein starkes Oxidationsmittel. Es entzieht dem Mangancluster der 4

17 Einleitung Wasserspaltungsmaschine des PS II ein Elektron und geht dadurch wieder in den Grundzustand über. Nach viermaligem Durchlaufen dieses Vorgangs wird aus zwei Molekülen H 2 O ein Molekül O 2 gebildet. Dabei werden vier Protonen freigesetzt. Das PS I und das PS II sind über den Cytochrom b 6 f Komplex miteinander gekoppelt. Hier wird das im PS II reduzierte Plastochinon reoxidiert. Die aufgenommenen Elektronen werden auf Plastocyanine übertragen, welche das P700 + des Photosystems I reduzieren. Auch die Elektronenübertragungen im Cytochrom b 6 f Komplex sind mit einem transmembranen Protonentransfer gekoppelt. Die Gesamtreaktion des PS I, des Cytochrom b 6 f Komplexes und des PS II ist somit der lichtinduzierte Elektronenfluss von H 2 O zu NADP +, der der Gewinnung von Reduktionsäquivalenten dient. Die stöchiometrische Gesamtgleichung ergibt sich zu: 2 H 2 O + 2 NADP + 2 NADPH + 2 H + + O 2 Gleichung A Zusätzlich führt der Elektronentransfer vom H 2 O zum NADP + durch den daran gekoppelten transmembranen Protonentransfer zur Erzeugung einer elektrochemischen Potentialdifferenz der Protonen, die nach der chemiosmotischen Theorie von P. Mitchell von der ATP-Synthase zur Synthese von ATP aus ADP und anorganischem Phosphat verwendet wird [3]. A.3. Anoxygene photosynthetische Bakterien Anoxygene Phototrophe besitzen nur ein Photosystem und sind nicht in der Lage, Reduktionsäquivalente selbst zu bilden. Wie in Abbildung A.3.1 dargestellt, katalysiert das Reaktionszentrum einen zyklischen Elektronentransport, an den ein Protonentransport durch die Membran gekoppelt ist. Die Beschreibung der anoxygenen Photosynthese sei hier am Beispiel Rhodobacter sphaeroides, eines der am besten untersuchten Purpurbakterien, vorgenommen. Ergänzend werden die davon abweichenden Eigenschaften bei Rhodopseudomonas viridis (vor kurzem in Blastochloris viridis umbenannt) beschrieben. 5

18 Einleitung Halbstufenpotential / V RC Abbildung A.3.1: Der zyklische Elektronentransfer in photosynthetischen Purpurbakterien [2]. Die Absorption von zweimal je ein Photon durch den primären Donator (P870) im Reaktionszentrum (RC 2 ) führt nach zweimaligem Durchlaufen der Elektronentransferkette zur Bildung von Ubihydrochinon (QH 2 ), das vom Reaktionszentrum abdissoziiert und zwei Elektronen dem Cytochrom bc 1 Komplex (Cyt bc 1 ) übergibt. Die Elektronen werden nacheinander über das lösliche Cytochrom c 2 (Cyt c 2 ) zurück zum primären Donator transferiert. Bei der Bildung von Ubihydrochinon (im Reaktionszentrum bzw. an der Q i -Bindungstelle des Cytochrom bc 1 Komplexes, siehe Kapitel A.3.5. und Abbildung A.3.5.1) werden Protonen aus dem Cytoplasma aufgenommen, die bei der Oxidation an der Q o -Bindungstelle des Cytochrom bc 1 Komplexes in das Periplasma abgegeben werden. Die gestrichelten Linien kennzeichnen den Elektronentransfer und der Pfeil die Absorption von Photonen. Der erste Schritt der bakteriellen Photosynthese ist die Absorption eines Photons durch die Lichtsammelkomplexe. Die Anregungsenergie wird dann auf den primären Elektronendonator des Reaktionszentrums weitergeleitet, welcher in den ersten angeregten Singulettzustand übergeht. Im Reaktionszentrum findet eine Ladungstrennung statt, bei der der primäre Donator oxidiert und das sekundäre Ubichinon reduziert wird. Durch ein lösliches Cytochrom c 2 wird der Donator rereduziert und ist somit in der Lage ein weiteres Photon aufzunehmen (in Rhodopseudomonas viridis ist noch ein gebundenes tetrahämes Cytochrom c zwischengeschaltet, siehe Kapitel A.3.3. und A.3.5.). Nach der Absorption eines zweiten Photons wird ein zweites Elektron über die Elektronentransportkette zum sekundären Ubichinon weitergeleitet. Nach Aufnahme zweier Protonen aus dem Cytoplasma verlässt das gebildete Dihydrochinon seine Bindungsstelle im 2 In dieser Arbeit wird das Reaktionszentrum mit RC abgekürzt, wie es in der angelsächsischen Literatur (reaction center) üblich ist. 6

19 Einleitung Reaktionszentrum und wird durch ein Ubichinon aus dem Chinon-Pool in der Membran ersetzt. Die vom Ubihydrochinon aufgenommenen Elektronen werden über den Cytochrom bc 1 Komplex auf ein lösliches Cytochrom c 2 übertragen, welches wiederum den oxidierten primären Donator (bzw. das gebundene Cytochrom c) reduziert. Im Gegensatz zum linearen lichtinduzierten Elektronentransfer der pflanzlichen Photosynthese, findet bei den Bakterien ein zyklischer Elektronentransfer statt, der in der Summe zu keiner Redoxreaktion führt, sondern einzig Protonen vom Cytoplasma ins Periplasma pumpt. Dies führt zu einer transmembranen elektrochemischen Potentialdifferenz der Protonen, welche zur Synthese von ATP benutzt wird. Das bei der Photophosphorylierung erzeugte ATP wird dann bei den Stoffwechselprozessen eingesetzt. Da Purpurbakterien nicht in der Lage sind, NADP + direkt im photoinduzierten Elektronentransfer zu reduzieren, müssen sie zur Reduktion von NADP + unter Aufwand von ATP externe Elektronendonatoren (wie H 2 S, S, S 2 O 2-3, H 2 und auch viele organische Verbindungen) verwenden. In den folgenden Kapiteln wird auf die Struktur und Funktion der Proteinkomplexe der Lichtreaktionen näher eingegangen. Gegenstand neuester Untersuchungen ist die supramolekulare Anordnung der an der Lichtreaktion der Photosynthese beteiligten Proteinkomplexe, da diese für die Funktion des photosynthetischen Apparates von Bedeutung sind [4, 5]. In Rhodobacter sphaeroides liegen die Komplexe in der Membran im stöchiometrischen Verhältnis von 1 Cytochrom bc 1 Komplex auf 2 Reaktionszentren und von ca. 24 Bacteriochlorophyllmolekülen pro Reaktionszentrum vor, wobei ein Lichtsammelkomplex LH I und ca. 9 Lichtsammelkomplexe LH II auf ein Reaktionszentrum kommen. 7

20 Einleitung A.3.1. Struktur und Funktion der Lichtsammelkomplexe Die Funktion der Lichtsammelkomplexe (auch Antennenkomplexe genannt) besteht darin, Lichtquanten zu absorbieren und die Anregungsenergie möglichst effizient innerhalb von s mittels Resonanzenergietransfer (nach dem Förster- Mechanismus [6]) dem aufnahmebereiten Reaktionszentrum zu übergeben. Antennenkomplexe existieren bezüglich ihrer Struktur, ihrer Polypeptidzusammensetzung und ihrer Chromophoren (Bacteriochlorophylle und Carotenoide) in viel größerer Vielfalt als die untereinander recht ähnlichen Reaktionszentren. Infolgedessen können Antennenkomplexe Licht verschiedener Wellenlänge absorbieren und dem Reaktionszentrum weiterleiten, so dass sie die Bakterien befähigen, die spektrale Verteilung des zur Verfügung stehenden Lichtes möglichst optimal zur Photosynthese auszunutzen und so die Anpassung an die Umweltbedingungen zu optimieren. Die Effizienz der Energieübertragung von den Antennenkomplexen auf das Reaktionszentrum wird durch den hohen Organisationsgrad ihrer Anordnung in der Membran gewährleistet [7]. Purpurbakterien haben ein relativ einfaches System mit in der Regel zwei Typen von Lichtsammelkomplexen, LH I und LH II 3 [8]. LH I umgibt das Reaktionszentrum und bildet mit ihm einen Kernkomplex [9-11]. Dieser wird von einem weiteren Antennenkomplex LH II umgeben, in einer Stöchiometrie, die von den Wachstumsbedingungen abhängen kann. Die Lichtsammelkomplexe werden nach dem Absorptionsmaximum der Bacteriochlorophylle spezifiziert. In Purpurbakterien sind B875, B880 und B890 die Bacteriochlorophylle des LH I und B800-B820 sowie B800-B850 die Bacteriochlorophylle des LH II 4. In Rhodobacter sphaeroides absorbiert LH II bei 800 nm und 850 nm, LH I bei 875 nm, und die absorbierte Energie wird dem Energiegefälle folgend von LH II über LH I auf den primären Donator des Reaktionszentrums übertragen. Die Lichtsammelkomplexe bestehen aus zwei Typen von Polypeptidketten α und β von jeweils ca. 50 Aminosäuren mit einer Molekularmasse von jeweils ca. 6 kda. Beide Polypeptide haben jeweils eine hydrophobe Domäne, die eine α-helix formt und die Membran durchspannt, und eine 3 Lichtsammelkomplexe werden mit LH oder LHC (von light-harvesting complex) abgekürzt. In dieser Arbeit wird die Abkürzung LH verwendet. 4 Bei der Bezeichnung der Bacteriochlorophylle steht B für Bacteriochlorophyll und die Zahl entspricht der Wellenlänge des Maximums (bzw. der Maxima) im langwelligen Bereich des UV-VIS- Absorptionspektrums. 8

21 Einleitung hydrophile C-terminale und N-terminale Domäne [12]. Sie bilden im Verhältnis 1:1 jeweils eine Untereinheit, die im Gegensatz zu den Lichtsammelkomplexen in Pflanzen große Ansammlungen von bis zu 9 Untereinheiten bilden [13, 14]. Für den Lichtsammelkomplex LH II von Rhodopseudomonas acidophila [15] und von Rhodospirillum molischianum [16] konnte die dreidimensionale Struktur mit atomarer Auflösung aufgeklärt werden. Danach besteht dieser aus Ringen von jeweils neun bzw. acht Untereinheiten. Für LH I konnte die dreidimensionale Struktur mit atomarer Auflösung bisher nicht aufgeklärt werden. Dennoch zeigen Untersuchungen an zweidimensionalen Kristallen, dass LH I einen großen Ring um das Reaktionszentrum bildet [10, 11, 17]. Abbildung A zeigt eine schematische Darstellung der Anordnung der Lichtsammelkomplexe und des Reaktionszentrums in der Membran nach einer Modellrechnung [18]. Abbildung A.3.1.1: Anordnung der Lichtsammelkomplexe LH I und LH II und des Reaktionszentrums in Rhodobacter sphaeroides in einer Modellrechnung nach H. Xiche et al. [18] mit Blick auf die Membran, in der die Proteinkomplexe eingebettet sind. Bei den Lichtsammelkomplexen befinden sich die β-apoproteine auf der Außenseite der Ringe (helle Helices relativ zur Senkrechten der Membranebene geneigt), die α- Apoproteine im Inneren der Ringe (dunkle Helices senkrecht zur Membranebene). Die Struktur des Reaktionszentrums in atomarer Auflösung ist bekannt (siehe Text und Abbildung A.3.2.1). Die relative Lage der Bacteriochlorophylle und der Carotinoide ist eingezeichnet. Die Bacteriochlorophylle der Lichtsammelkomplexe und des Reaktionszentrums sind coplanar angeordnet, so dass ein Energietransfer von den Lichtsammelkomplexen zum Reaktionszentrum erfolgen kann. 9

22 Einleitung A.3.2. Struktur und Funktion des Reaktionszentrums Die photoinduzierte schnelle Ladungstrennung findet in den Reaktionszentren der anoxygenen Bakterien statt. Die Gesamtheit der photosynthetischen Reaktionszentren lässt sich in zwei Gruppen unterteilen, die entsprechend ihrer Ähnlichkeit zu den Photosystemen I und II der oxygenen Photosynthese als Typ I und II klassifiziert werden [19]. Die Reaktionszentren des Typs I enthalten als terminale Elektronenakzeptoren Eisen-Schwefel-Cluster. Zu dieser Gruppe gehören die Reaktionszentren aus grünen Schwefelbakterien und Heliobakterien. Als terminale Elektronenakzeptoren der Reaktionszentren des Typs II fungieren hingegen Chinone. Zu den Reaktionszentren dieses Typs zählen die Reaktionszentren der Purpurbakterien und der grünen fädigen Bakterien. Im folgenden Abschnitt wird das Reaktionszentrum der Purpurbakterien Rhodobacter sphaeroides und Blastochloris viridis besprochen. Das Reaktionszentrum ist ein integraler Membranproteinkomplex. Obwohl seine Existenz schon in den 30er Jahren postuliert wurde [20, 21], gelang es erst um 1970, das Reaktionszentrum aus Rhodobacter sphaeroides (Wildtyp) und aus Rhodobacter sphaeroides R-26 in der aktiven Form zu isolieren [22-24]. Die Aminosäuresequenz wurde Anfang der 80iger Jahre bestimmt [25-27], und schließlich konnte die Röntgenstruktur mit nahezu atomarer Auflösung aufgeklärt werden. Das bakterielle Reaktionszentrum aus Blastochloris viridis war das erste Membranprotein, dass kristallisiert und dessen dreidimensionale Struktur mit atomarer Auflösung aufgeklärt werden konnte, wofür H. Michel, R. Huber und J. Deisenhofer 1988 den Nobelpreis für Chemie erhielten [28, 29]. Kurze Zeit später wurde die dreidimensionale Struktur des bakteriellen Reaktionszentrums von Rhodobacter sphaeroides aufgeklärt [30-33]. 10

23 P Einleitung Q B Q A Abbildung A.3.2.1: Die Struktur des photosynthetischen Reaktionszentrums aus Rhodobacter sphaeroides in atomarer Auflösung [34]. Dargestellt sind die drei Untereinheiten L (dunkel, rechts), M (hell, links), die vollständig in der Membran (als Strichzeichnung dargestellt) eingebettet sind, und H (hell, unten), die über eine Helix mit dem LM-Komplex verbunden ist und in das Cytoplasma hereinragt. Eingezeichnet sind die symmetrisch angeordneten Cofaktoren. Das Bacteriochlorophylldimer befindet sich auf der periplasmatischen und die zwei Ubichinone auf der cytoplasmatischen Seite. Die Struktur der Reaktionszentren aus Blastochloris viridis und Rhodobacter sphaeroides ist ähnlich. Im Folgenden wird zunächst auf die Struktur des Reaktionszentrums aus Rhodobacter sphaeroides eingegangen, die in Abbildung A dargestellt ist. Das Reaktionszentrum aus Rhodobacter sphaeroides ist ein integrales Membranprotein mit einer Molmasse von Da. Es besteht aus drei Proteinuntereinheiten L, M, H [32]. Der gesamte Proteinkomplex enthält elf transmembrane Helices, davon fünf in der L-, fünf in der M- und eine in der H- Untereinheit. L und M sind Strukturhomologe und liegen im engen Kontakt zueinander, so dass man von einem zylindrischen LM-Komplex spricht. Die Lichtabsorption und Ladungstrennung erfolgt über Cofaktoren, die in der Proteinmatrix eingebettet liegen (vgl. auch Abbildung A.3.2.3): ein Dimer aus zwei Bacteriochlorophyllen (P), zwei weitere Bacteriochlorophyllmonomere (B A und B B ), zwei Bacteriophäophytine (φ A und φ B ), zwei Ubichinone (Q A und Q B ) sowie ein highspin Fe 2+ -Kation. Die Cofaktoren bilden die Elektronentransportkette und sind in einer nahezu perfekten zweizähligen Symmetrie angeordnet, die sich in der 11

24 Einleitung Symmetrie des LM-Komplexes widerspiegelt [35]. Im nativen Reaktionszentrum ist nur der A-Zweig photosynthetisch aktiv, der weitgehend in der L-Untereinheit liegt, während der in der M-Untereinheit gelegene B-Zweig photosynthetisch inaktiv ist. Die H-Untereinheit hat eine globuläre Struktur, die ins Cytoplasma hineinragt, und über eine α-helix mit dem LM-Komplex verbunden ist. Sie ist wahrscheinlich für die Stabilisierung der Reaktionszentrenstruktur von Bedeutung. Eine weitere Funktion der H-Untereinheit könnte die Abschirmung des Ubichinons in der Q A -Bindungsstelle von der wässrigen Umgebung sein [36], was für den Ablauf des Protonentransfers im Reaktionszentrum von Bedeutung ist. Auf der periplasmatischen Seite der Membran findet sich die Bindungsstelle für den sekundären Donator, das Cytochrom c 2. Die Strukturen der Untereinheiten L, M, und H des Reaktionszentrums aus Blastochloris viridis sind homolog zu den Strukturen von Rhodobacter sphaeroides. Dieses Reaktionszentrum hat aber eine zusätzliche Untereinheit, die Cytochrom c- Untereinheit, die in Abbildung A dargestellt ist. Dieses Cytochrom c aus 333 Aminosäuren mit einer Molmasse von ca Da enthält vier Häm-Gruppen und ist an das Reaktionszentrum gebunden [37]. Es ist üblich, die vier Häme auf Grund ihres Redoxpotentials in zwei Gruppen zusammenzufassen: zwei mit hohem Potential (H1 und H2), die sogenannten high potential Häme und zwei mit niedrigem Potential (L1 und L2), die sogenannten low potential Häme. Das Halbstufenpotential der Häme in Blastochloris viridis ist in Tabelle A aufgeführt [38-41]: Tabelle A.3.2.1: Physikalische Eigenschaften der Tetrahämuntereinheit des Reaktionszentrums aus Blastochloris viridis. Angegeben sind die Halbstufenpotentiale E m,7 und die Absorptionsmaxima l der a-bande. Häm E m,7 / mv l (a-bande) / nm Name H Cytochrom c 559 H Cytochrom c 556 L Cytochrom c 552 L Cytochrom c

25 Einleitung L2 H2 L1 H1 Abbildung A.3.2.2: Struktur der tetrahämen Cytochrom c-untereinheit des Reaktionszentrums aus Blastochloris viridis in atomarer Auflösung [29]. Die Proteinkette ist als Band dargestellt, die relative Lage der Häm-Gruppen und der Cystein- Reste, an die sie gebundenen sind, sind eingezeichnet. Die Häm-Gruppen werden nach ihrem Redoxpotential mit H1, H2, L1, und L2 bezeichnet (Details im Text). Das Häm H1 ist dem Bacteriochlorophylldimer des Reaktionszentrums am nächsten. Von dieser Seite ist die Cytochrom c-untereinheit auf der periplasmatischen Seite der Membran an den LM-Komplex des Reaktionszentrum gebunden. Die Cytochrom c-untereinheit ragt in das Periplasma. Aus der Kristallstruktur erkennt man, dass die Häme näherungsweise linear angeordnet sind. Wie Untersuchungen der Elektronentransferkinetik, EPR- und Lineardichroismus-Messungen gezeigt haben, ist die Zuordnung der Redoxpotentiale zu den Hämen in Blastochloris viridis, wie in Abbildung A dargestellt [29, 42-45]. 13

26 Einleitung Abbildung A.3.2.3: Anordnung der Cofaktoren des Reaktionszentrums aus Blastochloris viridis und Orientierung der Häme der Cytochrom c-untereinheit (verändert nach O. Hucke [46]). Die Pfeile zeigen den Weg des lichtinduzierten Elektronentransfers. Nach Anregung durch Licht erfolgt ein Elektronentransfer vom primären Donator P über das Bacteriochlorophyll B A und das Bacteriophäophytin φ A zum primären Akzeptor Q A, das im Falle von Blastochloris viridis ein Menachinon ist, und von dort auf den sekundären Akzeptor Q B (Ubichinon). P + wird dann von Häm H1 reduziert, das wiederum von Häm H2 reduziert wird. In Klammern sind die Halbstufenpotentiale der Häme der Cytochrom- Untereinheit angegeben. Die Funktion des gebundenen tetrahämen Cytochroms c ist, den primären Donator nach erfolgter lichtinduzierter Ladungstrennung wieder zu reduzieren. Das oxidierte tetrahäme Cytochrom c wird wiederum vom löslichen Cytochrom c 2 reduziert. Das tetrahäme Cytochrom c ist in vielen photosynthetischen Bakterien vorhanden [47-53]. Die Struktur dieser Untereinheit variiert in Hinblick auf die elektrochemischen Eigenschaften und Orientierung der Häme. Darüber hinaus werden verschiedene Mechanismen der Elektronenübertragung gefunden. Die besondere Funktion dieser tetrahämen Cytochrom c-untereinheit ist noch unklar. 14

27 Einleitung Die Untereinheiten L, M und C des Reaktionszentrums sind zusammen mit den Untereinheiten des LH I Komplexes im puf Operon im Genom kodiert (pufbalm in Rhodobacter sphaeroides [25] bzw. pufbalmc in Blastochloris viridis [54]). Die H- Untereinheit wird an anderer Stelle im Genom kodiert. Im nächsten Kapitel sollen die Elektronentransferreaktionen im Reaktionszentrum näher erläutert werden. A.3.3. Elektronentransferreaktionen im bakteriellen Reaktionszentrum aus Rhodobacter sphaeroides Im Reaktionszentrum aus Rhodobacter sphaeroides wird die durch Lichtabsorption aufgenommene Energie durch Ladungstrennung stabilisiert, wie in Abbildung A schematisch dargestellt. Nach der Absorption eines Photons geht der primäre Elektronendonator P in den angeregten Singulettzustand P * über. Aus diesem wird ein Elektron auf das Bacteriochlorophyllmonomer B A übertragen [55]. Vom B A wird das Elektron über das Bacteriophäophytin φ A auf den primären Elektronenakzeptor Q A übertragen. Die Elektronenübertragung auf das Q A führt zum ersten stabilen ladungsgetrennten Zustand P + Q - A. Von diesem erfolgt ein weiterer Elektronentransfer zum sekundären Akzeptor Q B. Durch ein lösliches Cytochrom c wird das Radikalkation P + reduziert und ist somit in der Lage ein weiteres Photon zu absorbieren. Aus dem angeregten Zustand des Donators wird dann wiederum ein - Elektron auf das Ubichinonanionradikal Q B übertragen, welches nach Aufnahme zweier Protonen als Ubihydrochinon die Bindungsstelle verlässt und durch ein Ubichinon aus dem Pool der Membran ersetzt wird. 15

28 Einleitung 1,5 P * φ A Q A Q B s P + φ A - Q A Q B Freie Standardenthalpie / ev 1,0 0,5 hν 10-9 s 10-8 s s P + φ A Q - A Q B 10-1 s 1 s 10-4 s P + - φaqaqb 0,0 Pφ A Q A Q B Abbildung A.3.3.1: Vereinfachtes Schema der Elektronentransferreaktionen im bakteriellen photosynthetischen Reaktionszentrum aus Rhodobacter sphaeroides. Die Größenordnungen der charakteristischen Elektronentransferzeiten sind bei den Pfeilen angegeben, die die jeweiligen Reaktionen symbolisieren. Als Konkurrenzreaktion zu jedem Schritt des Vorwärtselektronentransports tritt die Ladungsrekombination aus dem jeweiligen ladungsgetrennten Zustand auf. Jede Ladungsrekombination stellt eine unproduktive Vergeudung von Energie dar. Daher versucht die Natur, die Ladungsrekombination weitgehend zu unterbinden. Dies geschieht durch Optimierung der Proteinstruktur dahingehend, dass der Vorwärtselektronentransfer um zwei bis drei Größenordnungen schneller ist als die jeweils konkurrierende Ladungsrekombination (die Zeiten für die Elektronentransferreaktionen finden sich in Abbildung A.3.3.1). Die Quantenausbeute beträgt somit nahezu eins. Die hohe Effizienz geht jedoch mit einem hohen Energieverlust einher. Von der Energie des angeregten Singulettzustands des Donators werden nur ca. 35% im ladungsgetrennten Zustand gespeichert. Die Untersuchung sowohl der schnellen Vorwärtselektronentransferschritte wie auch der langsamen Ladungsrekombinationen sind Voraussetzung für das Verständnis, 16

29 Einleitung wie das Protein die effektive Speicherung der Energie der absorbierten Photonen in einen stabilen ladungsgetrennten Zustand bewerkstelligt. Die Ladungsrekombination, die aus dem Zustand P + Q - A Q B zurück in den Grundzustand führt, wird durch die Geschwindigkeitskonstante k AP 10 s -1 charakterisiert. Zwei Bedingungen müssen erfüllt sein, um die Ladungsrekombination von P + - Q A in isolierten Reaktionszentren zu beobachten. Zum einen darf kein exogener Elektronendonator den oxidierten primären Donator reduzieren (Cytochrom c 2 wird bei der Isolation des Reaktionszentrums entfernt). Außerdem muss der Vorwärtselektronentransfer zum Q B unterbunden werden, entweder durch selektive Extraktion von Q B oder durch Verwendung eines kompetitiven Inhibitors für die Q B - Bindungsstelle (o-phenanthrolin oder Terbutryn). In isolierten Reaktionszentren, bei denen Q B vorhanden ist, wird hingegen die Ladungsrekombination aus dem Zustand P + Q A Q - B in den Grundzustand beobachtet (k BP 1 s -1 ). Im Falle einer am Reaktionszentrum gebundenen Cytochrom c-untereinheit, wie es bei Blastochloris viridis der Fall ist (siehe Kapitel A.3.2.), kann der primäre Donator vom gebundenen Cytochrom c reduziert werden, sofern dieser reduziert vorliegt. Diese Elektronentransferreaktionen des tetrahämen Cytochrom c werden in Kapitel A.3.5. im Rahmen des bakteriellen lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfers beschrieben. Bei Messung der Ladungsrekombination liegen die Reaktionszentren in Lösung vor und stehen mit dem Sauerstoff aus der Luft in Kontakt. Somit liegen oxidierende Bedingungen vor, so dass das gebundene Cytochrom c oxidiert vorliegt und den primären Donator nicht reduzieren kann (vgl. Kapitel B und C.2.). A.3.4. Struktur und Funktion des Cytochrom bc 1 Komplex in photosynthetischen Bakterien Die Cytochrom bc Komplexe bilden eine phylogenetisch vielfältige Gruppe von Membranproteinkomplexen, die sowohl in der mitochondrialen und bakteriellen Atmungskette als auch in der Photosynthese den Elektronentransfer von einem Dihydrochinon zu einem Cytochrom des c-typs (bzw. eines Fe-S-Proteins mit hohem Potential, HiPIP, oder eines Plastocyanins) katalysieren. Dieser Elektronentransfer ist gekoppelt mit einem Transfer von Protonen durch die Membran und erzeugt so eine elektrochemische Potentialdifferenz der Protonen über die Membran, die von 17

30 Einleitung der ATP-Synthase zur Synthese von ATP genutzt wird. Zu dieser Gruppe von Membranproteinkomplexen gehören die mitochondrialen und bakteriellen Cytochrom bc 1 Komplexe sowie die Cytochrom b 6 f Komplexe aus den Chloroplasten und Cyanobakterien (Reviews finden sich in [56-60]). Der Cytochrom bc 1 Komplex (auch Ubichinol:Cytochrom c Oxidoreduktase) konnte sowohl aus Mitochondrien verschiedener Organismen als auch aus verschiedenen Purpurbakterien isoliert werden [61-65]. Der Cytochrom bc 1 Komplex von Rhodobacter sphaeroides R-26 konnte erstmals 1982 isoliert werden [66, 67]. Kürzlich konnte die Struktur des mitochondrialen Cytochrom bc 1 Komplexes auf atomarer Ebene aufgeklärt werden [68-70], während für den bakteriellen Cytochrom bc 1 Komplex auf Grund mangelnder Ausbeute und Stabilität des isolierten Proteins noch keine Struktur-Analyse zur Verfügung steht. Der mitochondriale Cytochrom bc 1 Komplex besteht aus 10 oder 11 Untereinheiten, während der bakterielle Cytochrom bc 1 Komplex wesentlich einfacher gebaut ist und aus drei (z.b. Rhodospirillum rubrum) oder vier (z.b. Rhodobacter sphaeroides) Untereinheiten besteht [71-73]. Die drei katalytischen Untereinheiten (Cytochrom b, Cytochrom c 1 und das Rieske Protein) sind in allen bisher untersuchten Spezies konserviert und sind zusammen auf dem fbc Operon im Genom kodiert [71, 74, 75]. Diese drei Untereinheiten binden alle Redoxzentren des Enzyms. Die Beschreibung der Untereinheiten des Cytochrom bc 1 Komplexes erfolgt am Beispiel des Cytochrom bc 1 Komplexes von Rhodobacter sphaeroides [63, 76]. Dieser besteht aus vier Untereinheiten: die Cytochrom b- Untereinheit, die Cytochrom c 1 -Untereinheit, das Rieske-Eisen-Schwefel-Protein und die Untereinheit IV (vgl. auch Abbildung A.3.5.1). Die Cytochrom b-untereinheit (mit einer Molekularmasse von 40 kda) bindet zwei Häme des b-typs, Häm b H (Cytochrom b ) mit einem hohem Halbstufenpotential (E m = 50 mv) und Häm b L (Cytochrom b 566 ) mit einem niedrigen Halbstufenpotential (E m = -90 mv), und bildet die Chinonbindungsstellen Q i und Q o. Sie ist ein integrales Membranprotein, das aus acht transmembranen Helices und einer amphipatischen α-helix, die sich außerhalb der Membran befindet [77], besteht, in dem die Häme senkrecht zur Membran in einer Linie angeordnet sind. An der Q o -Bindungsstelle wird das Dihydrochinon aus der Membran gebunden und oxidiert. 5 Die Bezeichnung der Cytochrome erfolgt anhand der Wellenlänge im Maximum der α-bande im UV- VIS-Absorptionsspektrum (siehe Abbildung B.2.5.1). 18

31 Einleitung Cytochrom c 1 (34 kda) ist in der Membran durch eine C-terminale transmembrane α- Helix verankert, während der größte Teil des Proteins, das auch die Häm-Gruppe (E m = 270 mv) bindet, sich außerhalb der Membran befindet. Hier verlassen die Elektronen den Cytochrom bc 1 Komplex. Das Rieske Eisen-Schwefel Protein (24 kda) wurde zuerst in den Membranen von Rinderherz Mitochondrien von J. S. Rieske et al. [78-80] gefunden. Es bindet über die N-terminale Domäne an die Membran und ist auf diese Weise mit dem Komplex assoziiert. Der [2Fe-2S]-Cluster befindet sich in dem C-terminalen Teil in Nähe der Oberfläche des Proteins und die koordinierenden Proteinreste sind in allen Rieske- Proteinen konserviert. Der [2Fe-2S]-Cluster ist von zwei Cysteinen und zwei Histidinen koordiniert und hat ein hohes Halbstufenpotential von ca. 300 mv. Er ist somit der Oxidationsfaktor des Cytochrom bc 1 Komplexes. Die Untereinheit IV des Cytochrom bc 1 Komplexes aus Rhodobacter sphaeroides hat eine Molmasse von 14 kda und spielt eine Rolle bei der Bindung von Chinon sowie für die Struktur [67, 72, 76, 81]. Die Elektronentransferreaktionen im Cytochrom bc 1 Komplex werden im nächsten Kapitel im Rahmen der Beschreibung des lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfers nach dem sogenannten Q-Zyklus behandelt. A.3.5. Der lichtinduzierte zyklische Elektronentransfer als Q-Zyklus Rhodobacter sphaeroides ist das am besten untersuchte photosynthetische Purpurbakterium in Bezug auf die Teilreaktionen des lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer. Auf Grundlage der Untersuchungen an dieser Spezies ist für die photosynthetische Elektronentransferkette ein Modell erarbeitet worden, das auf den Q-Zyklus basiert, wie ursprünglich von P. Mitchell [82, 83] vorgeschlagen (Abbildung A.3.5.1). Dieses Modell beschreibt die Sequenz der lichtinduzierten Elektronentransferschritte und den Mechanismus der Protonenpumpe, durch die die Energieumwandlung des Sonnenlichtes in chemische Energie erfolgt [84-87]. An diesem Prozess sind zwei transmembrane Proteinkomplexe beteiligt: das Reaktionszentrum und der Cytochrom bc 1 Komplex (oder Ubichinol-Cytochrom c 1 - Oxidoreduktase-Komplex). Diese beiden Komplexe sind durch zwei weitere 19

32 Einleitung Redoxkomponenten miteinander verbunden: das Ubichinon in der hydrophoben Membran und das lösliche Cytochrom c 2 im Periplasma. Diese sind Elektronenakzeptoren bzw. Elektronendonatoren zum Reaktionszentrum. Das Ubichinon ist in der Membran gegenüber dem Reaktionszentrum und dem Cytochrom bc 1 Komplex im stöchiometrischen Überschuss vorhanden (Ubichinon- Pool). In Membranen von Rhodobacter sphaeroides sind je nach Wachstumsbedingungen Ubichinon-Moleküle pro Reaktionszentrum vorhanden. Das Ubichinon reagiert am Cytochrom bc 1 Komplex an zwei katalytischen Bindungsstellen: Q o auf der periplasmatischen Seite der Membran und Q i auf der cytoplasmatischen Seite. Die beiden Bindungsstellen können selektiv gehemmt werden durch verschiedene Typen von Inhibitoren, wie z.b. Antimycin und Myxothiazol. Im folgenden wird die Sequenz der Teilreaktionen nach einer Photoaktivierung des Reaktionszentrums in einem einzelnen Turnover betrachtet. Wenn das System unter oxidierenden Bedingungen (200 mv bei ph=7) vollständig dunkeladaptiert ist, sind vor der Photoaktivierung der primäre Donator P (E m,7 = 450 mv), das lösliches Cytochrom c 2 (E m,7 = 340 mv), die Komponenten des Cytochrom bc 1 Komplexes mit hohem Potential, das FeS-Zentrum (E m,7 = 290 mv) sowie Cytochrom c 1 (E m,7 = 270 mv) reduziert. Hingegen liegen im Dunkeln die beiden Cytochrome b 561 (E m,7 = 50 mv) und b 566 (E m,7 = -90 mv), sowie die Ubichinone Q A und Q B des Reaktionszentrum oxidiert vor. Der Ubichinon-Pool in der Membran (E m,7 = 90 mv) liegt bei diesen Bedingungen vollständig oxidiert vor [88]. Unter diesen Bedingungen wird durch die Photoaktivierung zunächst das Semichinon von Q B gebildet. Ein zweiter lichtinduzierter Elektronentransfer ist notwendig, um das Dihydrochinon Q B H 2 zu bilden, welches mit dem Cytochrom bc 1 Komplex reagieren kann. Es ist jedoch bei den üblichen spektroskopischen Untersuchungen nicht möglich, eine vollständige Dunkeladaptation zu erhalten, so dass alleine das - Messlicht ausreicht, um in einem Teil der Reaktionszentren Q B zu erzeugen. In diesen Reaktionszentren wird das Dihydrochinon bereits nach den ersten Laserblitz gebildet. Der primäre Donator P + oxidiert das lösliche Cytochrom c 2, das wiederum Cytochrom c 1 und das FeS-Zentrum im Cytochrom bc 1 Komplex (high potential Zweig) oxidiert. Das Dihydrochinon verlässt das Reaktionszentrum und reagiert an der Q o -Bindungsstelle des Cytochrom bc 1 Komplexes in einer konzertierten, diffusionskontrollierten Reaktion. Ein Elektron reduziert den high potential Zweig des 20

33 Einleitung Cytochrom bc 1 Komplexes und das andere den low potential Zweig, so dass schließlich das an der Q i -Bindungsstelle gebundene Ubichinon reduziert wird. Der Protonentransfer vom Cytoplasma ins Periplasma ist am zyklischen Elektronentransfer gekoppelt. Periplasma e - FeS E m = 290 mv Myxothiazol cyt c 1 E m = 270 mv 2e - cyt b 566 E m = 90 mv e - cyt b 561 E m = 50 mv e - 2 H + e Q o Q i bc 1 Komplex Q Cytoplasma Antimycin 2 H + - cyt c 2 E m = +340 mv e - QH 2 Q QH 2 Q Q QH 2 QH 2 P E m =+450 mv e - e - Q A E Q m = 0 mv B RC Licht Plasmamembran 2 H + Abbildung A.3.5.1: Modifizierter Q-Zyklus-Mechanismus für den zyklischen Elektronentransfer in Rhodobacter sphaeroides nach A. R. Crofts et al. [84]. Die Elektronentransferschritte sind mit durchgezogenen Pfeilen eingezeichnet, die Diffusion von Q und QH 2 in der Membran mit gestrichelten Pfeilen, und die Aufnahme bzw. Abgabe von Protonen mit gepunkteten Pfeilen. Die Anregung durch Licht wird durch den gezackten Pfeil symbolisiert. Die Halbstufenpotentiale E m der Redoxpartner bei ph = 7 sind angegeben. P: primärer Donator des Reaktionszentrums (RC) Q: Ubichinon QH 2 : Dihydroubichinon Q A, Q B,: Bindungsstellen für Ubichinon bzw. Dihydroubichinon am Reaktionszentrum Q i und Q o : Bindungsstellen für Ubichinon bzw. Dihydroubichinon am Cytochrom bc 1 Komplex b, c 1 und FeS: Cytochrom b, c 1 und das Rieske-Protein im Cytochrom bc 1 Komplex Für die Reduktion von Q zu QH 2 am Reaktionszentrum (RC) müssen zwei Anregungen von P erfolgen. Für die Oxidation eines Äquivalents von QH 2 müssen die Elektronentransferschritte von Q o, FeS, cyt c 1 und cyt c 2 zu P zweimal erfolgen, hingegen die Schritte von Q o über cyt b 566 und cyt b 561 zu Q i nur einmal. 21

34 Einleitung Bei reduzierenden Redoxbedingungen ( mv) ist der Redoxzustand der Komponenten mit Ausnahme des Ubichinon-Pools, der jetzt teilweise reduziert vorliegt, unverändert. Da jetzt schon vor der Anregung Dihydroubichinon-Moleküle zur Verfügung stehen, ergibt sich nach dem Anregungsblitz eine schnelle Reaktion an der Q o -Bindungsstelle. Dieses Modell wurde aus Messungen an Chromatophoren (Vesikel der intracytoplasmatischen Membran, s.o.) in Rhodobacter sphaeroides und Rhodobacter capsulatus erhalten. In diesen Spezies ist kein am Reaktionszentrum gebundenes Tetrahäm vorhanden. Cytochrom c 2 reduziert direkt den primären Donator P +. Diese Spezies scheinen jedoch eher die Ausnahme bei den Purpurbakterien zu bilden. Bei viele Arten (Blastochloris viridis [41], Chromatium vinosum [48], Rhodocyclus gelatinosus [47], Ectothiorhodospira mobilis, Chloroflexus aurantiacus [50], Rhodospirillum salinarum [89] und Rhodoferax fermentans [90]) wird P + vom am Reaktionszentrum gebundenen multihämen Cytochrom c reduziert (s.o.). Man vermutet, dass das Schema des Q-Zyklus in seinen grundsätzlichen Elektronentransferschritten auch in diesen Arten gilt. Experimentelle Nachweise wurden in Chromatophoren von Chromatium vinosum [91] und Blastochloris viridis [92] erhalten, auch wenn systematische Untersuchungen der vom Cytochrom bc 1 Komplex katalysierten Reaktionen fehlen. Untersuchungen an ganzen Zellen von Blastochloris viridis [92] zeigen, dass sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen 6 eine Oxidation des high potential Häms H2 10 µs nach der Anregung durch einen Blitz beobachtet werden kann, das wiederum vom löslichen Cytochrom c 2 mit einer Halbwertszeit von 110 µs bei aeroben Bedingungen und 40 µs bei anaeroben Bedingungen rereduziert wird. Das lösliche Cytochrom c 2 wird dann mit einer Halbwertszeit von 25 ms bei aeroben Bedingungen und 8 ms bei anaeroben Bedingungen in einer Reaktion, an der der Cytochrom bc 1 Komplex beteiligt ist, rereduziert. Eine Photooxidierung der low potential Häme konnte selbst bei den reduzierendsten Bedingungen, d.h. bei anaeroben Bedingungen, nicht beobachtet werden. Im gebundenen Cytochrom c erfolgt der lichtinduzierte Elektronentransfer bei höheren Potentialen, wenn nur ein high potential Häm reduziert vorliegt, mit einer Halbwertszeit von 230 ns von H1 zum primären Donator P +. Bei niedrigeren Potentialen, wenn beide high potential Häme reduziert vorliegen, erfolgt der Elektronentransfer von H1 zu P + mit einer 6 Aerobe Bedingungen wurden erzeugt, indem Luft durch die Zellsuspension geleitet wurde, anaerobe Bedingungen hingegen durch Zugabe von 20 mm Glucose und 3 mg/ml Glucoseoxidase, wobei Stickstoff durch die Suspension geleitet wurde [92]. 22

35 Einleitung Halbwertszeit von 190 ns. H1 wird anschließend von H2 mit einer Halbwertszeit von 1,7 µs reduziert und dieses wird wiederum von Cytochrom c 2 rereduziert [93]. Der beschriebene Mechanismus des Elektronentransfers im gebundenen Cytochrom c von Blastochloris viridis ist in Abbildung A schematisch dargestellt und mit dem Mechanismus des Elektronentransfers in Roseobacter denitrificans verglichen (siehe Kapitel A.4.5.). Zur Zeit geht man davon aus, dass bei den Bakterienarten mit einem am Reaktionszentrum gebundenen Cytochrom c je nach Redoxpotential das Oxidationsäquivalent, das sich nach Anregung bildet, zeitweise auf einem der high potential Häme des Reaktionszentrums lokalisiert ist. Die Reduktion dieses Häms erfolgt dann durch eine lösliche Komponente im Periplasma, das die Elektronen vom Cytochrom bc 1 Komplex erhält. Die Art des periplasmatischen Transporters hängt von der untersuchten Spezies ab [94]. Außer Cytochrom c 2 [92] kann dies auch ein HiPIP (ein FeS-Protein mit hohem Redoxpotential) und/oder ein Cytochrom c 8 sein [95-97]. A.4. Aerobe photosynthetische Bakterien Bei den meisten fakultativ phototrophen Purpurbakterien, wie z.b. Rhodobacter sphaeroides, die sowohl zu einer phototrophen als auch zu einer chemotrophen Energiegewinnung 7 befähigt sind, ist neben der Lichteinstrahlung vor allem der Sauerstoffpartialdruck der wichtigste Faktor, der die Bildung des Photosyntheseapparates reguliert, so dass ein hoher Sauerstoffpartialdruck 7 An dieser Stelle sollen einige in Zusammenhang mit Mikroorganismen verwendete Begriffe erläutert werden (nähere Ausführungen finden sich z.b. in [98]): Autotrophe Mikroorganismen speichern Energie, in dem sie aus anorganischen Verbindungen energiereiche Verbindungen synthetisieren. CO 2 ist die einzige Kohlenstoffquelle. Heterotrophe Organismen benötigen organische Verbindungen als Kohlenstoffquelle. Phototrophe Bakterien speichern die Sonnenenergie durch Synthese energiereicher Verbindungen (Photosynthese). Photoautotrophe Organismen nutzen die Sonnenenergie und CO 2 ist die einzige Kohlenstoffquelle. Chemotrophe Organismen benutzt energiereiche Verbindungen als Energiequelle. Chemohetrotrophe Organismen benutzen energiereiche Verbindungen als Energiequelle und brauchen organische Verbindungen als Kohlenstoffquelle. Aerobe Bakterien benötigen Sauerstoff für das Zellwachstum. Anaerobe Bakterien benötigen kein Sauerstoff für das Zellwachstum und können nicht an der Luft (21% Sauerstoff) wachsen. Für sie ist Sauerstoff toxisch. 23

36 Einleitung besonders im Licht die Biosynthese des Photosyntheseapparates hemmt [99-101]. Eine Ausnahme dazu bilden Rhodovulum sulfidophilum und Rhodospirillum cetenum, die auch bei Anwesenheit von Sauerstoff den Photosyntheseapparat ausbilden können [102, 103]. Ende der 70er Jahre wurde erstmals eine neue physiologische Gruppe von Bakterien entdeckt, die Bacteriochlorophyll a-haltigen, obligat aeroben photosynthetischen Bakterien [ ]. Die aeroben photosynthetischen Bakterien 8 können den Photosyntheseapparat ausschließlich unter aeroben Bedingungen bilden, und ein effizienter photoinduzierter Ladungstransfer findet nur unter aeroben Bedingungen statt. Unter anaeroben Bedingungen hingegen findet keine Photosynthese statt, d.h. diese Bakterien sind nicht in der Lage, phototroph in Abwesenheit von Sauerstoff bzw. von externen Oxidantien zu wachsen. In den letzten Jahrzehnten wurden über 20 Spezies aerober photosynthetischer Bakterien aus verschiedenen marinen und Süßwasserstandorten isoliert und untersucht (zum Überblick siehe [107] und [109]). Alle bisher bekannten Arten mit Ausnahme von Roseobacter denitrificans haben eine obligat aerobe chemoheterotrophe Lebensweise. Roseobacter denitrificans ist in der Lage, auch anaerob mit Nitrat oder Trimethylaminoxid (TMAO) als Elektronenakzeptor im Licht zu wachsen [110, 111]. Da Licht und hoher Sauerstoff-Gehalt die Ausbildung des Photosyntheseapparates und die Synthese von Bacteriochlorophyll a hemmen, scheint die Photosynthese unter Standortbedingungen keinen signifikanten Beitrag zum Energiestoffwechsel der aeroben photosynthetischen Bakterien zu liefern. Über Nacht (also im Dunkeln) und bei niedrigem Sauerstoffgehalt wird der Photosyntheseapparat in geringem Umfang gebildet. Er kann in den frühen Morgenstunden bevor ein lichtbedingter Abbau der Photosynthesepigmente einsetzt, einen kleinen Beitrag zum Energiestoffwechsel der Bakterien leisten [112]. Unter Ausschluss von Sauerstoff im Licht findet kein Wachstum statt, da diese Bakterien keinen anaeroben Lichtstoffwechsel betreiben können. Die Ursache hierfür ist zur Zeit Gegenstand intensiver Untersuchungen. Die Tatsache, dass aerobe photosynthetische Bakterien nicht photoautotroph wachsen können und Sauerstoff benötigen, führte zur Hypothese, dass diese die evolutionäre Verbindung zwischen den photosynthetischen Purpurbakterien und den aeroben Heterotrophen bilden [113] oder in ihrer Entwicklung zu aeroben Bakterien 8 Diese neue Gruppe von Bakterien soll hier aerobe photosynthetische Bakterien genannt werden. Sie wurden in der Literatur zunächst als (obligat) aerobe Bacteriochlorophyll-enthaltende Bakterien [106], später auch als (obligat) aerobe Photoheterotrophen, aerobe anoxygene Bakterien, aerobe anoxygene Phototrophe [107], obligat aerobe phototrophe Bakterien und quasi-photosynthetische Bakterien [108] bezeichnet. 24

37 Einleitung einen überflüssigen, nicht funktionierenden Photosyntheseapparat beibehalten haben. Ferner könnten diese Organismen den Photosyntheseapparat aeroben Bedingungen angepasst haben und einen kompetenten photosynthetischen Elektronentransfer als zusätzliche Möglichkeit der Energiegewinnung im Rahmen eines effizienten heterotrophen Metabolisums aufrechterhalten [114]. Im Folgenden soll ein Überblick über die aeroben photosynthetischen Bakterien gegeben werden, wobei der Schwerpunkt auf Roseobacter denitrificans 9 liegt. Diese Spezies ist am besten charakterisiert und wurde für die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit verwendet. A.4.1. Habitat, Morphologie und Phylogenese Alle bisher bekannten Arten der aeroben photosynthetischen Bakterien haben eine obligat aerobe chemoheterotrophe Lebensweise. Roseobacter denitrificans bildet insofern eine Ausnahme, als diese Bakterien auch unter anaeroben Bedingungen in Anwesenheit von Elektronenakzeptoren wie Nitrat oder TMAO 10 im Licht wachsen. Die aeroben photosynthetischen Bakterien wurden hauptsächlich aus nahrungsreichen, geschützten wässrigen Umgebungen wie Sandstränden, Seetang u.ä. isoliert. Die ersten Arten wurden in den marinen Gewässern an der japanischen Küste in der Nähe von Tokio gefunden [106]. Weitere marine Arten wurden an den Küsten Australiens [106] und der kanadischen Küste bei Vancouver [115] gefunden. Süßwasserarten wurden in Russland gefunden [116]. Trotz der weiten Verbreitung dieser aeroben photosynthetischen Bakterien in verschiedenen ökologischen Nischen, wo sie bis zu 30% der heterotrophen Bakterien ausmachen, ist die ökologische Bedeutung und ihre Rolle in den Populationen von Mikroben bis heute unklar. Neuere Untersuchungen zeigen, dass die Verbreitung von aeroben photosynthetischen Bakterien über nahrungsreiche, geschützte ökologische Nischen hinausgeht und sie in den oberen Schichten der Ozeane der Welt verbreitet sind, wo sie mindestens 11% der gesamten mikrobiellen Organismen ausmachen [114, 117]. Die aeroben photosynthetischen Bakterien der Ozeane bilden eine relativ 9 Früher als Erythrobacter sp. OCh 114 bezeichnet. 10 Trimethylamino-N-oxid 25

38 Einleitung einheitliche, weitverbreitete Klasse, die mit den phänotypisch vielfältigen aeroben photosynthetischen Bakterien der nahrungsreichen ökologischen Nischen verwandt sind, wobei letztere möglicherweise sich aus einem Vorläufer der ozeanischen aeroben photosynthetischen Bakterien entwickelt haben könnten. Die ozeanischen aeroben photosynthetischen Bakterien koexistieren mit den oxygenen Photoautotrophen der Ozeane und leisten einen nicht zu unterschätzenden Beitrag zum organischen und anorganischen Kohlenstoff-Zyklus im Ozean, dessen Details noch völlig unbekannt sind [117]. Neueste Analysen der Genome von ozeanischen aeroben photosynthetischen Bakterien zeigen, dass in den Ozeanen noch wesentlich mehr bisher noch nicht kultivierte und charakterisierte, z.t. nur entfernt miteinander verwandte Arten von aeroben photosynthetischen Bakterien verbreitet sind [118]. Alle bisher untersuchten aeroben photosynthetischen Bakterien haben eine gramnegative Zellwand, ihre Morphologien sind jedoch sehr verschieden. Die marine Spezies Roseobacter denitrificans, die 1979 von T. Shiba [106] isoliert wurde, vermehrt sich durch binäre Zellteilung und bildet ovoid bis stäbchenförmige Zellen mit einer Größe von ca. 0,5 µm x 1,0 µm. Die meisten Spezies sind mobil und haben polar oder subpolar angeordnete Flagellen (Geißeln). Die meisten Purpurbakterien haben zusätzlich zur Plasmamembran ein System von intracytoplasmatischen Membranen (ICM) mit Morphologien, die von Spezies zu Spezies variieren können. Die ICM wird aus der Plasmamembran gebildet und ist mit ihr verbunden. Sie kann Vesikel, Tubuli oder thylakoidähnliche Gebilde bilden. Die Proteinkomplexe des Photosyntheseapparates sind fast ausschließlich in den ICM zu finden. Bei den meisten Purpurbakterien wird die Ausbildung der ICM durch Licht und Sauerstoffpartialdruck reguliert. Bei den aeroben photosynthetischen Bakterien hingegen sind iintracytoplasmatische Membranen wahrscheinlich nicht vorhanden und wurden in den Genera Erythrobacter und Erythromonas nicht gefunden. In Roseobacter denitrificans wurden hingegen gelegentlich vesikelähnliche Strukturen gefunden wie in Abbildung A dargestellt [119]. 26

39 Einleitung Abbildung A.4.1.1: Elektronenmikroskopische Aufnahme der Zelle von Roseobacter denitrificans [119]. Der Balken entspricht 0,5 µm. Man kann die innere cytoplasmatische und die äußere Membran erkennen sowie Vesikel in der Größe von ca. 100 nm Durchmesser, die die intracytoplasmatische Membran (ICM) bilden. Der Bacteriochlorophyll- Gehalt der Zellen betrug 3,8 nmol/mg Trockengewicht. Die aeroben photosynthetischen Bakterien [107] bilden zwei marine (Erythrobacter und Roseobacter) und sechs Süßwasser-Genera (Erythromicrobium, Roseococcus, Porphyrobacter, Acidiphilium, Erythromonas und Sandaracinobacter). Phylogenetisch sind aerobe photosynthetische Bakterien im Stammbaum der photosynthetischen Bakterien in der α-subklasse der Proteobakterien, zu denen die photosynthetischen Purpurbakterien gehören, einzuordnen 11. Die starke Verbreitung in verschiedenen Untergruppen deutet darauf hin, dass sie sich aus verschiedenen unabhängigen Purpurbakterien entwickelt haben könnten. Interessanterweise bringt die vergleichende Sequenzanalyse der 16S ribosomalen RNA Roseobacter denitrificans in relativ nahe phylogenetische Verwandtschaft zu den fakultativen Phototrophen Rhodobacter capsulatus und Rhodobacter sphaeroides [121], während es nur entferntere Verwandtschaft zu den anderen aeroben photosynthetischen Bakterien zeigt [122]. 11 Eine vereinfachte Beschreibung des Stammbaumes der photosynthetischen Bakterien und ihrer phylogenetischen Verwandtschaften findet sich in G. Drews [120]. 27

40 Einleitung A.4.2. Pigmente Charakteristisch für alle Arten von aeroben photosynthetischen Bakterien sind die großen Mengen an Carotinoiden, die deren Farbe bestimmen. Die Zusammensetzung variiert von Spezies zu Spezies. Ihre Funktion ist der Schutz vor photooxidativen Schäden sowie die Absorption von Licht zur Weiterleitung an die Lichtsammelkomplexe bzw. an das photosynthetische Reaktionszentrum. In Roseobacter denitrificans ist die rosarote Farbe durch Spheroidenon verursacht, das 95% des Carotionoidgehalts ausmacht [123]. Spheroidenon ist auch das häufigste Carotinoid bei semiaerob gezogenen Zellen von einigen Purpurbakterien wie Rhodobacter sphaeroides. Im Gegensatz zu den anderen Arten aerober photosynthetischer Bakterien besitzt Roseobacter denitrificans nur Carotinoide, die nicht-kovalent an das Reaktionszentrum und die Lichtsammelkomplexe gebunden sind (Pigment-Protein- Komplexe) und als lichtsammelnde Pigmente fungieren [124]. Spektroskopische Untersuchungen haben gezeigt, dass Roseobacter denitrificans ein Reaktionszentrum und zwei Antennenkomplexe, LH I bzw. B870 (ähnlich dem in Purpurbakterien) und LH II bzw. B806, besitzt [125, 126]. In den aeroben photosynthetischen Bakterien ist die einzige Form von Bacteriochlorophyll, die gefunden wurde, das Bacteriochlorophyll a, das nichtkovalent in Pigment-Protein-Komplexen (LH I, LH II und Reaktionszentrum) eingebaut ist und Absorptionsmaxima zwischen 800 und 870 nm aufweist (Abbildung A.4.2.1). Im Vergleich zu den Purpurbakterien enthalten die aeroben Bakterien viel geringere Mengen an Bacteriochlorophyll (5-10% bzw. ca. 1-2 nmol/mg Zellen Trockengewicht [109]), daher überrascht eine geringe Bildung der für die Photosynthese spezialisierten intracytoplasmatischen Membran (ICM) nicht. Das Bacteriochlorophyll a, das von Roseobacter denitrificans isoliert wurde, enthält wie auch bei den meisten Purpurbakterien einen Phytolrest. Das Verhältnis von Bacteriochlorophyll zu Carotinoiden liegt in ganzen Zellen aerober photosynthetischer Bakterien bei ca. 1 : 10, wobei dieser Wert durch Licht und Sauerstoffgehalt während des Zellwachstums beeinflusst wird [109]. Ferner bilden diese Bakterien einen Photosyntheseapparat aus, der in seiner Organisation dem der Purpurbakterien entspricht, aber in wesentlich geringeren Konzentrationen synthetisiert wird. Die bisher bekannten Eigenschaften des Photosyntheseapparates 28

41 Einleitung in den aeroben photosynthetischen Bakterien sollen im Folgenden beschrieben werden, wobei besonders auf Roseobacter denitrificans eingegangen wird Absorption Wellenlänge (nm) Abbildung A.4.2.1: Absorptionsspektren von Membransuspensionen aerober Bakterien Roseococcus thiosulfatophilus (A), Erythrobacter litoralis (B), Erythromicrobium hydrolyticum (C) und Erythromicrobium ezovicum (D) [109]. Die Ausschnitte zeigen die Absorptionsmaxima des in Proteinkomplexen (Antennenkomplexe und Reaktionszentrum) eingebauten Bacteriochlorophylls a. A.4.3. Struktur und Funktion der Antennenkomplexe in den aeroben photosynthetischen Bakterien Die Absorptionsmaxima der Antennenkomplexe in den aeroben Bakterien weisen oft unübliche Wellenlängen auf, wie z.b. bei Roseococcus thiosulfatophilus, der einen LH I Komplex B856 (mit einem Absorptionsmaximum bei 856 nm) enthält. Roseobacter denitrificans besitzt zwei Antennenkomplexe, B870 (LH I) und B806 (LH II). LH II wurde isoliert und gereinigt und besteht aus zwei Polypeptiden α und β mit Molekularmassen von jeweils 5,0 kda und 7,0 kda. Der Lichtsammelkomplex weist als Pigmente Carotinoide (95% Spheroidenon) und Bacteriochlorophyll a auf. Das UV-VIS-Absorptionsspektrum weist neben dem Absorptionsmaximum bei 806 nm, Bacteriochlorophyll-Absorptionsbanden bei 370 nm und 590 nm auf. Die Bande bei 510 nm ist den Carotinoiden zuzuschreiben (Abbildung A.4.3.1). Die Funktion der 29

42 Einleitung Lichtsammelkomplexe besteht darin, Lichtquanten zu absorbieren und die Anregungsenergie möglichst effizient mittels Förster-Resonanzenergietransfer an das Reaktionszentrum weiterzuleiten (siehe Kapitel A.3.1.). Im Vergleich zu den Purpurbakterien überlappen die Absorptionsmaxima von B806 (LH II) und B870 (LH I) nur sehr wenig. Untersuchungen von K. Shimada [126] zeigen, dass der Energietransfer von LH II zum LH I-RC-Komplex 12 trotzdem effizient verläuft. Das Fluoreszenz-Spektrum der Membran weist bei Raumtemperatur (bei einer Anregungswellenlänge von 800 nm) eine starke Emissionsbande bei 885 nm und eine schwache bei 820 nm auf, die jeweils B870 und B806 zugeschrieben werden können. Vergleicht man das Emissionsspektrum der Membran mit dem einer mit Detergens behandelten Membran, beobachtet man bei der Fluoreszenzbande von B806 einen sehr starken Anstieg und bei der von B870 eine Abnahme. Die Fluoreszenz von B806 wird also in den intakten Membran unterdrückt, was auf einen effizienten Energietransfer von LH II auf den LHI-RC-Komplex schließen lässt. Der Grund für die hohe Effizienz des Energietransfers ist vermutlich die strukturelle Anordnung der Lichtsammelkomplexe in der Membran (siehe Kapitel A.3.1.). Obwohl die Lichtsammelkomplexe in den aeroben photosynthetischen Bakterien in den Absorptionseigenschaften signifikant verschieden von denen der Purpurbakterien sind, scheint ihre Organisation grundsätzlich ähnlich zu sein [109]. 12 RC steht für Reaktionszentrum. 30

43 Einleitung,6 Absorption,5,4,3,2,1 0, Wellenlänge (nm) Abbildung A.4.3.1: Absorptionsspektrum vom Lichtsammelkomplex LH II aus Roseobacter denitrificans [127]. Die Absorptionsbanden des Bacteriochlorophyll a finden sich bei 370 nm, 590 nm und 806 nm. Bei 510 nm befindet sich eine breite Bande der Absorption der Carotinoide. A.4.4. Struktur und Funktion der Reaktionszentren Die Anwesenheit eines Reaktionszentrums in aeroben photosynthetischen Bakterien wurde zunächst Anfang der 80iger Jahre in Roseobacter denitrificans und Erythrobacter longus [119] durch lichtinduzierte Absorptionsänderungen nachgewiesen. Später konnte das Reaktionszentrum von Roseobacter denitrificans isoliert werden [128]. Die Absorptionsspektren im oxidierten und reduzierten Zustand ähneln den entsprechenden Spektren von Rhodobacter sphaeroides mit Ausnahme der Cytochrom-Banden und der Carotinoid-Banden. Die Cofaktoren des Reaktionszentrums, die die transmembrane Ladungstrennung katalysieren (siehe Kapitel A.3.2. und A.3.3.) sind die gleichen wie in Blastochloris viridis. Das Protein besteht aus vier Untereinheiten, und davon konnte eine als Cytochrom-Untereinheit identifiziert werden [128]. Kürzlich konnte die Primärstruktur der Untereinheiten L und M des Reaktionszentrums sowie der Polypeptide α und β des LH I Komplexes durch Sequenzanalyse des puf Operons, das die Gene der Untereinheiten L, M und C des Reaktionszentrum (puflmc) sowie der Polypeptide des LH I Komplexes (pufab) enthält, ermittelt werden [129, 130]. Das pufc Gen kodiert die Untereinheit 31

44 Einleitung des tetrahämen Cytochroms c, das aus 352 Aminosäuren besteht (M r = Da). Dabei sind 20% bzw. 34% der Aminosäuren identisch mit den Aminosäuren der Cytochrom c-untereinheit von Chloroflexus aurantiacus bzw. Rubrivirax gelatinosum. Der hydrophobe N-terminale Bereich ist wahrscheinlich für die Verankerung der Untereinheit in der Membran verantwortlich. Das Sequenz-Alignment von Roseobacter denitrificans, Blastochloris viridis, Rubrivirax gelatinosum und Chloroflexus aurantiacus hat es ermöglicht, die Aminosäuren zu identifizieren, die die Häme binden (Cys-X-X-Cys). Bislang gab es nur relativ wenige Arbeiten, die sich mit der physikalischen Charakterisierung der Reaktionszentren aerober photosynthetischer Bakterien beschäftigten. Messungen an Membranen aus Roseobacter denitrificans ergaben für den primären Elektronenakzeptor Q A ein Halbstufenpotential von E m,7 = 35 mv [131]. Dieser Wert war wesentlich größer verglichen mit dem Halbstufenpotential von E m,7 = 0 mv bzw. E m,7 = -100 mv, den Dutton et. al. für Chromatophoren aus Rhodobacter sphaeroides bzw. Chromatium vinosum gefunden haben[132]. Daraus schlossen K. Okamura et al. [131], dass Q A in dunkeladaptierten Zellen reduziert vorliegt. Da Q A ein Ein-Elektronen-Akzeptor ist, kann unter diesen Bedingungen kein - lichtinduzierter Elektronentransfer stattfinden. In Gegenwart von Sauerstoff wird Q A oxidiert, und der Prozess der Photosynthese kann ablaufen. Dies erklärt, warum diese Bakterien Sauerstoff zum Wachsen benötigen. In isolierten Reaktionszentren wurde für Q A ein Wert von E m = -44 mv und für den primären Donator P ein Halbstufenpotential von E m,7 = 435 mv gefunden [128]. Das Ergebnis für Q A entspricht dabei im Rahmen der Messgenauigkeit dem von Rhodobacter sphaeroides [133]. Der Grund für diese Diskrepanz zwischen den gemessenen Daten an Reaktionszentren und Membranen ist unklar und bedarf weiterer Untersuchungen. Der two electron gate Mechanismus konnte durch Untersuchung der binären Oszillationen, die aus der Ubisemichinonbildung nach Lichtanregung resultieren, durch eine Sequenz von vier aufeinanderfolgenden Anregungsblitzen verifiziert werden. Auch die Ladungsrekombinationskinetiken ähneln denen in Rhodobacter sphaeroides (siehe Kapitel A.3.3.). Für die Rekombination von P + Q - A zu PQ A bzw. von P + Q - B zu PQ B wurde jeweils eine Halbwertzeit von 20 ms (in Anwesenheit von 10 mm o-phenanthrolin) bzw. 0,8 s ermittelt [128]. 32

45 Einleitung Ebenso wurden in Roseobacter denitrificans die thermodynamischen und spektroskopischen Eigenschaften des tetrahämen Cytochrom c im isolierten Reaktionszentrum untersucht [108]: Tabelle A.4.4.1: Physikochemische Eigenschaften der Tetrahäm-Untereinheit des Reaktionszentrums aus Roseobacter denitrificans [108]. Die Halbstufenpotentiale wurden bei ph = 7 angegeben. Häm Halbstufenpotential E m,7 / mv Absorptionsmaximum l (a-bande) / nm Name H Cytochrom c 555 H Cytochrom c 554 L1 / L Cytochrom c Die low potential Häme können spektroskopisch nicht unterschieden werden. Aus Untersuchungen des Linearen Dichroismus wurde die Orientierung der Häme in bezug auf die Membranebene abgeschätzt [108]. Die Häme H1, H2, L1 und L2 bilden jeweils Winkel von 40, 55, 90 bzw. 40 und 40 bzw. 90 mit der Membranebene. L1 und L2 haben ein sehr ähnliches Potential und können deshalb nicht unterschieden werden. Die Orientierung der Häme in Blastochloris viridis, Rubrivirax gelatinosum, Chromatium vinosum, Chloroflexus aurantiacus und Roseobacter denitrificans ist in Tabelle A verglichen. In Roseobacter denitrificans sind die Halbstufenpotentiale der high potential Häme H1 und H2 niedriger als in den anderen photosynthetischen Bakterien (in Blastochloris viridis ist E m,7 = 370 mv für H1 und E m,7 = 320 mv für H2; in Chromatium vinosum ist E m,7 = 350 mv für H1 und E m,7 = 320 mv für H2). Hingegen sind die Halbstufenpotentiale der low potential Häme L1 und L2 höher als in Blastochloris viridis und Chromatium vinosum. Ähnlicher sind die Werte bei Rubrivirax gelatinosum und Chloroflexus aurantiacus [47, 50]. 33

46 Einleitung Tabelle A.4.4.2: Orientierung der Häme der tetrahämen Cytochrom c- Untereinheit des Reaktionszentrums in bezug auf die Membranebene verschiedener photosynthetischer Bakterien. Blastochloris viridis [108] Rubrivirax gelatinosum [42] Chromatium vinosum [48] Chloroflexus aurantiacus [134] Roseobacter denitrificans [108] H L bzw bzw H L bzw bzw Die Häme L1 und L2 können bei diesen Spezies nicht spektroskopisch unterschieden werden. A.4.5. Der zyklische Elektronentransfer in Roseobacter denitrificans und beteiligte Enzymkomplexe Das Reaktionszentrum aus Roseobacter denitrificans hat ebenso wie in anderen aeroben photosynthetischen Bakterien der Genera Erythromonas, Sandaracinobacter und Roseococcus [115, 116] eine tetrahäme Cytochrom c- Untereinheit. Die Elektronentransferkinetiken vom tetrahämen Cytochrom c zum primären Donator P + wurden kürzlich im Detail an isolierten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans untersucht [93]. In einem weiten Bereich des eingestellten Redoxpotentials (E h = mv) zeigt die Reduktionskinetik des durch Anregung mit einem Laserimpuls oxidierten primären Donators P + zu P drei exponentielle Phasen (vgl. Abbildung A.4.5.1): eine langsame Phase mit einer Halbwertzeit t 1/2 > 10 ms und zwei schnelle Phasen mit t 1/2 = 5 µs bzw. 280 ns. Die langsame Phase überwiegt bei einem eingestellten Redoxpotential E h > 290 mv und verschwindet, wenn das Potential verringert wird mit einem scheinbaren Halbstufenpotential E m,7 = 290 mv. Diese Phase entspricht der Rekombination von P + - mit Q A zu PQ A und verschwindet mit zunehmender Reduktion von H1 (E m,7 = 290 mv) bei Verringerung des eingestellten Redoxpotentials. Die schnelle Phase mit 5 µs entsteht in dem Maße wie die langsame verschwindet und entspricht dem Elektronentransfer von H1 nach P +. Kommt man bei Verringerung des eingestellten Redoxpotentials in den 34

47 Einleitung Bereich, in dem H2 anfängt, vor der Photoanregung reduziert vorzuliegen (E h 240 mv), verschwindet die 5 µs Phase und wird nach und nach durch die schnellere 280 ns Phase ersetzt. Diese Phase entspricht dem Elektronentransfer von H2 zu P +. Die Elektronentransferkinetik zwischen den high potential Hämen und dem primären Donator in Roseobacter denitrificans unterscheidet sich stark von der in Blastochloris viridis. In Blastochloris viridis erfolgt die Reduktion des primären Donators P + mit 230 ns, wenn H1 reduziert vorliegt, und mit 190 ns, wenn beide high potential Häme vor der Anregung reduziert sind, wobei H2 zunächst H1 mit einer Halbwertszeit t 1/2 = 1,7 µs reduziert [135]. In Roseobacter denitrificans ist der Elektronentransfer von H1 zu P + 20mal langsamer. Das lässt vermuten, dass H1 nicht das dem Reaktionszentrum am nächsten liegende Häm ist. Zudem lässt sich die Verringerung der Halbwertszeit des Elektronentransfers von den Hämen auf P +, wenn beide Häme reduziert vorliegen, nicht mit einem Elektronentransfer von H2 auf H1, welches dann P reduziert, erklären. Daher wurde vorgeschlagen, dass in Roseobacter denitrificans im Unterschied zu Blastochloris viridis H2 das dem Reaktionszentrum nächste Häm sein muss. Aus der Sequenzanalyse und aus dem Vergleich mit Blastochloris viridis und Rhodocyclus gelatinosus wird vermutet, dass ein low potential Häm zwischen H1 und H2 liegt. Demnach wäre die Reihenfolge der Häme im gebundenen Cytochrom c wie folgt: P H2 L1 H1 L2 35

48 Einleitung E m,7 = 450 mv E m,7 = 435 mv E m,7 = 380 mv E m,7 = 240 mv E m,7 = 20 mv E m,7 = 90 mv E m,7 = 310 mv E m,7 = 290 mv E m,7 = -60 mv E m,7 = 90 mv Abbildung A.4.5.1: Anordnung der Häme im tetrahämen Cytochrom c von Roseobacter denitrificans (rechts) im Vergleich zu Blastochloris viridis (links) nach D. Garcia et al. [93]. Angegeben sind die Halbwertszeiten für die Elektronentransferreaktionen, die durch Pfeile symbolisiert sind sowie die Halbstufenpotentiale der Redoxkomponenten (siehe Text). Bei 0 mv, wenn die low potential Häme reduziert vorliegen wird P + mit einer Halbwertszeit von 160 ns reduziert, ein ähnlicher Wert wie bei Blastochloris viridis [92]. Die Organisation der Häme, wie sie für Roseobacter denitrificans vorgeschlagen wurde, konnte auch für Chromatium vinosum und Rhodocyclus gelatinosus verifiziert werden [47, 48]. In beiden Spezies ist die Ebene des Häms H2 senkrecht zur Membranebene und damit parallel zum Bacteriochlorophylldimer. Diese Orientierung begünstigt einen schnellen Elektronentransfer zwischen H2 und P +. Ähnliches könnte bei Roseobacter denitrificans der Fall sein. Die Ebene des Häms H2 bildet in der Tat einen größeren Winkel mit der Membranebene als das Häm H1. Der Vergleich zeigt, wie die funktionelle Anordnung der Häme in der tetrahämen Cytochrom c-untereinheit des Reaktionszentrums von der Spezies abhängt. In Chloroflexus aurantiacus wurde z.b. eine Reihenfolge P-H1-L1-L2-H2 postuliert [136]. Untersuchungen an ganzen Zellen von Roseobacter denitrificans zeigen, dass neben dem tetrahämen Cytochrom c noch ein lösliches Cytochrom c am lichtinduzierte Elektronentransfer beteiligt ist [108]. Es wurden blitzinduzierte Absorptionsänderungen in der α-bande der Cytochrome des c-typs zeitabhängig unter aeroben Bedingungen gemessen. Das Differenzspektrum hat ein Absorptionsmaximum bei 554 nm, aufgenommen 10 µs nach der Anregung, was der Oxidation von H2 entspricht. Nach weiteren 6 ms ist das Maximum auf 552 nm 36

49 Einleitung verschoben und zeigt somit die Beteiligung eines anderen Cytochrom c, das als Cytochrom c 551 identifiziert wurde [108]. Cytochrom c 551 wurde isoliert und aufgereinigt [137] und ist das häufigste lösliche Cytochrom in Roseobacter denitrificans. Es hat Absorptionsmaxima bei 277 nm, 410 nm sowie zwischen 524 und 525 nm im oxidierten Zustand, während im reduzierten Zustand die Werte bei 415 nm, 522 nm sowie bei 550,5 nm liegen. Das Halbstufenpotential beträgt E m,7 = 250 mv bei ph = 7. Die Aminosäuresequenzanalyse [138] hat ergeben, dass dieses lösliche Protein aus 119 Aminosäuren besteht und einer Molmasse von Da hat. Das Alignment mit den Sequenzen anderer Cytochrome c zeigt, dass es dem Cytochrom c 2 von Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides und Paracoccus denitrificans ähnlich ist. Obwohl die physikochemischen Eigenschaften ähnlich sind, überträgt Cytochrom c 551 die Elektronen nicht wie Cytochrom c 2 direkt auf P +, sondern über die tetrahäme Cytochrom c-untereinheit. Das Cytochrom c 551 in Roseobacter denitrificans ist möglicherweise sowohl an der Photosynthese als auch an der Zellatmung beteiligt [139]. Versuche an ganzen Zellen zeigen, dass Cytochrom c 551 von H2 mit einer Halbwertzeit von 1,5 ms oxidiert wird [108]. Die darauffolgende Rereduktion erfolgt mit t 1/2 > 10 ms. Wird die Viskosität der Zellsuspension durch Zugabe von 20% Ethylglycol erhöht, verdoppelt sich sowohl die Halbwertszeit der Oxidation als auch die der Rereduktion des Cytochrom c 551. Dieses steht in Einklang mit der Hypothese, dass Cytochrom c 551 mit dem tetrahämen Cytochrom reagiert und seinerseits Elektronen aus der zyklischen Transportkette in einem diffusionskontrollierten Prozess zweiter Ordnung erhält. Es ist anzunehmen, dass auch in Roseobacter denitrificans ein zyklischer Elektronentransfer stattfindet, an dem ein Cytochrom bc 1 Komplex beteiligt ist. Dieser Komplex wurde bisher nicht isoliert, aber seine Beteiligung in der aeroben Zellatmungskette vorgeschlagen, um die Inhibierung durch spezifische Inhibitoren wie Antimycin und Myxothiazol zu erklären [139]. In der Literatur sind bisher keine Daten veröffentlicht worden, die die Beteiligung des Cytochrom bc 1 Komplexes am lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer zeigen. In ganzen Zellen konnte gezeigt werden, dass die Rereduktion von Cytochrom c 551 mit zunehmender Konzentration an Myxothiazol (< 1 µm) verlangsamt wird [108]. Dieses Ergebnis lässt die Beteiligung eines Cytochrom bc 1 Komplexes vermuten und ist im Einklang mit der Hypothese, dass Cytochrom c 551 den lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer 37

50 Einleitung ermöglicht, indem es Elektronen vom Cytochrom bc 1 Komplex übernimmt und zum tetrahämen Cytochrom c des Reaktionszentrums überträgt. Unter semiaeroben Bedingungen wird in ganzen Zellen von Roseobacter denitrificans die Amplitude der Photooxidation der Cytochrome des c-typs gegenüber aeroben Bedingungen um ca. 20% verringert, vermutlich wegen der partiellen Präreduktion des primären Akzeptors Q A im Reaktionszentrum. Zudem verschiebt sich das Maximum in der α-bande der Cytochrome im lichtinduzierten Differenzspektrum von 554 nm zu 553 nm, was dem Absorptionsmaximum der low potential Häme entspricht [108]. Unter diesen Bedingungen liegt also eines oder beide low potential Häme L vor der Anregung teilweise reduziert vor. Die beobachtete Photooxidierung nimmt nur sehr langsam mit einer Halbwertzeit von ca. 5 s ab und zeigt, dass unter diesen offensichtlich sehr reduzierenden Redoxbedingungen kein zyklischer Elektronentransfer mittels Cytochrom c 551 möglich ist. Aus thermodynamischer Sicht ist dieses Verhalten in Einklang mit den Redoxpotentialen der low potential Häme L (90 mv), die sehr viel niedriger sind als Cytochrom c 551 (250 mv) und daher keinen Elektronentransfer ermöglichen. Abbildung A fasst die bisherigen Ergebnisse der Untersuchungen des lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfers in Roseobacter denitrificans zusammen. 38

51 Einleitung Periplasma cyt c 551 E m = +250 mv e - cyt c L 2 E m = +90mV H 1 E m = +290mV L 1 E m = +90mV Licht H 2 E m = +240mV e - P 870 Cytochrom bc 1 Komplex E m = +435 mv e - Plasmamembran Cytoplasma Q B e - Q A E m,chrom = 34 mv E m,rc = -44 mv RC Abbildung A.4.5.2: Schematische Darstellung des zyklischen Elektronentransfers in Roseobacter denitrificans. Die Halbstufenpotentiale des am Reaktionszentrum (RC) gebundenen Cytochrom c (cyt c) wurden in isolierten Reaktionszentren gemessen [108], ebenso wie das Redoxpotential des primären Donators [128]. Das Halbstufenpotential des primären Akzeptors Q A wurde zunächst in Chromatophoren (Chrom [131]) und später in isolierten Reaktionszentren (RC [128]). Das Halbstufenpotential von Cytochrom c 551 wurde im isolierten Protein bestimmt [137]. Die Elektronentransferreaktion wurde im isolierten Reaktionszentrum bestimmt [93]. Der Elektronentransfer von Cytochrom (cyt) c 551 zum tetrahämen Cytochrom c wurde in ganzen Zellen gemessen [93]. Der Cytochrom bc 1 Komplex konnte nicht direkt nachgewiesen werden. Aerobe photosynthetische Bakterien können nicht unter anoxischen Bedingungen wachsen und den Photosyntheseapparat synthetisieren. In ganzen Zellen von Roseobacter denitrificans findet die lichtinduzierte ATP-Synthese nur unter aeroben Bedingungen statt [140]. So wurde beobachtet, dass in Zellsuspensionen die durch kontinuierliches Licht unter aeroben Bedingungen induzierten ph-veränderungen unter anoxischen Bedingungen verschwanden [131]. Ebenso wird die photochemische Aktivität stark gehemmt, wenn man von aeroben zu anaeroben Bedingungen wechselt. Sowohl die lichtinduzierte Oxidation des primären Donators, als auch die Oxidation des Cytochrom c 551 nach Anregung durch einen Blitz ist unter 39

52 Einleitung anaeroben Bedingungen blockiert. Die photochemische Aktivität kommt nach und nach zurück, wenn man die Zellsuspension belüftet [131]. Die Interpretation dieses Verhaltens mit Hilfe der thermodynamischen und kinetischen Eigenschaften der photosynthetischen und/oder respiratorischen Elektronentransferkette ist Gegenstand der Forschung. Bisher wurde die Inhibierung der photochemischen Aktivität in Anaerobiosis mit der Präreduktion des primären Akzeptors Q A des Reaktionszentrums begründet, da Redoxtitrationen von Q A in Chromatophoren von Roseobacter denitrificans einen Wert von 35 mv ergeben haben [131]. Dieser Wert ist positiver als bei anderen photosynthetischen Bakterien wie Rhodobacter sphaeroides, und deshalb sollte Q A in Roseobacter denitrificans unter anaeroben Bedingungen leichter reduziert werden als in anderen photosynthetischen Bakterien. Eine weitere mögliche Ursache für die Blockierung des lichtinduzierten Elektronentransfers unter anaeroben Bedingungen könnte die Unfähigkeit der Zellen sein, ein für den lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer optimales Redoxpotential aufrechtzuerhalten, so dass unter diesen Bedingungen der Q-Pool vollständig reduziert vorliegen würde und der Elektronentransferzyklus unterbrochen wäre. Es wurde beobachtet, dass Roseobacter denitrificans unter anaeroben Bedingungen wachsen kann und externe Oxidantien wie TMAO oder Nitrat in der Lage sind, die photochemische Aktivität unter anaeroben Bedingungen in ganzen Zellen wieder herzustellen [139]. Dies zeigt, dass in Roseobacter denitrificans unter Sauerstoffausschluss externe Oxidantien als Elektronenakzeptoren benutzt werden können, um Reduktionsäquivalente aus der Elektronentransferkette zu entfernen und einen optimalen Redoxzustand in der Zelle wiederherzustellen. Auf diese Weise ist auch unter anaeroben Bedingungen eine photochemische Aktivität möglich. 40

53 Einleitung A.5. Motivation und Ziele der Arbeit Im ersten Teil der Arbeit sollte die Anzucht des Bakteriums Roseobacter denitrificans in einem Fermenter sowie die Isolation und Reinigung von photosynthetischen Reaktionszentren etabliert werden. Dabei sollte die Präparationsvorschrift vor allem im Hinblick auf eine hohe Ausbeute an reinen und funktionalen Reaktionszentren optimiert werden. Die erhaltenen Reaktionszentren sollten mittels transienter Absorptionsspektroskopie charakterisiert werden. Im zweiten Teil der Arbeit sollte der photosynthetische Apparat von Roseobacter denitrificans über die Messung lichtinduzierter Redoxänderungen der Cytochrome b und c bei definierten Redoxbedingungen untersucht werden: Es sollte die Beteiligung eines Cytochrom bc 1 Komplexes am lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer (Q-Zyklus) nachgewiesen werden, indem die Redoxänderungen von Cytochromen des b-typs nach Anregung durch einen Blitz mittels transienter Absorptionsspektroskopie in Abhängigkeit von der Zeit untersucht wurden. Das high potential Cytochrom b sollte anhand des Absorptionsdifferenzspektrums und des Halbstufenpotentials charakterisiert werden. Darüber hinaus sollten die Elektronentransferreaktionen vom Cytochrom bc 1 Komplex zur tetrahämen Cytochrom c-untereinheit des Reaktionszentrums untersucht und die Beteiligung des löslichen Cytochrom c 551 in einer diffusionskontrollierten Reaktion nachgewiesen werden. Die Häme des am Reaktionszentrum gebundenen Cytochrom c sollten anhand ihrer Absorptionsdifferenzspektren und der Halbstufenpotentiale charakterisiert sowie deren Funktion beim zyklischen Elektronentransfer in Abhängigkeit des eingestellten Redoxpotentials untersucht werden. Die Größe des Ubichinon-Pools in Membranen aus Roseobacter denitrificans sollte durch Extraktion des Ubichinons aus der Membran bestimmt werden. 41

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55 Materialien und Methoden B. Materialien und Methoden B.1. Materialien B.1.1. Chemikalien Die für das Ansetzen von Puffern und Stammlösungen benötigten Chemikalien, sowie benötigte Lösungsmittel und andere gängige Chemikalien wurden von kommerziellen Anbietern (Fluka, Aldrich, Merck, Roth, Sigma, etc.) bezogen und, wenn nicht anders angegeben, ohne vorherige Reinigung eingesetzt. Aufgelistet sind hier die Quellen der Chemikalien, die besondere Eigenschaften erfordern oder generell schwer zu erhalten sind. Anzucht von Roseobacter denitrificans: Der Stamm von Roseobacter denitrificans (ATCC Number: 33942) wurde erhalten von der American Type Culture Collection, University Boulevard, Manassas, Virginia, USA, FAX: , Pepton Casein, Hefeextrakt (Yeast Extract) und Agar-Agar wurden von Fluka, Deisenhofen bezogen, Bacto Pepton von Difco, USA, bestellbar bei Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Tel.: 06221/305-0, Fax: 06221/ Antifoam 204 wurde von Sigma, Seelze/Taufkirchen bezogen. Präparationen: Der Proteasen-Inhibitoren-Cocktail Complete wurde bei Boehringer, Mannheim erhalten, DNAse I sowie Triton X-100 Molecular Biology Grade bei Calbiochem, Bad Soden / Schwalbach, LDAO bei Fluka, Deisenhofen. Für die Säulenchromatographien wurden fertige Säulen bei Pharmacia, Freiburg gekauft: PD-10 desalting Column und HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade. Bei TosoHaas, Japan (TosoHaas Stuttgart, Tel.: , Fax: ) 43

56 Materialien und Methoden wurde das Säulenmaterial DEAE Toyopearl Chromatographic Resin 650M bezogen. Der BCA Protein Assay Kit wurde bei Pierce, USA; bestellbar bei KMF Laborchemie Handels GmbH, Sankt Augustin, Tel.: , Fax: , erhalten. Der LMW Electrophoresis Calibration Kit wurde bei Pharmacia, Freiburg erhalten. Bei Millipore, Eschborn wurden die PM-30 und YM-100 Flachmembranen (mit einem Ausschlussmasse von Da bzw Da) für die Amicon Rührzelle und die PM-100 Centricon-Konzentratoren bezogen. Spektroskopische Untersuchungen: 1,10-Phenanthrolin Monohydrat wurde von Merck, Darmstadt bezogen, Terbutryn von Riedel de Haen, Seelze. Die Mediatoren 3,6-Diaminodurol (2,3,5,6-Tetramethyl-p-phenylendiamin), p-benzochinon, 1,2-Naphthochinon, 1,4-Naphthochinon, Durochinon (2,3,5,6- Tetramethyl-1,4-benzochinon), Phenazin Methosulfat (N-Methylphenazoniummethosulfat), Phenazin Ethosulfat (N-Methylphenazoniumethosulfat) und 2- Hydroxy-1,4-Naphthochinon wurden bezogen von Aldrich bzw. Sigma, Seelze/Taufkirchen. Valinomycin und Nigericin wurden erhalten bei Sigma, Seelze/Taufkirchen. Cytochrome c Type 6 (aus Pferdeherz) wurde von Sigma, Seelze/Taufkirchen bezogen. 44

57 Materialien und Methoden B.1.2. Puffer und Lösungen B Anzucht von Roseobacter denitrificans In den Tabellen B bis sind die für die Anzucht von Roseobacter denitrificans verwendeten Stammlösungen und Medien aufgelistet. Tabelle B : Rbor (Roseobacter denitrificans organic rich) -Medium Lösung I 74 % (v/v) Lösung II 25 % (v/v) Vitamine Stammlösung 1 % (v/v) Glycerin 1,84 g/l Die Lösungen werden getrennt autoklaviert und unter sterilen Bedingungen zusammen gegeben. Bei kleineren Ansätzen kann die Vitamin Stammlösung und das Glycerin vor dem Autoklavieren zur Lösung I hinzugegeben werden. Tabelle B : Lösung I NaCl MgSO 4 6 H 2 O KCl Pepton Casein Hefe Extrakt Bacto Pepton Spurenelemente Stammlösung ph=7,8 (HCl) 31,75 g/l 2,70 g/l 0,81 g/l 1,35 g/l 1,35 g/l 1,35 g/l 1,35 % (v/v) Tabelle B : Lösung II MgCl 2 6 H 2 O CaCl 2 2 H 2 O 40 g/l 5,84 g/l 45

58 Materialien und Methoden Tabelle B : Spurenelemente Stammlösung Titriplex II FeSO 4 7 H 2 O MnCl 2 2 H 2 O CoCl 2 6 H 2 O CuCl 2 2 H 2 O NiCl 2 6 H 2 O Na 2 MO 4 2 H 2 O ZnSO 4 7 H 2 O H 3 BO 3 ph 3 (HCl) 0,5 g/l 0,3 g/l 3 mg/l 5 mg/l 1 mg/l 2 mg/l 3 mg/l 5 mg/l 2 mg/l Tabelle B : Vitamine Stammlösung Nicotinsäure Nicotinsäureamid Thiamin Biotin 0,2 g/l 0,2 g/l 0,4 g/l 8 mg/l B Präparation von Membranen und Reaktionszentren In den Tabellen B bis B sind die für die Isolierung der Membranfragmente und für die Isolierung und Aufreinigung der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans verwendeten Stammlösungen und Medien aufgelistet. Für die Herstellung der Puffer werden folgende Stammlösungen verwendet: 1 M Tris/HCl (ph = 7,5) 100 mm EDTA/NaOH (ph = 7,5) Außerdem wurden bei den Präparationen folgende Puffer verwendet (siehe Kapitel B.2.2. und B.2.3.): 20 mm Tris / HCl (ph = 7,8) 20 mm Tris /HCl (ph = 7,5) 46

59 Materialien und Methoden Lösungen für die Präparation nach K. Takamiya Tabelle B : Tris-Puffer I für Solubilisierung Tris NaCl Phenylmethylsulfonylfluorid ph=7,5 (HCl) 20 mm 0,1 M 1 mm Tabelle B : Tris-Puffer IV A für Anionenaustausch-Chromatographie Tris 20 mm Triton X-100 0,1% (v/v) NaCl 0,1 M ph=7,5 (HCl) Die NaCl-Puffer, die beim Eluieren verwendet werden, entsprechen dem Tris-Puffer IV A mit der entsprechenden NaCl-Konzentration (siehe Kapitel B ). Lösungen für die Präparation mittels Dichtegradientenfraktionierung Tabelle B : Saccharose-Lösungen für Dichtegradientenzentrifugation Tris 20 mm LDAO 0,4% ph=7,8 (HCl) Im Tris/HCl-Puffer wurde jeweils 1,2 M, 0,9 M bzw. 0,3 M Saccharose gelöst (siehe Kapitel B ). Tabelle B : LDAO-Stammlösung LDAO (N,N-Dimethyldodecylamin-N-Oxid) Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (C 4 H 11 NO 3 ) ph=7,5 (HCl) 10% (v/v) 20 mm LDAO wird als 30%ige Stammlösung in H 2 O eingesetzt. 47

60 Materialien und Methoden Tabelle B : Tris-Puffer IV für Anionenaustausch-Chromatographie Tris 20 mm EDTA (C 10 H 14 N 2 NO 2 O. 8 2H 2 O) 1 mm Triton X-100 0,1% (v/v) NaCl 0,1 M NaN 3 1 mm ph=7,5 (HCl) Die NaCl-Puffer, die beim Eluieren (siehe Kapitel B ) verwendet werden, entsprechen dem Tris-Puffer IV mit der entsprechenden NaCl-Konzentration. Lösungen für die Präparation nach der modifizierten Vorschrift von K. Takamiya Tabelle B : LDAO-Stammlösung LDAO (N,N-Dimethyldodecylamin-N-Oxid) Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (C 4 H 11 NO 3 ) ph=7,5 (HCl) 10% (v/v) 20 mm LDAO wird als 30%ige Stammlösung in H 2 O eingesetzt. Tabelle B : Tris-Puffer II für Ammoniumsulfat-Fällung Tris Triton X-100 (Polyethylenglycol-p-isooctylphenyl ether; Octylphenoxypolyethoxyethanol) ph=7,5 (HCl) 20 mm 0,6% Triton X-100 wird als 10%ige Stammlösung in H 2 O eingesetzt (Ausnahme bei sehr großen Ansätzen). Tabelle B : Tris-Puffer III für Gelfiltration Tris Triton X-100 NaCl NaN 3 ph=7,5 (HCl) 20 mm 0,2% (v/v) 0,1 M 1 mm Die Lösung wird mit einem 0,45 µm-sterilfilter von kleinen Partikeln befreit. 48

61 Materialien und Methoden Tabelle B : Tris-Puffer IV für Anionenaustausch-Chromatographie Tris 20 mm EDTA (C 10 H 14 N 2 NO 2 O. 8 2H 2 O) 1 mm Triton X-100 0,1% (v/v) NaCl 0,1 M NaN 3 1 mm ph=7,5 (HCl) Die NaCl-Puffer, die beim Eluieren (siehe Kapitel B ) verwendet werden, entsprechen dem Tris-Puffer IV mit der jeweiligen NaCl-Konzentration. Tabelle B : Tris-Puffer V für Entsalzung Tris EDTA Triton X-100 NaN 3 ph=7,5 (HCl) 20 mm 1 mm 0,025% (v/v) 1 mm Tabelle B : Tris-Puffer VI für Aufkonzentrierung Tris EDTA ph=7,5 (HCl) 20 mm 1 mm B BCA-Proteinbestimmung Die für den BCA-Protein-Test benötigten Lösungen werden kommerziell bei Pierce erworben: - BCA Protein Assay Reagent A - BCA Protein Assay Reagent B - BSA-Proteinstandard 49

62 Materialien und Methoden B SDS-Page-Gelelektrophorese In den Tabellen B bis B sind die für die SDS-Gelelektrophorese verwendeten Lösungen aufgelistet. Tabelle B : Acrylamidstammlösung Acrylamid/Bisacrylamid im Mischungsverhältnis 37,5 : 1 40%ige Lösung von Sigma Tabelle B : Probenpuffer Tris ph=8,0 SDS Glycerin Dithiothreitol (DTT) Bromphenolblau 20 mm 3% bzw. 5% (w/v) 25% (v/v) 40 mm 0,025% (w/v) Wird in Aliquots bei -20 C gelagert. Tabelle B : Trenngelpuffer Tris ph=8,0 1,5 M SDS 0,4% Tabelle B : Sammelgelpuffer Tris ph=6,8 0,5 M SDS 0,4% Tabelle B : APS-Lösung APS (Ammoniumperoxodisulfat) 0,1 g / 1 ml H 2 O Tabelle B : Elektrophoresepuffer Tris 50 mm Glycin 0,384 M SDS 0,1% erhaltener ph 8,3 (nicht mit HCl titrieren) 50

63 Materialien und Methoden Tabelle B : Fixierer Ethanol 30% Essigsäure 10% Tabelle B : Färber Ethanol 25% Essigsäure 10% Coomassie 0,1% Tabelle B : Proteinreferenz Phosphorylase b BSA Ovalbumin Carbonic Anhydrase Soybean Trypsin Inhbitor α-lactalbumin Da Da Da Da Da Da Es werden 600 µg Proteinreferenz in 300 µl H 2 O aufgenommen. B Spektroskopische Untersuchungen In den Tabellen B bis B sind die Lösungen und Puffer aufgelistet, die bei den spektroskopischen Untersuchungen an Membranen sowie an isolierten Reaktionszentren verwendet wurden. Tabelle B : Tris-Puffer VII für Reaktionszentren Tris EDTA (C 10 H 14 N 2 NO 2 O 8 2H 2 O) Triton X-100 ph=7,5 (HCl) 20 mm 1 mm 0,025% (v/v) 51

64 Materialien und Methoden Tabelle B : Mops-Puffer I für Reaktionszentren Mops (3-Morpholino-propansulfonsäure) KCl Triton X-100 ph=7,2 (NaOH) 10 mmol/l 50 mmol/l 0,25% (v/v) Tabelle B : Mops-Puffer II für Membranen Mops (3-Morpholino-propansulfonsäure) KCl ph=7,0 (NaOH) 50 mmol/l 100 mmol/l B Ubichinonstammlösung Bei der Isolierung und Aufreinigung der Reaktionszentren gehen die Ubichinone in den Bindungstaschen Q A und Q B verloren. Zur Aktivitätsbestimmung müssen diese wieder mit Ubichinon besetzt werden. Aufgrund seiner langen Isoprenkette ist das Ubichinon in wässrigen Systemen extrem schlecht löslich. Das Ubichinon zeigt aber detergensähnliche Eigenschaften, da es aus einer langen aliphatischen Kette und einer polaren Kopfgruppe besteht. Daher lässt es sich in wässrigen Systemen zusammen mit Detergens in Form von Mischmizellen in Lösung bringen [141]. In dieser Arbeit kamen Mischmizellen aus Ubichinon und Triton X-100 zur Anwendung (zu Testzwecken wurden auch Mischmizellen aus Ubichinon mit LDAO bzw. n-dodecyl-β-d-maltosid verwendet). Für die Herstellung von Mischmizellen aus Ubichinon und Detergens wurden in einem 50 ml Rundkolben mg Ubichinon in möglichst wenig Ethanol bei ca. 50 C gelöst. Anschließend wurde durch Einblasen von Stickstoff das Ethanol wieder entfernt und dadurch das Ubichinon als Film am Glasrand abgeschieden. Auf diese Weise wird die Oberfläche des Ubichinons vergrößert und die Lösungseigenschaften verbessert. Dann wurden ml der gewünschten Detergenslösung (Triton X- 100, 1% (w/v) bzw. 15 mm, CMC = 0,2 mmol/l; LDAO, 1% (v/v) bzw. 13 mm, CMC = 0,14 mmol/l; n-dodecyl-β-d-maltosid, 1% (w/v) bzw. 20 mm, CMC = 0,12 mmol/l [142]) in Mops/NaOH-Puffer (ph = 7,2) zugegeben und der Ansatz über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Konzentration des zuzugebenden Detergens wurde oberhalb der jeweiligen kritischen Mizellenkonzentration gewählt. Anschließend 52

65 Materialien und Methoden wurde die Lösung vorsichtig abdekantiert. Sofern sich noch ungelöste Ubichinonpartikel in der Lösung befanden, wurden diese über eine Fritte vorsichtig abgesaugt. Um die Konzentration der Ubichinonlösung zu bestimmen, wurde ein Teil der Lösung auf zwei Küvetten verteilt. Zur Messküvette wurde vorsichtig eine Spatelspitze NaBH 4 gegeben und nach Beendigung der Reduktion das Differenzspektrum zwischen Hydrochinon und Chinon gemessen. Die Differenz zwischen den Extinktionskoeffizienten des Ubihydrochinons und des Ubichinons beträgt bei 275 nm ε 275nm = 12,25 cm -1 mm -1 [143]. Mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes (Gleichung B ) wurde aus der gemessenen Absorptionsdifferenz die Konzentration der Ubichinonstammlösung berechnet. E = OD = A = εcd = log I 0 /I Gleichung B mit: OD optische Dichte E Extinktion A Absorption ε molarer dekadischer Extinktionskoeffizient c Konzentration der Probe d Schichtdicke der Probe I 0 eingestrahlte Lichtintensität I Lichtintensität nach der Probe Die Konzentration des Ubichinons lag je nach Ansatz zwischen 100 und 300 µmol/l, wobei im allgemeinen mit den Detergentien Triton X-100 (bis zu 700 µmol/l) und LDAO höhere Konzentrationen erreicht wurden als mit n-dodecyl-β-d-maltosid. B Inhibitorlösung für die Q B -Bindungsstelle Als Inhibitor wurde das Triazinherbizid 2-tert-Butylamino-4-ethyl-amino-6-methylthio- 1,3,5-triazin (Handelsname: Terbutryn; Riedel de Haen) verwendet, das mit einer Konzentration von 10 mmol/l in Ethanol gelöst wurde. Die Endkonzentration in den Messansätzen betrug 100 µmol/l. 53

66 Materialien und Methoden Alternativ wurde o-phenanthrolin in Ethanol (c = 500 mm) verwendet. Die Endkonzentration in der Probe betrug 10 mm. In beiden Fällen war der Ethanolgehalt kleiner als 1%. B Redoxmediatoren, Entkoppler und Inhibitoren für die Messungen an Membranen von Roseobacter denitrificans Die verwendeten Mediatoren (Diaminodurol, p-benzochinon, 1,2-Naphthochinon, 1,4-Naphthochinon, Durochinon, Phenazin Methosulfat, Phenazin Ethosulfat, 2- Hydroxy-1,4-naphthochinon) sowie die Entkoppler Nigericin und Valinomycin und die verwendeten Inhibitoren Myxothiazol und Antimycin A wurden als konzentrierte Lösungen in Ethanol eingesetzt. Die Endkonzentration an Ethanol in der Probe war < 3% (v/v), so dass Ethanol selbst keinen Effekt auf den Ladungstransfer hatte. 54

67 Materialien und Methoden B.2. Methoden B.2.1. Anzucht von Roseobacter denitrificans B Stämme Der Stamm von Roseobacter denitrificans wurde von der American Type Culture Collection (ATCC Number: 33942) bezogen. Die Langzeitkultur wurde in 20% Glycerin in Rbor-Medium (siehe Kapitel B ) bei -80 C gelagert. B Anzucht Die Anzucht von Roseobacter denitrificans erfolgte in einer statischen Kultur nach einer modifizierten Vorschrift von Y. Shioi [144]. Sie erfolgte durch Ausplattieren, zwei Vorkulturen und Kultivierung im Fermenter, wie schematisch in Abbildung B dargestellt. Nach etwa 4 Tagen konnten etwa 100 g Zellen im 28 l-fermenter bzw. nach etwa 5 Tagen etwa 800 g Zellen im 200 l- Fermenter gewonnen werden. Alle verwendeten Lösungen sind in Kapitel B aufgelistet. 55

68 Materialien und Methoden Langzeitkultur Roseobacter denitrificans Agarplatte Wärmeschrank 1-2 Tage Vorkultur I 3 x 12 ml Schüttler 16 h Vorkultur II 3 x 200ml Schüttler 16 h Hauptkultur 28 l Fermenter 17 h Vorkultur I 2 x 12 ml Schüttler 16h Vorkultur II 2x 200ml Schüttler 16 h Hauptkultur 200 l Fermenter 30 h Abbildung B : Anzucht des Bakteriums Roseobacter denitrificans B Vorkulturen Die Langzeitkultur von Roseobacter denitrificans wurde mit einer sterilen Öse auf eine Agarplatte (20 g Agar Agar auf 1 l Rbor-Medium) übertragen. Die Festkultur wurde im Brutschrank bei 30 C im Dunkeln angezogen. Nach 1-2 Tagen waren einzelne rosarote Kolonien sichtbar, und die Kultur wurde in eine Flüssigkultur (12 ml Rbor-Medium) überführt. Diese wurde bei 30 C in Schikane Kolben bei 200 rpm in einem Schüttler (New Brunswick Scientific, G25) semiaerob im Dunkeln angezogen. Nach Erreichen des letzten Drittels der exponentiellen Wachstumsphase (ca. 16 h; OD 660 1,5) wurde diese Vorkultur zum Animpfen einer zweiten größeren Vorkultur 56

69 Materialien und Methoden (200 ml Rbor-Medium) verwendet, die unter den gleichen Bedingungen angezogen wurde. Nach Erreichen des letzten Drittels der exponentiellen Wachstumsphase (ca. 16 h; OD 660 1,5) wurde diese zweite Vorkultur zum Animpfen eines größeren Ansatzes (siehe unten) verwendet. Die Vorkulturen müssen innerhalb von wenigen Stunden weiter verwendet werden, da die Zellen dann sehr schnell in die Absterbephase übergehen. Die Festkulturen können im Kühlschrank bei 4 C einige Tage aufbewahrt werden. B Hauptkulturen 28 l-fermenter Die Anzucht der Hauptkultur erfolgte in einem 28 l -Fermenter von Bioengineering (Laborpilot LP 35 l) mit einem Arbeitsvolumen von 28 l bei 30 C im Dunkeln bei rpm Rührwerksdrehzahl und semiaeroben Bedingungen unter Luftzufuhr über einen Pressluftgenerator (zur Handhabung des Fermenters siehe [145]). Zur Vorbereitung der Fermentation wurde Lösung I in den Fermenter eingefüllt und 20 min bei 121 C sterilisiert. Mit Hilfe eines autoklavierten Trichters wurden anschließend Lösung II, Glycerin, die Spurenelemente-Stammlösung, die Vitamine- Stammlösung sowie 5 ml der Antischaumemulsion (eine Emulsion von 1 Teil Antifoam 204 mit 99 Teilen H 2 O) zugegeben (jeweils vorher autoklaviert). Anschließend wurde durch eine Voreichung eine 70%ige O 2 -Sättigung eingestellt. Zum Schluss wurde mit ca. 600 ml Vorkultur II angeimpft. Der Verlauf der Fermentation wurde durch eine stündliche Messung der optischen Dichte bei 660 nm sowie des Spektrums zwischen 600 und 1000 nm und durch eine kontinuierliche Messung des Sauerstoffgehalts im Medium, überprüft. Nach ca. 17 h erreichten die Zellen das Ende der exponentiellen Wachstumsphase (OD 660 2,0) ; der Fermenter wurde auf 5 C abgekühlt und die Zellen mittels Durchflusszentrifuge (CEPA GLE mit SK Rotor) geerntet, weiterverarbeitet (bzw. eingefroren) und bei -80 C gelagert. 57

70 Materialien und Methoden 200 l-fermenter Um schneller zu größeren Mengen an Zellmaterial für die Präparationen (siehe unten) zu kommen, wurde die Anzucht auch in Zusammenarbeit mit N. Gad on, Arbeitskreis Prof. Dr. G. Fuchs, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Institut für Biologie, Mikrobiologie in einem 200 l -Fermenter von Bioengineering durchgeführt (Arbeitsvolumen 200 l). Die Vorbereitungen des Fermenters erfolgten analog zum 28 l -Fermenter. Es wurden 100 ml (1% (w/v)) der Antischaumemulsion zugegeben. Der Fermenter wurde mit 400 ml der Vorkultur II angeimpft, und die Fermentation erfolgte bei 30 C mit einer Rührergeschwindigkeit von rpm und einem Luftdurchfluss von l/min. Der Verlauf der Fermentation wurde durch mehrere Messungen der optischen Dichte bei 578 nm überprüft. Nach ca. 30 h bei einer OD 578 3,0 wurden die Zellen mittels Durchlaufzentrifuge geerntet, eingefroren und bei -80 C gelagert. 58

71 Materialien und Methoden B.2.2. Isolierung und Reinigung der Membranen aus Roseobacter denitrificans Die Isolierung und Reinigung der Membranen von Roseobacter denitrificans erfolgte nach dem Schema in Abbildung B analog zu den ersten Schritten der Isolierung und Aufreinigung der Reaktionszentren (siehe Kapitel B.2.3.). Die verwendeten Lösungen sind in Kapitel B aufgelistet. Roseobacter denitrificans Zellen French Press Zentrifugation Überstand Membranen + Cytoplasma Niederschlag nicht aufgeschlossene Zellen Ultrazentrifugation Überstand Cytoplasma Niederschlag Membranen Pufferwechsel 100 mm Mops / NaOH ph=7,0 Abbildung B.2.2.1: Isolation der Membranen aus Roseobacter denitrificans. 59

72 Materialien und Methoden B Waschen der Zellen 100 g Roseobacter denitrificans Zellen über Nacht im Kühlschrank auftauen Zellen in 800 ml 20 mm Tris/HCl-Puffer ph = 7,8 durch 30 min rühren bei 4 C resuspendieren 20 min im JA 10 Rotor (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) bei 9000 rpm (10000 g) bei 4 C zentrifugieren Niederschlag in 300 ml 20 mm Tris/HCl-Puffer ph = 7,8 resuspendieren und homogenisieren (Potter), Überstand verwerfen Suspension direkt weiterverarbeiten B Zellaufschluss und Isolierung der Membranen Zugabe von Protease Inhibitor (1 Tablette pro 50 ml Zellsuspension) und EDTA (1 mm Endkonzentration) unter rühren Zugabe von einer Spatelspitze DNase I ohne rühren French Press Zelle über Nacht im Kühlraum vorkühlen Zellaufschluss in der French Press (French Pressure Cell Press, SLM Aminco) der vorbereiteten Zellsuspension bei psi (entspricht der Einstellung psig am Gerät) Probe auf Eis auffangen und vor Licht schützen Zentrifugation im JA 20 Rotor bei rpm (17000 g) und 30 min bei 4 C (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) Der Überstand (enthält aufgeschlossene Zellen) wird abgenommen, während der Niederschlag verworfen wird Überstand 60 min bei 4 C im Ti 55,2 Rotor bei rpm ( g) zentrifugieren (Beckman Ultrazentrifuge L7) Überstand verwerfen und den Niederschlag weiterverarbeiten 60

73 Materialien und Methoden B Pufferwechsel Niederschlag in 200 ml 100 mm Mops/NaOH-Puffer ph = 7,0 resuspendieren und homogenisieren Überstand 60 min bei 4 C im Ti 55,2 Rotor bei rpm ( g) zentrifugieren (Beckman Ultrazentrifuge L7) Überstand verwerfen, den Niederschlag weiterverarbeiten Die ersten drei Schritte wiederholen Den Niederschlag (Membranen) in möglichst wenig 100 mm Mops/NaOH-Puffer ph = 7,0 resuspendieren und homogenisieren, anschließend 50% Glycerin zugeben und bei -20 C lagern, so dass das H 2 O nicht kristallisiert und die Proteine nicht zerstört werden. 61

74 Materialien und Methoden B.2.3. Isolierung und Reinigung der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans Für die Isolation und Aufreinigung der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans wurden verschiedene Vorschriften getestet, die im Folgenden beschrieben werden sollen (für Details siehe Kapitel C.2.). Letztendlich wurde die in Kapitel B beschriebene modifizierte Vorschrift von K. Takamiya für die Isolation und Aufreinigung der Reaktionszentren in dieser Arbeit verwendet. Alle verwendeten Lösungen sind in Kapitel B beschrieben. B Vorschrift nach K. Takamiya Abbildung B zeigt schematisch die Isolationsvorschrift nach K. Takamiya et al. [128, 131, 146, 147]. Aus 100 g Roseobacter denitrificans Zellen können in 2-3 Tagen ca. 10 mg Reaktionszentren isoliert werden. 62

75 Materialien und Methoden Roseobacter denitrificans Zellen French Press Roseobacter denitrificans Membranen Vorsolubilisierung mit 0,45% LDAO Solubilisierung mit 0,45% LDAO nach Verdünnung auf das doppelte Probenvolumen Ultrazentrifugation Überstand 1. DEAE-Sephacel- Anionenaustausch- Chromatographie reaktionszentrenreiche Fraktionen sammeln und um das 5fache verdünnen 2. DEAE-Sephacel- Anionenaustausch- Chromatographie Reaktionszentren Abbildung B : Schema der Isolation von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach K. Takamiya et al. [128]. 63

76 Materialien und Methoden B Waschen der Zellen 100 g Roseobacter denitrificans Zellen über Nacht im Kühlschrank auftauen Zellen in 800 ml 20 mm Tris/HCl-Puffer ph = 7,8 durch Rühren resuspendieren 20 min im JA 10 Rotor (Beckman Kühlzentzrifuge J2-HS) bei 9000 rpm (10000 g) bei 4 C zentrifugieren Niederschlag in 300 ml 20 mm Tris/HCl-Puffer ph = 7,8 resuspendieren und homogenisieren (Potter), Überstand verwerfen Suspension direkt weiterverarbeiten B Zellaufschluss und Isolierung der Membranen Zugabe von Protease Inhibitor (1 Tablette pro 50 ml Zellsuspension) und EDTA (1 mm Endkonzentration) unter rühren Zugabe von einer Spatelspitze DNase ohne rühren Zellaufschluss der vorbereiteten Zellsuspension in der vorgekühlten French Press Zelle bei psi Probe auf Eis auffangen und vor Licht schützen Zentrifugation im JA 20 Rotor bei rpm (17000 g) 30 min bei 4 C (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) Überstand (enthält aufgeschlossene Zellen) wird abgenommen; der Niederschlag wird verworfen Überstand 60 min bei 4 C im Ti 55,2 Rotor bei rpm ( g) zentrifugieren (Beckman Ultrazentrifuge L7) Überstand verwerfen, Pellet in möglichst wenig Tris-Puffer I resuspendieren und homogenisieren (Potter) Membranen in flüssigen N 2 einfrieren und bei -80 C Kühlschrank oder über Nacht auf Eis im Dunkeln lagern 64

77 Materialien und Methoden B Solubilisierung der Membranproteine Membranen gegebenenfalls auftauen, homogenisieren; Bacteriochlorophyllgehalt der Suspension bestimmen (siehe Kapitel B ) und mit Tris-Puffer I, unter Berücksichtigung des Volumens der LDAO-Lösung, auf 0,2 mm Bacteriochlorophyll- Konzentration verdünnen die 30%ige (v/v) LDAO-Lösung langsam unter rühren dazu tropfen bis zu einer Endkonzentration von 0,45% (v/v) LDAO 30 min bei RT im Dunkeln rühren Zentrifugation im Ti 55,2 Rotor bei rpm ( g) 60 min bei 4 C (Beckman Ultrazentrifuge L7) Der Überstand wird verworfen; der Niederschlag wird in Tris-Puffer I resuspendiert und homogenisiert, so dass das ursprüngliche Volumen verdoppelt wird (unter Berücksichtigung des Volumens der LDAO-Lösung) Das entsprechende Volumen an 30%iger (v/v) LDAO-Lösung (s.o.) wird unter rühren langsam dazu getropft, so dass eine Endkonzentration von 0,45% (v/v) LDAO erreicht wird 60 min bei RT im Dunkeln rühren Zentrifugation im Ti 55,2 Rotor bei rpm ( g) 60 min bei 4 C (Beckman Ultrazentrifuge L7) Der Überstand wird abgenommen und sofort weiterverarbeitet; er beinhaltet die solubilisierten Proteine; der Niederschlag wird verworfen B Anionenaustausch-Chromatographie Es wird eine Säule mit DEAE-Toyopearl 650M Säulenmaterial verwendet: Durchmesser: 2 cm Länge: ca. 16 cm Volumen: ca. 50 ml Die Säule wird nach Anleitung vorbereitet und in Tris-Puffer IV A aufbewahrt. 65

78 Materialien und Methoden Die Säule wird mit 5 Säulenvolumen (5 x 50 ml) Tris-Puffer IV A äquilibriert, Flussrate: ml/min Probe nach Solubilisierung (s.o.) auftragen Waschen mit 1 Säulenvolumen (50 ml) Tris-Puffer IV A, Flussrate: ml/min Elution: der Gradient erfolgt in Stufen von jeweils 50 ml (entspricht einem Säulenvolumen): 0,20 M NaCl 0,25 M NaCl 0,28 M NaCl 0,30 M NaCl 0,50 M NaCl Flussrate: 5 ml/min Detektion: Spektrum zwischen 300 nm und 900 nm Waschen der Säule mit Tris-Puffer IV A; Flussrate: 50-20ml/min Die RC-enthaltenden Fraktionen mit hohem Proteingehalt (ODV) werden gesammelt (vgl. Kapitel B ) Das Eluat der 1. Anionenaustausch-Chromatographie wird auf das 5fache verdünnt und durch eine 2. Anionenaustausch-Chromatographie unter den gleichen Bedingungen weiter aufgereinigt Die erhaltenen RC-Fraktionen werden gesammelt, aufkonzentriert, mit flüssigem N 2 schockgefroren und bei -80 C gelagert B Isolierung durch Dichtegradientenzentrifugation Als weitere Methode zur Isolation und Aufreinigung der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans wurde in Zusammenarbeit mit N. Gad on, Arbeitskreis Prof. Dr. G. Fuchs, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Institut für Biologie II die Methode der Dichtegradientenfraktionierung getestet. Abbildung B zeigt schematisch die verwendete Isolationsvorschrift. Aus 100 g Roseobacter denitrificans Zellen können in ca Tagen 3-5 mg Reaktionszentren isoliert werden. 66

79 Materialien und Methoden Roseobacter denitrificans Zellen French Press Roseobacter denitrificans Membranen Solubilisierung mit 0,5% LDAO Auftragung der solubilisierten Membranproteine auf einen Saccharosegradienten Ultrazentrifugation über Nacht reaktionszentrenreiche Fraktionen sammeln Abbildung B : Schematische Darstellung der Isolation und Aufreinigung der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans mittels Dichtegradientenfraktionierung. DEAE-Toyopearl- Anionenaustausch- Chromatographie Eluat Reaktionszentren B Waschen der Zellen 100 g Roseobacter denitrificans Zellen über Nacht im Kühlschrank auftauen Zellen in 800 ml 20 mm Tris/HCl-Puffer ph = 7,8 durch rühren resuspendieren 20 min im JA 10 Rotor (Beckman Kühlzentzrifuge J2-HS) bei 9000 rpm (10000 g) bei 4 C zentrifugieren Niederschlag in 300 ml 20 mm Tris/HCl-Puffer ph = 7,8 resuspendieren und homogenisieren (Potter), Überstand verwerfen Suspension direkt weiterverarbeiten 67

80 Materialien und Methoden B Zellaufschluss und Isolierung der Membranen Zugabe von Protease Inhibitor (1 Tablette pro 50 ml Zellsuspension) und EDTA (1 mm Endkonzentration) unter rühren Zugabe von einer Spatelspitze DNase ohne rühren Zellaufschluss der vorbereiteten Zellsuspension in einer vorgekühlten French Press Zelle bei psi Probe auf Eis auffangen und vor Licht schützen Zentrifugation im JA 20 Rotor bei rpm (17000 g) 30 min bei 4 C (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) Überstand (enthält aufgeschlossene Zellen) wird abgenommen; der Niederschlag wird verworfen Überstand 60 min bei 4 C im Ti 55,2 Rotor bei rpm zentrifugieren (Beckman Ultrazentrifuge L7) Überstand verwerfen, den Niederschag in möglichst wenig Puffer resuspendieren (20 mm Tris / HCl / ph = 7,5) und homogenisieren (Potter) Protease Inhibitor und EDTA (1 mm Endkonzentration) hinzugeben und bis zum Lösen rühren Membranen in flüssigen N 2 einfrieren und bei -80 C Kühlschrank oder über Nacht auf Eis im Dunkeln lagern B Solubilisierung der Membranproteine Membranen gegebenenfalls auftauen, homogenisieren; Bacteriochlorophyllgehalt der Suspension bestimmen (siehe Kapitel B ) und mit 20 mm Tris/HCl-Puffer ph = 7,8, unter Berücksichtigung des Volumens der LDAO-Lösung, auf 0,2 mm Bacteriochlorophyll-Konzentration verdünnen die 1%ige (v/v) LDAO-Stammlösung langsam unter rühren dazu tropfen bis zu einer Endkonzentration von 0,5% (v/v) LDAO und 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln rühren die solubilisierte Protein-Lösung (ca. 200 ml) wird gleich weiterverarbeitet 68

81 Materialien und Methoden B Dichtegradientenfraktionierung der Membranproteine der Saccharose-Gradient wird hergestellt, indem je 7 ml einer 1,2 M, 0,9 M und 0,3 M Saccharose-Lösung in 20 mm Tris-Puffer (ph = 7,8) mit 0,4% LDAO in Zentrifugenröhrchen, wie in Abbildung B A schematisch dargestellt, übereinandergeschichtet werden nach der Solubilisierung werden 2-2,5 ml Protein-Lösung auf den Saccharose- Gradienten aufgetragen und über Nacht (16 h) im Ti 60 Rotor bei rpm ( g) bei 4 C zentrifugiert (Beckman Ultrazentrifuge L7); es werden ca. 10 Zentrifugenläufe durchgeführt, um das gesamten Volumen an solubilisierten Membranproteine aufzutrennen die Reaktionszentren werden an der Grenzschicht zwischen 1,2 M und 0,9 M Saccharose-Lösung (siehe Abbildung B B) mit Hilfe einer Pipette gewonnen Die Reaktionszentren-Fraktionen werden gesammelt und weiterverarbeitet A 0,3 M 0,9 M 1,2 M B Cytochrom LH I LH II Reaktionszentren Niederschlag Abbildung B : Schematische Darstellung des Saccharose-Gradienten (A) und Auftrennung der Membranproteine mittels Dichtegradientenzentrifugation (B). 69

82 Materialien und Methoden B Anionenaustausch-Chromatographie Es wird eine Säule mit DEAE-Toyopearl 650M Säulenmaterial verwendet: Durchmesser: 2 cm Länge: ca. 16 cm Volumen: ca. 50 ml Die Säule wird nach Anleitung vorbereitet und in Tris-Puffer IV aufbewahrt. Die Säule wird mit 5 Säulenvolumen (5 x 50 ml) Tris-Puffer IV äquilibriert, Flussrate: ml/min gesammelte Fraktionen der Dichtegradientenfraktionierung (s.o.) auftragen Waschen mit 1 Säulenvolumen (50 ml) Tris-Puffer IV, Flussrate: ml/min Elution: der Gradient erfolgt in Stufen von jeweils 50 ml (entspricht einem Säulenvolumen): 0,20 M NaCl 0,25 M NaCl 0,28 M NaCl 0,30 M NaCl 0,50 M NaCl Flussrate: 5 ml/min Detektion: Spektrum zwischen 300 nm und 900 nm Waschen der Säule mit Tris-Puffer IV; Flussrate: 50-20ml/min Die RC-enthaltenden Fraktionen mit hohem Proteingehalt (ODV) werden gesammelt (vgl. Kapitel B ), aufkonzentriert, mit flüssigem N 2 schockgefroren und bei -80 C gelagert 70

83 Materialien und Methoden B Modifizierte Vorschrift von K. Takamiya Zur Isolierung und Aufreinigung der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans wurde die Vorschrift von K. Takamiya et al. [128] modifiziert. Im folgenden wird die in dieser Arbeit verwendete Vorschrift im Detail beschrieben. Sie ermöglicht es, aus 100 g Roseobacter denitrificans Zellmasse in etwa 10 Tagen ca. 15 mg (50 ODV) Reaktionszentren zu isolieren. Sämtliche Isolationsschritte wurden im Dunkeln und, wenn nicht anders angegeben, auf Eis oder im Kühlraum bei 4 C durchgeführt. In Abbildung B sind die Isolierungs- und Aufreinigungsschritte schematisch dargestellt. 71

84 Materialien und Methoden Roseobacter denitrificans Zellen French Press Zentrifugation Überstand Membranen + Cytoplasma Niederschlag nicht aufgeschlossene Zellen Ultrazentrifugation Überstand Cytoplasma Niederschlag Membranen Aufweichen der Zellmembran mit LDAO Solubilisierung mit LDAO Ultrazentrifugation Überstand solubilisierte Membranproteine Niederschlag Membranen Ammoniumsulfat-Fällung (mit Detergenswechsel zu Triton X-100) Zentrifugation Überstand andere Membranproteine, z.b. LH II schwimmender Niederschlag RC + andere Membranproteine Gelfiltration Eluat RC + andere Proteine andere Proteine Anionenaustausch-Chromatographie Eluat Reaktionszentrum übrige Membranproteine Abbildung B : Isolation von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans. 72

85 Materialien und Methoden B Waschen der Zellen 100 g Roseobacter denitrificans Zellen über Nacht im Kühlschrank auftauen Zellen in 800 ml 20 mm Tris/HCl-Puffer ph = 7,8 durch rühren resuspendieren 20 min im JA 10 Rotor (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) bei 9000 rpm (10000 g) bei 4 C zentrifugieren gelblich-klar rosarot Niederschlag in 300 ml 20 mm Tris/HCl-Puffer ph = 7,8 resuspendieren und homogenisieren (Potter), Überstand verwerfen Suspension direkt weiterverarbeiten B Zellaufschluss und Isolierung der Membranen Zugabe von Protease Inhibitor (1 Tablette pro 50 ml Zellsuspension) und EDTA (1 mm Endkonzentration) unter Rühren Zugabe von einer Spatelspitze DNase ohne Rühren French Press Zelle über Nacht im Kühlraum vorkühlen Zellaufschluss der vorbereiteten Zellsuspension bei psi (entspricht der Einstellung psig am Gerät) Probe auf Eis auffangen und vor Licht schützen Zentrifugation im JA 20 Rotor bei rpm (17000 g) 30 min bei 4 C (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) 73

86 Materialien und Methoden dunkelrot fast undurchsichtig Membranen rosarot Zellbruchstücke Überstand (enthält aufgeschlossene Zellen) wird abgenommen; der Niederschlag wird verworfen Überstand 60 min bei 4 C im Ti 55,2 Rotor bei rpm zentrifugieren (Beckman Ultrazentrifuge L7) Überstand verwerfen, den Niederschlag in möglichst wenig Puffer resuspendieren (20 mm Tris / HCl / ph = 7,5) und homogenisieren (Potter) Protease Inhibitor und EDTA (1 mm Endkonzentration) hinzugeben und bis zum Lösen rühren Membranen in flüssigen N 2 einfrieren und bei -80 C Kühlschrank oder über Nacht auf Eis im Dunkeln lagern B Solubilisierung der Membranproteine Membranen gegebenenfalls auftauen, homogenisieren; BChl- bzw. Proteingehalt der Suspension bestimmen (siehe Kapitel B und B ) und mit 20 mm Tris/HCl-Puffer ph = 7,5, unter Berücksichtigung des Volumens der LDAO-Lösung, auf 0,2 mm bzw. 20 mg/ml einstellen (in der Regel ml) die 10%ige (v/v) LDAO-Stammlösung langsam unter rühren dazu tropfen bis zu einer Endkonzentration von 0,45% (v/v) LDAO 30 min bei RT im Dunkeln rühren Zentrifugation im Ti 55,2 Rotor bei rpm 60 min bei 4 C (Beckman Ultrazentrifuge L7) 74

87 Materialien und Methoden klar rot Der Überstand wird verworfen; das Pellet wird in 20 mm Tris/HCl-Puffer ph = 7,5 resuspendiert und homogenisiert, so dass das ursprüngliche Volumen verdoppelt wird (unter Berücksichtigung des Volumens der LDAO-Lösung) Das entsprechende Volumen an 10%iger (v/v) LDAO-Lösung in Puffer (s.o.) wird unter Rühren langsam dazu getropft, so dass eine Endkonzentration von 0,45% (v/v) LDAO erreicht wird 60 min bei RT im Dunkeln rühren Zentrifugation im Ti 55,2 Rotor bei rpm 60 min bei 4 C (Beckman Ultrazentrifuge L7) durchsichtig rot solubilisierte Proteine rot Der Überstand wird abgenommen und sofort weiterverarbeitet; er enthält die solubilisierten Proteine; der Niederschlag wird verworfen 75

88 Materialien und Methoden B Ammoniumsulfat-Fällung Es wurde alternativ die fraktionierende oder die 50%ige Ammoniumsulfat-Fällung durchgeführt (vgl. Kapitel C ). A. Fraktionierende Ammoniumsulfat-Fällung 50%-Fällung (w/v) Zugabe der aus der Tabelle B berechneten Menge an festem Ammoniumsulfat unter rühren Zentrifugation im JA 20 Rotor bei rpm bei 4 C 10 min (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) schwimmender Niederschlag in 1/4 des Ausgangsvolumen der Probe an Tris- Puffer II (20 mm Tris/HCl-Puffer ph=7,5 mit 0,6% (v/v) Triton X-100) aufnehmen und vorsichtig homogenisieren schwimmender Niederschlag durchsichtig rot 50%-Waschung (w/v) Tropfenweise Zugabe von gesättigter, neutralisierter Ammoniumsulfat-Lösung bis zu einer Sättigung von 50% unter rühren Zentrifugation im JA 20 Rotor bei rpm bei 4 C 10 min (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) 76

89 Materialien und Methoden Niederschlag wie oben abnehmen und im gleichen Volumen Tris-Puffer II aufnehmen und vorsichtig homogenisieren die 50%ige Waschung kann wiederholt werden, um einen besseren Detergensaustausch zu erhalten 35%-Fällung (w/v) Tropfenweise Zugabe von gesättigter, neutralisierter Ammoniumsulfat-Lösung bis zu einer Sättigung von 35% unter rühren Zentrifugation im JA-20 Rotor bei rpm bei 4 C 10 min (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) Den Überstand abnehmen (hier befinden sich die Reaktionszentren) und weiterverarbeiten, den Niederschlag verwerfen 65%-Fällung (w/v) Tropfenweise Zugabe von gesättigter, neutralisierter Ammoniumsulfat-Lösung bis zu einer Sättigung von 65% unter rühren (Differenz zu 35%) Zentrifugation im JA 20 Rotor bei rpm bei 4 C 10 min (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) Der Überstand wird verworfen und der schwimmende Niederschlag in 1/20 des Ausgangsvolumens der Probe in Tris-Puffer II aufgenommen und vorsichtig homogenisiert Zur vollständigen Abtrennung nicht gelöster Bestandteile wird anschließend im JA-20 Rotor bei rpm 20 min bei 4 C zentrifugiert (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS). Der Überstand wird so abgenommen, dass keine festen Partikel in die Lösung kommen, den Vorgang eventuell wiederholen Probe gleich weiterverarbeiten oder nach Zugabe von 20% Glycerin bei -20 C lagern, damit das H 2 O nicht kristallisieren kann und die Proteine bei der Lagerung nicht zerstört werden 77

90 Materialien und Methoden B. 50%ige Ammoniumsulfatfällung 50%-Fällung (w/v) Zugabe der aus der Tabelle B berechneten Menge an festen Ammoniumsulfat unter rühren und weitere 15 min rühren Zentrifugation im JA 20 Rotor bei rpm bei 4 C 20 min (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) Der Niederschlag schwimmt auf der Flüssigkeit ( floating pellet ), in 1/4 des Ausgangsvolumens der Probe (ca. 20 ml) an Tris-Puffer II aufnehmen und vorsichtig homogenisieren, den Rest verwerfen Tabelle B : Die Menge an festem Ammoniumsulfat, die einer Lösung zugefügt werden muss, um die gewünschte Endkonzentration bei 0 C zu erreichen [148]. Endkonzentration an Ammoniumsulfat, % Sättigung bei 0 C Anfangskonzentration an Ammoniumsulfat, % Sättigung bei 0 C g festes Ammoniumsulfat, das 100 ml einer Lösung zugegeben wird 78

91 Materialien und Methoden 50%-Waschung (w/v) Tropfenweise Zugabe von gesättigter, neutralisierter Ammoniumsulfat-Lösung bis zu einer Sättigung von 50% unter rühren (insgesamt 15 min rühren). Zentrifugation im JA 20 Rotor bei rpm bei 4 C 10 min (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) Niederschlag wie oben abnehmen und im gleichen Volumen Tris-Puffer II aufnehmen und vorsichtig homogenisieren Die 50%ige Waschung kann wiederholt werden, um einen besseren Detergensaustausch zu erhalten. Dies gilt besonders, wenn die Probe länger gelagert werden soll. Abtrennung nichtgelöster Bestandteile Zur vollständigen Abtrennung nichtgelöster Bestandteile wird anschließend in der Biofuge 28 RS mit dem Eppendorf-Rotor Nr bei rpm (21400 g) 20 min bei 4 C zentrifugiert. Der Überstand wird so abgenommen, dass keine festen Partikel in die Lösung kommen. Probe gleich weiterverarbeiten oder nach Zugabe von 20% Glycerin bei -20 C lagern B Gelfiltration Es wird eine HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade-säule verwendet: Durchmesser: 16 mm Länge: ca. 60 cm Säulenvolumen: ca. 120 ml Die Säule wird bei längeren Zeiträumen in 20% Ethanol gelagert; Inbetriebnahme erfolgt nach Anleitung; es sind mehrere (ca. 4) Läufe notwendig Die Säule wird mit 3 Säulenvolumen (3 x 120 ml) Tris-Puffer III äquilibriert 79

92 Materialien und Methoden Auftragung der Probe aus der Ammoniumsulfat-Fällung (Probenvolumen: 4-5 ml) ohne Pumpe Elution mit Tris-Puffer III, Flussrate: 30 ml/h Die Reaktionszentren enthaltenden Fraktionen werden gesammelt (Detektion nach den Spektren, vgl. Abbildung C.2.2.2) und nach Zugabe von 20% Glycerin bei -20 C gelagert B Anionenaustausch-Chromatographie Es wird eine Säule mit DEAE-Toyopearl 650M Säulenmaterial verwendet: Durchmesser: 2 cm Länge: ca. 16 cm Volumen: ca. 50 ml Die Säule wird nach Anleitung vorbereitet und in Tris-Puffer IV aufbewahrt. Die Säule wird mit 5 Säulenvolumen (5 x 50 ml) Tris-Puffer IV äquilibriert, Flussrate: ml/min Probe (aus den ca. 4 Gelfiltrationen gesammelt) auftragen Waschen mit 1 Säulenvolumen (50 ml) Tris-Puffer IV, Flussrate: ml/min Elution: der Gradient erfolgt in Stufen von jeweils 50 ml (entspricht einem Säulenvolumen): 0,20 M NaCl 0,25 M NaCl 0,28 M NaCl 0,30 M NaCl 0,50 M NaCl Flussrate: 5 ml/min Detektion: Spektrum zwischen 300 nm und 900 nm Waschen der Säule mit Tris-Puffer IV; Flussrate: 20-50ml/min 80

93 Materialien und Methoden Die Reaktionszentren enthaltenden Fraktionen (vgl. Abbildung B ) mit hohem Proteingehalt (ODV) werden gesammelt und gleich weiterverarbeitet (vgl. Kapitel B ) B Entsalzung Es wird eine Sephadex G-25 M PD-10 Entsalzungssäule verwendet: Säulenvolumen: 9,1 ml Probenvolumen: 2,5 ml Flussrate: durch die Schwerkraft gegeben Zur Entsalzung muss die Probe aus dem Anionenaustauscher gegebenenfalls geteilt werden. Die Säule wird mit 25 ml Tris-Puffer V äquilibriert Die Probe (2,5 ml) wird aufgetragen und einsickern gelassen, während das Eluat verworfen wird Es wird mit 3,5 ml Tris-Puffer V eluiert; das farbige Eluat wird gesammelt Säule waschen Probe gleich weiterverarbeiten Sollten die Reaktionszentren noch nicht rein genug sein, folgt eine zweite Aufreinigung durch Anionenaustauscher und Entsalzung. Der Reinheitsgrad wird zunächst anhand des UV-VIS-Spektrum beurteilt, welches mit dem Spektrum reiner Reaktionszentren, wie in Abbildung B dargestellt, verglichen wird. Insbesondere wird darauf geachtet, dass die Amplituden der Banden bei 750 nm und 860 nm im Verhältnis 1 : 1 stehen und das Verhältnis der Amplituden der Banden bei 750 nm, 802 nm und 860 nm möglichst nahe bei 1 : 2 : 1 ist. 81

94 Materialien und Methoden B Aufkonzentrierung Die Aufkonzentrierung geschieht mittels einer YM 100 Membran (mit einem Ausschlussmolekulargewicht von Da) in einer Amicon-Rührzelle bei 4 C. Bei kleineren Volumina werden PM 100 Centricon Konzentratoren verwendet. Die Proben werden bis zu einer OD 802 von 30 aufkonzentriert. B Lagerung der Reaktionszentren Die erhaltenen Reaktionszentren werden in Aliquots unter Zusatz von 20% Glycerin in Tris-Puffer IV bei -20 C gelagert. Die Reaktionszentren können nicht wie sonst üblich bei -80 C gelagert werden, da das Kristallisieren des H 2 O das Protein soweit zerstört, dass keine Ladungstrennung mehr beobachtet werden kann (siehe Kapitel C.2.1.) 82

95 Materialien und Methoden B.2.4. Charakterisierung der Proben B Bacteriochlorophyll-Bestimmung Die Bacteriochlorophyll (BChl)-Konzentration in den Membransuspensionen wurde durch Extraktion mit einer Aceton/Methanol-Mischung im Verhältnis 7 : 2 (v/v) und Absorptionsmessung mit einem Perkin-Elmer Lambda 2 Spektrometer bei 770 nm bestimmt. Bei dieser Wellenlänge beträgt der Extinktionskoeffizient für das Bacteriochlorophyll ε = 75 mm -1 cm -1 [149]. B Proteinbestimmung mit dem BCA-Proteintest Die Bestimmung der Proteinkonzentration während der Isolation und Reinigung erfolgte mit dem BCA-Proteintest [150]. Die verwendeten Lösungen sind in Kapitel B beschrieben. Der BCA-Test ähnelt der Proteinbestimmung nach Lowry, hat aber eine geringere Störanfälligkeit gegenüber Detergentien, wie sie insbesondere zur Solubilisierung von Membranproteinen verwendet werden. Die Methode kombiniert den Biuret-Proteintest mit 2,2 -Bicinchoninsäure (BCA) als Detektionssystem. Die Methode beruht auf der Reduktion von Cu 2+ zu Cu + durch Cystein, Tyrosin, Tryptophan und die Peptidbindungen des Proteins. BCA bildet spezifisch mit Cu + einen violetten Farbkomplex mit einem Absorptionsmaximum bei 562 nm. Eine Eichung erfolgt mit einem BSA (Bovine Serum Albumin) Standard, der im Bereich von 2,0 20 µg/ml eine lineare Zunahme der Absorption mit der Konzentration zeigt. Es können Proteinkonzentrationen bis 5 µg/ml nachgewiesen werden Die Proteinbestimmung erfolgt direkt in Küvetten. Dazu werden die Proben sowie der Proteinstandard nach Anleitung mit den Test-Lösungen (BCA Protein Assay Reagent A und Reagent B) vermischt, inkubiert und in einem UV-VIS-Spektrometer vermessen. 83

96 Materialien und Methoden B SDS-PAGE-Gelelektrophorese Die Standardmethode der SDS-Gelelektrophorese [151] wurde zur Charakterisierung des isolierten Reaktionszentrums und seiner Untereinheiten sowie zur Überprüfung seiner Reinheit angewendet. Ebenso wurde mit dieser Methode der Verlauf der Isolierung und Reinigung des Proteins dokumentiert. Natriumdodecylsulfat (SDS) ist ein anionisches Detergens, das an die hydrophoben Regionen des zu untersuchenden Proteins bindet (bei den meisten Proteinen mit einem konstanten Verhältnis von etwa einem SDS-Molekül pro zwei Aminosäureresten), es in seine Untereinheiten dissoziiert (durch Disulfid-Brücken zusammengehaltene Untereinheiten werden mit Dithiothreitol (DTT) dissoziiert) und die Eigenladung des Proteins maskiert. Dadurch weisen SDS-beladene Proteine nahezu identische Ladungs-Masse-Verhältnisse und ähnliche Formen auf. Die Proteine werden bei einer SDS-Gelelektrophorese in der Reihenfolge der molaren Massen getrennt. Die Molmasse des zu untersuchenden Proteins wurde durch den Vergleich mit einem mitlaufenden Proteinstandard ermittelt. Die verwendeten Lösungen sind in Kapitel B beschrieben. B Gießen der Gele In der Gießkammer können zwei Gele gleichzeitig gegossen werden. Die Gele wurden sofort verwendet. Trenngel (12,5 %; 1 mm Dicke; für zwei Gele) - 7,35 ml H 2 O - 4,25 ml Trenngelpuffer (siehe Tabelle B ) - 5,3 ml Acrylamidstammlösung (siehe Tabelle B ) - 10 min entgasen µl APS-Lösung (siehe Tabelle B ) - 6 µl TEMED (startet die Polymerisation) 84

97 Materialien und Methoden Sammelgel (5 %; 1 mm Dicke; für zwei Gele) - 4,38 ml H 2 O - 2 ml Sammelgelpuffer (siehe Tabelle B ) - 1 ml Acrylamidstammlösung - 10 min entgasen - 94 µl APS-Lösung - 8 µl TEMED B Probenvorbereitung Die Proteinprobe wurde im gleichen Verhältnis mit dem Probenpuffer vermischt und 30 min bei 60 C inkubiert. Die Proteinkonzentration betrug etwa 1 mg/ml. Es wurden ca. 1-2 µg Protein pro erwartete Bande auf eine Bahn aufgetragen. B Elektrophorese Die Elektrophorese wurde nach einer Standardmethode bei einer konstanten Stromstärke von ca. 5 ma pro Gel im Sammelgelbereich und ca. 28 ma pro Gel im Trenngelbereich durchgeführt und dauert ca. 1-2 h. Als Elektrophorese-Apparatur wurde die Mini Protean II von Biorad verwendet, in der bis zu zwei Gele eingebaut werden können. B Färbung der Gele mit Coomassie Brilliant Blue Jedes Gel wurde getrennt in einer Plastikbox unter schwenken mit Coomassie Brilliant Blue G-250 eingefärbt. 30 min in Fixierer-Lösung schwenken 1 h in Färber-Lösung schwenken 85

98 Materialien und Methoden in Fixierer-Lösung entfärben, bis die Banden sichtbar werden und der Hintergrund klar wird Gel in 10 % Essigsäure-Lösung aufbewahren B Gel-Dokumentation Die fertigen Gele wurden dokumentiert und ausgewertet. Als Protein Referenz diente der LMW Electrophoresis Calibration Kit von Pharmacia Biotech sowie aufgereinigtes Reaktionszentrum aus Rhodobacter sphaeroides. Die Gele wurden mit einer Gel-Dokumentationsanlage Digit Store System 95KFE103 von INTAS gespeichert und mit dem Programm Gelscan bearbeitet. B UV-VIS-Absorptionsspektren Die UV-VIS-Spektren der Zellen, der Membranen und des Reaktionszentrums aus Roseobacter denitrificans wurden an einem Perkin-Elmer Lambda 2 Spektrometer aufgenommen. Je nach benötigten Extinktionswerten wurden Spektren im Bereich zwischen 650 und 900 nm für die Suspension der Zellen, 300 und 900 nm für die Membranen und zwischen 300 und 900 nm bzw. 700 nm und 900 nm für die Reaktionszentren-Lösungen aufgenommen (Schichtdicke = 1 cm). Diese Aufnahmen dienen zur Dokumentation der Anzucht von Roseobacter denitrificans sowie der Isolationen von Membranen und Reaktionszentren. Zudem wurden Spektren von jeder Probe vor und nach Messreihen aufgenommen. Abbildungen B bis 3 zeigen typische Spektren der Zellsuspension, der Membranen und des Reaktionszentrums aus Roseobacter denitrificans. Aus den Spektren der Reaktionszentren-Lösungen wird die optische Dichte OD 802 bestimmt. Sie entspricht der Absorption der Bacteriochlorophylle im Reaktionszentrum (und damit der Absorption des Proteins) und wird bei der Charakterisierung von Reaktionszentrenpräparationen häufig anstelle von Konzentrationsangaben verwendet (siehe Gleichung B ). 86

99 Materialien und Methoden Mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten des Reaktionszentrums kann die optische Dichte (OD) in Konzentrationseinheiten umgerechnet werden (ε 802 = 288 mm -1 cm -1 für Rhodobacter sphaeroides [152]). Aus der OD 802 und dem Volumen der Probe in ml berechnet sich: ODV = OD 802 x V Probe Gleichung B Mit Hilfe der Molmasse Mr des Reaktionszentrums (Mr = Da aus der DNA- Sequenz abgeleitet nach [129, 130, 153] bzw. Mr = Da apparente Molmasse aus SDS-PAGE [128]) und des Extinktionskoeffizienten lässt sich diese Größe dann in Stoffmengen (mg bzw. nmol) umrechnen. 2, nm optische Dichte 2,30 2,25 2, nm 2, Wellenlänge (nm) Abbildung B : Absorptionsspektrum der Flüssigkultur von Roseobacter denitrificans Zellen. Das Maximum bei 806 nm zeigt die Absorption des Bacteriochlorophylls a von LH II, während das Maximum bei 870 nm die Absorption des Bacteriochlorophylls a des RC-LH I-Komplexes zeigt. 87

100 Materialien und Methoden 1,0 0,9 0,8 370 nm optische Dichte 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 420 nm 510 nm 590 nm 806 nm 870 nm 0,1 0, Wellenlänge (nm) Abbildung B : Absorptionsspektrum von gereinigten Roseobacter denitrificans Membranen in 100 mm Mops/NaOH-Puffer (ph = 7,0). Das Maximum bei 870 nm entspricht der Absorption von Bacteriochlorophyll a im LH I-RC- Komplex, das Maximum bei 806 nm der Absorption des Bacteriochlorophylls a im LH II. Weiterhin zeigt das Bacteriochlorophyll a Absorptionsbanden bei 590 nm und 370 nm. Die breite Bande mit Maximum bei 510 nm entspricht der Absorption der Carotinoide (95% Spheroidenon) und die Schulter bei 420 nm der Absorption der Cytochrome. 3,5 3,0 370 nm 420 nm optische Dichte 2,5 2,0 1,5 1,0 0, nm 600 nm 750 nm 802 nm 860 nm 0, Wellenlänge (nm) Abbildung B : Absorptionsspektrum von gereinigten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans. Die Absorptionsmaxima bei 860 nm und 600 nm entsprechen dem Bacteriochlorophylldimer, das Maximum bei 802 nm entspricht dem Bacteriochlorophyllmonomer und das Maximum bei 750 nm dem Bacteriophäophytin. Im Bereich von 500 bis 550 nm liegen die Banden des Bacteriophäophytin, der Carotinoide und der Cytochrome c (α-banden bei 550 nm) übereinander. Bei 420 nm beobachtet man die Soret-Banden der c-typ Cytochrome, während bei 370 nm das Bacteriochlorophyllmonomer absorbiert. Die Reaktionszentren sind in 20 mm Tris/HCl (ph = 7,5) / 1 mm EDTA / 0,25% (v/v) Triton X-100 gelöst. 88

101 Materialien und Methoden B.2.5. Transiente Absorptionsspektroskopie Elektronentransferreaktionen in photosynthetischen Reaktionszentren und den anderen an der Photosynthese beteiligten Proteinen lassen sich mit Hilfe der optischen Spektroskopie anhand der Extinktionsänderungen einzelner Spezies verfolgen. Diese Änderungen werden durch die mit dem Elektronentransfer verbundenen Oxidations- und Reduktionsreaktionen und der Änderung der jeweiligen Extinktionskoeffizienten von Cofaktoren verursacht. Die Rekombination der ladungsgetrennten Zustände P + Q - A und P + Q A Q - B im Reaktionszentrum kann z.b. mit Hilfe der Absorptionsänderung des bei der Ladungsrekombination rereduzierten primären Elektronendonators untersucht werden. In dieser Arbeit wurde hierfür die Q y -Bande des Donators P bei 860 nm verwendet, da der Differenzextinktionskoeffizient zwischen reduziertem und oxidiertem Zustand in dieser Bande relativ groß ist. Für Rhodobacter sphaeroides ist ε P/P +(865 nm) = 112 mm -1 cm -1 [152]. Auf Grund der Strukturähnlichkeiten ist anzunehmen, dass sich der Differenzextinktionskoeffizient in Roseobacter denitrificans in einem ähnlichen Bereich bewegt. Alternativ dazu lassen sich Änderungen des Redoxzustandes auch im Bereich der Soret-Bande (370 nm), der Q x -Bande (600 nm) oder im langwelligen Bereich bei 1250 nm, wo der Donator stark absorbiert, untersuchen. Ebenso lässt sich die Reduktion der Ubichinone spektroskopisch verfolgen. Das Semichinonanionradikal des Ubichinons zeigt eine charakteristische Bande bei ca. 450 nm. Der Differenzextinktionskoeffizient ε UQ/UQ -(445 nm) = 8,5 mm -1 cm -1 (für Q B in Rhodobacter sphaeroides [154]) ist jedoch sehr klein. Daher wurden in dieser Arbeit die Ladungsrekombinationskinetiken im Reaktionszentrum aus Roseobacter denitrificans über die Reduktion von P + gemessen. Auch die Redoxänderungen der Cytochrome können spektroskopisch untersucht werden. Abbildung B zeigt schematisch das typische Spektrum von Cytochrom c im oxidierten und reduzierten Zustand. Eingezeichnet sind die charakteristischen Banden (α-, β- und γ-bande), in denen die Absorptionsänderungen, die mit den Redoxänderungen einhergehen, verfolgt werden können. Die Differenzextinktionskoeffizienten liegen im Bereich von ε ox/red (γ-bande) 60 mm -1 cm -1 und ε ox/red (α-bande) 20 mm -1 cm -1 (vgl. Abbildung B.2.5.1). Cytochrome werden nach der Lage ihrer α-bande in 89

102 Materialien und Methoden Cytochrome des Typs a (Häm A mit dem Maximum der α-bande bei 600 nm), des Typs b (Eisen-Protoporphyrin IX mit dem Maximum der α-bande bei 560 nm) und des Typs c (Häm C mit dem Maximum der α-bande bei 550 nm) eingeteilt. Durch gezielte Wahl der Wellenlänge, bei der Absorptionsänderungen beobachtet werden, können Cytochrome und der Elektronentransfer zwischen den Redoxzentren von Proteinen eines Systems (also auch differenziert in Zellen oder isolierten Membranen, in denen eine komplexe Mischung verschiedenster Cytochrome vorliegt) untersucht werden. γ-bande α-bande β-bande Abbildung B.2.5.1: Absorptionsspektrum einer 10 µm Lösung von Cytochrom c im reduzierten (durchgezogene Linie) und oxidierten Zustand (gepunktete Linie). Die drei charakteristischen Banden im Spektrum von reduziertem Cytochrom werden als γ- (oder Soret-), α- und β-bande bezeichnet. Sie entsprechen den p-p * -Übergängen des Häms aus dem Grundzustand S 0 in die drei angeregten Zustände S 1, S 2 und S 3. Der energetisch höchste Übergang S 0 Æ S 3 liegt zwischen 390 und 430 nm (g-bande) und verschiebt sich durch Reduktion zum Längerwelligen. Reduziertes Cytochrom c zeigt bei 520 nm die b- Bande (S 0 Æ S 2 Übergang) und bei 550 nm die a-bande (S 0 Æ S 1 Übergang). Im oxidierten Zustand liegt zwischen 500 und 600 nm eine breite Absorptionsbande vor. 90

103 Materialien und Methoden B Messungen an isolierten Reaktionszentren B Messanordung Der Aufbau der Apparatur wurde im Detail bei R. Schmid [155] beschrieben. Als Lichtquelle wurde eine Philips Halogenlampe (12 V, 50 W, abgelöteter Blechkragen) verwendet. Das Messlicht wurde mit dem Monochromator eines Sigma ZWS 11 Spektrometers monochromatisiert und mit Lichtleitern zur Probe geführt (Schichtdicke = 1 cm). Die Detektion des Messlichtes erfolgte mit einem im nahen Infrarot sensitiven Sekundärelektronenvervielfacher (SEV, Hamamatsu R316(S-1)), der über ein Sigma ZWS 11 Spektrometer mit einer Hochspannung von 1000 V betrieben wurde. Das erhaltene Spannungssignal wurde verstärkt und digital gefiltert (Stanford Research Systems SR570) sowie auf einem Speicher Oszilloskop (LeCroy 9310AM) aufgezeichnet. Zur Messung der Ladungsrekombination muss die optische Anregung des Reaktionszentrums und damit die Ladungstrennung induziert werden. Die Anregung des Reaktionszentrums erfolgte im Bereich der Q x -Bande des primären Donators und der akzessorischen Bacteriochlorophylle bei einer Wellenlänge von 590 nm mit einem blitzlampengepumpten Farbstofflaser (Cynosure SLL-250, Rhodaminchlorid 590 (Fa. Exciton) in Methanol, Pulsbreite = 400 ns, Energie pro Puls ca. 0,2 J), der im rechten Winkel zum Messlicht in die Probenkammer eingekoppelt war. Die Auslösung des Laserblitzes erfolgte entweder manuell oder mit Hilfe eines Pulsgenerators (Stanford Research Systems, DG 535). Der Aufzeichnungsvorgang am Oszilloskop wurde durch eine auf das Streulicht des Lasers ansprechende Photodiode (Eigenbau der Elektronikwerkstatt des Instituts für Physikalische Chemie) ausgelöst. Der SEV wurde mit einem für den langwelligen Teil des Lichtes durchlässigen Kantenfilter (780-FG07-50, Lot-Oriel) oder einem Interferenzfilter (870- FS10-50, Lot-Oriel) vor Laserstreulicht geschützt. In der Abbildung B ist ein Schema dieser Messanordnung gegeben. 91

104 Materialien und Methoden Optischer Filter Sekundärelektronenvervielfacher Probenkammer Lampe Monochromator Verstärker/ elektronischer Filter Oszilloskop Laser PC Abbildung B : Messanordnung für die transiente Absorptionsspektroskopie an Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans (Zeitauflösung 400 ns, bedingt durch die Pulsbreite des Lasers). B Probenvorbereitung und Messbedingungen Für die spektroskopischen Untersuchungen wurden 2,5 ml Fluoreszenzküvetten aus Quarzglas (Helma 108F-QS) verwendet. Die Reaktionszentren waren in Tris-Puffer VII oder in Mops-Puffer I für Reaktionszentren (siehe Kapitel B ) gelöst. Die Konzentration der Reaktionszentren lag zwischen 0,1 < OD 802 < 1,0 (entspricht einer Konzentration von 0,3-3 µm). Die Absorptionsänderung wurde bei 860 nm verfolgt, dem Maximum in der Bacteriochlorophylldimer-Bande. 92

105 Materialien und Methoden B Absorptionsdifferenzspektroskopie: Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten der Ladungsrekombination von P + Q A - bzw. P + Q B - und des Besetzungsgrades der Q A - und Q B -Bindungsstellen im Reaktionszentrum aus Roseobacter denitrificans Die Messungen erfolgten als Differenzmessungen, d.h. das Ausgangssignal V 0, das proportional zur Zahl der Photonen (und damit auch der Lichtintensität I 0 ) ist, die die Probe vor der Anregung durchlaufen, wurde durch eine mit Hilfe der Verstärkereinheit angelegte Gegenspannung auf 0 mv kompensiert. Verstärkt wurde folglich nur das Differenzsignal. Zur weiteren Verbesserung des Signal-Rausch- Verhältnisses wurden mehrere Messungen auf dem Oszilloskop gemittelt. Die gemittelten Daten wurden zur Weiterverarbeitung auf einen IBM-kompatiblen Personalcomputer übertragen. Die Umrechnung der gemessenen Spannungsänderungen in Absorptionsänderungen erfolgte gemäß Gleichung B : A(t) = -log[1+ U(t)/U 0 ] Gleichung B mit: A Absorptionsänderung als Funktion der Zeit U Spannungsänderung als Funktion der Zeit U 0 Spannung vor der Anregung Aus den Absorptionsänderungen A als Funktion der Zeit können die Geschwindigkeitskonstanten bestimmt werden, da diese den Konzentrationsänderungen der beteiligten Spezies proportional sind (siehe Abbildung B ). Im Prinzip lassen sich die Elektronentransferreaktionen im Reaktionszentrum mit einer Kinetik erster Ordnung beschreiben. Die Kurvenanpassung erfolgt dann mit einer einfachen Exponentialfunktion: A(t) = A 1 exp(-k AP t) + C Gleichung B

106 Materialien und Methoden mit: A(t) Gesamtänderung der Amplitude als Funktion der Zeit A 1 Amplitude der Komponente 1 k AP Geschwindigkeitskonstante der Ladungsrekombination von Q A - t Zeit C Konstante Absorptionsänderung, A 860 0,00-0,01-0,02-0,03-0,04 Laserblitz 0,00 0,05 0,10 0,15 Zeit (s) - Abbildung B : Ladungsrekombination von Q A und P + im bakteriellen Reaktionszentrum aus Roseobacter denitrificans. Die Ladungstrennung erfolgt durch einen Laserblitz bei t = 0 s. Die Amplitude des Signals entspricht der Zahl der Reaktionszentren im Zustand P +. Bei Ladungsrekombination wird P + reduziert und die Kinetik klingt monoexponentiell ab mit einer Geschwindigkeitskonstante von 35 s -1. Dies entspricht der schnellen Kinetik von Reaktionszentren, die kein Ubichinon in der Q B -Bindungsstelle -1 enthalten, und demzufolge mit k AP rekombinieren. Über 99% der Reaktionszentren haben kein gebundenes Ubichinon in der Q B -Bindungstasche, so dass keine Rekombination von k -1 BP beobachtet werden kann. Nach etwa 10 k -1 AP ist das System vollständig rekombiniert, und man erhält die Ausgangsabsorption ( A 860 0). 94

107 Materialien und Methoden Für den Fall zweier Parallelreaktionen ist jedoch eine weitere Exponentialfunktion zur Beschreibung der Messdaten notwendig: A(t) = A 1 exp(-k AP t) + A 2 exp(-k BP t) + C Gleichung B mit: A(t) Gesamtänderung der Amplitude als Funktion der Zeit A 1 Amplitude der Komponente 1 zur Zeit t = 0 A 2 Amplitude der Komponente 2 zur Zeit t = 0 k AP Geschwindigkeitskonstante der Ladungsrekombination von Q A - k BP Geschwindigkeitskonstante der Ladungsrekombination von Q B - t Zeit C Konstante Die zusätzlichen Konstanten C bzw. C werden benötigt, um den Signalabfall für - einen Bruchteil an Reaktionszentren zu korrigieren, bei denen das Elektron auf Q A bzw. Q - B durch unkontrollierten Elektronenfluss verschwindet oder oxidiert wird und somit der photooxidierte Donator zurückbleibt. - Um die Geschwindigkeitskonstante der Ladungstrennung von Q A (k AP ) im Reaktionszentrum zu bestimmen, wurde selektiv das Ubichinon der Q B - Bindungsstelle durch Zugabe eines kompetitiven Inhibitors verdrängt. Es wurde entweder Terbutryn mit einer Endkonzentration von 100 µm oder o-phenanthrolin mit einer Endkonzentration von bis zu 10 mm eingesetzt (siehe Kapitel B ). Nach einer Inkubationszeit von 30 min bei Raumtemperatur wurde die Messung durchgeführt. Der Wert für k AP lässt sich dann durch Anpassung der Kinetik nach Gleichung B erhalten. Analog kann die Geschwindigkeitskonstante der Ladungsrekombination von Q - B (k BP ) bestimmt werden. In der Regel ging jedoch bei der Präparation der Reaktionszentren ein Teil des Ubichinons in den Bindungsstellen verloren, so dass die Reaktionszentren vor der Messung zunächst mit Ubichinon rekonstituiert werden mussten. Hierzu wurde die Probe mit einer Ubichinonstammlösung (Ubichinon in Detergensmizellen) titriert, bis die maximale Besetzung erreicht wurde. Trotzdem trat generell das Problem auf, dass die Q B -Bindungsstelle nicht vollständig besetzt vorliegt, so dass in der Regel eine zweiphasige Kinetik beobachtet wurde: eine 95

108 Materialien und Methoden schnelle Phase, verursacht durch Reaktionszentren, die nur Ubichinon in der Q A - Bindungsstelle enthalten und mit der Geschwindigkeitskonstante k AP rekombinieren, und eine langsame Phase der Reaktionszentren, die beide Ubichinon- Bindungsstellen besetzt haben, mit der Geschwindigkeitskonstante k BP. Für die Auswertung ist also die Bestimmung von k AP notwendig. Diese wurde in der biexponentiellen Kurvenanpassung (Gleichung B ) vorgegeben und k BP aus einer Vier-Parameter-Anpassung bestimmt. Die erhaltene Amplitude der schnellen Phase entspricht der Besetzungszahl von Ubichinon in der Q A -Bindungsstelle. Sie wurde bestimmt, in dem man das Ausbleichen der Absorptionsbande des Bacteriochlorophylldimers in einem sehr kleinen Zeitfenster (< 20 ms) misst und die Amplitude des Signals A 860 (t=0) durch lineare Extrapolation ermittelt. Der Quotient aus der Absorptionsänderung A 860 (t=0) und der Absorption A 860 ist ein Maß für die Besetzung von Q A mit einem Chinon. Für Reaktionszentren aus Rhodobacter sphaeroides hat dieser Quotient je nach Präparation den Wert von 0,8-0,9 für eine vollbesetzte Q A -Bindungsstelle. Die Amplitude der langsamen Phase A 860 (langsame Phase) entspricht der Anzahl an Reaktionszentren mit Ubichinon in der Q B -Bindungsstelle. Zur Bestimmung der relativen Besetzung der Q B -Bindungsstelle bezüglich der Q A -Bindungsstelle wurde der Quotient aus A 860 (langsame Phase) und A 860 (t=0) gebildet. Die nichtlineare Kurvenanpassung erfolgte mit dem Programm Peakfit (Version 4,05, SPSS Inc.). 96

109 Materialien und Methoden B Messungen an Membranen B Messanordnung Die Untersuchungen des photosynthetischen Apparates an Membranen aus Roseobacter denitrificans wurde am Dipartimento di Biologia, Università di Bologna im Labor von Prof. Dr. G. Venturoli durchgeführt. Der Aufbau des optischen Systems der Apparatur bestand aus einer Reihe von ORIEL Elementen, die auf einen schwingungsgedämpften Tisch linear angeordnet wurden [96]. Als Lichtquelle diente eine Halogenquarzlampe (150 W, 15 V), die von einem Countant ACS1000 betrieben wurde und in einem Beleuchtungsapparat von ORIEL (Modell 7340) eingebaut war. Die Wellenlänge des Messlichtes wurde durch einen doppelten Monochromator von ORIEL (Gitter von 1200 l/mm; Eingangsöffnung 600 µm, Ausgangsöffnung 280 µm) ausgewählt. Ein System aus zwei bikonvexen Linsen mit einem Durchmesser von 25,4 mm und einer Brennweite von 50 mm bzw. 25 mm, fokussierte das Messlicht auf die Küvette in der Probenkammer (Schichtdicke = 1 cm). Durch einen Magnetrührer unter der Probenkammer konnte die Probe in der Küvette gerührt werden. Das Messlicht wurde von einem Photomultiplier PHILIPS XP2013B (10 Dynoden; semitransparente Photokathode Typ S20) detektiert. Der Anodenstrom des Photomultipliers wurde in Spannung umgewandelt und zu einem Drei-Phasen- Verstärker weitergeleitet. Am Verstärker konnte eine Gegenspannung angelegt werden, um das vom Messlicht hervorgerufene Spannungssignal im Photomultiplier zu kompensieren, so dass auch kleine Änderungen des Signals mit ausreichender Auflösung gemessen werden können. Um eine Anregung der Probe durch das Messlicht zu vermeiden, wurde die Probe dem Messlicht nur für die für die Messung erforderliche Zeit (durch Öffnen und Schließen eines Shutters im Messlicht Strahlengang) ausgesetzt. Das System wurde durch eine Photodiode vervollständigt, der ein Teil des Messlichtes (10%) mittels eines Strahlteilers zugeleitet wurde. Diese Anordnung wurde für langsame Messungen (Messdauer länger als 50 ms) verwendet, um die Qualität der Signale zu verbessern, die bei diesen Bedingungen unter den kleinen Änderungen der Lichtintensität des Messlichtes leiden. Dazu wurde das Signal des Photomultipliers mit dem Signal der Photodiode (vor der Probe) nach entsprechender Verstärkung verglichen und normalisiert. 97

110 Materialien und Methoden Für die Anregung der Probe wurde eine Xenonlampe (EG&G; Pulsbreite 4 µs) verwendet, die im rechten Winkel zum Messstrahl in die Probenkammer eingekoppelt wurde. Das Anregungslicht wurde durch einen Kodak Wratten 88 A Filter (durchlässig für den Spektralbereich zwischen 730 und 950 nm) geleitet. Das System zur Datenaufnahme bestand aus einem digitalen Oszilloskop (Le Croy 9410, 100 MHz) mit einem Interface zu einem Personal Computer. Zu Beginn der Messung wurde durch Auslösung eines Schalters der Lichtschalter geöffnet, der Magnetrührer gestoppt und der Ventilator für die Kühlung der Lampe ausgeschaltet (um mechanische Schwingungen auszuschließen) sowie zeitlich verzögert der Impulsgenerator aktiviert, der die Signale zur Auslösung der Blitzlampe für die Anregung sowie zur Auslösung der Datenaufzeichnung am Oszilloskop weiterleitet. In Abbildung B ist ein Schema der beschriebenen Messanordnung dargestellt. Die Zeitauflösung der gesamten Apparatur war, durch die Dauer des Anregungsblitzes bedingt, auf einige µs begrenzt. 98

111 Materialien und Methoden 1 Lampe 13 Salzbrücke 2 Betreiber der Lampe 14 Voltmeter 3 Doppelter Monochromator 15 Argonflasche 4 Beam Splitter 16 Magnetrührer für die Probe 5 Photodiode 17 Verstärker und Betreiber des Photomultipliers 6 Probenkammer 18 Oszilloskop 7 Photomultiplier 19 Trigger 8 Blitzlampe 20 Verstärker der Photodiode 9 Impulsgenerator 21 Personal Computer 10 Betreiber der Blitzlampe 22 Monitor 11 Platinelektrode 23 Shutter 12 Calomel-Referenzelektrode Abbildung B : Messanordnung für die transiente Absorptionsspektroskopie an Membranen aus Roseobacter denitrificans. Die Redoxküvette (siehe Kapitel B.2.6.) wird in der Probenkammer 6 eingesetzt und angeschlossen. Die Zeitauflösung der gesamten Apparatur beträgt einige µs, bedingt durch die Dauer des Anregungsblitzes. 99

112 Materialien und Methoden B Probenvorbereitung und Messbedingungen Die Membranen wurden mit einer Endkonzentration an Bacteriochlorophyll von µm in Mops-Puffer II ph = 7,0 suspendiert. Die Konzentration der Reaktionszentren in der Membransuspension wurde aus der Absorptionsänderung, die bei 605 nm gemessen wurde und dem Extinktionskoeffizienten ε 605 = 19,5 mm -1 cm -1 [156, 157] mit Hilfe des Lambert-Beer Gesetzes (Gleichung B , Kapitel B ) berechnet. Zur Bestimmung wurde die Wellenlänge λ = 605 nm gewählt, da sie das maximale Ausbleichen der Bande nach Anregung durch Licht zeigt und keine Interferenzen durch andere Redoxkomponenten vorhanden sind. Es wurden 10 µm Valinomycin und 10 µm Nigericin zugegeben. Diese Entkoppler (oder Ionophoren) heben das Membranpotential der Membran und die ph-differenz zwischen Cytoplasma und Periplasma auf, das durch den zyklischen Elektronentransfer erzeugt wird. Valinomycin macht die Membran für K + -Kationen durchlässig, während Nigericin den ladungsneutralen Austausch von H + und K + durch die Membran katalysiert. Die Mediatoren wurden mit einer Konzentration von 10 µm zugesetzt, außer Diaminodurol, Phenazin Methosulfat und Phenazin Ethosulfat, die mit einer Konzentration von 5 µm eingesetzt wurden. Nicht alle Mediatoren wurden in allen kinetischen Messungen eingesetzt (siehe hierzu Kapitel C.3.2.). Antimycin A und Myxothiazol wurden als spezifische Inhibitoren des Cytochrom bc 1 Komplexes mit einer Konzentration von 10 µm bzw. 0,5 µm bei bestimmten Experimenten zugesetzt (siehe Kapitel C.3.2.). Antimycin A bindet an der Q i - Bindungstelle des Cytochrom bc 1 Komplexes, Myxothiazol an der Q o -Bindungsstelle und verhindern so die Bindung von Ubichinon (siehe Kapitel D.2.). Myxothiazol bindet auch an der Q B -Bindungstelle im Reaktionszentrum, wie in Rhodobacter sphaeroides nachgewiesen wurde [158], wenn auch mit einer geringeren Affinität (Dissoziationskonstante K D = 1, M). Daher wurde die Konzentration von Myxothiazol in der Probe so gering gehalten (0,5 µm), dass keine Inhibierung der Photochemie im Reaktionszentrum stattfinden konnte. Das Redoxpotential der Membransuspension wurde durch Zugabe von Reduktionsmitteln (Natriumascorbat und Natriumdithionit) oder von Oxidationsmitteln (Kaliumhexacyanoferrat) eingestellt (siehe Kapitel B.2.6.). 100

113 Materialien und Methoden Um die Trübung der Probe zu reduzieren und damit das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, wurden die Proben vor Zugabe der Mediatoren, der Entkoppler und der Inhibitoren auf Eiswasser beschallt (MSE Sonifier, Stufe 3, mittlere Stärke; 3 x 3 s mit 60 s Pause). In Abbildung B ist eine typische Messkurve dargestellt: Die lichtinduzierte Absorptionsänderung bei einer bestimmten Wellenlänge und bei einem bestimmten eingestellten Redoxpotential ist gegen die Zeit aufgetragen. Im Zeitpunkt t = 0 und t = 500 ms erfolgt jeweils eine Anregung des Systems mit einem Blitz. Um ein besseres Signal-Rausch-Verhältniss zu erhalten, wurden je nach Messbedingungen bis zu 64 Messungen gemittelt (siehe Angaben in Kapitel C.3.2.). Aus den gemessenen Kinetiken wurde die Änderung der Amplitude bei der gewählten Wellenlänge zu einem bestimmten Zeitpunkt nach der Anregung ermittelt. Die erhaltenen Absorptionsänderungen wurden dann in Abhängigkeit von der Wellenlänge ( Differenzspektren ), vom angelegten Redoxpotential E h ( Titrationen ) sowie von Viskosität und Ionenstärke graphisch dargestellt (siehe Kapitel C.3.2.). Absorptionsänderung, A 430 x Antimycin + Myxothiazol Zeit (ms) Abbildung B : Einfluss von Inhibitoren auf den lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer in Membranen aus Roseobacter denitrificans. Bei t = 0 und t = 500 ms erfolgt jeweils eine Anregung durch einen Blitz. Die Messung erfolgte bei E h = 390 mv unter Zugabe der Inhibitoren Myxothiazol und Antimycin A bei 430 nm (Soret-Bande der Cytochrome des Typs b). Es wurden 64 Messungen mit einer Dunkelzeit von 90 s zwischen den einzelnen Messungen gemittelt (weitere Details finden sich in Kapitel C.3.2.). 101

114 Materialien und Methoden B.2.6. Redox-Potentiometrie Die kinetischen Untersuchungen der lichtinduzierten Elektronentransferreaktionen an suspendierten Membranen aus Roseobacter denitrificans erfordern eine genaue Kontrolle der Redoxzustände der beteiligten Redoxpartner und damit des Redoxpotentials der Suspension. Um dies zu gewährleisten, wurde für die Messungen eine spezielle Redoxküvette verwendet, die es ermöglicht, während der Messung strikt anaerobe Bedingungen einzuhalten. Abbildung B zeigt eine schematische Darstellung der Küvette und in Abbildung B ist dargestellt wie sie in das Spektrometer eingebaut wird. Pt-Elektrode Argon Argon zur Kalomel-Referenzelektrode Küvette mit der Probe Rührer Abbildung B.2.6.1: Schematische Darstellung der Redoxküvette. Die Platin-Elektrode taucht in die Probe ein. Es besteht ein Kontakt über eine Salzbrücke zur Kalomel-Referenz- Elektrode. Die Probe kann gerührt werden und wird unter Argon (d.h. sauerstofffrei) gehalten. Die Funktionsweise ist im Text beschrieben. 102

115 Materialien und Methoden Zur Einstellung des Redoxpotentials der Suspension wurde die Redoxküvette unter konstantem Argondurchfluss gehalten und die Suspension mit einem Magnetrührer gerührt. Das Redoxpotential wurde mittels einer Platinelektrode (Radiometer Pt 100), dessen Platinplättchen direkt in die Membran-Suspension tauchen, und einer Kalomel-Referenzelektrode gemessen. Das Redoxpotential der Kalomel-Referenzelektrode E h (cal) gegen die Standard- Wasserstoffelektrode (SHE) bei einer bestimmten Temperatur T ist durch folgende Gleichung gegeben: E h (cal)= 260,6 mv - (0,69 mv/ C x T) Gleichung B Das Redoxpotential der Suspension (und damit der Redoxzustand der am Elektronentransfer beteiligten Redoxpartner) wurde durch Zugabe von Reduktionsmitteln (Natriumascorbat und Natriumdithionit) oder von Oxidationsmitteln (Kaliumhexacyanoferrat) eingestellt. Das eingestellte Redoxpotential der Membransuspension bewirkt in Abhängigkeit des jeweiligen Halbstufenpotentials die Reduktion oder Oxidation der Redoxkomponente. Damit kommt es nach Anregung durch Licht je nach eingestellten Redoxpotential zu unterschiedlichen Redox- bzw. Elektronentransfer-Reaktionen, deren Untersuchung Gegenstand dieser Arbeit ist. Der reduzierte bzw. oxidierte Anteil einer Redoxkomponente bei einem bestimmten Redoxpotential wird mit Hilfe der Nernst-Gleichung (Gleichung B.2.6.3) berechnet. Für den Redox-Prozess an einer Elektrode gilt: ox + z e - red Gleichung B Die Nernst-Gleichung ergibt sich zu: RT a ox E = E + ln Gleichung B zf a red mit: E Elektrodenpotential E Standardpotential der Elektrode a ox Aktivität der Spezies im oxidierten Zustand a red Aktivität der Spezies im reduzierten Zustand 103

116 Materialien und Methoden R Gaskonstante 8,31441 JK -1 mol -1 T Temperatur in K z stöchiometrischer Faktor der Elektronen F Faraday-Konstante 9, Cmol -1 Es ist: RT f ox RT c ox E = E + ln + ln Gleichung B zf zf f red c red mit: f ox Aktivitätskoeffizient der Spezies im oxidierten Zustand f red Aktivitätskoeffizient der Spezies im reduzierten Zustand c ox Konzentration der Spezies im oxidierten Zustand c red Konzentration der Spezies im reduzierten Zustand Bei biochemischen Prozessen setzt man meistens voraus, dass: f ox = f red 1 Gleichung B Somit können statt der Aktivitäten die Konzentrationen der entsprechenden Spezies verwendet werden. Darüber hinaus wird zumeist noch der biochemische Standardzustand (c [H + ] = 10-7 M und die Konzentrationen sind die Summenkonzentrationen der jeweiligen Stoffe) eingeführt: RT c ox E h = E m,7 + ln Gleichung B zf c red Für den Fall, dass c ox = c red Gleichung B ergibt sich E h = E m,7 E m,7 Gleichung B

117 Materialien und Methoden Der Wert von E m,7 wird als Halbstufenpotential bezeichnet und bei ph = 7 gemessen. Zum Beispiel berechnet sich der Anteil an oxidierten H1 (E m,7 = 290 mv) der tetrahämen Cytochrom c-untereinheit des Reaktionszentrums bei einem eingestellten Redoxpotential E h = 375 mv (siehe Kapitel C ) wie folgt: RT c ox E h = E m,7 + ln Gleichung B zf c red mit: E m,7 = 290 mv E h = 375 mv zu: c ox ln = (0,375-0,29) V / 0,0257 V Gleichung B c red das Verhältnis von oxidiertem zu reduziertem Anteil von H1 beträgt somit: c ox c red = 27,39 Gleichung B und damit erhält man für den oxidierten Anteil von H1: c ox c ges = 0,96 Gleichung B mit: c ges = c ox + c red Gleichung B Um eine schnelle Gleichgewichtseinstellung zwischen dem biologischen System und der externen wässrigen Umgebung, in der die Messelektroden eintauchen, herzustellen, ist der Einsatz von Redoxmediatoren notwendig. Dies sind organische Moleküle mit partiell hydrophoben Eigenschaften und von geringerer Größe als die 105

118 Materialien und Methoden zu untersuchenden Komponenten, die in der Lage sind sowohl mit den biologischen Redoxzentren als auch mit den gelösten Redoxstoffen zu reagieren, so dass sie die Oxidations- bzw. Reduktionsmittel aus der wässrigen Umgebung dem Protein zugänglich machen. Ohne den Einsatz von Mediatoren wären die Redoxzentren des zu untersuchenden Systems durch die Proteinstruktur von der wässrigen Umgebung abgeschirmt. Die wichtigsten Voraussetzungen für Redoxmediatoren sind: - Sie müssen wirksam und reversibel sowohl mit der Elektrode als auch mit den biologischen Proteinkomplexen reagieren. - Sie müssen stabil in Bezug auf Oxidation und Reduktion sein. - Sie dürfen keine durch eine Änderung ihres Redoxzustands bedingte Absorptionsänderungen im Wellenlängenbereich des Spektrums der zu untersuchenden Redoxpartner des Proteins zeigen. In Tabelle B werden die in dieser Arbeit verwendeten Mediatoren und ihre Redoxpotentiale bei ph = 7 (E m,7 ) sowie deren ph-abhängigkeit aufgelistet. Tabelle B.2.6.1: Verwendete Redoxmediatoren mit ihrem Halbstufenpotential bei ph = 7,0, den pk A -Werten und der Molmasse [ ]. Mediator Halbstufenpotential gegen SHE 1 (mv) pk A -Werte Molmasse (g/mol) Diaminoduren ,6 ; 7,7 164,25 p-benzochinon ,85 ; 11,4 108,1 1,2-Naphthochinon ,16 1,4-Naphthochinon ,16 Durochinon ,2 Phenazin Methosulfat +85 9,0 306,3 Phenazin Ethosulfat +65 9,0 334,4 2-Hydroxy-Naphthochinon ,2 174,16 1 Standardwasserstoffelektrode 106

119 Materialien und Methoden B.2.7. Bestimmung des Ubichinongehalts in der Membran aus Roseobacter denitrificans Der Ubichinongehalt in der Membran aus Roseobacter denitrificans wurde durch vollständige Extraktion und Reverse-phase HPLC Analyse mit einer ODS-Säule bestimmt [163]. Die Membranen wurden in 50 mm Mops / 100 mm KCl-Puffer (ph = 7) resuspendiert und dreimal mit einem Methanol/Petrolether-Gemisch im Verhältnis 6 : 4 extrahiert. Die drei Extrakte wurden vereint und die Etherphase wurde eingedampft. Die so erhaltenen eingetrockneten Proben wurden in Ethanol (HPLC grade) gelöst. Zur Analyse wurde die Elution auf einer HPLC-Säule bei 275 nm verfolgt. Die mobile Phase enthielt 96% Ethanol und 4% H 2 O. Es wurde eine Eichung mit reinem Ubichinon in verschiedenen Konzentrationen erstellt. Durch Vergleich der Chromatogramme der zu untersuchenden Extrakte mit denen der reinen Ubichinon- Proben konnte Ubichinon klar von anderen Komponenten im Extrakt unterschieden werden. Die integrierten Banden vom Elutionsprofil des reinen Ubichinons sind proportional zur Konzentration an Ubichinon in der Probe im Bereich zwischen 0 und 240 pmol. Es wurde eine Eichkurve erstellt, die zur Bestimmung der Konzentration an Ubichinon in den Extrakten verwendet wurde. 107

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121 Ergebnisse C. Ergebnisse C.1. Anzucht von Roseobacter denitrificans Die Anzucht von Roseobacter denitrificans erfolgte standardmäßig in einer statischen Kultur in einem 28 l-fermenter bzw. in einem 200 l-fermenter nach einer modifizierten Vorschrift von Y. Shioi [144], wie in Kapitel B.2.1. beschrieben. Das Kulturmedium wurde leicht verändert. Die Zusammensetzung der Salze wurde vereinfacht. Es wurden andere organische Substrate verwendet, und vor allem wurden neben dem Vitamine-Cocktail auch ein Spurenelemente-Cocktail zugegeben (vgl. Kapitel B.2.1.). Die Belüftung der Kultur im Fermenter wurde durch die Luftzufuhr über eine Pressluftpumpe und die Rührergeschwindigkeit eingestellt. Die Anzucht wurde bei 30 C durchgeführt. Das Ziel war, eine möglichst hohe Ausbeute an Zellen zu erhalten, die einen hohen Anteil an Bacteriochlorophyll in der Membran aufweisen sollten, wenig Carotinoide bilden und bei denen das Mengenverhältnis RC/LH I : LH II zu Gunsten der Reaktionszentren verschoben sein sollte. Eine erhöhte Luftzufuhr begünstigt das Wachstum (nach T. Shiba [164] erhält man bei 55% O 2 die optimale Wachstumsrate), kann aber auch zur vermehrten Bildung von Lipopolysacchariden auf der äußeren Membran führen, die den Aufschluss der Zellen in der French-Press und das Gewinnen von Membranen (siehe Kapitel B.2.2. bzw. B.2.3.) erschwert bzw. verhindert [165]. Daher wurde in der Anfangsphase eine geringere Luftzufuhr und Rührergeschwindigkeit verwendet (ca. 70% O 2 und 200 bis 250 rpm Rührergeschwindigkeit im 28 l-fermenter; ca. 40 l/min Luftzufuhr und 150 bis 200 rpm Rührergeschwindigkeit im 200 l-fermenter), die während der exponentiellen Wachstumsphase erhöht wurde, um das Zellwachstum zu begünstigen (85% O 2 und 300 rpm Rührergeschwindigkeit im 28 l-fermenter; 80 l/min Luftzufuhr und 250 rpm Rührergeschwindigkeit im 200 l-fermenter). Es wurde versucht, durch Variierung der Luftzufuhr und der Rührergeschwindigkeit das Verhältnis von BCHl : Carotinoide (1:10) zu verbessern, um die Isolierung des Reaktionszentrums aus den Zellen zu erleichtern. Es konnte aber kein Effekt nachgewiesen werden. Auch das Verhältnis von RC-LH I-Komplex zu LH II konnte nicht verbessert werden. Die Bildung von LH II kann durch Licht inhibiert werden 109

122 Ergebnisse [166]; dies war aber bei den verwendeten Fermentern nicht durchzuführen. Ein weiteres Problem für den Zellaufschluss könnten Einlagerungen von Polysacchariden, Polyhydroxyalkanoaten und Polyphosphaten in die Zelle darstellen, die bei bestimmten Wachstumsbedingungen stattfinden können [109]. Ein ungünstiges Verhältnis von C und N im Nährmedium könnte sich negativ auswirken, allerdings ist über die genaue Ursache und Bedingungen für solche Einlagerungen nichts bekannt. Es wurde mit einer kleinen Menge an Bakterienzellen angeimpft (insbesondere beim großen Fermenter mit 200 l Arbeitsvolumen), was zwar eine längere lag-phase bedingte, wodurch aber ein stärkeres Wachstum der Zellen und eine bessere Bildung von Bacteriochlorophyll (gemessen anhand der charakteristischen Absorptionsmaxima im Spektrum bei 810 nm (RC-LH I) und 870 nm (LH II)) erreicht werden konnte. Das Wachstum der Zellen im 28 l-fermenter wurde durch die Messung der Zunahme der Trübung der Zellsuspension mittels der optischen Dichte bei 660 nm, das Wachstum der Zellen im 200 l-fermeter analog durch die Messung der optischen Dichte bei 578 nm verfolgt. Nach dem Animpfen betrug die optische Dichte im 28 l-fermenter OD 660 0,05 bis 0,1 und im 200 l-fermenter OD 578 0,005 bis 0,01. Standardmäßig wurde eine Wachstumskurve aufgenommen, indem die Absorption als Maß der Zellmenge gegen die Zeit aufgetragen wurde, um den geeigneten Zeitpunkt für das Ernten der Zellen zu ermitteln. Die Wachstumskurve hat eine sigmoidale Gestalt, bei der verschiedene Wachstumsphasen unterschieden werden: - lag-phase: Sie umfasst das Zeitintervall zwischen dem Impfen und Erreichen der maximalen Teilungsphase. Ihre Länge ist abhängig von der Menge und Konzentration der zum Impfen verwendeten Vorkultur sowie von den Bakterienund Nährmedium-Eigenschaften. - log-phase: Sie wird durch eine konstante minimale Generationszeit charakterisiert, die von der Bakterienart abhängt. - stationäre Phase: In dieser Phase hört das Zellenwachstum auf. - letale Phase: Hier beginnen die Zellen abzusterben. 110

123 Ergebnisse In den Abbildungen C.1.1 und C.1.2 sind die Wachstumskurven der Anzucht von Roseobacter denitrificans im 28 l-fermenter bzw. im 200 l-fermenter dargestellt. 1,5 Absorption, A 660 1,0 0,5 0, Zeit (h) Abbildung C.1.1: Wachstumskurve der Anzucht von Roseobacter denitrificans Bakterien im 28 l-fermenter. Bei dieser Anzucht wurde bei einer OD 660 1,7 abgeerntet. 4 3 Absorption, A Zeit (h) Abbildung C.1.2: Wachstumskurve der Anzucht von Roseobacter denitrificans Bakterien im 200 l-fermenter. Man beachte die relativ lange lag-phase von ca. 15 h. Es wurde bei einer OD 578 3,0 abgeerntet. 111

124 Ergebnisse Die Fermentation wurde am Ende der log-phase abgebrochen, um die Zellen mit einer Durchflusszentrifuge abzuernten. Um das Absterben und andere Veränderungen der Zellen, die das Verarbeiten der Zellen beeinträchtigen könnten, in dieser Zeit zu verhindern, wurde die Kultur sofort auf 10 C abgekühlt. Die geernteten Zellen wurden anschließend bei -80 C eingefroren. Die Ausbeute im 28 l-fermenter nach ca. 17 bis 20 h Laufzeit betrug 3,5 bis 4,0 g/l Medium (Nassgewicht); die Ausbeute im 200 l-fermenter nach ca. 30 h Laufzeit betrug ca. 3,5 g/l Medium (Nassgewicht). In Tabelle C.1.1 sind die im Text beschriebenen Daten zu der Anzucht im Fermenter zusammengefasst. Tabelle C.1.1: Zusammenfassung der Bedingungen und Ergebnisse für die Anzucht von Roseobacter denitrificans im 28 l-fermenter und im 200 l-fermenter (siehe auch Text). 28 l-fermenter 200 l-fermenter OD 660 beim Animpfen 0,05-0,1 - OD 578 beim Animpfen - 0,005-0,01 T ( C) O 2 während der lag-phase (%) 70 - Luftzufuhr während der lag-phase - 40 (l/min) O 2 während der log-phase (%) 85 - Luftzufuhr während der log-phase - 80 (l/min) Laufzeit (h) Länge der lag-phase (h) OD 660 beim Ernten der Zellen 1,8-2,3 - OD 578 beim Ernten der Zellen - 2,5-3,0 Ausbeute (g Nassgewicht/ l Medium) 3,5-4,0 3,0-3,5 112

125 Ergebnisse C.2. Untersuchungen an isolierten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans C.2.1. Isolation der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans Grundsätzlich umfasst die Isolation eines Membranproteins folgende Schritte: - Aufbrechen der Zellen; - Gewinnung von Membranvesikel bzw. Chromatophoren oder von Membranfragmenten; - Solubilisierung der Membranproteine mit einem geeigneten Detergens; - Abtrennung des gewünschten Membranproteins. Bei der Isolation von Reaktionszentren aus Purpurbakterien werden u.a. modifizierte Vorschriften nach der Methode von G. Feher und M.Y. Okamura für Rhodobacter sphaeroides [167] verwendet. Bei dieser Methode werden nach dem Zellaufschluss die gewonnenen Chromatophoren mit LDAO zur Solubilisierung der Membranproteine behandelt und die Reaktionszentren mittels Anionenaustausch- Chromatographie von den restlichen Proteinen abgetrennt. Dieses Präparationsschema kann im Prinzip auch bei der Isolation der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans angewendet werden [128]. Es beinhaltet im wesentlichen folgende Schritte: - Aufbrechen der Zellen mit einer French Press; - Gewinnung der Chromatophoren durch fraktionierende Zentrifugation; - Vorsolubilisierung und Solubilisierung der Membranproteine mit LDAO; - Abtrennung der Reaktionszentren über eine DEAE-Sephacel- Anionenaustausch-Säule durch Elution mit NaCl. Daneben wird in der Literatur ein anderes Verfahren beschrieben, was auf einer Dichtegradientenzentrifugation beruht. Dieses Verfahren wurde bereits sehr erfolgreich zur Reinigung der H + -ATPase aus Spinat-Chloroplasten (CF 0 F 1 ) [168] und aus Escherichia coli (EF 0 F 1 ) [169] verwendet. Auch bei der Isolation von 113

126 Ergebnisse Lichtsammelkomplexen aus photosynthetischen Bakterien [170] fand die Methode mit den folgenden Schritten Anwendung: - Aufbrechen der Zellen mit einer French Press; - Gewinnung von Membranvesikel durch Ultrazentrifugation; - Abtrennung der Cytoplasmamembran durch Dichtegradientenzentrifugation; - Solubilisierung der Membranproteine mit LDAO; - Abtrennung von LH I und LH II durch Dichtegradientenzentrifugation; - Weitere Aufreinigung von LH I und LH II durch Anionenaustausch- Chromatographie. Ziel der Arbeit war funktionale Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans in möglichst hoher Ausbeute mit allen Untereinheiten (H, M, L und C; siehe Kapitel A.4.4.) und Cofaktoren zu erhalten. Die Funktionalität der Reaktionszentren wurde über die Ladungsrekombination vom primären Akzeptor Q A bzw. vom sekundären Akzeptor Q B zum primären Donator P nachgewiesen. C Isolation der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach der Vorschrift von K. Takamiya Zunächst wurden die Reaktionszentren nach der Vorschrift von K. Takamiya et al. [128, 131, 146, 147] isoliert und aufgereinigt. Die Isolationsvorschrift ist in Kapitel B beschrieben, die verwendeten Lösungen in Kapitel B Bei allen Präparationen wurden die Zellen zunächst mittels einer French Press aufgebrochen (siehe Kapitel B.2.2.). Da bei einigen Präparationen nach dem Zellaufschluss im SDS-Gel keine Proteinbanden mehr erkennbar waren, schloss man daraus, dass beim Zellaufschluss Proteasen freigesetzt wurden, die die Proteine zerstören. In den folgenden Präparationen wurde dies behoben, indem beim Zellaufschluss das Protease-Inhibitoren-Cocktail Complete (Boehringer) und 1 mm EDTA zugegeben wurde. 114

127 Ergebnisse Bei einigen Präparationen ließen sich die Zellen nicht aufschließen und oft war die Ausbeute an gewonnenen Membranen nach dem Zellaufschluss sehr gering. Daher wurde der Zellaufschluss einer Zellsuspension mit der French Press bis zu 5x hintereinander mit dem maximalen Druck (27000 psi) wiederholt. Alternativ wurde die Zellsuspension mit Ultraschall behandelt, um die Zellen aufzuschließen. Keine dieser Methoden verbesserte den Zellaufschluss. Bei diesen Untersuchungen wurde aber festgestellt, dass die Zellsuspension sich im Laufe der Zeit verändert (obwohl die Präparationsschritte bei 4 C durchgeführt wurden) und zu einer leicht zähflüssigen und schäumenden Suspension wurde, die sich dann nicht mehr aufschließen ließ. Um dies zu vermeiden, wurden die Zellen in den folgenden Präparationen im Kühlschrank bei 4 C über Nacht aufgetaut, in 4 C kalten Puffer resuspendiert, homogenisiert und gewaschen sowie danach sofort und zügig in der vorgekühlten French Press mit einem Durchgang bei psi aufgebrochen und die Membranen durch Zentrifugation bei 4 C gewonnen. Dennoch konnten bei einigen Präparationen die Zellen nicht oder nicht vollständig aufgeschlossen werden, was auf ein unterschiedliches Wachstum der Zellen zurückgeführt wurde (siehe Kapitel C.1.). Im Folgenden soll der Verlauf und das Ergebnis der Isolation und Reinigung von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach der Vorschrift von K. Takamiya et al. [128] beschrieben werden. Abweichend zur Vorschrift wie in Kapitel B beschrieben wurde mit 0,4% LDAO solubilisiert, da die Bacteriochlorophyllkonzentration in der Membransuspension nach dem Zellaufschluss nur 0,16 mm (anstatt 0,2 mm) betrug. Es wurden zwei Anionenaustausch-Reinigungsschritte durchgeführt und dabei 15 ODV bzw. 5 mg Reaktionszentren aus ca. 65 g Zellen von Roseobacter denitrificans gewonnen. Abbildung C zeigt die UV-VIS-Absorptionsspektren der Zellen von Roseobacter denitrificans zwischen 660 und 900 nm vor Beginn der Präparation und im Verlauf der Isolation der Reaktionszentren beginnend mit der Abtrennung der Membranen vom Cytoplasma und größeren Membranen zwischen 700 und 900 nm bzw. zwischen 300 und 900 nm. Im Spektrum der Zellen erkennt man die charakteristischen Absorptionsbanden des LH II bei 806 nm und des LH I-RC- Komplexes bei 870 nm, die auch nach Isolation der Membranen erhalten bleiben. Im Spektrum der Membranen wird lediglich die Trübung der Probe stark reduziert. Nach der Solubilisierung mit 0,4% LDAO ändert sich das Spektrum deutlich. Jetzt sind 115

128 Ergebnisse Absorptionsbanden von an Protein gebundenem Bacteriochlorophyll im Bereich zwischen 700 und 900 nm zu erkennen, die sowohl von Reaktionszentren als auch von LH I und LH II herrühren. Das Spektrum zwischen 300 und 600 nm ändert sich ebenfalls im Vergleich zum Spektrum von Membranen (siehe Kapitel C.2.2.). Nach der 1. Anionenaustausch-Säule entspricht das Spektrum schon weitgehend dem typischen Spektrum isolierter Reaktionszentren (vgl. Abbildung B ), lediglich die Amplituden der Banden, insbesondere die Amplituden der Banden bei 750, 802 und 860 nm, stehen noch nicht im richtigen Verhältnis zueinander, was auf noch vorhandene Verunreinigungen hindeutet. Das Spektrum nach weiterer Reinigung durch eine 2. Anionenaustausch-Säule entspricht dem Spektrum gereinigter Reaktionszentren (vgl. Abbildung B ). 116

129 Ergebnisse Absorption 1,90 1,85 1,80 1,75 1,70 A Zellen Wellenlänge (nm) Absorption 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 Membranen B Wellenlänge (nm) Absorption 0,6 0,4 0,2 Solubilisierung mit 0,4% LDAO C Absorption 0, ,4 0,3 0,2 0,1 Wellenlänge (nm) 1. DEAE-Säulen- Chromatographie D 0, Wellenlänge (nm) Absorption 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 gereinigte Reaktionszentren E 0, Wellenlänge (nm) Abbildung C : Verlauf der Isolation von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach K. Takamiya. (A) Zellsuspension, (B) nach Isolation der Membranen, (C) nach Solubilisierung mit 0,4% LDAO (D) nach der Isolation von Reaktionszentren und Aufreinigung mit einer Anionenaustausch-Säule und (E) die gereinigten Reaktionszentren nach der zweiten Anionenaustausch-Säule. 117

130 Ergebnisse Abbildung C zeigt das SDS-Gel der isolierten Reaktionszentren. Die Proben wurden vorbereitet wie in Kapitel B beschrieben. Im SDS-Gel sind die Untereinheiten M, L und die Cytochrom c-untereinheit des Reaktionszentrums zu erkennen, während die H-Untereinheit fehlt. Die isolierten Reaktionszentren zeigen auch keinerlei Rekombinationskinetik (vgl. Kapitel B ). Mit dieser Methode konnten also keine aktiven Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans erhalten werden, da die H-Untereinheit während der Präparation abdissoziierte und möglicherweise weitere Schädigungen des Reaktionszentrums auftraten. Cyt M L H M L RC I RC II RC III Ref sphe Abbildung C : SDS-Gel von isolierten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach der Vorschrift von K. Takamiya [128].. RC I, RC II und RC III sind verschiedene gesammelte Fraktionen an Reaktionszentren aus einer Präparation. Ref ist der Proteinstandard mit den angegebenen Molmassen und sphe sind aufgereinigte Reaktionszentren aus Rhodobacter sphaeroides. Weitere Erläuterungen im Text. 118

131 Ergebnisse C Isolation der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans durch Dichtegradientenfraktionierung Als Nächstes wurde in Zusammenarbeit mit N. Gad on, Arbeitskreis Prof. Dr. G. Fuchs, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Institut für Biologie, Mikrobiologie die Methode der Dichtegradientenfraktionierung getestet, um reine intakte Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans zu isolieren. Die verwendete Vorschrift ist in Kapitel B beschrieben, die Lösungen in Kapitel B Diese Methode lieferte sehr reine und stabile Reaktionszentren. Dennoch musste diese Methode verworfen werden, da sie nur kleine Mengen verarbeiten kann. Für die Präparation von Reaktionszentren aus 100 g Zellen sind 10 und mehr Dichtegradientenzentrifugationen nötig, denn die Ausbeute an Reaktionszentren ist eher gering (ca ODV bzw. 3-5 mg Reaktionszentren aus 100 g Zellen), was möglicherweise auch auf Verluste bei der Entnahme der gewünschten Fraktion aus dem Dichtegradienten zurückzuführen ist. Auf eine weitere spektroskopische Charakterisierung wurde aus diesen Gründen verzichtet. C Isolation der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach der modifizierten Vorschrift von K. Takamiya Wie in Kapitel C beschrieben, konnten nach der Vorschrift von K. Takamiya et al. [128] keine intakten und aktiven Reaktionszentren isoliert werden. Daher wurde diese Vorschrift wie im Folgenden dargestellt modifiziert. Solubilisierung der Membranproteine mit LDAO Die Solubilisierung der Membranproteine mit LDAO wurde untersucht, um die Ausbeute an Reaktionszentren zu erhöhen. Dazu wurde die Konzentration an zugegebenem Detergens variiert (Abbildung C ). Die Vorsolubilisierung nach K. Takamiya et al. [128], die die Membranstruktur aufweiten soll, um die Effektivität der darauffolgenden Solubilisierung zu erhöhen, wurde beibehalten. Hierzu wurden die Membranen mit einer Bacteriochlorophyll-Konzentration von 0,2 mm (ca

132 Ergebnisse mg/ml Gesamtprotein) eingesetzt. Es zeigte sich, dass Konzentrationen von LDAO > 1% insbesondere die Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans zerstörten, eine Konzentration von LDAO < 0,4% jedoch kein Protein zu lösen vermochte. Die Bestimmung der benötigten LDAO Konzentration im Vorfeld durch Titration kleiner Proben der verwendeten Membranen-Suspension mit 0,4 bis 0,5% LDAO und Ultrazentrifugation mit einer Airfuge (die Methode ist im Detail bei R. Schmid beschrieben [155]) verbessert die Ausbeute an Reaktionszentren nur geringfügig (von ca. 35 auf ca. 50 ODV bzw. von 10 mg auf 15 mg Reaktionszentren aus ca. 100 g Zellen pro Präparation). Dennoch kann sich unter Umständen der dazu erforderliche Arbeitsaufwand lohnen, da ohnehin nur eine geringe Ausbeute an Reaktionszentren erwartet werden kann, wenn man voraussetzt, dass in Zellen von Roseobacter denitrificans selbst unter optimalen Wachstumsbedingungen im Vergleich zu Rhodobacter sphaeroides (aus 100 g Zellen werden ca. 120 mg bzw. 420 ODV Reaktionszentren gewonnen; [171]) nur etwa 1/10 Reaktionszentren gebildet werden [172]. 120

133 Ergebnisse Absorption Absorption Absorption Absorption Absorption 0,05 0,00 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0,5 0,0 1,0 0,5 0,0 1,0 0,5 0,40% LDAO Wellenlänge (nm) 0,50% LDAO Wellenlänge (nm) 0,55% LDAO Wellenlänge (nm) 0,70% LDAO Wellenlänge (nm) 0,95% LDAO 0, Wellenlänge (nm) Abbildung C : Solubilisierung mit unterschiedlichen Konzentrationen an LDAO. Ab einer Konzentration von 0,55% LDAO ändert sich das Spektrum deutlich. Die typischen Absorptionsbanden für das Membranen-Spektrum verschwinden, und es treten die typischen Banden für die aus den Membranen herausgelösten Proteinkomplexe auf (siehe Kapitel B ). Bei höheren LDAO-Konzentrationen werden mehr Proteine herausgelöst. Im weiteren Verlauf der Präparation stellte sich jedoch heraus, dass durch eine höhere LDAO- Konzentration die H-Untereinheit vom Reaktionszentrum abgelöst wird und vermutlich weitere Schädigungen (Aufweitung der Bindungstasche) erfolgen, so dass keine Rekombinationskinetik zu beobachten war (siehe Kapitel C.2.2.). Die optimale Konzentration an LDAO betrug in diesem Fall 0,50%. Die geringste Konzentration, bei der sich die Proteinkomplexe aus der Membran herauslösen ließen, war 0,55% LDAO. Bei Verwendung eines Vorsolubilisierungsschrittes (siehe Text bzw. vgl. Kapitel B und B ) wurde dann die niedrigere Konzentration an LDAO verwendet. 121

134 Ergebnisse Abtrennung der Reaktionszentren von den restlichen Membranproteinen Die Abtrennung der Reaktionszentren von den anderen Membranproteinen mittels Anionenaustausch-Chromatographie wurde mehrfach untersucht und variiert. Als Säulenmaterial wurde DEAE Toyopearl Chromatographic Resin 650M eingesetzt, das in der Arbeitsgruppe bei der Isolation der Reaktionszentren aus Rhodobacter sphaeroides verwendet wurde und von den getesteten Säulenmaterialien die beste Aufreinigung der Reaktionszentren zeigte [171]. Die Elution der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans erfolgte mit einem NaCl-Stufen-Gradienten (0,1-0,5 M NaCl). Die Reaktionszentren wurden bei der DEAE-Toyopearl-Säule bei 0,28 M NaCl eluiert (bei der DEAE-Sephacel-Säule in der Vorschrift von K. Takamiya bei 0,35 M NaCl; [128]). Gegebenenfalls wurde eine zweite Aufreinigung mit der DEAE- Toyopearl-Säule angeschlossen, um die Reinheit der erhaltenen Reaktionszentren zu verbessern. Trotz des Detergenswechsel von LDAO zu Triton X-100 (milderes Detergens) bei der Aufreinigung der Reaktionszentren [128] wurde festgestellt, dass die erhaltenen Reaktionszentren instabil waren und bei Lagerung in Puffer mit 0,1 % Triton [128] bei 4 C innerhalb einiger Stunden bzw. beim Einfrieren und wieder Auftauen zerstört wurden. Dies zeigte sich durch Änderungen im UV-VIS-Spektrum der Reaktionszentren. Insbesondere ging die Absorptionsbande des Bacteriochlorophylldimers (primärer Donator P) bei 860 nm zurück oder verschwand ganz (Abbildung C ). Weiterhin konnte an solchen Reaktionszentren-Proben keine Aktivität in Form einer blitzinduzierten Ladungsrekombination nachgewiesen werden. Die Zerstörung der Reaktionszentren nach der Isolation wurde auf die aggressive Wirkung der verwendeten Detergentien (LDAO und Triton X-100) in hoher Konzentration zurückgeführt. Zudem wurde vermutet, dass auch die erhöhte NaCl- Konzentration die Reaktionszentren destabilisieren könnte. Die gleiche Wirkung hatte offensichtlich auch die Kristallisation des H 2 O beim Einfrieren der Reaktionszentren- Proben. 122

135 Ergebnisse 0.1 nach dem Auftauen Absorption Wellenlänge (nm) Abbildung C : Absorptionsspektrum von gereinigten Reaktionszentren nach dem Auftauen. Die Reaktionszentren wurden zur Lagerung mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und dann bei -80 C gelagert. Die Bacteriochlorophylldimer-Bande bei 860 nm ist fast vollständig verschwunden, die Reaktionszentren sind inaktiv. Diese Instabilität der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans gegen Detergentien, Salzen und Einfrieren ist ungewöhnlich groß, wenn man sie z.b. mit den Reaktionszentren aus Rhodobacter sphaeroides vergleicht, die ohne weiteres in 0,025% LDAO bei -80 C gelagert werden können. Um die Zerstörung der Reaktionszentren zu vermeiden, wurden folgende Maßnahmen getroffen: Die Reaktionszentren-Proben wurden nach der Anionenaustausch-Säule sofort entsalzt, bevor sie weiterverarbeitet wurden (weitere Aufreinigung, Aufkonzentrierung oder Lagerung). Die Reaktionszentren-Proben wurden nach Zugabe von 20% Glycerin bei -20 C gelagert, so dass das H 2 O nicht kristallisierte. 123

136 Ergebnisse Es wurden verschiedene Methoden getestet, um die Konzentration an Detergens zu erniedrigen. Insbesondere wurde versucht, die LDAO-Konzentration nach der Solubilisierung der Membranproteine möglichst rasch zu verringern, da dieses Detergens (ionisches Detergens) wesentlich aggressiver ist als Triton X-100 (nichtionisches Detergens) und eine Mischmizellen-Bildung nach dem Detergenswechsel bei der Aufreinigung wahrscheinlich ist. Zunächst wurde versucht, das LDAO nach der Solubilisierung durch Behandlung mit Biobeads, die Detergensmoleküle binden können, zu entfernen. Die LDAO-Konzentration konnte dadurch nur geringfügig verringert werden. Diese Methode konnte bei den verwendeten großen Volumina (>100 ml) die große Menge an Detergensmolekülen (ca. 0,5% LDAO) nicht bewältigen. Es wurde versucht, die Detergensmoleküle durch Dialyse bei 4 C gegen einen Puffer, der kein Detergens enthielt, zu entfernen (diese Methode wird bei Rhodobacter sphaeroides angewendet [155]). Diese Methode ist aber nicht schnell genug, und die Reaktionszentren wurden während der Dialyse zerstört. Als weitere Methode zur Abtrennung von überschüssigem Detergens (LDAO) wurde die Gelfiltration untersucht. Ausgehend von der Vorschrift nach K. Takamiya et al. [128] wurde nach der Solubilisierung der Proteine mit LDAO und vor der Anionenaustausch-Chromatographie der Detergensaustausch zum weniger aggressiven Triton X-100 mittels Gelfiltration durchgeführt. Hierzu musste das Probenvolumen nach der Solubilisierung mittels Ammoniumsulfat-Fällung, wie in Kapitel B beschrieben, auf ca. ¼ (ca. 20 ml) des Ausgangsvolumen reduziert werden. Schon während dieses Schrittes wurde das Detergens gewechselt. Dann wurde die Probe in ca. 4-5 Proben zu jeweils 5 ml aufgeteilt, die jeweils auf eine Superdex 200 Gelfiltrationssäule aufgetragen und wie in Kapitel B beschrieben eluiert wurden. Die einzelnen Proben aus den Gelfiltrationen wurden bei -20 C gelagert, für die Anionenaustausch-Chromatographie wieder zusammengegeben und wie in Kapitel B beschrieben 124

137 Ergebnisse weiterverarbeitet. Diese Methode war von den untersuchten am zufriedenstellendsten, obwohl auch sie einen Zeitaufwand von mehreren Tagen bedeutete (siehe auch Kapitel C.2.2.). Nach der Anionenaustausch-Chromatographie wurde die Triton X-100 Konzentration in den Puffern beim Entsalzen und Aufkonzentrieren der Reaktionszentren-Proben auf 0,025 % verringert. Die Konzentrierung der Reaktionszentren-Proben geschah mit einer Amicon- Rührzelle über eine YM 100-Membran, die Moleküle mit einer Molmasse von 100 KDa durchlässt und Moleküle, die größer sind, zurückhält. Auf diese Weise sollten die reaktionszentrenfreien Detergensmizellen (90000 Da nach Herstellerangaben der Firma Roth, Karlsruhe) die Lösung verlassen können, während das Reaktionszentrum ( Da) zurückgehalten wird. Dies verhindert eine Aufkonzentrierung des Detergens, was die isolierten Reaktionszentren zerstören würde. Weiterhin wurde untersucht, inwieweit sich die Ammoniumsulfat-Fällung zur Abtrennung von Proteinverunreinigungen eignet. Hierzu wurde neben der einfachen 50%igen Ammoniumsulfat-Fällung eine fraktionierende Ammoniumsulfat-Fällung in drei Schritten getestet. Beide Methoden sind in Kapitel B beschrieben. Für die fraktionierende Ammoniumsulfat-Fällung wurde zunächst eine Fällung und darauffolgende Waschung mit 50% Ammoniumsulfat-Sättigung in der Lösung durchgeführt. Dieser Schritt bewirkte hauptsächlich die Abtrennung von einem Teil der LH II Komplexe. Anschließend wurde der Niederschlag wieder in Puffer aufgenommen und mit 35% Ammoniumsulfat gefällt. Dabei blieben die Reaktionszentren in Lösung, während andere Proteinverunreinigungen gefällt wurden. Anschließend wurde der Überstand, der die Reaktionszentren enthielt, mit 65% Ammoniumsulfat versetzt und so das gesamte übriggebliebene Protein gefällt, das wieder in Puffer aufgenommen und mittels Gelfiltration wie in Kapitel B beschrieben weiterverarbeitet wurde. Die so erhaltene Vorreinigung der Reaktionszentren ging einher mit nicht vernachlässigbaren Proteinverlusten, da insbesondere bei der 35%-Fällung ein erheblicher Teil der Reaktionszentren mitgefällt wurde und damit für die Präparation verloren ging. Die Ausbeute an 125

138 Ergebnisse Reaktionszentren mit der fraktionierenden Ammoniumsulfat-Fällung betrug 21 ODV bzw. 7 mg, während mit der 50%igen Ammoniumsulfat-Fällung 45 ODV bzw. 15 mg Reaktionszentren erhalten wurden. Daher wurde die fraktionierende Ammoniumsulfat-Fällung durch eine einfache 50%-Fällung ersetzt, die in jedem Fall einen Teil der LH II Komplexe aus der Proteinlösung abtrennen konnte. Gleichzeitig wurde dadurch der benötigte Zeitaufwand reduziert, was ein wichtiger Faktor bei der Erhaltung der Aktivität der Reaktionszentren während der Aufreinigung ist. Die Ergebnisse der Präparation mit fraktionierender Ammoniumsulfat-Fällung sowie der Präparation mit 50%iger Ammoniumsulfat-Fällung sind in Kapitel C.2.2. beschrieben. 126

139 Ergebnisse C.2.2. Isolation und Reinigung von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach Optimierung der Präparationsvorschrift In diesem Kapitel werden die Ergebnisse der Isolation und Aufreinigung von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach Optimierung der Vorschrift wie in Kapitel B und C beschrieben dargestellt. Die verwendeten Lösungen sind in Kapitel B beschrieben. Zur Dokumentation der Isolationsprozedur wurden am Ende bestimmter Präparationsschritte Proben entnommen, um den Bacteriochlorophyll- bzw. Proteingehalt zu bestimmen, die Absorptionsspektren aufzunehmen, ein SDS-Gel der Proteine zu machen und/oder die Ladungsrekombination zu messen (siehe Kapitel B.2.4. und B.2.5.). Für die im folgenden beschriebene Präparation von Reaktionszentren wurden 75 g Zellen von Roseobacter denitrificans eingesetzt. Es wurde mit 0,5% LDAO solubilisiert und eine fraktionierende Ammoniumsulfat-Fällung durchgeführt. In Abbildung C ist die Proteinmenge im Verlauf der Isolation dargestellt. Die Angaben beziehen sich auf eine Ausgangszellmasse von 75 g (Nassgewicht) mg 4800 mg 2250 mg 1630 mg 149 mg 98 mg 10 mg Zellsuspension aufgeschlossene Zellen Membranen solubilisierte Proteine Ammoniumsulfat-Fällung nach der Gelfiltration isolierte Reaktionszentren Abbildung C.2.2.1: Verlauf der Proteinmenge während der Isolation und Reinigung von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans. Die Ausgangszellmasse betrug 75 g (Nassgewicht). Die Präparationsschritte sind in Kapitel B detailliert beschrieben. 127

140 Ergebnisse Betrachtet man den Verlauf der Proteinmenge, ist zu Beginn ein starker Verlust durch den Zellaufschluss und die Abtrennung der Membranen zu erkennen. Weitere Verluste treten vor allem nach der fraktionierenden Ammoniumsulfat-Fällung und nach Abtrennung der Reaktionszentren durch Anionenaustausch-Chromatographie auf. Abbildung C zeigt die UV-VIS-Absorptionsspektren zwischen 300 und 900 nm im Verlauf der Isolation beginnend mit der Abtrennung der photosynthetischen Membranen vom Cytoplasma und größeren Membranen. Im Spektrum der Membranen sind deutlich die beiden Maxima der Absorption de LH II- (Lichtsammelkomplex II) und RC-LH I-Komplexe (Reaktionszentrum- Lichtsammelkomplex I-Kernkomplex) bei 806 und 870 nm zu erkennen. Die Reaktionszentren sind noch in die Membran eingebettet und bilden einen Komplex mit dem Lichtsammelkomplex LH I aus. Nach der Solubilisierung mit 0,5% LDAO ändert sich das Spektrum deutlich. Jetzt sind Absorptionsbanden von an Protein gebundenem Bacteriochlorophyll im Bereich zwischen 700 und 900 nm zu erkennen, die sowohl von Reaktionszentren als auch von LH I und LH II herrühren. Das Spektrum zwischen 300 und 600 nm ändert sich ebenfalls im Vergleich zum Spektrum der Membranen. Bei 590 und 370 nm erkennt man wiederum die Bacteriochlorophyllbanden. Die breite Bande um die 500 nm entspricht der Absorption von Carotinoiden. Andere Banden, wie z.b. die von Cytochromen (siehe Abbildung B.2.5.1), werden hingegen (fast) vollständig überlagert. In den folgenden Präparationsschritten der Ammoniumsulfat-Fällung und der Gelfiltration ändern sich die Spektren nur wenig. Es werden immer mehr neue Banden bzw. Schultern sichtbar, wie z.b. zwischen 400 und 420 nm die Soret-Bande der Cytochrome oder bei 860 nm die Bande des Bacteriochlorophylldimers des Reaktionszentrums (Abbildung C.2.2.2D). In diesen Präparationsschritten werden nach und nach die Antennenkomplexe und die Carotinoide abgetrennt. Abbildung C.2.2.2E zeigt das Spektrum der isolierten Reaktionszentren nach dem Entsalzen. Aufgrund der relativ kleinen Ausbeute wurde die Probe nicht aufkonzentriert. Dieses Spektrum zeigt alle charakteristischen Banden des Reaktionszentrum aus Roseobacter denitrificans (vgl. Abbildung B ). Das Verhältnis der Amplituden der Banden A 750 nm : A 802 nm : A 860 nm = 1 : 2,5 : 1 ist etwas größer als in isolierten Reaktionszentren aus Rhodobacter sphaeroides (A 760 nm : A 802 nm : A 865 nm = 1 : 2,2 : 1; [167]) und deutet 128

141 Ergebnisse daraufhin, dass die Antennenkomplexe nicht restlos von den Reaktionszentren abgetrennt werden konnten. Dies könnte auf die besondere Stabilität des RC-LH I- Komplex zurückzuführen sein. Ein ähnliches Verhältnis der Amplituden findet sich auch bei K. Takamiya et al. [128]. 129

142 Ergebnisse Absorption Absorption Absorption Absorption Absorption Absorption Absorption Absorption Absorption Absorption 0, 2 0, 1 0, 0 0, 6 0, 4 0, , , 0 0, 5 0, 3 0, 2 0, 1 0, 0 1,0 0,5 Membranen Wellenlänge (nm) Solubilisierung Wellenlänge (nm) fraktionierende Ammoniumsulfat- Fällung Wellenlänge (nm) Gelfiltration Wellenlänge (nm) Anionenaustausch- Chromatographie D A B C E 0, Wellenlänge (nm) Abbildung C.2.2.2: Verlauf der Isolation und Reinigung von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans. Beschreibung im Text. 130

143 Ergebnisse Abbildung C zeigt das SDS-Gel der isolierten Reaktionszentren. Die Proben wurden vorbereitet wie in Kapitel B beschrieben. Es sind deutlich die vier Banden der vier Untereinheiten des Reaktionszentrums zu erkennen: die Cytochrom c-untereinheit bei ca Da, die M-Untereinheit bei Da, die H-Untereinheit bei Da und die L-Untereinheit bei Da. Diese Zuordnung der Banden wurde durch N-terminale Sequenzierung der vier Proteine bestätigt [173]. Die dunklere Färbung der Banden des Cytochroms und der H-Untereinheit lässt sich wahrscheinlich auf die höhere Polarität dieser aus der Membran ins Cytoplasma bzw. Periplasma ragenden Proteine, die eine stärkere Anfärbung durch den Farbstoff Coomassie brilliant blue ermöglicht, zurückführen. Die weiteren Banden, die insbesondere bei höheren Molmassen auftreten, könnten auf Komplexbildung zwischen den vier Untereinheiten zurückzuführen sein. Die Solubilisierung der Proteine mit SDS erwies sich als problematisch, da die üblicherweise angewandte Methode [174], die Proteinprobe mit SDS bei 95 C zu kochen, hier nicht angewendet werden konnte, da das Protein dabei agglutinierte und nicht mehr in Lösung zu bringen war. Eine Solubilisierung bei RT hingegen brachte kein Protein in Lösung. Das beste Ergebnis wurde mit einer Erhitzung der Probe auf 60 C erzielt. Darüber hinaus verbesserte eine Erhöhung der SDS-Konzentration von 3% auf 5% die Solubilisierung. 131

144 Ergebnisse Cyt H M L M H L sphe Ref Roseo Abbildung C.2.2.3: SDS-Gel der isolierten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans (Roseo). Die mittlere Bahn zeigt die Banden der Referenzproteine (Ref), die Bahn ganz links die Banden der isolierten Reaktionszentren aus Rhodobacter sphaeroides (sphe). Probenvorbereitung und Durchführung der Gelelektrophorese wie in Kapitel B beschrieben. 132