Prinzip der Fluoreszenz. SSM3 J. Schmid. Anregungs- und Emissionsspektren

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1 SSM3 J. Schmid Prinzip der Fluoreszenz Methoden der Fluoreszenzmessung Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskopie BRET und FRET Jablonski-Diagramm 1. Elektronen eines Fluorophors werden durch das Auftreffen eines Photons (hνex) in einen angeregten Zustand S 1 versetzt. 2. Der angeregte Zustand 2 existiert für etwa 1 10 nsec. Energie geht durch Interaktionen und Zustandsänderungen z.t. verloren und führt zum Zustand S Beim Zurückspringen des Fluorophors auf den Grundzustand S 0 werden Photonen (hνem) emittiert. Durch den Verlust an Energie von S 1 auf S 1 ist die Energie dieser Photonen (hν) geringer, folglich ist die Wellenlänge des emittierten Lichts λ (= c/ν) größer. 1 2 Anregungs- und Emissionsspektren Java-Applet für Spektren von BD: Stoke s Shift Infos zu Spektren: Java-Applet von BD: 3 4

2 Charakteristika von Fluoreszenzfarbstoffen Anregungsmaximum (Excitation): Wellenlänge der maximalen Photonenabsorption (λ in nm) Emissionsmaximum: Wellenlänge der maximalen Photonenemission (Fluoreszenz) Molarer Extinktionskoeefizient: Gibt die Absorption von Anregungsphotonen beim Anregungsmaximum λ an (in cm -1 M -1 ) Quanten-Ausbeute: Zahl der emittierten Photonen dividiert durch die Zahl der absorbierten Photonen Eigenschaften einiger wichtiger Fluoreszenzfarbstoffe Farbstoff Ex Em DAPI FITC TRITC TexasRed DAPI... 4,6-Diamidino-2-Phenylindol FITC... Fluorescein Isothiocyanat TRITC...Tetramethylrhodamine ITC 5 6 Alexa-Fluorophore von Molecular Probes ( 7 GFP (Green Fluorescent Protein) und seine Varianten Raumstruktur: Fass-ähnlich mit dem Fluorophor in der Mitte Molekulargewicht: ca. 29 kda Stammt urspr. aus einer Qualle (Aequorea victoria), existiert in bakteriell bzw. Säugerzellen-optimierten Versionen (hinsichtlich der Basencodons für die Aminosäuren). Punkt-Mutationen wurden eingebracht, um die Fluoreszenz zu erhöhen, bzw. unterschiedliche Anregungs- und Emissionseigenschaften zu erreichen (enhanced GFP: EGFP,...) Fluoresziert in lebenden Zellen und kann als Fusionsprotein mit anderen Proteinen exprimiert werden; ändert dabei die Funktion der zellulären Proteine kaum. 8

3 Fluoreszenz-Eigenschaften der GFP-Varianten Spektralfluorimetrische Methoden EBFP (Blue) ECFP (Cyan) EGFP (Green) EYFP (Yellow) DsRed Variante Anregung (nm) Emission (nm) Ähnlich zur Photometrie gefärbter Lösungen gibt es eine Vielzahl von Methoden, bei denen Fluoreszenz als Messgröße eingesetzt wird, wobei oft eine deutlich höhere Sensitivität und Selektivität erzielt werden kann. Spektralfluorimeter haben normalerweise 2 Monochromatoren, einen, um die Wellenlänge des Anregungslichts einstellen zu können und einen zweiten, um die Wellenlänge der emittierten Fluoreszenz bestimmen zu können. Die Bandbreite (slit bandwidth) des Anregungs- und des Emissionslichtes ist meist einstellbar. Das emittierte Licht gelangt auf einen Verstärker (PMT) und wird gemessen. Emissionslicht 9 Anregungslicht Monochromatoren Detektor 10 Parameter der Spektralfluorometrie Wellenlänge des Anregungslichts (Excitation in nm) Bandbreite des Anregungslichts (etwa 1 20 nm, slit width ) Wellenlänge des gemessenen Lichts (Emission) Bandbreite des gemessenen Lichts Empfindlichkeit des Detektors ( Gain, Spannung des Photomultipliers...) Integrationszeit der Messung (langsam schnell) Bei der Einstellung dieser Messparameter müssen die Fluoreszenzeigenschaften entsprechend berücksichtigt werden (z.b. der Stoke s Shift um ein Überstrahlen des Anregungslichtes in das detektierte Licht zu verhindern) 11 rel. fluor Spektren-Analysen (Wavelength Scans) Emissionsspektrum (ECFP) nm Anregungs- und Emissionsmaxima können u.u. von den Literaturwerten abweichen. Deshalb sollte bei jedem Fluorophor eine Spektrenanalyse gemacht werden: 1. Excitation Scan (Anregungsspektrum) beim vermuteten Emissionsmaximum 2. Emissionsspektrum bei dem zuvor ermittelten Anregungsmaximum 3. Überprüfung des Anregungsspektrums und Anregungsmaximums beim ermittelten Emissionsmaximum 12

4 Ex436/Em Kinetische Analysen (Time Scans) Können eingesetzt werden, um z.b. Reaktionskinetiken aufzunehmen, oder aber auch in Verbindung mit Trenn-Verfahren, wie etwa FPLC (Kinetik der Elution fluoreszierender Moleküle, wie z.b. GFP-Fusionsproteine) 0 5 SERT Standards SERT 670 kda 158 kda 44 kda Trp-fluorescence Schnelle Kinetik-Analysen im Millisekundenbereich (Stopped-Flow Fluorometry) Wenn zwei Reaktionspartner in eine Reaktionskammer eingespritzt werden, wo sie sich innerhalb von etwa 1-2 msec mischen, können schnelle Reaktionen zwischen ihnen auch über Fluoreszenzmessungen analysiert werden. Durch Analyse der initialen Raktionsgeschwindigkeit und deren Konzentrationsabhängigkeit können z.b. die Geschwindigkeitskonstanten der Reaktion (k on und k off ) bestimmt werden und damit auch die Dissoziationskonstante bestimmt werden A B Licht-Abschwächung (Stopped Flow Photometrie) Fluoreszenz (Stopped Flow Fluorimetrie) min 13 Anregungslicht 14 Beispiel für eine Stopped-Flow Fluorimetrie Quantitative Fluorimetrie rel. fluorescence Tangente der initialen Reaktionsgeschwindigkeit (rate in 1/sec) seconds Tet-DNA mutant Tet-DNA K aff = 1/K diss = k on / k off rate (1/sec) Linearität zwischen initialer Reaktionsgeschwindigkeit und Konzentration der Reaktionspartner rate (15 C) rate (37 C) k off k on k off y = 734,21x + 244,09 R 2 = 0, ,2 0,4 0,6 0,8 DNA (μm) 15 k on Fluoreszenz kann natürlich auch zur Quantifizierung verschiedenster Substanzen eingesetzt werden. Nachdem die Messbedingungen zwischen unterschiedlichen Geräten variieren, wird normalerweise immer eine Eichkurve unter den identen Bedingungen (Anregungs- und Emissionswellenlänge, Bandbreiten von Anregung und Emission, Detektor-Verstärkung) durchgeführt. Beispiele für häufig eingesetzte quantitative Fluoreszenzmessungen sind: 1. Enzym-Messungen (z.b. β-galactosidase) 2. DNA-Messungen (Hoechst 33258, SYBR Green): Fluoreszenzfarbstoffe, die sich in die DNA einlagern und in Abhängigkeit von der DNA-Menge fluoreszieren. 3. Protein-Messungen (inhärente Fluoreszenz durch aromatische Aminosäuren, SYBR Orange) 16

5 Beispiel für eine quantitative fluorimetrische Bestimmung Fluoreszenz (Em 376/ Ex 276) Probe y = 0,8738x + 0,1417 R 2 = 0,9959 Standardkurve Fluoreszenz als Messgröße bei speziellen Analysen-Verfahren: Real-Time PCR LightCycler TM, Roche Heizschlange Ventillator Kapillare mit dem PCR-Mix Strahlenteiler µg/ml 17 Lichtquelle Detektoren 18 PCR Prinzip PCR Prinzip - animiert 19 20

6 Real-Time PCR mit SYBR Green als DNA- Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green interkaliert in die gebildete DNA (PCR-Produkt)-dadurch steigt die Fluoreszenz mit zunehmenden Zyklen an. Die Bildung von Primer-Dimeren und Addukten führt zum Fluoreszenzanstieg auch in der Negativkontrolle Schmelzpunkt-Analyse der PCR-Produkte Spezifische und unspezifische PCR-Produkte können durch ein Schmelzpunkt-Analyse der Fluoreszenz unterschieden werden, ebenso können genetische Mutationen durch die Schmelzpunktanalyse detektiert werden Mikroskopie Grundlagen der optischen Auflösung Feine Strukturen induzieren ein Beugungsmuster des Lichts (Licht 0.Ordnung, 1. Ordnung...). Je mehr Ordnungseinheiten des Lichts detektiert werden können, umso mehr Feinheiten können aufgelöst werden. Die optische Auflösung, die erreicht werden kann, ist durch die sogenannte numerische Apertur (N.A.) des Objektivs gegeben. N.A. = i sin q i... Refraktionsindex des Mediums (z.b. 1.0 bei Luft, bis zu 1.56 bei Öl) q... Hälfte des Objektiv-Öffnungswinkels (Apertur) 23 24

7 Optische Grundlagen der Mikroskopie II Lichtbeugung an einer kleinen Blende (entspricht der Beugung an kleinen zellulären Strukturen): Airy Scheiben als optische Grundstrukturen sinθ(1) = 1.22(λ/d) θ... Winkel bis zum ersten Licht-Minimum λ... Wellenlänge d... Durchmesser der Blende Für sehr kleinen Winkel θ gilt: θ(1) 1.22(λ/d) Objekte, die näher zueinander stehen als θ(1) können nicht als getrennt aufgelöst werden Verlangsamung (Phasenverschiebung) des Lichts durch ein Objekt Köhler sche Beleuchtung 27 Um eine optimale gleichmäßige Beleutung des Objekts zu erzielen, wurde von Koehler ein Beleuchtungsprinzip mit Licht- Kondensor entwickelt. Diese Beleuchtung ist auch eine Grundvoraussetzung für den optimalen Einsatz verschiedenen Kontrastverfahren, deren Komponenten meist für die Koehler sche Beleuchtung optimiert sind. Um die Köhler sche Beleuchtung zu erzielen fokussiert man zuerst das Objekt, schließt die Feldblende so, dass nur die Mitte des Gesichtsfeldes ausgeleuchtet ist (nötigenfalls zentriert man den Strahlengang) und stellt die vertikale Position des Kondensors so ein das man die Umrandung der Blende scharf sieht. 28

8 Richtige und falsche Beleuchtung Bild der Feldblende bei falscher vertikaler Position des Kondensors Strahlengang (Kondensor) nicht zentriert Korrekte Koehler sche Beleuchtung 29 Spezifikationen der Objektive Der Vergrößerungsfaktor des Objektes (z.b. 10x, 20x, 60x...) ergibt gemeinsam mit dem Vergrößerungsfaktor des Okulars (z.b. 10x) bzw. des Detektionssystems (Linsen vor der CCD-Kamera etc.) die Gesamtvergrößerung (z.b. 100x bei 10x und 10x). Man unterscheidet hauptsächlich zwischen Luft- und Ölimmersionsobjektiven. Die höchste Auflösung und Vergößerung wird nur mit Öl als Medium zwischen Objektiv und Objekt erreicht (bei 60x und 100x Objektiven). Objektive können speziell für Fluoreszenz konstruiert sein (geringe Eigenfluoreszenz des Glases) und weisen oft zusätzliche Spezifikationen auf, wie z.b. eingebaute Phasenkontrast-Ringe. Meistens sind die Objektive auf optische Fehler (Verzerrungen, Farbeffekte...) korrigiert (z.b. Qualitätsbezeichnung: PlanApochromat). 30 Durchlicht-Kontrastverfahren Phasen-Kontrast 1. Phasenkontrast 2. Differential-Interferenzkontrast (Normarski) Ungefärbte Objekte wie Zellen verlangsamen meistens die Phase des durchdringenden Lichts um etwa ¼ λ gegenüber dem Licht, das nicht durch die Zellen geht. Durch Phasenkontrastringe in Objektiv und Kondensor kann das direkte Licht um ein ¼ λ beschleunigt werden, die resultierende Differenz ½ λ verursacht eine Interferenz, die zur Kontrast-Erhöhung führt. ¼ λ 3. Hoffman-Kontrast: Im Objektiv ist ein Modulator mit 3 verschiedenen Grau-Abstufungen, im Kondensor ein Polarisator. Optische Gradienten werden dadurch in unterschiedliche Lichtintensitäten umgewandelt. ½ λ

9 Phasenkontrast II Phasenkontrast III Falscher Phasenkontrastring Korrekte Koehler sche Beleuchtung und Phasenkontrast Phasenkontrastringe nicht zentriert Die Phasenkontrast-Ringe des Objektivs und des Kondensors müssen vom Durchmesser her zusammenpassen und konzentrisch sein; zusätzlich muss der Abstand zwischen ihnen korrekt sein (ist bei Köhler scher Beleuchtung gegeben) dies ist besonders wichtig bei größerer Vergrößerung. Am Objektiv steht meistens welcher Phasenkontrastring beim Kondensor eingestellt werden muss (z.b. Ph1, Ph2...) Beleuchtungsschema bei Invert-Mikroskopen Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Feldblende Kondensor mit Phasenkontrastringen Einstellrad für die vertikale Position des Kondensors Zentrierschrauben für die Phasenkontrastringe und Zentrierschrauben für den Strahlengang Bevor das Licht den Kondensor passiert wird es polarisiert und an einem Doppelprisma (Wollaston Prisma) in zwei Teilstrahlen aufgebrochen, die sich in ihrer Richtung unterscheiden und deren Schwingungsebenen normal aufeinander stehen (dadurch kommt es zu keinen Interferenzen). Die geteilten Strahlen durchwandern die Probe, werden unterschiedlich verändert (in Intensität, Phase etc.), gelangen zum Objektiv und werden dort fokussiert. In der Fokusebene liegt ein zweites Doppelprisma, das die beiden Strahlen wieder kombiniert. Durch einen Analysator wird das Licht in eine Schwingungsebene gebracht. Dadurch können die durch die Probe modifizierten Strahlen miteinander interferieren und es kommt zu Intensitäts- und Farbveränderungen. Als Resultat entsteht ein pseudo-dreidimensionales Bild 35 36

10 Vergleich Phasenkontrast Differentialinterferrenz-Kontrast Fluoreszenz-Mikroskopie HeLa Zellen Beispiel: Triple-Fluoreszenzmarkierte Endothelzellen: Rot: Aktin-Filamente mit Phalloidin markiert Grün: Membranen (DiO-C 6 ) Blau: Nuclei (DAPI-Färbung von DNA) Grundsätze der Fluoreszenzmikroskopie Schema eines Fluoreszenzmikroskops Fluoreszierende Proben werden durch Anregungslicht einer geeigneten Wellenlänge beleuchtet (durch das Objektiv), die emittierte Fluoreszenz wird wieder in das Objektiv gestrahlt durch geeignete Filtersysteme vom Anregungslicht getrennt und zum Okular oder einem Detektionssystem weitergeleitet

11 Einstellung der Fluoreszenzlampe Lichtquellen für die Fluoreszenzanregung 1. Konventionelle Lichtquellen und ihre Lichtverteilung: - Quecksilberdampflampen: - Xenon-Lampen: Laser (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation): Geben nur Licht diskreter Wellenlängen (sogenannte Linien) ab man ist somit in der Wahl des Anregungslichts sehr eingeschränkt Vorteil: hohe Lichtintensität und Qualität (kohärentes Licht), kann durch die feine Bündelung für Scanning Systeme (Konfokale Laser- Scanning Mikroskopie) eingesetzt werden. Verwendet werden meist Argon- Laser, deren Hauptlinien bei 458, 488 und 514 nm liegen, sowie Krypton, Helium oder He/Neon (543 nm, 633 nm). UV-Laser (405 nm) sind meist sehr teuer, es gibt aber seit kurzem preisgünstige blaue Laserdioden-Lichtquellen Lichtquellen II 43 Müssen eingesetzt werden, um die geeignete Anregungswellenlänge aus dem Anregungslicht zu filtern, und die emittierte Fluoreszenz vom Anregungslicht optisch abzutrennen. Die primäre optische Trennung erfolgt durch einen wellenlängen-abhängigen Strahlenteiler (dichroic mirror), der für die emittierte Fluoreszenz durchlässig ist, das Anregungslicht jedoch reflektiert. Fluoreszenzfilter sample 44

12 Charakteristika von Fluoreszenzfilter-Sets Dualband-Filtersets: Simultane Beobachtung zweier unterschiedlicher Fluorophore (z.b. EGFP/DsRed) Anregungsbereiche Strahlenteiler Emissionsbereiche Anregungsfilter (Band Pass) Emissionsfilter (Band Pass) Strahlenteiler (dichroic mirror) Emissionsfilter Anregungsfilter Monochromatoren Detektion des Fluoreszenzlichts Ausgehend von einer konventionellen Lichtquelle (z.b. einer Xenonlampe) kann ein Beugungsgitter-System (Monochromator) Licht einer beliebigen Wellenlänge erzeugen ( nm), womit ein Anregungsfilter nicht mehr nötig ist. Zwischen verschiedenen Anregungswellenlängen kann innerhalb von Millisekunden gewechselt werden (Anwendung bei Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen, Calcium-Visualisierung etc.) UV (320 nm) Schwingbares Gitter Rot (700 nm) 47 -Visuell über das Okular (bei entsprechender Dunkeladaptation) -Durch einen Foto-Apparat und einen empfindlichen Film (veraltet) -Über eine gekühlte CCD-Kamera (charged coupled device) und einen Computer mit Monitor: Die Fluoreszenz trifft auf einen lichtempfindlichen Chip aus einzelnen Pixeln (z.b x 1030). Jeder einzelne Pixel kann viele Graustufen darstellen (z.b bei einer 12 bit-kamera) meist werden aber nur 256 Graustufen dargestellt (8 bit). Die Bilder können direkt am Schirm optimiert und abgespeichert werden. -Durch PMT-Detektoren (Photomultiplier Tubes; Sekundärelektronen-Vervielfacher); vor allem bei konfokalen Laser-Mikroskopen: auf den Detektor auftreffende Photonen induzieren die Freisetzung eines Elektronen-Impulses, der verstärkt und räumlich detektiert wird. 48

13 Beispiel eines Fluoreszenzmikroskopie- Experiments Zellen wurden mit unterschiedlichen fluoreszierenden Proteinen markiert, die normalerweise nur im Cytosol sichtbar sind, und mit einem Inhibitor des nukleären Exports inkubiert. Die Anreicherung der Proteine im Kern nach einiger Zeit deutet auf einen kontinuierlichen Shuttle-Prozess zwischen Kern und Cytosol hin. Kombinationen von Durchlicht und Fluoreszenz A) Direkte Aufnahme mit beiden Lichtquellen IP-Lab Software B) Getrennte Aufnahme und Erstellen eines kombinierten Bildes via Software (z.b. Adobe Photoshop) Interaktive Mikroskopie-Demonstration Interaktive Mikroskopie-Website (sehr empfehlenswert): 1. Grundlagen der optischen Auflösung: Köhler sche Beleuchtung: 3. Phasenverschiebung des Lichts durch ein Objekt 4. Phasenkontrast Objektive mit Einstellring für den Arbeitsabstand: Konfokale Laser Scanning Mikroskopie Prinzip: Durch eine Blende an einer geeigneten Stelle des Strahlengangs wird jenes Licht, das nicht aus der Fokusebene stammt, eliminiert. Dadurch entsteht sozusagen ein optischer Schnitt durch das Präparat (mit einer Schichtdicke je nach Blendendurchmesser im Bereich von µm). Um dieses Prinzip verwirklichen zu können ist eine hohe Qualität des Anregungslichts nötig, wie sie normal nur durch Laser erreicht wird. Da es zu keiner Signalüberlagerung durch Licht außerhalb der Fokusebene kommt, können sehr scharfe Bilder erzielt werden. Die Auflösung ist etwas höher als bei der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie. Photomultiplier konfokale Blende Laser Scanner z-motor Farbteiler (dichroischer Spiegel) Objektiv 51 Detektor Laser (Lichtfaser-Optik zum Mikroskop) 4. Laser Scanning Confocal Microscopy Java.mht 52

14 Konfokale Mikroskopie mit Emissionswellenlängen-Analyse Leica Confocal Microscope TCS SP2: Monochromator vor dem Detektor AOBS: Acousto-Optical Beam Splitter (statt Strahlenteiler) META System von Zeiss: 32 PMT-Detektoren im Abstand von je 10 nm ( nm): simultane Wellenlängen-Analyse. Emissionswellenlängen- Bilderserie (λ-stack) Beispiel für spectral imaging rel. fluor Spektralkurve einer definierten Region nm Zeiss META System: Entmischen der Fluoreszenzsignale aufgrund von Referenzspektren und Zeitreihen mit Wellenlängenanalyse Realtime konfokale Mikroskopie durch verbesserte Nipkow-Scheiben Laserlicht Kombination von Wellenlängenund Zeit-Analyse Linsen Probe 55 Sanfteres Scannen (weniger Bleichen) > gut für empfindliche lebende Zellen Detektion des Fluoreszenzlichts durch eine CCD-Kamera 56

15 Firmen die konfokale Mikroskope anbieten Multiphoton Laser Scanning-Mikroskopie Zeiss: FrameDHTML/205DBFBFB4579E A5A00487C7E Bio-Rad: Leica: Nikon: Olympus: Ein spezielles quantenphysikalisches Phänomen wird genutzt, um die Fluoreszenzmoleküle anzuregen: Im Normalfall wird das Fluorophor durch jeweils 1 Photon angeregt und emittiert dann ein Photon höherer Wellenlänge. Bei einer hohen Lichtdichte langwelliger Photonen (im Bereich von 900 nm) kommt es jedoch in der Fokusebene zum Auftreten von Photonenpaketen aus 2 oder mehreren Photonen (deshalb 2- Photon- oder Multiphoton LSM), deren Energie einem einzelnen kurzwelligen Photon entspricht, wodurch sie das Fluorophor zur Emission eines Photons anregen können (in diesem Fall mit kürzerer Wellenlänge als die Anregungsphotonen!). Der Vorteil dieser Anregungsmethode liegt in der extrem hohen Durchdringungstiefe des Präparats (bis etwa 700 µm) und in der Tatsache, dass weniger Bleicheffekt auftritt, da die Fluoreszenzmoleküle nur in der Fokusebene angeregt werden Multiphoton Laser Scanning-Mikroskopie II Spezielle Fluoreszenzmikroskopie-Techniken normale Anregung (1-Photon > Anregungslichtkegel) 2-Photonen-Anregung: Anregungspunkt) 1. FRAP: Fluorescence Recovery After Photobleaching 2. FLIP: Fluorescence Loss in Photobleaching 3. FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer 4. FLIM: Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy 5. FISH: Fluorescence In Situ Hybridization 59 60

16 FRAP: Fluorescence Recovery After Photobleaching Beispiel für ein FRAP-Experiment: Beweglichkeit eines Rezeptors in der Membran Eine Region der Zelle wird ausgebleicht (meistens mit Hilfe des Lasers bei hoher Intensität) und gleich danach wird eine Bildserie der gesamten Zelle aufgenommen. Kurz nach dem Ausbleichen erscheint die Bleichregion nahezu schwarz, die Zunahme der Fluoreszenz in diesem Bereich durch Einwandern von Fluorophoren von außen gibt Auskunft über die Diffusionsgeschwindigkeit (bzw. Transportgeschwindigkeit) und das Verhältnis von mobilen und immobilen Fluoreszenzmolekülen (wenn z. B. ein Teil der Moleküle an das Zytoskelett assoziiert ist) SPAN K BOTTOM R² Sy.x t ½= 0,85 s Auswertung eines FRAP-Experiments Nicht-lineare Regressionsanalyse der Daten (z.b. mit GraphPad-Prism TM ): meist einzel-exponentielle Zunahme: y = Spanne (1-e -k. x ) + Ausgangswert Ausgangswert % Int Immobile Mobile Spanne FLIP: Fluorescence Loss in Photobleaching Die Abnahme der Gesamt-Fluoreszenz durch wiederholtes Ausbleichen einer bestimmten Region wird quantifiziert. Diese Abnahme entsteht durch Transport von Fluoreszenz-Molekülen in die Bleichregion. Damit können z.b. vesikuläre Transportvorgänge analysiert werden (wenn z.b. nur im Golgi-Bereich gebleicht wird und fluoreszierende Moleküle vom ER in den Golgi transportiert werden) T 1/2 time 63 64

17 Beipiel für ein FLIP Experiment Dynamische Verteilung einer Signalkinase zwischen Kernmatrix und Nucleoli nuclear FLIP (bleach in nucleus outside nucleoli) nuclear nucleolar sec wiederholtes Bleichen in der Kernmatrix > Fluor. nimmt auch in Nucleoli ab 65 FRET: Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer Mikroskopie Zwischen Fluoreszenzmolekülen mit geeigneten Eigenschaften kann es durch Dipolwechselwirkungen zu einem Energietransfer kommen, wenn sie sehr nahe zueinander stehen (im Bereich bis etwa 10 nm). Dieser Energietransfer äußert sich durch eine Verringerung der Fluoreszenz des sogenannten Donor-Fluorophors und eine Zunahme der Fluoreszenz des Akzeptor-Fluorophors (bei Anregung des Donors). Eine Voraussetzung für den Energietransfer ist, dass das Emissionsspektrum des Donors (des Fluoreszenzfarbstoffs mit der niedrigeren Emissions-Wellenlänge) mit dem Anregungsspektrum des Akzeptors überlappt. Der Energie-Transfer ist stark vom Abstand der beiden Fluoreszenzmoleküle abhängig und nimmt mit r 6 ab. Die Distanz, bei der der halb-maximale Energie-Transfer auftritt, wird als Förster-Distanz R 0 bezeichnet (bei CFP/YFP: R 0 = ca. 5 nm) FRET-Mikroskopie wird verwendet, um z.b. Protein-Protein- Interaktionen in der Zelle sichtbar zu machen. 66 Prinzip des Resonanz-Energietransfers Appropriate Fluorophore Pairs for FRET Donor Acceptor no FRET FRET donor fluor. (CFP) Fluorophore Pair CFP / YFP Comments Good combination for normal FRET microscopy using Hglamps as light source and special filters. CFP is poorly excitated by Ar-lasers, but: good excitation by blue laser diodes Licht Donor Acceptor nm Anregung Emission acceptor fluor. (YFP) E = R 06 /(R 06 + r 6 ) und R 0 = [κ 2 J(λ) n -4 Q] 1/6 970 R0 Förster-Distanz r.. tatsächliche Distanz κ.. Orientierungsfaktor J(λ) spektrale Überlappung n Brechungsindex Q Quantenausbeute der Fluor. BFP / GFP GFP / DsRed-variants GFP / YFP GFP / Cy3 or Alexa 546 FITC / TRITC Alexa 488 / Alexa 546 (Cy3 / Cy5) BFP has inferior fluorescence properties DsRed is just fluorescent as tetramer, shows complex maturation characteristics with green fluorescent intermediates and tends to aggregate; DsRed2 is a dimer Are very difficult to separate with filters (but can be used in FLIM and with spectral analysis) Antibodies can be directly labeled with Cy3 or equivalent Alexa dye and give FRET with a GFP chimera to which they bind. Classical FRET pair for labeled proteins (e.g. antibodies) alternatives as labeling dyes (superior to FITC and TRITC) Johannes A. Schmid

18 FRET kann zur Analyse von Protein-DNA Interaktionen eingesetzt werden FRET kann dazu eingesetzt werden, die Interaktion von Signalmolekülen in lebenden Zellen zu visualisieren relative fluorescence Einzelspektren von Donor und Akzeptor (GFP-NF-κB und Tet-markierter DNA) Spektralüberlappung Anregung von GFP (488 nm) GFP-NF-kB DNA nm GFP-NFkB (Em) Tet (Em) Tet (Ex) Spektren-Analyse einer Mischung: Zunahme an Akzeptor-Fluoreszenz zeigt den FRET-Effekt RFU GFP FRET Tet-label GFP-NFkB + Tet-DNA (Tet-scan subtracted) GFP-NFkB nm GFP-Emission (512 nm) Tet-Emission (540 nm) 69 relative fluorescence 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 EYFP (Em) EYFP (Ex) ECFP (Em) ECFP (Ex) ECFP and EYFP-Scans Spectral overlap 0, nm Förster Distanz R 0 für ECFP und EYFP: ca. 5 nm (50% FRET Effizienz): > kein FRET-Signal ab 10 nm. Abnahme der Donor Emission X FRET Y Zunahme der Akzeptor Emission 1 nm Donor Acceptor 70 Überblick über die FRET-Mikroskopie-Techniken 1. Aufnahme mit FRET-Filtersatz (Donor-Anregung und Akzeptor- Emission) unter kontrollierten Aufnahmebedingungen (Verstärkung, Integrationszeit...) 2. Erstellen eines Divisionsbildes (ratio image) zwischen dem Akzeptorfluoreszenzbild (bei Donor-Anregung) und dem Donorfluoreszenzbild (ebenfalls bei Donor-Anregung) 2-Filter FRET Mikroskopie 3. 3-Filter FRET Mikroskopie 4. Bestimmung der Ausbleichkinetik des Donor (diese ist abhängig von der Anwesenheit eines FRET-Akzeptors) 5. Zunahme der Donor-Fluoreszenz nach Ausbleichen des Akzeptor- Fluorophors 6. Bestimmung der Fluoreszenz-Dauer des Donors (fluorescence lifetime FLIM (nimmt ab, wenn ein FRET-Akzeptor vorhanden ist) 71 3-Filter Methode der FRET-Mikroskopie Spezialisierte Form des Ratio Imagings: die Probe wird unter gleichen Kameraeinstellungen mit allen 3 Filtersätzen aufgenommen: 1. CFP (CFP-Anregung und Emission), 2. YFP (YFP-Anregung und Emission Signal nicht von FRET beeinflusst) und 3. FRET-Filtersatz (CFP-Anregung und YFP-Emission). Ein normalisierter FRET-Wert kann errechnet werden nach der Formel: FRETN = I FRET -corr CFP x I CFP corr YFP x I YFP corr CFP : ca corr YFP : ca CFP / YFP neg. control Korrekturfaktoren: empirisch ermittelt für die verwendeten Filtersätze: 59% crosstalk von der CFP-Emission zum FRET-Filter-Signal and 18% crosstalk von deryfp-emission zum FRET- Filter-Signal) CFP-YFP pos. control 72

19 Das Ausbleichen des Donors ist in Gegenwart eines FRET-Akzeptors verlangsamt ECFP FRET Mikroskopie durch Analyse der Ausbleichkinetik des Donors 436 nm FRET CFP-Protein alleine Zeitreihe von Bildern EYFP CFP- und YFP-Protein ECFP Zeitreihe von Bildern 476 nm 436 nm 476 nm 73 Donor- Ausbleichkinetik Probe mit FRET Probe ohne FRET Vorteile: Konzentrationsunabhängig Donor und Akzeptor müssen nicht vollständig kolokalisieren Limitierung: externe Kontrolle nötig, kein FRET-Bild Einzel-exponentielle Abnahme kt y = A 0. e + offset y... Fluor. Signal A 0... Ausgangssignal k... Abnahmekonstante t... Zeit offset... Endwert Fluoreszenz Halbzeit Tau: τ = 0.69/k FRET eff. E = 1 - (τ ohne / τ mit Akzeptor.) 74 FRET Mikroskopie durch Akzeptor-Bleichen und Analyse der Donor-Fluoreszenzzunahme Donor recovery after acceptor bleaching: Ein Bild des Donors in Gegenwart des Akzeptors wird aufgenommen, gefolgt durch ein (partielles) Ausbleichen des Akzeptors und Aufnahme eines zweiten Donor-Bildes 1.2 ECFP (Em) ECFP and EYFP-Scans 436 nm 476 nm Beispiel für eine Donor Recovery FRET-Mikroskopie Positive Kontrolle (Fusionsprotein) CFP Image Ratio Image vor YFP-Bleichen. nach YFP-Bleichen. (Farbdarstellung) relative fluorescence ECFP (Ex) nm ECFP FRET 436 nm EYFP 476 nm Negative Kontrolle Probe: 2 interagierende Signalmoleküle excitation bleaching of acceptor Donor Image 1 Donor Image 2 ECFP EYFP 75 Vorteile: Konzentrationsunabhängig; Donor und Akzeptormüssen nicht vollständig kolokalisieren; interne Kontrolle ist vorhanden, Ratio- Bild (nach Akzeptor-Bleichen/vor Akzeptor-Bleichen) = FRET-Bild 76

20 Confocal 3-Filter FRET Microscopy with EGFP and monomeric DsRed Verifizierung der FRET Mikroskopie durch Spektralfluorimetrie in vitro Wellenlängen-Analyse (Emissions-Scans) bei der Donor-Anregungswellenlänge FRET GFP mdsred merge FRETcorr = FF x GF x DsRed corr. FRET (3x enhanced) 77 Akzeptor-Fluoreszenz, die nicht durch FRET entstanden ist, sondern durch direkte Anregung des Akzeptors bei der Donorwellenlänge, muss abgezogen werden (durch Messung der Akzeptor- Fluoreszenz bei Akzeptor- Anregung und Rückrechnen auf Emission bei Donor-Anregung. Die erhaltenen Spektren können noch auf das Donor- Emissionsmaximum normiert werden (dadurch werden unterschiedliche Donor- Konzentrationen rechnerisch kompensiert. 78 Visualisierung biochemischer Reaktionen durch FRET-Mikroskopie Detektion der Autophosphorylierung einer Rezeptor-Tyrosin-Kinase durch Bindung eines fluoreszenz-markierten Antikörpers (Cy3 = FRET-Akzeptor) an Tyrosinphosphorylierte GFP-markierte Rezeptoren (GFP = FRET Donor) erb2 -P GFP Cy3 GFP Ratio image FLIM: Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy Die Lebensdauer der Donor-Fluoreszenz nach kurzer Impuls-artiger Anregung wird durch die Anwesenheit von Energie-Transfer Akzeptor-Molekülen deutlich reduziert. Diesen Effekt nutzt man bei der FLIM-Methode aus, um räumliche Assoziationen von Makromolekülen sichtbar zu machen. Statt kurzen Lichtimpulsen wird dabei meist ein pulsierender (modulierter) Laser als Lichtquelle verwendet und die Phasenverschiebung der Donorfluoreszenz gemessen. Daraus kann die Donorfluoreszenz-Lebensdauer errechnet werden. Mit diesen Methoden kann man sogar biochemische Prozesse, wie z.b. Phosphorylierung in der Zelle räumlich lokalisieren

21 FLIM Mikroskopie II Beispiel für FLIM-Mikroskopie Fluoreszenz-Abnahme ( Lebensdauer im nsec- Bereich) bei einer Pulsanregung Phasenverschiebung des Emissionslichtes gegenüber dem Anregungslicht bei einer sinusartigen Laserquelle FLIM-Bild Vorteile: konzentrationsunabhängig keine Kolokalisation nötig FRET-Bild kann errechnet werden Nachteil: teure Geräte-Anschaffung 81 EGFR-GFP Anti-P-Tyr (Cy-3) GFPlifetime Lifetime nach Cy3-Bleichung FRET-Effizienz 82 Anwendung der FRET-Mikroskopie für Biosensoren Caspase 3-Biosensor: Apoptose (Aktivierung von Caspase 3) kann durch CFP-YFP Fusionsproteine, die durch Caspase-Spaltsequenz getrennt sind, visualisiert werden. Andere Beispiele für FRET-Biosensoren Calcium-Biosensor: Ca 2+ -sensitives Calmodulin und eine Ca 2+ /Calmodulinbindende M13 Domäne befinden sich zwischen CFP und YFP (Vorteil: durch zusätzliche Lokalisationssequenzen kann der Biosensor in den Kern, ins ER geschleust werden). Ein Anstieg der Ca-Konzentration führt zu einer Konformationsänderung und einem Anstieg des FRET-Signales. CFP Caspase 3 - DEVD - YFP FRET CFP Calmodulin M13 YFP Ca 2+ CFP Ca 2+ YFP FRET PKA Aktivitätssensor: CFP und YFP getrennt durch eine PKA- Substratsequenz und eine Domäne, die Phosphoserin bindet. FRET kein FRET PKA-substrate CFP YFP PKA CFP P YFP 83 84

22 Digitale Bildanalyse Für Schwarz/Weiß Aufnahmen werden meist Programme mit 256 Graustufen pro Pixel verwendet (8 bit). Farbbilder: meistens 24 bit RGB (3 x 8 bit = 256 Intensitätsstufen der drei Grundfarben Rot, Blau und Grün) Verschiedene Datei-Formate: TIF: verlustfrei, JPG: komprimiert aber mit Qualitätsverlusten, BMP: Bitmap Häufig verwendet: NIH-Image (wissenschaftliche Freeware für MacIntosh: bzw. das Windows- Äquivalent: ScionImage ( Eine Eigenheit dieser Programme ist, dass: Weiß = Intensität 0 und Schwarz = 255 definiert ist (wichtig bei Rechenoperationen). Bildanalyse-Programme können meistens verschiedene optische Filteroperationen durchführen (Schärfen, Glätten, Kontrast- Verstärkung etc.), und zusätzlich auch mathematische Bildoperationen, wie etwa Divisionen, Subtraktionen, sowie auch Messungen wie etwa Fluoreszenz-Intensität etc. 85 Andere FRET Anwendungen: Real-Time PCR mit FRET-Hybridisierungssonden Innerhalb der von Primer 1 und Primer 2 liegenden amplifizierten Sequenz können 2 zusätzliche Oligonukleotide 1 und 2 (Hybridisierungssonden) binden, die am 3 und am 5 -Ende so markiert sind, dass die beiden Fluorophore bei den gebundenen Sonden nebeneinander liegen und einen Fluoreszenz Resonanzenergie-Transfer verursachen, der gemessen werden kann. In diesem Fall können Primer-Addukte kein falsches Signal generieren. 86 Real-Time PCR mit TaqMan Sonden Bei einer TaqMan-Sonde liegen FRET-Donor und Akzeptor (Quencher)-Fluorophor am gleichen Oligonukleotid. Bei der Bindungstemperatur für die Oligos (annealing) bindet die Sonde an eine Zielsequenz innerhalb des PCR-Produkts. Die Exonuklease-Aktivität der Taq- Polymerase spaltet die Sonde und führt zur Freisetzung der Donor-Fluoreszenz. BRET: Biolumineszenz Reosnanz Energie Transfer Energie-Donor ist ein lumineszierendes Molekül (Luciferase ), dessen emittierte Photonen einen FRET Akzeptor zur Fluoreszenz anregen 87 88