Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Ludwig-Maximilian-Universität München

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1 Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Ludwig-Maximilian-Universität München UB Braunschwefc Virusinaktivierung in Blutplasma mittels Ultraschall Esther Schellenberg aus Dessau 2006

2 IV Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Sicherheit von Blutprodukten Blutpräparate Transfusionsrelevante Pathogene Verfahren zur Erhöhung der Sicherheit von Transfusionen Ultraschall Schallabstrahlung in flüssigen Medien Kavitation Zusammenhang zwischen Frequenz, Schallleistungsdichte und Intensität der Kavitation Zellschädigende Wirkungen des Ultraschalls Viren Parvoviren Flaviviren Togaviren Herpesviren Adenoviren Blutgerinnung Zielsetzung 18 2 Material und Methoden Geräte Software Materialien für die Zellkultur Materialien zur Präparation und Befüllung des Blutbeutels Materialien für die Präparation von AdV-luc Materialien für elektrophoretische Analysen Reagenzien Herstellung verwendeter Medien Herstellung der Komplettmedien für die Kultivierung der Zellen Herstellung des Einfriermediums Herstellung verwendeter Puffer und Lösungen Herstellung häufig verwendeter Tris-Puffer Lösungen für die Gelelektrophorese Lösungen für die Reinigung von AdV-luc Lösungen für die Titration von AdV-luc 27

3 V 2.10 Physikalisches und technisches Design Ultraschallwannen Beschallungsbehältnis Halterung zum Einspannen des Blutbeutels Versuchsaufbau Anfertigung einer Druckkammer zur sterilen Begasung von Plasma Ultraschallbehandlungen Ultraschallbehandlung unter Sauerstoff Ultraschallbehandlung unter Zugabe von CO 2 -Schutzgas Biologisches Design Beschallungsmedien Viren und Zellen Arbeiten mit Plasma Sterile Einleitung des CO 2 -Schutzgases Bestimmung der biologischen Aktivität von Gerinnungsproteinen Elektrophoretische Trenn verfahren Arbeiten mit Zellkulturen Kultivierung der Zellen Passagieren der Zellen Kryokonservierung der Zellen Auftauen der Zellen Bestimmung der Zellzahl WST-Assay zur Bestimmung der Zytotoxizität Arbeiten mit Viren Vermehrung und Ernte von PPV, BVDV, SFV und PRV Bestimmung des Virustiters von PPV, BVDV, SFV und PRV Vermehrung und Ernte von AdV-luc Reinigung von AdV-luc Bestimmung des Virustiters von AdV-luc Transmissionselektronenmikroskopie von AdV-luc 47 3 Ergebnisse Einfluss der Ultraschallbehandlung auf die im Plasma enthaltenen Gerinnungsfaktoren Einfluss von Ultraschall auf den Globaltest Thromboplastinzeit (TPZ) Einfluss von Ultraschall auf den Globaltest aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aptt) Einftuss von Ultraschall auf Fibrinogen Einfluss von Ultraschall auf die Aktivität des Gerinnungsproteins Faktor IX Einfluss von Ultraschall auf die Aktivität des Gerinnungsproteins Faktor VIII Zusammenfassung der Ergebnisse zum Einfluss der Ultraschallbehandlung auf die Aktivität von Plasmaproteinen 54

4 VI 3.2 Einfluss der Schutzgasbehandlung auf im Plasma enthaltene Gerinnungsfaktoren Verdrängung von Sauerstoff aus Plasma durch direktes Einleiten von Kohlendioxid als Schutzgas Entwicklung einer Methode zur sterilen Einleitung des CO 2 - Schutzgases Einfluss der Zugabe von CO 2 -Schutzgas unter Druck auf die Aktivität von Plasmaproteinen Einfluss von Frequenz und Leistung der Ultraschallbehandlung unter CO 2 -Schutzgas auf die Gerinnungsaktivität des Plasmas Einfluss von Frequenz und Leistung der Ultraschallbehandlung auf den Globalparameter TPZ Einfluss von Frequenz und Leistung der Ultraschallbehandlung auf den Globalparameter aptt Einfluss von Frequenz und Leistung der Ultraschallbehandlung auf Fibrinogen Einfluss von Frequenz und Leistung der Ultraschallbehandlung auf die Aktivität von FIX Einfluss von Frequenz und Leistung der Ultraschallbehandlung auf die Aktivität von FVIII Zusammenfassung der Ergebnisse zur Ultraschallbehandlung von Plasma unter CO 2 -Schutzgas Virusinaktivierung mittels Ultraschall in PBS nach Zugabe von CO 2 - Schutzgas Einfluss der Ultraschallbehandlung auf das Virus der bovinen Diarrhöe (BVDV) Einfluss der Ultraschallbehandlung auf das Semliki Forest Virus (SFV) Einfluss der Ultraschallbehandlung auf das Pseudorabies-Virus (PRV) Einfluss der Ultraschallbehandlung auf das porcine Parvovirus (PPV) Virusinaktivierung mittels Ultraschall in Plasma nach Zugabe von CO 2 - Schutzgas Einfluss der Ultraschallbehandlung auf die Inaktivierung von BVDV in Plasma Einfluss der Ultraschallbehandlung auf die Inaktivierung von SFV in Plasma Einfluss der Ultraschallbehandlung auf die Inaktivierung von PRV in Plasma Einfluss der Ultraschallbehandlung auf die Inaktivierung von PPV in Plasma Vergleich der Virusinaktivierung in PBS und Plasma Evaluierung der Mechanismen der Virusinaktivierung durch Ultraschall Prüfung der Eignung des Modellvirus AdV-luc zur Ermittlung des Mechanismus der Virusinaktivierung durch Ultraschall Untersuchung zum Einfluss der Ultraschallbehandlung auf die Integrität des Viruscapsids mittels Transmissionselektronenmikroskopie 80

5 Einleitung VM_ Untersuchung der Auswirkung von Ultraschall auf die Integrität der Gerinnungsproteine mittels Gelelektrophorese Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen des Plasmas Untersuchung der Zytotoxizität von Ultraschall behandeltem Plasma 84 4 Diskussion Einfluss verschiedener Beschallungsparameter auf die Stabilität therapeutisch relevanter Plasmaproteine Beeinflussung der Gerinnungsaktivität von Einzelplasmen durch Ultraschallbehandlung bei harter Kavitation in Anwesenheit von Sauerstoff Verbesserung des Erhalts der Gerinnungsaktivität von Einzelplasmen bei harter Kavitation durch Schutzgaseinleitung Variation der Leistungsdichte des Ultraschallfeldes bei weicher Kavitation zur Optimierung des Erhalts der Gerinnungsaktivität Variation der Frequenz des Ultraschallfeldes bei weicher Kavitation zur Optimierung des Erhalts der Gerinnungsaktivität Virusinaktivierung durch Ultraschall Virusinaktivierung in wässriger Lösung (PBS) Virusinaktivierung in Plasma Untersuchungen zum Mechanismus der Ultraschallwirkungen Untersuchung zum Mechanismus der Virusinaktivierung Untersuchung zum Mechanismus der Proteinschädigung der im Plasma enthaltenen Gerinnungsfaktoren Untersuchungen zur Zytotoxizität Ausblick Zusammenfassung Anhang Abkürzungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abbildungsverzeichnis Literaturverzeichnis Danksagung Lebenslauf 120

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